第四章 色谱技术
色谱法（ Cheromatography）是 19世纪俄国植物学家茨维特（ Tsweett）创立的一种分离混合物的技术。
他将植物色素放在一直立的装填有碳酸钙粉末的玻璃管中，然后用石油醚自上而下流下，得到一系列颜色排列的谱带，故称为色谱。
现代色谱已经发展到几乎可以分离任何有色或者无色混合物的水平，但是“色谱”的名称依旧保留。
色谱中重要的概念是“固定相”与“流动相”。
本章介绍几种常见色谱的原理，重点介绍气相色谱分离分析技术。
一般色谱法的分类
一,按照固定相与流动相物态分
气相色谱,GC （ GSC； GLC）
液相色谱,（ LSC； LLC）
超临界流体色谱,（ SFC）
二,按照固定相使用形式分
柱色谱
平面色谱,在平面介质上进行组分分离的技术薄层色谱,（ TLC） 薄层板和薄层棒纸上色谱,（ PC） 圆形纸上色谱按照分离机理分类
1、吸附色谱：混合物被吸附在固定相吸附剂上，流动相先带走吸附力弱的成分。
2、分配色谱：固定相是固定的液体，混合物在两相间分配（相当于萃取），在流动相溶解度大的先带走。
3、离子交换色谱,（ IC）
利用离子交换树脂作固定相分离离子型化合物的色谱法。用高效液相色谱技术和离子交换树脂柱，用含有某种特定离子的水溶液作流动相，在降低流动相背景信号的前提下进行离子分离；或通过调节流动相的 pH值以抑制试样组分的电离，从而分离离子化合物（离子抑制色谱） 。
离子排除色谱（ IEC）
4、利用离子交换树脂对电解质与非电解质的斥力不同而达到分离的色谱法。最常用的是粒径 =15μm 高效凝胶型磺化苯乙烯 /二乙烯苯离子交换树脂（强酸型）。树脂溶涨后在小球中滞留的水是稳定的水相，
小球间是流动的水相。离子交换树脂在两个水相间起半透膜作用。试样中与离子交换树脂的离子带相同电荷的离子被排斥在固定水相之外，弱酸以分子存在被固定水相滞留；非离子组分不被滞留，在两相间进行分配，按照组分与树脂官能团作用力大小不同分开。
离子对色谱与 凝胶色谱
5,（ IPC）在流动相中加入与所要分离的组分相反电荷的离子（称为离子对，即离子试剂），
与组分形成离子对，从而改变组分的保留值和分离度。
6、凝胶色谱：空间排除色谱、分子排除色谱，
分子筛色谱、液体排除色谱、体积排除色谱等
（ GPC），用于大分子分离。生化中水作流动相成为凝胶过滤色谱；合成高聚物中用有机物作流动相成为凝胶渗透色谱。
亲和色谱
亲和色谱,生物体内生物分子之间都具有亲和力，能形成可逆络合物。利用这种可逆络和与解离原理进行色谱分离，即把配基键合在不溶于水的惰性载体上成为亲和物，从而进行提纯的技术。
如酶与基质、抑制剂、变构效应剂或辅酶；激素与细胞受体；维生素与结合蛋白；基团与核酸；抗体与抗原；外源凝集素与红细胞表面的抗原等都具有亲和力。
按照色谱的动力学过程分类
1、洗脱法,组分在固定相和流动性反复的进行分配和再分配，或吸附与解吸。由于各组分的分配系数不同或吸附系数不同而分离。
2、顶替法 （置换法） 直接用流动性作为顶替剂，试样进入色谱柱后被顶替剂置换，而且反复置换达到平衡。利用流动相在在固定相上的溶度或吸附力比试样强，以及试样中各组分的溶度与吸附力差异而分离。
气相色谱 （ GC）
气相色谱是用气体作流动相的色谱技术 。 农药商品分析和农药残留分析一般用气相色谱 。
气相色谱分离原理：
载气 （ 如 N2 ） 通过进样器将样品带往色谱柱进行分离,空气和 H2进入检测器燃烧升温 。
色谱柱和检测器温度由控温仪控制 。 样品经检测后信号进入放大器放大,进入记录仪记录 。
气相色谱法 分类：
气 — 固 （ GSC） 只用于分离低分子物质
气 — 液 （ GLC）
气相色谱的基本概念
死时间 t M,不被吸附成分通过色谱住停留的时间 。
保留时间 t R 被吸附成分通过色谱住停留的时间；
调整保留时间 t’ R = t R - t M
是由于吸附作用比不被吸附成分多停的留时间 。
死体积 VM = tM.F（ 流速 × 时间 ）
保留体积 VR=tR.F
调整保留体积 VR’= t.’RF=VR-VM
相对保留值 α = t’ R（ 2） / t’ R （ 1）
组分 1对组分 2相对保留值气相色谱的基本概念
分配系数 K= Cs/Cm
被分离组分在固相和在流动相的浓度之比 。
色谱区域宽度：组分在色谱柱中谱带扩张函数 。
表示方法：标准偏差 σ 标准偏差 0.607倍峰高处峰宽的一半 。
半峰宽度 Y1/2（ 半宽度,区域宽度 ） 峰高一半处的宽度 。
基线宽度 Y 色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。
Y= 4 σ ； Y1/2 = 2.354σ
分配容量 k=vl/vg 柱内液体所占体积 /柱内气体所占体积。
动力学与热力学因素影响组分分离效果受动力学与热力学因素影响 。
动力学因素：气相扩散与固 （ 液 ） 相传质
热力学因素：相对保留值,反应在该温度下组分在两相分配过程与分配系数 （ 与样品和固定相的结构性质有关 ） 。
A,B两组分分离的必要条件：
1.两组分分配系数必须有差异 。
2.区域扩展的速率小于区域分离速率 。
3.保证快速分离的前提下提供足够长的色谱柱 。
色谱定性、定量分析
定性分析
确定色谱图上每一个峰所代表的物质。在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留值。通过比较以知物与未知物的保留参数可以确定时什么物质。
定量分析
fih fiA分别是峰高和面积校正因子。
对称的峰，用手工测量 AI =1.065 hI Y1/2
不对称的峰 AI =1/2 hI （ Y0.15 +Y0.85） hI
Y0.15 和 Y0.85是峰高 0.15和 0.85出的宽度。
绝对校正因子与相对校正因子
绝对校正因子
指某组分 I通过检测器的量与检测器对 I组分响应信号之比：
fiA = AI / mi； fih = mi / hI
相对校正因子
指某组分 I与基准组分 s的绝对校正因子之比。
fisA = miAs / AI ms ； fish = mi hs / ms hI
一般文献是指相对校正因子。
气象色谱定量分析方法
外标法,
将欲测组分的标准物质配成系列浓度，进行色谱分析，以峰高或面积对浓度作图制作标准曲线，试样进行分析后，在曲线上查得峰面积或峰高后可以求得其百分含量。
内标法
当只须测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，用内标法。
准确称取样品，加入一定量某种物质作为内标，然后进行色谱分析。根据被测物质和内标在色谱图上相应峰面积（或峰高）和相对校正因子求出某组分的含量。
