薄层分析、酶抑制技术和荧光技术
薄层分析,酶抑制技术和荧光技术都是基于薄层展开后用不同的现色方法进行显色分析的技术 。 其中薄层的制备,展开和显色技术是该分析方法的基础 。
薄层技术
薄层色谱法是把固定相 （ 活性吸附剂或键合剂 ） 均匀的铺在一块平整的板上,制成薄板 。
厚度约 0.25mm。 与纸上色谱法一样,点样经展开剂展开 。
特点：操作简单,效果比纸上色谱法要好 。
显色后斑点集中并且可以定量分析 （ 与薄层扫描仪配套 ） 。
试样量少,几微克到几百微克 。
可以为高效液相色谱选择合适的固定相 。
近代薄层色谱发展的类别简介
薄层板法 （ 略 ）
圆筒色谱 （ 管状色谱 ） 法 将固定相涂渍在管的外壁上,可以减少横向扩散,宜于制备色谱用 。
如果为小孔径管就为色谱棒 。
锥形薄层色谱法 将薄层板制作成倒圆锥体。展开时可以使溶剂前沿扩大，展开剂向前沿扩散时形成速度梯度，结果抵消了谱带扩展，使试样再度浓缩。
径向薄层色谱法
两种类型：一种与圆形纸上色谱方法相似,分离效果可以提高 1.5倍；另一种是将普通薄层板点样处固定相刮去,使展开剂只能通过点样处狭窄部分向前方弧形展开 。
连续展开法
在密闭槽中进行上行展开,
展开剂移动一定距离后即终了 。
顶板蒸发展开
用盖带有槽孔的展开槽，使部分薄层板露出槽外。
展开时，槽里的展开剂不能蒸发，当上升到槽外时就蒸发。这种展开法能够缩短展开剂移动满的斑点之间的距离，不能够提高分离效能。
开口槽展开法
薄层板在没有上盖的展开槽中展开 。 展开过程中展开剂随时可以蒸发 。 越往上蒸发越快 。 当展开剂到达一定高度时,上行展开剂与蒸发展开剂速率相等,此时形成了负的速度梯度,提高了移动慢的组分的分离度,而降低了移动快的组分的分离度 。
热板展开法
在薄层板的背面用热块加热 。 在高分离度区域加热,形成溶剂速度梯度和溶剂极性梯度,
从而改善分离度并可使斑点高度浓缩,提高痕量组分的检测灵敏度 。
连续展开是分离结构相似的多组分的有效方法 。 为了防止蒸发时色谱条件受槽外条件影响和展开剂污染空气,可以用在薄板顶端加吸附剂 （ 多层滤纸 ） 吸附展开剂的方法 。
梯度展开法与双向展开法
梯度展开法
展开过程中不断按照一定比例改变展开剂中溶剂的组成 。
这种方法有时能够提高分离效果,特别是反相薄层色谱中常用 。
双向展开法
将试样点在薄层板的一角,先沿一个方向展开 。 取出薄层板,干燥后旋转 90 o,然后再用同一种展开剂或换另一种展开剂沿另一方向展开 。 使前一次展开后的重叠斑点得以分离 。
双向展开法特点
双向展开法还可以用以检测对光、热、酸、
碱不稳定的组分。试样斑点经第一次展开后用光照或加热或用酸碱处理，旋转 90 o，再用相同的展开剂在相同条件下展开，凡是在对角线上的斑点都是稳定的，凡是不在对角线上的点都是分解产物或反应产物。
多次展开法
试样经一次展开不能的到很好的分离结果时,
是薄层板上的溶剂挥发后重新用展开剂展开 。
如此反复多次,直到有满意分离结果为止 。
单向或双向多次展开
同一种展开剂单向或双向多次展开，反复展开时由于后沿比前沿移动快，可以使散开的斑点合拢，提高检测灵敏度。用两种或两种以上不同的展开剂分别进行多次展开，可以将不同的的组分分开，称为阶梯式展开或多极展开。
薄层色谱分析方法
薄层色谱主要用于定性分析，重要的指标是
Rf i 。