mi /ms = AI fisA / As fssA ； mi = AI fisA ms / As fssA
mi % = （ mi /m） × 100% = （ AI fisAms / As fssA）
归一法
归一是把式样中所有组分得含量之和按 100%
计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下列公式计算各组分含量。
mi % = （ AI fisA /∑ fisA mi） × 100%
或
mi % = （ hI fish /∑ fish mi） × 100%
气相色谱仪结构
1.气路系统：载气 /氢气、氮气、氦气和氩气。气路结构 /减压阀、净化器、稳压阀、压力表、流量计。
2.进样系统：进样器、汽化室。
3.分离系统：色谱柱 /填充柱；内径 2— 4mm，长度
1— 10m。柱形有 U形和螺旋形。螺旋形直径与柱内径之比为 15,1— 25,1。
空心毛细管柱材质为玻璃或石英，内径一般为 0.2—
0.5mm，长度为 30— 300m，螺旋形。色谱柱分离效果与柱长、柱形、柱径、固定相和柱填料制备技术及操作条件有关。
气相色谱仪结构
4.温控系统：用来设定、控制和测量色谱柱炉温、汽化室、检测室得温度。
温度直接影响色谱柱的选择性、分离效果和检测器灵敏度及稳定性。
5.检测系统：检测器将载气中组分转变成易于测量的（电）信号。微分型检测器分为浓度型（热导池、电子捕获检测器器）和质量型（氢火焰离子化检测器）。
检测器性能指标
灵敏度：输入单位被检测物质时引起的输出信号
S=ΔR/Δm。
浓度型,S= Ac 1F 0/c 2 m
其中,A峰面积（ cm2）,c 1为记录器灵敏度
（ mv/cm）,c 2 为记录器走纸速度（ cm/min），
F 0为出口流动相速度（ mL/min）,m为进入检测器的质量。
气体样品 Sg单位为 mv.mL/mL；
液体样品 Sl= 60 Ac 1/c 2 m,Sl单位为 mv.mL/mg,60
是时间分换算成秒的因子。
检测限 D=2RN /S 恰能产生 2倍噪音的信号检测器线性范围用浓度上下限比值表示,107/10=106
检测器种类
热导池检测器（ TCD）：结构简单、性能稳定、线性范围宽。
氢火焰离子化检测器（（ FID）：结构简单灵敏度高、死体积小、响应快、线性范围宽、
稳定性好（永久性气体不产生信号）。
检测器
电子捕获检测器（ ECD）：只对于具有电负性的物质，如含有卤素,S,P,N的物质有响应。 β — 放射源为负极，不锈刚为正极。脉冲电压使 β — 放射源放射 β— 射线，将载气电离出低能电子并且向正极运动形成恒定基流，电负性物质俘获低能电子降低基流，产生负信号 — 倒峰。
火焰光度检测器（ FPD）又叫硫磷检测器，是对含硫、磷有机化合物具有高度选择性和高灵敏度的检测器。
离子交换色谱法
离子交换色谱种类
1、多孔树脂 细网 （凝胶型）和粗网（大孔型）。
前者溶涨后为多孔树脂，孔径大小决定于树脂交连度。常见的是苯乙烯与二乙烯苯共聚物，具有比较细小的空和伸到内部的沟、管道。
优点 具有较高的试样容量；
弱点 孔径小传质慢，柱效低不耐高压，超限后降压也不复原。
大孔树脂孔径不均匀，解决传质慢问题。
2、薄壳树脂 在玻璃微珠（ ≈ 30 μm）的表面形成薄的（ ≈1μm）离子交换树脂层。具有优点 离子只出入表面，树脂不需要较高的交连度，柱效高，分离速率快；可以制备均匀和任意厚度的树脂层；化学组分和树脂交连度没有限制；选用适当玻璃珠可以制备一定粒度范围的薄壳树脂；机械强度好，耐压，
薄壳层不易剥离；可以直接用干树脂填充色谱柱。
弱点 容量低，用灵敏度高的检测器。
3、表面多孔薄壳树脂 在玻璃微珠表面先盖一层较为惰性的树脂层作为载体，然后在比较大的孔（ 80～ 200μm）上沉积交换树脂。
试样容量比薄壳树脂更小，但是表面积对体积比值更高，柱效高，但是强度不如薄壳树脂，有时会脱落。
4、刷子行树脂 在玻璃珠的表面键合刷子型的有机余基，如烷基或芳基，以及引入离子交换基团。由于玻璃微珠表面积小，试样容量小，但可以用有机溶剂做流动相。如果用多孔硅胶代替玻璃微珠，并在引入离子交换基团后进行硅烷化可以增加容量。树脂交换量与硅胶表面积成正比，颗粒小的柱效高，
分离时间短。树脂耐压，流动相成分改变时体积不变。但是硅胶在 pH≥ 8.5时开始溶解，
故不能用于碱性强的溶液作流动相。
1975年 Small提出用电导检测器的离子交换色谱法首次实现了有机和无机阴离子的快速分离检测。用离子交换树脂要有强的渗透性。
不用离子交换树脂的用含己基硫酸盐或辛基硫酸盐的洗脱液动态涂渍的柱子分离阳离子；
辛基或十六烷基季铵盐用于分离阴离子。
经典离子交换色谱在树脂粒度、交换容量、
分离柱内径与长度及分离时间都大于现代离子家换色谱。现代检测手段先进及用泵输送流动相流速稳定等优点。
离子对色谱法
离子对色谱分为正相与反相。
正相是极性大的固定相，采用极性小的流动相，极性小的组分先流出，极性大的组分慢流出。
反相色谱采用疏水型非极性化学键合相，用极性大的流动性。极性大的组分先流出，极性小的组分或流出。如十八烷基硅胶键合相或苯基硅胶键合相，
流动性用低浓度的离子对试剂水溶液或能溶于水的有机溶剂，如甲醇或乙醇等与水组成的混合溶剂。
能够有效的分离有机酸碱和两性化合物，广泛用于分离羧酸、磺酸、酚、胺、季铵盐、氨基酸、多肽、
核酸及其衍生物。
离子对试剂
阳离子型伯铵盐、仲铵盐、叔铵盐、季铵盐阴离子型无机物 卤离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、
高氯酸根离子,硫酸根离子、硝酸根离子。
有机物 甲酸离子、乙酸离子、丙酸根离子、柠檬酸氢根离子、苯甲酸离子、水杨酸根离子、苦味酸离子、硫酸氢酯离子、磺酸根离子等
水是反相离子对色谱法中流动相的主要组成部分，
固定相是非极性键合相，组分与离子对试剂结合后改变组分离子的亲水性或疏水性，改变了保留值。
利用碳链较长的磺酸盐可以增大保留值，利用磷酸二氢根可增大亲水性。
保留值随离子对试剂浓度增大而增大碳链长的离子对试剂由于表面活性剂作用，保留值增大有一个极限值。
流动相的 pH值影响弱电解质的电离平衡,pH值上升，弱酸电离度增大，阴离子浓度增加，与离子对试剂作用增强 。分离两性化合物时，用阴离子对实际必须使两性离子带正电，既流动相的 pH值应该小于它们的等电点；用阳离子对试剂必须使两性离子带负电，即流动相的 pH值应大于它们的等电点。，
反相离子对色谱机理
各种机理
1、与试剂结合后改变了疏水性，影响了在固定相和流动相之间的分配系数，从而改变了色谱行为。
2、疏水型性离子对可逆吸附在非极性固定相表面后与祖坟发生动态离子交换，即形成具有离子交换能力的表层。带相反电荷组分的离子与离子对试剂的平衡离子发生交换。离子对碳链长的组分，交换剂的覆盖面大，保留值长。
3、离子相互作用 非极性固定相的表面先吸附流动相中部分亲脂性的带正或负电荷的离子对形成第一正、或负电层。为了维持电中性外面吸附了相反电荷的其它离子，形成第二相反电荷层。
固定相的表面吸附带负或正电荷的组分离子使第一层增加负、或正电荷。为了维持电中性，就从流动相中拉入带相反电荷的离子，结果离子被成对的吸附在固定相表面上，但不是形成离子对。因为各种组分的离子与过渡性表面的疏水作用和双电层的静电引力不同因而表现不同的保留值。
凝胶色谱
凝胶色谱法是一种化学惰性的高度多孔的非离子型凝胶小球作为固定相。
特点
分离原理 分子筛原理，大分子先流出、小分子依次流出。
凝胶色谱法适宜于分离非离子型的，分子量大于
2000的高分子化合物
天然高分子化合物，如蛋白质、核酸可以很好的被分离
一般式样可以用娘叫渗透色谱法进行试分离，一了界试样的复杂程度和分子量的分布范围
色谱峰容量小，不能分离分子量近似或相同的物质凝胶色谱固定相
固定相的要求
在 pH值很宽的范围内是化学惰性。
本身中性，不含可离解基团。
分离过程不发生离子交换。
溶涨度受交连度影响，交连度越低溶涨度越大，对大分子渗透性越强。
机械强度要好，否则使用过程变形，增大阻力，减少流速以至阻塞。
固定相种类
葡聚糖凝胶
Sephadex G 蔗糖经微生物发酵后制成的有葡萄糖残基构成的分子量大的聚合物。经提纯后用盐酸降解为分子量平均为 104～ 20× 104
葡聚糖。用乙醇分级沉淀，在碱性溶液中与环氧氯丙烷，生成由甘油交连的葡聚糖醚的不溶性三维强亲水结构。
G后面的数字表示没 10kg干葡聚糖凝胶溶涨吸水量
如 Sephadex G— 200表示 1g干凝胶吸水
20mL左右。
Sephadex G系列可以经受高温消毒，对水、
盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸都稳定。强酸型醚键水解。长时间与氧化剂接触骨架会破坏。
Sephadex G的分级方法是用微球直径表示。
适用于水、甲醇,DMSO作流动相。主要用于分离蛋白质、核酸、酶和多糖。分离范围从 1000以下到 8× 105，固流比 0.8～ 1.8，不能承受压力
Sephadex LH— 20,LH表示亲脂溶剂和亲水溶剂均能溶涨。可以分离不溶于水的的物质。
聚丙烯酰胺凝胶
由丙烯酰胺与 N,N’ — 亚甲基双丙烯酰胺共聚而成。后者为交连剂。交连剂的比例越大，
产品的孔径越小。商品名 Bio— Gel P。加水自然溶涨,P后的数字乘 1000表示肽与蛋白质的排除极限。
性质与 Sephadex G很相似，可以不被微生物腐蚀，耐酸碱性不如前者。
吸水量与 Sephadex G有近似值。
规格划分较细。
甲基丙烯酸聚乙二醇凝胶
甲基丙烯酸单酯与双甲基乙二醇酯共聚物。
改变配比可以改变孔径、比表面积和羟基官能团数目。商品名 Spheron,各种型号。具有良好的化学稳定性与机械强度，可以在高流速下使用，溶涨后体积变化小。内部结构是大网状干凝胶和气溶胶的混合物。
琼脂糖凝胶
琼脂糖是由 1,3 — 连接的 β — 吡喃半乳糖残基和 3，
6 — 脱水,α — 半乳糖 1,4 — 交替交连而成，糖链呈双螺旋状，链间有氢键连系，纵横交错成多孔状结构。
商品名 Sepharose和 Bio — Gel A等，制成微球。前者一溶涨状态，悬浮在 0.02℅的叠氮化钠（防腐剂）
溶液中，后者悬浮在 0.02℅的叠氮化钠的 0.001mol/L
三羟甲基氨基甲烷和 EDTA中，一充分水合形式供应。
不能脱水干燥，否则不能复原。
分级范围相同是可以代替 Sephadex G和 Bio— Gel
P，不可用于破坏氢键的物质。
其它凝胶
小孔球形硅胶渗盐后高温焙烧而成。化学惰性、热稳定性、机械强度好。使用温度高、
使用寿命长。粗粒多孔硅胶的柱效比交连聚苯乙烯凝胶的低。微粒多孔硅胶是高效高速凝胶，多孔硅胶平均力度为 10～ 200nm，排除极限为 10～ 106。
多孔玻璃珠 商品有 Bioglass系列和 CPG
[controlled pore glass控孔玻璃 ]系列。特点是孔径均匀，孔径不受流动相的化学性质、
pH值和离子强度影响不被微生物腐蚀、机械强度好、高压高速使用以及可以用热硝酸清洗,500℃ 蒸汽消毒。
交连聚苯乙烯凝胶 苯乙烯与二乙烯苯共聚物。适宜于凝胶渗透色谱用。商品 Poragel的微孔尺寸很小，排除极限分子量是 14000。
大孔交连聚苯乙烯凝胶 Styragel和 Bio— Bead
SM系列是大孔干凝胶和气溶胶混合体，具有良好的色谱特性，化学稳定性和机械强度，
溶涨后体积变化很小。除丙酮和乙醇等强极性溶剂外，其它有机溶剂均可以作流动相。
另有大空聚苯乙烯凝胶是将凝胶骨架磺化到一定程度，商品名 Aquapak,可以用水作流动相，但是有离子交换作用，影响凝胶色谱特性，可用离子强度高的液体作流动相可以消除影响。
聚乙二醇凝胶
商品名 Fractogel PGM 2000,对分离亲脂性和亲水性的物质都有用。
丙烯酰胺 /琼脂糖凝胶
商品名 Ultrogel 是颗粒坚硬的微球，在水中溶涨，机械强度好。
亲和色谱法
基本原理 被提纯物质与载体形成亲和物，
然后用不同 pH值的淋洗液洗脱。亲和十分牢固的大分子用强酸、强碱洗脱。洗脱后迅速中和稀释、透析，恢复大分子的天然活性。
也可以加入特种配基将结合牢固的配基置换出来。
特点 简单快速回收率高，一次可以将粗品纯化千百倍。
用于提纯蛋白质、酶、酶抑制剂、抗体、抗原、基因、激素、核酸等。
制备亲和物载体的条件
均匀、有一定硬度、不溶解于水；
易为大分子渗透的多孔网状结构；
具有相当数量可以供交连的基团；
没有吸附性；
有足够的化学稳定性；
不受微生物腐蚀或酶解。
摸前还没有完全满足以上条件的载体。较好的是琼脂凝胶、交连葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃微球。最常用琼脂凝胶。
纸上 色谱
纸上色谱源自 19世纪中叶,20世纪初成为毛细管分离法。现代纸上色谱是 1941年提出，
用于氨基酸分离。
固定相一般是纤维素上吸附的水分，流动相为与水互不相溶的有机溶剂；也可以用纸吸附甲酰胺、缓冲溶液作固定相。
操作 试样用点样管点在滤纸一端，纸条直立在密闭槽里，槽底部放有展开溶剂，带有试样的一端浸在展开剂中在毛细作用下展开剂向上展开带动试样中组分向上行。试样中的组分在两相中进行分配而分离开。