Rf i=xi /Y
Xi：溶质 i从点样点所行距离；
Y：溶剂所行距离
Rf影响因素：溶剂极性，吸附剂活度，薄层厚度，层析缸中溶剂蒸汽饱和度，空气湿度。
固相选择：如前所述。
操作,制板、晾干、活化、点样、展开、显色 （计算 Rf）
溶剂（展开剂）选择
溶剂（展开剂）选择：略。
一般情况下用用混合溶剂剂调节极性。
弱极性溶剂：石油醚、烃、卤烃
中等极性：乙醚、丙酮、醇，
强极性,水，吡啶 酸
商品农药和已知种类的残留农药一般都选定了薄层条件。
25种常见有机磷农药展开系统吸附剂 /展开剂
1.硅胶 /：甲苯
2.硅胶 /乙酸乙酯与 CH2Cl2(1:1)
3.硅胶 /己烷－丙酮（ 4,1）
4.聚酰胺 /己烷－丙酮（ 4,1）
5.聚酰胺 /己烷－醋酸（ 19,1）
6.聚酰胺 /甲醇－水（ 1,1）
7.聚酰胺 /乙醇－水－氨水（ 4,4,2）
聚酰胺薄板制备与展开实例
1g吸附剂加入 50mL带磨口塞的三角瓶中，再依次加入 2mL甲醇,1mLCHCl3和 2mL乙酸乙酯。每加一种溶剂充分振摇，使十分均匀。
取待涂片放在大玻璃片上，排一条。两边放等厚玻片下垫厚片（厚度与薄层同）将浆倒在装好的玻璃片上，用玻璃棒推均匀。通风干燥后可用。
展开注意事项（色谱过程）
点样后一定要使溶剂挥发至干；缸内蒸汽一定要饱和，二次展开一定要将薄板晾干后再展开。
薄层分析的显色的一般要求
显色要求
显色，少干扰或易排除
物质组成恒定，符合一定化学式，待测物含量与色斑大小、的深浅有定量灵敏度好高，检出限量足够小。
有色物要足够稳定
显色条件
显色尽可能完成，可以加入过量显色剂
酸度调节
适宜温度
显色时间要求短几种显色记剂及显色方法
显色：不同显色剂有不同显色法
色谱分析关键措施之一是显色显色剂 被显色物质 显 色 方 法 色 斑
AgNO3/NH3 有机 Cl.Br 1.0ml1MagNO3+5mol/L
NH3－丙酮 185ml。 灰或棕日光或紫外光照 5min
PdCl2 含硫有机物 0.1gPdCl2+1MH2SO4
5ml.溶解后 +100ml H2O,黄色
I2 多数农药 加热固体碘，使汽化熏薄板 5－ 10min。 黄色荧光硅胶 有紫外吸收农药 GF254,HF254制版，
展开后挥发干溶剂，
紫外照射下观察 紫色斑
AgNO3显色方法应用实例
亦有涂板时将 AgNO3深入吸附剂内。
方法 1：
0.1 g AgNO3溶于 20mL苯氧乙醇，加丙酮至
200mL,加 3%H2O2于暗处保存。喷到板上后紫外照 10min。浅棕色背景上有紫斑。检出限量 0.05ug－ 0.1ug。
方法 2：
0.17g AgNO3+1mLH2O+5mL浓 NH3·H 2O
使用方法及色斑同上，
检出极限 0.05ug— 0.1ug
AgNO3显色方法与原理
方法 3：
1g AgNO3+1mL水 +95%乙醇至 100mL，喷薄板。
检出极限 0.05ug。
显色原理,农药中的 -x与 Ag+在吸附表面，紫外照射下生成 Ag3 Cl2·AgCl·nAg2Cl和
AgClO,Ag ;Ag2O,AgCl
苯氧乙醇作用：加速 AgNO3 与 R-X的反应。
H2O2防背景过深，紫外加速 AgCl分解，亦可加速农药分解，故可以先照薄板 10-15min后再喷 AgNO3，
再照 2-3min。此法特点是显色快，防背景变黑。
NH3水和苯氧乙醇同用效果更好芳香胺显色法
六种芳胺可以用于薄层显色：
N,N-二甲苯胺,对苯二胺,联苯胺,联
（邻甲苯胺）,二苯胺,乙基苯胺。
在硅胶板上喷 10%联苯胺 /丙酮后 经日光或紫外照射显色。
芳香胺显色其不足之处是灵敏度不高，色调不稳，只作定性或半定量分析。
芳胺显色的结果农 药种类检出限量 /μ g
0.02— 0.2 0.2— 2.5 2.5 — 10
DDE 无色 浅土黄 深土黄
DDT 黄色 绿黄 叶绿
DDD 无色 弱棕 明棕林丹 浅蓝 鲜蓝 深蓝芳胺显色的结果农药种类检出限量 /μ g
0.02— 0.2 0.2— 2.5 2.5— 10
艾氏剂 无色 极弱黄绿 浅黄绿异狄氏剂无色 极弱粉红 粉红六六六 极浅蓝 鲜蓝 深蓝克菌丹 极浅酒瓶绿 鲜酒瓶绿 深酒瓶绿一般显色剂的不足
一般显色剂对同类农药缺乏选择性。
例：硫代磷酸酯用 pH（刚果红）指示剂显色机理是硫元素被氧化剂氧化成硫酸或水解成硫代磷酸而显色。
显色灵敏性 二硫代 >硫醇型 >硫酮型
不含硫的农药不显色常用 PH指示剂显色种类及颜色
刚果红； 3.0（蓝） ———— 5.2（红）
溴酚蓝,3.1（黄） ———— 4.6（蓝）
溴甲酚绿,4.0（黄） ——— 5.6（蓝 )
4-对硝基苄基吡啶作显色剂
4-对硝基苄基吡啶是灵敏的烃化剂在一定 PH
条件下显色 。 其显色机理如下：
兰色
N CH 2 N
+
O -
O P
O
O
O X
R
R P
O
O
O
R
R
N + CH 2 N
+
O -
O
P
O
O
O
R
R
N + CH 2 N +
O -
O
OH -
P
O
O
O
R
R
N CH N +
O -
O
其它显色法
四乙撑五胺或吗啉在控制一定酸度下使平衡向有色物方向移动。
HgNO3(亚汞 )-NH3显色法中，含硫有机水解成活性 S,生成 HgS和 Hg，显黑斑，显色中辅助试剂不可少
NH 2 N H N H N H N H 2
常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量
（ ug ）
农药种类柠檬酸 /硝酸亚汞 /氨黑色 浅灰 0.02—
0.03
含 S的磷酸酯苯氧乙醇 /
硝酸银 /氨黑色 浅灰 0.02—
0.1
有机氯二苯胺 /氯化锌绿 /橙 /紫 蓝 5— 20 有机氯磷酸酯常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量
（ ug ）
农药种类溴 /刚果红 蓝 红 0.2— 0.5 含 S的磷酸酯
NBP四乙撑五胺蓝 白 0.2— 0.5 磷酸酯（二嗪红色）
溴 /溴酚蓝 黄 蓝 0.1— 0.5 含 S的磷酸酯四溴苯酚磺酸乙酯 /硝酸银蓝紫 黄 0.05—
1.0
含 S的磷酸酯常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量
（ ug ）
农药邻联苯胺 /
碘化钾黄绿蓝 白 0.2— 0.5 有机氯、有机氟对硝基偶氮氟硼酸盐蓝紫 橙 0.01— 10 磷酸酯 /氨基甲酸酯双硫腙 黄红 浅绿 0.02 有机汞二氯化钯 蓝 /黄 /褐 白 0,5— 3.0 含 S,P氯的酯类化合物常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量（ ug ）