当展开剂前沿上升一定高度，取出纸条，风干展开剂，用喷雾器喷上显色剂后被分离组分就显示出色斑。
如果一次分离多个试样，可以用大滤纸点好试样后订成圆筒，直立在展开槽中展开。
点样前可以将滤纸挖成栅栏状，可以避免展开过程中试样横向扩散。
下行法展开是将展开剂放在展开槽上部，滤纸条跨越容器口下垂，展开剂渗入滤纸条后借重力下垂展开。
圆形滤纸展开法 用一圆形滤纸，圆心开一小孔，插如一棉芯或纸芯。在纸芯外用铅笔画同心圆，将 式样点在同心圆圆周上。将圆形滤纸平放在培养皿上。纸芯插入培养皿内的展开剂内。在滤纸上再盖一个同样大小的培养皿。展开后各组分是一系列同心圆。圆形纸色谱法比一般纸色谱法快分离效果好。但是里圆心越远同心圆越大，因此检出灵敏度低。
薄层色谱法
—
淋洗中组分的离子在流动相的作用下离开固定相表面，双电荷平衡破坏。为了维持电中型，对离子对等的离开固定相表面。
极性强的对离子趋向于形成离子键，非极性强的对离子通过动态离子交换的趋势大。
提高反相离子对色谱的分离效能条件非极性键合相键合最大的可以提高组分离子的保留值键合相中碳链长的可以增加固定相的亲脂性使用浓度大的和疏水性强的离子对试剂可以提高组分离子的保留值选择适当的缓冲溶液流动相中有机溶剂与水的配比小的有利于提高离子对的疏水性柱温低一利于分离，提高柱温可以降低组分离子的保留值气相色谱分析实例
气相色谱法测定葡萄中烯唑醇农药的残留量
烯唑醇 (diniconazole)又称力克菌、特普唑，是具有保护和治疗作用的三唑类内吸杀菌剂和甾醇脱甲基化抑制剂，可预防各类作物叶部和穗部病害，
具有广谱杀菌作用。
主要仪器和试剂
Shimadzu GC— 17A气相色谱仪,配备 ECD和 CR2A
数据处理器 。
烯唑醇标准品：纯度＞ 99％ 。
准确称取烯唑醇标准品 O,100 0 g,用少量丙酮溶解后,用正己烷定容至 l00mL,配成 l.00 g/L
的烯唑醇标准储备液 。 再根据检测要求用正己烷稀释成相应的标准工作溶液 。
色谱分析条件色 谱 柱,OV— 170l 石 英 毛 细 管 柱,30
m× O.53mm i.d,× 1,μ m(膜厚 )。
柱温为 220℃,进样口温度为 270℃,检测器温度为 300℃ ；载气为氮气 (99,999％ ),流速
20mL／ min,尾吹 100kPa；
外标法定量；进样量,1μ L。
实验步骤
提取,将葡萄样品用组织捣碎机捣碎,称取均匀试样 5g(精确到 0.0l g)于 30 mL离心管中,
加入 5mL丙酮,在混匀器上混匀 l min,以
2500r／ min的速率离心 3min,将上清液倒人另一 50 mL离心瓶中,残渣用 2× 5mL丙酮处理,合并提取液 。
净化,在提取液中加入 l0 mL 50 g/L硫酸钠水溶液和 7mL正己烷,于混匀器上混匀 l min，
以 2500r／ min的速率离心 3min后,用尖嘴吸管将有机相取到另一试管中,提取液再用
2× 7mL正己烷提取,合并提取液并于 45℃ 空气流下浓缩至近干,用 2mL丙酮 — 正己烷 (体积比为 1,1)溶液溶解残渣 。
将固相萃取小柱自上而下的按 Supelclean EN— VI—
CarbSPE 小柱 (3mL),Supelclean LC— ALUMN—
INA N SPE小柱 (3mL)的顺序串联接好,安装在真空抽滤装置上,用 8mL丙酮 — 正己烷 (体积比为 1,1)
溶液淋洗小柱；然后在固相萃取小柱下放好收集管,
将 2mL样品提取液加到小柱上,再用 4× 2mL丙酮 —
正己烷 (体积比为 1,1)溶液洗涤试管并一起转移至小柱中 。 收集洗脱液 (保持洗脱流速为 2mL／ min)。
将洗脱液于 45℃ 空气流下吹干,用 1,0mL正己烷溶解残渣后进行 GG-ECD测定 。
液相色谱分析实例
中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的反相高效液相色谱法
仪器与药品：
岛律 LC— 10AT泵,SPD— 10Avp阵列二极管检测器,
C1sss— 10Avp5工作站,SIL— 10A自动进样器 。
DWF— 100型电动植物粉碎机； CSF— 1A型超声波发生器； LD5— 2A型离心机； ZFQ— 922型旋转薄膜蒸发器；玻璃层析柱 (25cm× 1,5cm,头尖 )。
涕灭威 (aldicarb),呋喃丹 (carbofuran)和西维因 (carbaryl)农药对照品纯度均大于 99％ 。
三七,白芍,西洋参药材各 3批；当归药材 3
批丙酮 (1000mL加 lg高锰酸钾重蒸馏 ),二氯甲烷 (重蒸馏 ),无水硫酸钠均为分析纯；中性层析用氧化铝 (100— 200目 ),(550℃ 活化 5h，
冷却后,加水使含水量为 3,0％ 减活,加水后振摇至不结块 。
色谱条件
YWG— C18(250 mm× 4.6mm ） 5μL加 YwG—
C18预柱；
柱温：室温；
流动相：乙脂 — 水 (38,62)；流量,1,O
mL/min；
进样量,20μ L；检测波长,200 nm(检测涕灭威,呋喃丹 ),220 nm(检测西维因 ) 按上述色谱条件,
提取 将自然晾干的田七,西洋参,白芍
和当归 (当归切片后再用硅胶干燥 )切片后,用
植物粉碎机粉碎,各取通过 2号筛的样品粉末约
2,0g,精密称定,置 50mL量瓶中 。
加丙酮,超声波振荡提取 3次 (40,20,20 ML),提取时间分别为 30,10。 10min，
合并丙酮提取液,离心 10min(4000r/min),倾其上清液于 250mL圆底烧瓶中,在 40℃ 水浴中减压浓缩至近干,然后用空气轻吹至干 。 即刻用 2％ 氯化钠溶液
30mL分次将残渣完全移至 60mL分液漏斗中用二氯甲烷萃取 5次 (20ml,15mL × 4),每次至少振摇
1min。 萃取液通过装有适量无水硫酸钠的漏斗干燥,
合并二氯甲烷萃取液于 250ml圆底烧瓶中,在 40℃
热水浴中浓缩至 0.5ml,待净化 。
净化
20℃ — 25℃,取玻璃层析柱 (25cm× l,5cm),(下端纫尖,带活塞 ),自下而上依次装填少量棉花,1cm
厚无水硫酸钠,含水 3,0％ 中性氧化铝 10,0g，,
2cm厚无水硫酸钠,轻敲层析柱至填料紧密后,用
1,0％ 丙酮二氯甲烷溶液浸湿后,待液面下降至上层硫酸钠以下时,将上述浓缩液用少量 1,0％ 丙酮二氯甲烷溶液完全转移至层析柱上,并用 1,0％ 丙酮二氯甲烷溶液洗脱,去掉前 10mL,收集 50mL洗脱液 。
洗脱液在 40℃ 水浴中减压浓缩至近干,再用空气轻吹去掉残留溶剂 。
用乙腈 — 水 (1,1)溶液完全转移至 5ml量瓶中,
摇匀,作为供试品溶液 。 按标准品测定条件测定 。 以峰面积定量,按外标计算 。
色谱法（ Cheromatography）是 19世纪俄国植物学家茨维特（ Tsweett）创立的一种分离混合物的技术。
他将植物色素放在一直立的装填有碳酸钙粉末的玻璃管中，然后用石油醚自上而下流下，得到一系列颜色排列的谱带，故称为色谱。
现代色谱已经发展到几乎可以分离任何有色或者无色混合物的水平，但是“色谱”的名称依旧保留。
色谱中重要的概念是“固定相”与“流动相”。
本章介绍几种常见色谱的原理，重点介绍气相色谱分离分析技术。
一般色谱法的分类
一,按照固定相与流动相物态分
气相色谱,GC （ GSC； GLC）
液相色谱,（ LSC； LLC）
超临界流体色谱,（ SFC）
二,按照固定相使用形式分
柱色谱
平面色谱,在平面介质上进行组分分离的技术薄层色谱,（ TLC） 薄层板和薄层棒纸上色谱,（ PC） 圆形纸上色谱按照分离机理分类
1、吸附色谱：混合物被吸附在固定相吸附剂上，流动相先带走吸附力弱的成分。
2、分配色谱：固定相是固定的液体，混合物在两相间分配（相当于萃取），在流动相溶解度大的先带走。
3、离子交换色谱,（ IC）
利用离子交换树脂作固定相分离离子型化合物的色谱法。用高效液相色谱技术和离子交换树脂柱，用含有某种特定离子的水溶液作流动相，在降低流动相背景信号的前提下进行离子分离；或通过调节流动相的 pH值以抑制试样组分的电离，从而分离离子化合物（离子抑制色谱） 。
离子排除色谱（ IEC）
4、利用离子交换树脂对电解质与非电解质的斥力不同而达到分离的色谱法。最常用的是粒径 =15μm 高效凝胶型磺化苯乙烯 /二乙烯苯离子交换树脂（强酸型）。树脂溶涨后在小球中滞留的水是稳定的水相，
小球间是流动的水相。离子交换树脂在两个水相间起半透膜作用。试样中与离子交换树脂的离子带相同电荷的离子被排斥在固定水相之外，弱酸以分子存在被固定水相滞留；非离子组分不被滞留，在两相间进行分配，按照组分与树脂官能团作用力大小不同分开。
离子对色谱与 凝胶色谱
5,（ IPC）在流动相中加入与所要分离的组分相反电荷的离子（称为离子对，即离子试剂），
与组分形成离子对，从而改变组分的保留值和分离度。
6、凝胶色谱：空间排除色谱、分子排除色谱，
分子筛色谱、液体排除色谱、体积排除色谱等
（ GPC），用于大分子分离。生化中水作流动相成为凝胶过滤色谱；合成高聚物中用有机物作流动相成为凝胶渗透色谱。
亲和色谱
亲和色谱,生物体内生物分子之间都具有亲和力，能形成可逆络合物。利用这种可逆络和与解离原理进行色谱分离，即把配基键合在不溶于水的惰性载体上成为亲和物，从而进行提纯的技术。
如酶与基质、抑制剂、变构效应剂或辅酶；激素与细胞受体；维生素与结合蛋白；基团与核酸；抗体与抗原；外源凝集素与红细胞表面的抗原等都具有亲和力。
按照色谱的动力学过程分类
1、洗脱法,组分在固定相和流动性反复的进行分配和再分配，或吸附与解吸。由于各组分的分配系数不同或吸附系数不同而分离。
2、顶替法 （置换法） 直接用流动性作为顶替剂，试样进入色谱柱后被顶替剂置换，而且反复置换达到平衡。利用流动相在在固定相上的溶度或吸附力比试样强，以及试样中各组分的溶度与吸附力差异而分离。
气相色谱 （ GC）
气相色谱是用气体作流动相的色谱技术 。 农药商品分析和农药残留分析一般用气相色谱 。
气相色谱分离原理：
载气 （ 如 N2 ） 通过进样器将样品带往色谱柱进行分离,空气和 H2进入检测器燃烧升温 。
色谱柱和检测器温度由控温仪控制 。 样品经检测后信号进入放大器放大,进入记录仪记录 。
气相色谱法 分类：
气 — 固 （ GSC） 只用于分离低分子物质
气 — 液 （ GLC）
气相色谱的基本概念
死时间 t M,不被吸附成分通过色谱住停留的时间 。
保留时间 t R 被吸附成分通过色谱住停留的时间；
调整保留时间 t’ R = t R - t M
是由于吸附作用比不被吸附成分多停的留时间 。
死体积 VM = tM.F（ 流速 × 时间 ）
保留体积 VR=tR.F
调整保留体积 VR’= t.’RF=VR-VM
相对保留值 α = t’ R（ 2） / t’ R （ 1）
组分 1对组分 2相对保留值气相色谱的基本概念
分配系数 K= Cs/Cm
被分离组分在固相和在流动相的浓度之比 。
色谱区域宽度：组分在色谱柱中谱带扩张函数 。
表示方法：标准偏差 σ 标准偏差 0.607倍峰高处峰宽的一半 。
半峰宽度 Y1/2（ 半宽度,区域宽度 ） 峰高一半处的宽度 。
基线宽度 Y 色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。
Y= 4 σ ； Y1/2 = 2.354σ
分配容量 k=vl/vg 柱内液体所占体积 /柱内气体所占体积。
动力学与热力学因素影响组分分离效果受动力学与热力学因素影响 。
动力学因素：气相扩散与固 （ 液 ） 相传质
热力学因素：相对保留值,反应在该温度下组分在两相分配过程与分配系数 （ 与样品和固定相的结构性质有关 ） 。
A,B两组分分离的必要条件：
1.两组分分配系数必须有差异 。
2.区域扩展的速率小于区域分离速率 。
3.保证快速分离的前提下提供足够长的色谱柱 。
色谱定性、定量分析
定性分析
确定色谱图上每一个峰所代表的物质。在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留值。通过比较以知物与未知物的保留参数可以确定时什么物质。
定量分析
fih fiA分别是峰高和面积校正因子。
对称的峰，用手工测量 AI =1.065 hI Y1/2
不对称的峰 AI =1/2 hI （ Y0.15 +Y0.85） hI
Y0.15 和 Y0.85是峰高 0.15和 0.85出的宽度。
绝对校正因子与相对校正因子
绝对校正因子
指某组分 I通过检测器的量与检测器对 I组分响应信号之比：
fiA = AI / mi； fih = mi / hI
相对校正因子
指某组分 I与基准组分 s的绝对校正因子之比。
fisA = miAs / AI ms ； fish = mi hs / ms hI
一般文献是指相对校正因子。
气象色谱定量分析方法
外标法,
将欲测组分的标准物质配成系列浓度，进行色谱分析，以峰高或面积对浓度作图制作标准曲线，试样进行分析后，在曲线上查得峰面积或峰高后可以求得其百分含量。
内标法
当只须测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，用内标法。
准确称取样品，加入一定量某种物质作为内标，然后进行色谱分析。根据被测物质和内标在色谱图上相应峰面积（或峰高）和相对校正因子求出某组分的含量。