农药
N— 2,6 — 二氯 —
对苯并醌亚胺蓝 无 微克级 氨基甲酸酯氨基安替比林 /铁氰化钾红 紫 /
黄微克级 氨基甲酸酯磷酸 /鞣酸 /丙酮 洋红 无 1.0 天然除虫菊酯其它显色剂：碘蒸汽；硝酸银 /溴甲酚绿；氯亚明丁；
亮绿；孔雀绿；二氯醌亚胺；邻 — 联二茴香胺；靛红 /
硫酸等显色剂（法）。
薄层 -酶抑制技术
薄层 -酶抑制技术是薄层显色技术的特殊方法。
特点：灵敏度高，适应性广，可以检出化学显色检不出的物质
显色原理：有机磷与氨基甲酸酯农药对辅乳动物毒性在于抑制中枢和周围神经系统胆碱酯酶。
胆碱酯酶分解乙酰胆碱和醋酸，其它酯类也会水解成显色物质。而农药所在之处，由于胆碱酯酶被抑止则基质物质不能水解显色，
所以在有色背景上出现无色斑点。故酶抑制技术实际上是酶水解基质显色而非农药显色。
酶种来源
1,动物肝脏酯酶
2,人血浆或血清
3,马血清或黄鳝胆碱酯酶
4,蜜蜂或蝇头的脑酯酶
5,牛胰腺酵素或酸性磷酸酯酶
6,动物羧酸酯酶酶基质
各种乙酰胆碱,乙酸萘酯,羧酸酯,乙酰羟基吲哚等
1,乙酸羟基吲哚及其衍生物
2,乙酸 α -萘酯及其衍生物
3,卤化乙酰胆碱
4,乙酸靛酯
5,磷酸硝基苯酯
6,α -N-苯甲酰基 -DL赖氨酸 -对硝基苯胺盐酸盐 （ CBAPNA） 只适用于胰酶乙酰胆碱 -溴百里酚蓝显色法
显色原理,乙酰胆碱被酶分解出胆碱与乙酸,
然后用溴百里酚蓝显色； pH6.2（ 黄色 ） ——
7.6（ 兰色 ） 。 反应方程式如下：
CH 3
O
O
N
+
C H 3
C H 3
CH 3
CH 3
O
O H
OH
N
+
C H 3
C H 3
CH 3
+
乙酸 -β -萘酯固蓝 B盐显色法
酶分解出 β -萘酚与固蓝盐 B显紫红色
乙酰羟基吲哚显色法
利用水解产生 β -羟基吲哚与氧气产生靛蓝
（ 蓝底白斑 ） 。
O C H 3OCH 3
N 2
+
N 2
+
Z n C l
2 -
N
H
O H
N
H
O
N
H
O
醋酸靛酯显色法
利用醋酸靛酯水解产生靛酚蓝显色。
靛酚蓝（兰色）
C H
3
O
N
O
O
OH
2
CH
3
O
O H
N
O
O H
+
TCL-EI技术基质显色情况酶 机 质 斑点 底色乙酸 -β -萘酯固蓝 B盐 白 紫红吲哚乙酸酯 白 蓝
5— 溴吲哚乙酸酯 白 蓝 /紫红
5— 溴 — 6— 氯吲哚乙酸酯 白 粉红乙酰胆碱 +溴百里酚蓝 蓝 黄
TCL-EI技术基质显色情况酶 机 质 斑点 底色
5— 溴 — 4— 氯吲哚乙酸酯 白 蓝绿吲哚酚 +固蓝 RR 白 粉红
5— 溴 — 4— 氯吲哚乙酸酯 +固蓝 RR
白 粉红酶液制备
从动物肝制取酶液
动物肝 一份 3(去筋膜 ;脂 )加三份蒸馏水,匀浆离心分离,取清液 -备用,用时 5-20倍稀释 。
从动物 血清制取酶液
刚抽出马血,不加抗凝剂练凝,取清液备用 。
用时加 1-5倍水稀释 (保质 1年 )。 将清液加如
22% Na2SO4 溶液 (1:22),于 37℃ 静置 24小时,
去沉降,可以延长储存期,还可 改善斑点模糊的情况 。
机质及显色剂
基质
1,乙酸萘脂 10mg 溶于 5-6 mL无水乙醇
2,乙酸羟基吲哚 15mg溶于 5 mL无水乙醇 (或
20mg加 2mL 无水乙醇,用时加 8mLPH=9.4的硼酸液混合 ).