mi /ms = AI fisA / As fssA ； mi = AI fisA ms / As fssA
mi % = （ mi /m） × 100% = （ AI fisAms / As fssA）
归一法
归一是把式样中所有组分得含量之和按 100%
计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下列公式计算各组分含量。
mi % = （ AI fisA /∑ fisA mi） × 100%
或
mi % = （ hI fish /∑ fish mi） × 100%
气相色谱仪结构
1.气路系统：载气 /氢气、氮气、氦气和氩气。气路结构 /减压阀、净化器、稳压阀、压力表、流量计。
2.进样系统：进样器、汽化室。
3.分离系统：色谱柱 /填充柱；内径 2— 4mm，长度
1— 10m。柱形有 U形和螺旋形。螺旋形直径与柱内径之比为 15,1— 25,1。
空心毛细管柱材质为玻璃或石英，内径一般为 0.2—
0.5mm，长度为 30— 300m，螺旋形。色谱柱分离效果与柱长、柱形、柱径、固定相和柱填料制备技术及操作条件有关。
气相色谱仪结构
4.温控系统：用来设定、控制和测量色谱柱炉温、汽化室、检测室得温度。
温度直接影响色谱柱的选择性、分离效果和检测器灵敏度及稳定性。
5.检测系统：检测器将载气中组分转变成易于测量的（电）信号。微分型检测器分为浓度型（热导池、电子捕获检测器器）和质量型（氢火焰离子化检测器）。
检测器性能指标
灵敏度：输入单位被检测物质时引起的输出信号
S=ΔR/Δm。
浓度型,S= Ac 1F 0/c 2 m
其中,A峰面积（ cm2）,c 1为记录器灵敏度
（ mv/cm）,c 2 为记录器走纸速度（ cm/min），
F 0为出口流动相速度（ mL/min）,m为进入检测器的质量。
气体样品 Sg单位为 mv.mL/mL；
液体样品 Sl= 60 Ac 1/c 2 m,Sl单位为 mv.mL/mg,60
是时间分换算成秒的因子。
检测限 D=2RN /S 恰能产生 2倍噪音的信号检测器线性范围用浓度上下限比值表示,107/10=106
检测器种类
热导池检测器（ TCD）：结构简单、性能稳定、线性范围宽。
氢火焰离子化检测器（（ FID）：结构简单灵敏度高、死体积小、响应快、线性范围宽、
稳定性好（永久性气体不产生信号）。
检测器
电子捕获检测器（ ECD）：只对于具有电负性的物质，如含有卤素,S,P,N的物质有响应。 β — 放射源为负极，不锈刚为正极。脉冲电压使 β — 放射源放射 β— 射线，将载气电离出低能电子并且向正极运动形成恒定基流，电负性物质俘获低能电子降低基流，产生负信号 — 倒峰。
火焰光度检测器（ FPD）又叫硫磷检测器，是对含硫、磷有机化合物具有高度选择性和高灵敏度的检测器。
离子交换色谱法
离子交换色谱种类
1、多孔树脂 细网 （凝胶型）和粗网（大孔型）。
前者溶涨后为多孔树脂，孔径大小决定于树脂交连度。常见的是苯乙烯与二乙烯苯共聚物，具有比较细小的空和伸到内部的沟、管道。
优点 具有较高的试样容量；
弱点 孔径小传质慢，柱效低不耐高压，超限后降压也不复原。
大孔树脂孔径不均匀，解决传质慢问题。
2、薄壳树脂 在玻璃微珠（ ≈ 30 μm）的表面形成薄的（ ≈1μm）离子交换树脂层。具有优点 离子只出入表面，树脂不需要较高的交连度，柱效高，分离速率快；可以制备均匀和任意厚度的树脂层；化学组分和树脂交连度没有限制；选用适当玻璃珠可以制备一定粒度范围的薄壳树脂；机械强度好，耐压，
薄壳层不易剥离；可以直接用干树脂填充色谱柱。
弱点 容量低，用灵敏度高的检测器。
3、表面多孔薄壳树脂 在玻璃微珠表面先盖一层较为惰性的树脂层作为载体，然后在比较大的孔（ 80～ 200μm）上沉积交换树脂。
试样容量比薄壳树脂更小，但是表面积对体积比值更高，柱效高，但是强度不如薄壳树脂，有时会脱落。
4、刷子行树脂 在玻璃珠的表面键合刷子型的有机余基，如烷基或芳基，以及引入离子交换基团。由于玻璃微珠表面积小，试样容量小，但可以用有机溶剂做流动相。如果用多孔硅胶代替玻璃微珠，并在引入离子交换基团后进行硅烷化可以增加容量。树脂交换量与硅胶表面积成正比，颗粒小的柱效高，
分离时间短。树脂耐压，流动相成分改变时体积不变。但是硅胶在 pH≥ 8.5时开始溶解，
故不能用于碱性强的溶液作流动相。
1975年 Small提出用电导检测器的离子交换色谱法首次实现了有机和无机阴离子的快速分离检测。用离子交换树脂要有强的渗透性。
不用离子交换树脂的用含己基硫酸盐或辛基硫酸盐的洗脱液动态涂渍的柱子分离阳离子；
辛基或十六烷基季铵盐用于分离阴离子。
经典离子交换色谱在树脂粒度、交换容量、
分离柱内径与长度及分离时间都大于现代离子家换色谱。现代检测手段先进及用泵输送流动相流速稳定等优点。
离子对色谱法
离子对色谱分为正相与反相。
正相是极性大的固定相，采用极性小的流动相，极性小的组分先流出，极性大的组分慢流出。
反相色谱采用疏水型非极性化学键合相，用极性大的流动性。极性大的组分先流出，极性小的组分或流出。如十八烷基硅胶键合相或苯基硅胶键合相，
流动性用低浓度的离子对试剂水溶液或能溶于水的有机溶剂，如甲醇或乙醇等与水组成的混合溶剂。
能够有效的分离有机酸碱和两性化合物，广泛用于分离羧酸、磺酸、酚、胺、季铵盐、氨基酸、多肽、
核酸及其衍生物。
离子对试剂
阳离子型伯铵盐、仲铵盐、叔铵盐、季铵盐阴离子型无机物 卤离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、
高氯酸根离子,硫酸根离子、硝酸根离子。
有机物 甲酸离子、乙酸离子、丙酸根离子、柠檬酸氢根离子、苯甲酸离子、水杨酸根离子、苦味酸离子、硫酸氢酯离子、磺酸根离子等
水是反相离子对色谱法中流动相的主要组成部分，
固定相是非极性键合相，组分与离子对试剂结合后改变组分离子的亲水性或疏水性，改变了保留值。
利用碳链较长的磺酸盐可以增大保留值，利用磷酸二氢根可增大亲水性。
保留值随离子对试剂浓度增大而增大碳链长的离子对试剂由于表面活性剂作用，保留值增大有一个极限值。
流动相的 pH值影响弱电解质的电离平衡,pH值上升，弱酸电离度增大，阴离子浓度增加，与离子对试剂作用增强 。分离两性化合物时，用阴离子对实际必须使两性离子带正电，既流动相的 pH值应该小于它们的等电点；用阳离子对试剂必须使两性离子带负电，即流动相的 pH值应大于它们的等电点。，
反相离子对色谱机理
各种机理
1、与试剂结合后改变了疏水性，影响了在固定相和流动相之间的分配系数，从而改变了色谱行为。
2、疏水型性离子对可逆吸附在非极性固定相表面后与祖坟发生动态离子交换，即形成具有离子交换能力的表层。带相反电荷组分的离子与离子对试剂的平衡离子发生交换。离子对碳链长的组分，交换剂的覆盖面大，保留值长。
3、离子相互作用 非极性固定相的表面先吸附流动相中部分亲脂性的带正或负电荷的离子对形成第一正、或负电层。为了维持电中性外面吸附了相反电荷的其它离子，形成第二相反电荷层。
固定相的表面吸附带负或正电荷的组分离子使第一层增加负、或正电荷。为了维持电中性，就从流动相中拉入带相反电荷的离子，结果离子被成对的吸附在固定相表面上，但不是形成离子对。因为各种组分的离子与过渡性表面的疏水作用和双电层的静电引力不同因而表现不同的保留值。
凝胶色谱
凝胶色谱法是一种化学惰性的高度多孔的非离子型凝胶小球作为固定相。
特点
分离原理 分子筛原理，大分子先流出、小分子依次流出。
凝胶色谱法适宜于分离非离子型的，分子量大于
2000的高分子化合物
天然高分子化合物，如蛋白质、核酸可以很好的被分离
一般式样可以用娘叫渗透色谱法进行试分离，一了界试样的复杂程度和分子量的分布范围
色谱峰容量小，不能分离分子量近似或相同的物质凝胶色谱固定相
固定相的要求
在 pH值很宽的范围内是化学惰性。
本身中性，不含可离解基团。
分离过程不发生离子交换。
溶涨度受交连度影响，交连度越低溶涨度越大，对大分子渗透性越强。
机械强度要好，否则使用过程变形，增大阻力，减少流速以至阻塞。
固定相种类
葡聚糖凝胶
Sephadex G 蔗糖经微生物发酵后制成的有葡萄糖残基构成的分子量大的聚合物。经提纯后用盐酸降解为分子量平均为 104～ 20× 104
葡聚糖。用乙醇分级沉淀，在碱性溶液中与环氧氯丙烷，生成由甘油交连的葡聚糖醚的不溶性三维强亲水结构。
G后面的数字表示没 10kg干葡聚糖凝胶溶涨吸水量
如 Sephadex G— 200表示 1g干凝胶吸水
20mL左右。
Sephadex G系列可以经受高温消毒，对水、
盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸都稳定。强酸型醚键水解。长时间与氧化剂接触骨架会破坏。
Sephadex G的分级方法是用微球直径表示。
适用于水、甲醇,DMSO作流动相。主要用于分离蛋白质、核酸、酶和多糖。分离范围从 1000以下到 8× 105，固流比 0.8～ 1.8，不能承受压力
Sephadex LH— 20,LH表示亲脂溶剂和亲水溶剂均能溶涨。可以分离不溶于水的的物质。
聚丙烯酰胺凝胶
由丙烯酰胺与 N,N’ — 亚甲基双丙烯酰胺共聚而成。后者为交连剂。交连剂的比例越大，
产品的孔径越小。商品名 Bio— Gel P。加水自然溶涨,P后的数字乘 1000表示肽与蛋白质的排除极限。
性质与 Sephadex G很相似，可以不被微生物腐蚀，耐酸碱性不如前者。
吸水量与 Sephadex G有近似值。
规格划分较细。
甲基丙烯酸聚乙二醇凝胶
甲基丙烯酸单酯与双甲基乙二醇酯共聚物。
改变配比可以改变孔径、比表面积和羟基官能团数目。商品名 Spheron,各种型号。具有良好的化学稳定性与机械强度，可以在高流速下使用，溶涨后体积变化小。内部结构是大网状干凝胶和气溶胶的混合物。
琼脂糖凝胶
琼脂糖是由 1,3 — 连接的 β — 吡喃半乳糖残基和 3，
6 — 脱水,α — 半乳糖 1,4 — 交替交连而成，糖链呈双螺旋状，链间有氢键连系，纵横交错成多孔状结构。
商品名 Sepharose和 Bio — Gel A等，制成微球。前者一溶涨状态，悬浮在 0.02℅的叠氮化钠（防腐剂）
溶液中，后者悬浮在 0.02℅的叠氮化钠的 0.001mol/L
三羟甲基氨基甲烷和 EDTA中，一充分水合形式供应。
不能脱水干燥，否则不能复原。
分级范围相同是可以代替 Sephadex G和 Bio— Gel
P，不可用于破坏氢键的物质。
其它凝胶
小孔球形硅胶渗盐后高温焙烧而成。化学惰性、热稳定性、机械强度好。使用温度高、
使用寿命长。粗粒多孔硅胶的柱效比交连聚苯乙烯凝胶的低。微粒多孔硅胶是高效高速凝胶，多孔硅胶平均力度为 10～ 200nm，排除极限为 10～ 106。
多孔玻璃珠 商品有 Bioglass系列和 CPG
[controlled pore glass控孔玻璃 ]系列。特点是孔径均匀，孔径不受流动相的化学性质、
pH值和离子强度影响不被微生物腐蚀、机械强度好、高压高速使用以及可以用热硝酸清洗,500℃ 蒸汽消毒。
交连聚苯乙烯凝胶 苯乙烯与二乙烯苯共聚物。适宜于凝胶渗透色谱用。商品 Poragel的微孔尺寸很小，排除极限分子量是 14000。
大孔交连聚苯乙烯凝胶 Styragel和 Bio— Bead
SM系列是大孔干凝胶和气溶胶混合体，具有良好的色谱特性，化学稳定性和机械强度，
溶涨后体积变化很小。除丙酮和乙醇等强极性溶剂外，其它有机溶剂均可以作流动相。
另有大空聚苯乙烯凝胶是将凝胶骨架磺化到一定程度，商品名 Aquapak,可以用水作流动相，但是有离子交换作用，影响凝胶色谱特性，可用离子强度高的液体作流动相可以消除影响。
聚乙二醇凝胶
商品名 Fractogel PGM 2000,对分离亲脂性和亲水性的物质都有用。
丙烯酰胺 /琼脂糖凝胶
商品名 Ultrogel 是颗粒坚硬的微球，在水中溶涨，机械强度好。
亲和色谱法
基本原理 被提纯物质与载体形成亲和物，
然后用不同 pH值的淋洗液洗脱。亲和十分牢固的大分子用强酸、强碱洗脱。洗脱后迅速中和稀释、透析，恢复大分子的天然活性。
也可以加入特种配基将结合牢固的配基置换出来。
特点 简单快速回收率高，一次可以将粗品纯化千百倍。
用于提纯蛋白质、酶、酶抑制剂、抗体、抗原、基因、激素、核酸等。
制备亲和物载体的条件
均匀、有一定硬度、不溶解于水；
易为大分子渗透的多孔网状结构；
具有相当数量可以供交连的基团；
没有吸附性；
有足够的化学稳定性；
不受微生物腐蚀或酶解。
摸前还没有完全满足以上条件的载体。较好的是琼脂凝胶、交连葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃微球。最常用琼脂凝胶。
纸上 色谱
纸上色谱源自 19世纪中叶,20世纪初成为毛细管分离法。现代纸上色谱是 1941年提出，
用于氨基酸分离。
固定相一般是纤维素上吸附的水分，流动相为与水互不相溶的有机溶剂；也可以用纸吸附甲酰胺、缓冲溶液作固定相。
操作 试样用点样管点在滤纸一端，纸条直立在密闭槽里，槽底部放有展开溶剂，带有试样的一端浸在展开剂中在毛细作用下展开剂向上展开带动试样中组分向上行。试样中的组分在两相中进行分配而分离开。