3,乙酸 靛酯 1.5 mg溶于 15mL无水乙醇,
显色剂,20-25mg固蓝盐 B溶于 16mL蒸馏水
1.65gK3Fe(CN)6 +1.84 g K4Fe(CN)6溶于 100mL
蒸馏水
缓冲溶液,0.2M三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 25
mL+20mL0.1MHCl蒸馏水至 100mL (pH=8.32).
显色方法展开后的薄板,喷酶工作液至湿润状态,调恒温箱温度 37-38℃ 相对湿度 80-90%,酶 活化
30分钟,取出喷基质,数十分钟显色衬斑,
酶液与基质液配比
酶,鼠肝酯酶或马血清工作液,B盐 16mL与酯液 6mL 混合 — 乙酸萘酯固盐 B显色法,
乙酸羟基吲哚 — 牛肝酯酶或马血清工作液
Tris/HCl 4 mL +2mol/LNaCl5mL
+1mol/LCaCl2 0.2mL +K3Fe(CN)6 与
K4Fe(CN)6 2 mL +蒸馏水 13mL+5mL乙酸羟基吲哚或乙酸靛酯混合。
基质应用条件乙酸 — 5—— 溴羟基吲哚基质
动物肝酶与 Tris/HCl 1:8稀释成工作液
对多种氨基甲酸酯农药检出限量为 0.1-10毫微克,
乙酸 靛 酯基质
基质 15mL与 K3Fe(CN)6 与 K4Fe(CN)6 2 5mL混合
蜜蜂脑酶与 Tris/HCl 1:25混合
牛肝酯酶和胰酶素用于 TCL-E1检测有机氯农药,许多酶抑制剂在生物体内是弱作用,有时转化成它们的氧化类同物可能有强抑制作用,可能足够的抑制能力,
酶抑制剂转化剂和薄层厚度
发烟 HNO3，
稀溴 /水,溴蒸汽,溴代琥珀酰亚胺 (NBS)，
双氧水 /乙酸,间氯过氧苯甲酸,
紫外光,双氧水 /氨 。
酶抑制剂的薄层比一般薄层厚一些,一般为
350-500 毫微米,为酶基质提供较充分的支持介质,可获得低色与抑制斑较强的反差 。
酶浓度过大或过多会覆盖抑制部分,会使斑点被显色物所盖,
薄层荧光分析技术
荧光产生原理
荧光,一个电子从最低激发单线态回到基态时发射的光子 。 其 放出量子的能量低于吸收量子的能量 。
薄 层 原位荧光测定技术中以近紫外和可见光作激发光,荧光侧在可见光区 。
农药测定技术中可以用以下方法：
1,薄 层 背景猝灭,斑点荧光 ；
2,背景荧光,斑点 猝 灭 。
物质结构与荧光的关系
一般刚性,平面 芳香结构有利于发生荧光 ;
给电子基，如 -OH,-NH2 倾向于增强荧光,
空间张力和吸电子基使荧光 熄灭或减弱,可旋转弯曲的分子有 损于 受激能量 。
有些农药分子本身具备荧光特性,有些要经过处理才有荧光。
农药预处理方法
本身不产生荧光的农药分子经过化学反应，
使之转变成产生荧光的分子。
水解使农药生成荧光离子或化合物,。如羟基苯并 吡喃 (蝇毒磷 )；
含氨基苯甲酸 (谷硫磷 )。
2-氨基苯并咪唑 (苯莱特 )N-羟基萘甲酰胺。
西维因及其代谢物水解成萘酚阴离子。
配位基基交换产生荧光
配位基基交换产生荧光是指农药水解产物与金属配合物反应,交换出金属鳌合物中可以产生荧光的配体阴离子 。
如脱叶磷水解产生丁硫醇,丁硫醇可以把 8—
羟基 喹啉 磺酸的 钯 螯合物中的 8 羟基 喹啉 交换出来,而显荧光 (在氯化镁存在下 )。
含 硫 有机磷化合物经 溴活化 处理生成 溴化氢,
溴化氢 置换 螯合物中配体而显荧光 。
钙黄绿素金属鳌合物与某些农药配基交换 。
影响荧光的因素
吸附剂上的溶剂可以显著影响荧光强度和波长 。 极性溶剂比烃类溶剂更能增强荧光 。
如 5— 无 取代的黄 酮,在非极性溶剂中无荧光,
而在极性溶剂中强荧光 。
在薄层上喷上非瑟酮,能在弱荧光或非荧光底板上显农药光斑 。 用于氨基甲酸酯极性农药最小检出限量为 10-60微克,
PH值和温度对荧光的影响
PH值改变往往使荧光明显改变 。 如含硫有机物磷农药经 Br2 处理,产生 HBr,在农药斑点的酸性条件下,喷上 DDQ (2,3-二氯 -5，
6-二氰基对苯醌 )的中性溶液,在农药斑的酸性条件下 DDQ强烈发荧光 。
热处理,某些原有荧光的农药经热处理,使荧光激发和发射峰显著向长波方向移动 。 并增加强度,其结果是使检出限量更小 。 如 2-
（ 2— 吡喃 ） -苯并咪唑,在薄 层 上加热处理后最小检出限量从 1000微克提高到 2微克,
荧光标记
荧光标记是荧光试剂取代无荧光农药分子中一个简单原子,形成有荧光化合物的过程 。
许多含羰基官能团的农药,通常用 2-（ 二 苯乙酰 ） -1，
3-茚满二酮 -1-腙和 2-羟 -5-甲氧基苯甲酰肼或 5-甲氧基 -2-硝基水杨酰肼标记 。
用于标记含羰基农药分子的荧光试剂
N
NH 2
O
O
C 6 H 5
H 5 C 6
O H
O
C H 3
O
NH
N H 2
NO 2
O
C H 3
O
NH
N H 2
O H
含伯仲叔胺的农药的荧光标记
经还原或水解生成伯仲叔胺的农药一般用 DS氯化物,
NBD氯化物（ 4-氯 -7-硝基 -2-1,3-恶二唑）和荧光胺等标记形成了强荧光衍生物 。
如甲氨基酸脂农药水解产物酚和甲胺,苯胺基甲酰脂和取代脲除草剂产生苯胺等,荧光胺只与伯胺产生衍生物 。
SO 2 Cl
N
CH 3
CH 3
Cl N
+
O
-
O
NH N H
O
标记伯、仲、叔胺农药分子的荧光试剂荧光显色技术 实例
氯化钯 — 钙黄叶绿素显色：农药斑显色法
适用范围：含硫有机磷农药
原理：在盐酸介质中 Pd2+与二硫代或硫代物型磷酸分别形成 1:1型或者 1,2型螯合物,在白色薄底上现黄褐斑,
检测出限量 为 微克级 。
加钙黄绿素和钙黄绿素蓝,金属荧光试剂所发荧光可被副族金属离子 猝 灭 。 猝 灭的荧光试剂喷于活性硫的农药斑上 。 游离出钙黄绿素,荧光很强,检出限量可达 10-150毫克级,
试剂配制
取 PdCl2 溶 于 浓 盐 酸 配 成 5 % 的 溶 液,用
0.1MHCl稀释成 0.05mol/L(PdCl2 MW=177.31)。
取一定的钙黄绿素 (MW=622.54),用 0.1mol/L