当展开剂前沿上升一定高度，取出纸条，风干展开剂，用喷雾器喷上显色剂后被分离组分就显示出色斑。
如果一次分离多个试样，可以用大滤纸点好试样后订成圆筒，直立在展开槽中展开。
点样前可以将滤纸挖成栅栏状，可以避免展开过程中试样横向扩散。
下行法展开是将展开剂放在展开槽上部，滤纸条跨越容器口下垂，展开剂渗入滤纸条后借重力下垂展开。
圆形滤纸展开法 用一圆形滤纸，圆心开一小孔，插如一棉芯或纸芯。在纸芯外用铅笔画同心圆，将 式样点在同心圆圆周上。将圆形滤纸平放在培养皿上。纸芯插入培养皿内的展开剂内。在滤纸上再盖一个同样大小的培养皿。展开后各组分是一系列同心圆。圆形纸色谱法比一般纸色谱法快分离效果好。但是里圆心越远同心圆越大，因此检出灵敏度低。
薄层色谱法
—
淋洗中组分的离子在流动相的作用下离开固定相表面，双电荷平衡破坏。为了维持电中型，对离子对等的离开固定相表面。
极性强的对离子趋向于形成离子键，非极性强的对离子通过动态离子交换的趋势大。
提高反相离子对色谱的分离效能条件非极性键合相键合最大的可以提高组分离子的保留值键合相中碳链长的可以增加固定相的亲脂性使用浓度大的和疏水性强的离子对试剂可以提高组分离子的保留值选择适当的缓冲溶液流动相中有机溶剂与水的配比小的有利于提高离子对的疏水性柱温低一利于分离，提高柱温可以降低组分离子的保留值气相色谱分析实例
气相色谱法测定葡萄中烯唑醇农药的残留量
烯唑醇 (diniconazole)又称力克菌、特普唑，是具有保护和治疗作用的三唑类内吸杀菌剂和甾醇脱甲基化抑制剂，可预防各类作物叶部和穗部病害，
具有广谱杀菌作用。
主要仪器和试剂
Shimadzu GC— 17A气相色谱仪,配备 ECD和 CR2A
数据处理器 。
烯唑醇标准品：纯度＞ 99％ 。
准确称取烯唑醇标准品 O,100 0 g,用少量丙酮溶解后,用正己烷定容至 l00mL,配成 l.00 g/L
的烯唑醇标准储备液 。 再根据检测要求用正己烷稀释成相应的标准工作溶液 。
色谱分析条件色 谱 柱,OV— 170l 石 英 毛 细 管 柱,30
m× O.53mm i.d,× 1,μ m(膜厚 )。
柱温为 220℃,进样口温度为 270℃,检测器温度为 300℃ ；载气为氮气 (99,999％ ),流速
20mL／ min,尾吹 100kPa；
外标法定量；进样量,1μ L。
实验步骤
提取,将葡萄样品用组织捣碎机捣碎,称取均匀试样 5g(精确到 0.0l g)于 30 mL离心管中,
加入 5mL丙酮,在混匀器上混匀 l min,以
2500r／ min的速率离心 3min,将上清液倒人另一 50 mL离心瓶中,残渣用 2× 5mL丙酮处理,合并提取液 。
净化,在提取液中加入 l0 mL 50 g/L硫酸钠水溶液和 7mL正己烷,于混匀器上混匀 l min，
以 2500r／ min的速率离心 3min后,用尖嘴吸管将有机相取到另一试管中,提取液再用
2× 7mL正己烷提取,合并提取液并于 45℃ 空气流下浓缩至近干,用 2mL丙酮 — 正己烷 (体积比为 1,1)溶液溶解残渣 。
将固相萃取小柱自上而下的按 Supelclean EN— VI—
CarbSPE 小柱 (3mL),Supelclean LC— ALUMN—
INA N SPE小柱 (3mL)的顺序串联接好,安装在真空抽滤装置上,用 8mL丙酮 — 正己烷 (体积比为 1,1)
溶液淋洗小柱；然后在固相萃取小柱下放好收集管,
将 2mL样品提取液加到小柱上,再用 4× 2mL丙酮 —
正己烷 (体积比为 1,1)溶液洗涤试管并一起转移至小柱中 。 收集洗脱液 (保持洗脱流速为 2mL／ min)。
将洗脱液于 45℃ 空气流下吹干,用 1,0mL正己烷溶解残渣后进行 GG-ECD测定 。
液相色谱分析实例
中药材中氨基甲酸酯类农药残留量的反相高效液相色谱法
仪器与药品：
岛律 LC— 10AT泵,SPD— 10Avp阵列二极管检测器,
C1sss— 10Avp5工作站,SIL— 10A自动进样器 。
DWF— 100型电动植物粉碎机； CSF— 1A型超声波发生器； LD5— 2A型离心机； ZFQ— 922型旋转薄膜蒸发器；玻璃层析柱 (25cm× 1,5cm,头尖 )。
涕灭威 (aldicarb),呋喃丹 (carbofuran)和西维因 (carbaryl)农药对照品纯度均大于 99％ 。
三七,白芍,西洋参药材各 3批；当归药材 3
批丙酮 (1000mL加 lg高锰酸钾重蒸馏 ),二氯甲烷 (重蒸馏 ),无水硫酸钠均为分析纯；中性层析用氧化铝 (100— 200目 ),(550℃ 活化 5h，
冷却后,加水使含水量为 3,0％ 减活,加水后振摇至不结块 。
色谱条件
YWG— C18(250 mm× 4.6mm ） 5μL加 YwG—
C18预柱；
柱温：室温；
流动相：乙脂 — 水 (38,62)；流量,1,O
mL/min；
进样量,20μ L；检测波长,200 nm(检测涕灭威,呋喃丹 ),220 nm(检测西维因 ) 按上述色谱条件,
提取 将自然晾干的田七,西洋参,白芍
和当归 (当归切片后再用硅胶干燥 )切片后,用
植物粉碎机粉碎,各取通过 2号筛的样品粉末约
2,0g,精密称定,置 50mL量瓶中 。
加丙酮,超声波振荡提取 3次 (40,20,20 ML),提取时间分别为 30,10。 10min，
合并丙酮提取液,离心 10min(4000r/min),倾其上清液于 250mL圆底烧瓶中,在 40℃ 水浴中减压浓缩至近干,然后用空气轻吹至干 。 即刻用 2％ 氯化钠溶液
30mL分次将残渣完全移至 60mL分液漏斗中用二氯甲烷萃取 5次 (20ml,15mL × 4),每次至少振摇
1min。 萃取液通过装有适量无水硫酸钠的漏斗干燥,
合并二氯甲烷萃取液于 250ml圆底烧瓶中,在 40℃
热水浴中浓缩至 0.5ml,待净化 。
净化
20℃ — 25℃,取玻璃层析柱 (25cm× l,5cm),(下端纫尖,带活塞 ),自下而上依次装填少量棉花,1cm
厚无水硫酸钠,含水 3,0％ 中性氧化铝 10,0g，,
2cm厚无水硫酸钠,轻敲层析柱至填料紧密后,用
1,0％ 丙酮二氯甲烷溶液浸湿后,待液面下降至上层硫酸钠以下时,将上述浓缩液用少量 1,0％ 丙酮二氯甲烷溶液完全转移至层析柱上,并用 1,0％ 丙酮二氯甲烷溶液洗脱,去掉前 10mL,收集 50mL洗脱液 。
洗脱液在 40℃ 水浴中减压浓缩至近干,再用空气轻吹去掉残留溶剂 。
用乙腈 — 水 (1,1)溶液完全转移至 5ml量瓶中,
摇匀,作为供试品溶液 。 按标准品测定条件测定 。 以峰面积定量,按外标计算 。