NaOH配成 0.02M溶液,
取 两 溶 液 按 一 定 比 例 混 合,加 入 数 滴
5 mol/LNaOH溶液,用 0,05mol/L的 H3PO4调至
pH=7.2,并稀释成 2.0× 10-4 mol/LPd2+和 1.6×
10-4mol/L钙黄绿素,或 6.0× 10-4 mol/L钙黄绿素 。
贮存数小时,可保最大 猝 灭 。 临 用前用 1:1丙酮和水稀释成工作液 。
工作液的浓度要求
工作液的浓度要求如下,
1.0× 10-4 mol/LPd2+和 8.0× 10-5mol/L钙黄绿素
5.0× 10-5mol/LPd2+和 4.0× 10-5mol/L钙黄绿素
1.0× 10-4mol/LPd2+和 3.0× 10-4mol/L钙黄绿素
显色,上述工作液喷展开后的薄板呈透明状,
二硫代磷酸酯干后一小时可在紫外光下检出 。
硫代磷酸酯的薄板放在存饱和硝酸钙溶液的密闭容器中 (相对湿度 57%)18-24小时,或在洁净的空气中同样长的时间,用 3650nm 照射，
粉红底上出现蓝色荧光。
荧光显色剂与罗丹明 B显色法
不同的荧光物质中具有 N-甲基和 N-乙基者，
对有机氮显色快,灵敏度大,Cl-干扰小,如：
N,N,N`,N`— 四乙基联苯胺； N,N`—
二甲基荧光蒽； N— 甲基咔唑,3— 氨基芘；
罗丹明 B和试卤灵。 O H
O
C O O H
N
N C H
3
C H
3
CH
3
CH
3
罗丹明 B溶液的配制
取罗丹明 B50mg溶于 50ml 水作为储备液。使用时取储备液 10mL,加于含 0.3gKBr和
0.6gKOH的 80 mL水中，喷于展开后的薄板上。置薄板于 254— 350nm下照 10— 30min，
趁薄板上有一定温度时观察，紫外背景上有黄红荧光，而农药斑点处荧光猝灭 。
板干后再喷丙酮 /水（ 1,1），荧光再现。
此显色液一天有效。
罗丹明显色 (对有机氯较灵敏 )
A溶液,25 mg罗丹明 B溶于于 25ml 水中备用 。,
B溶液,取 A溶液 5 ml与含 0.15 KBr 和 0.3g
KOH的 40 ml水溶液混合得 。
C溶液,B溶液与 丙酮混合液 (1:1)
显色,展上喷 B液后在 250或 350nm紫外光 照 1-
30分钟,底板红荧光,斑点猝灭 。 干后再喷 C
液,斑点再现 。 有机氯农药可检出至 20微克 。
薄 色谱定量方法简介
原位斑点定量法有直接法与间接法 。
直接法,面积,色阶,工作曲线 。
间接法,色谱扫描仪与光密度计 。
溶出定量：与光度计,光谱,气谱,液谱,
质谱,极谱联用 。
称重法,将色斑标记,在 Xe 或 X复写机获得色谱斑复本,剪下斑点纸片,在分析天平称重 ； 或把色谱斑吸附剂剥下称重 。 沿半对数纸的横坐标对农药称量 (纵坐标 )作图,绘制工作曲线以斑点重查典线得样品农药重,
色谱色阶比色法
将标准系列与待测样的一定量点在同一薄 层板 上展开显色 。 依面积大小,色度 深浅 概括样品定量 。 此法实际上只是半定量 。
溶出 1法,将斑点剥离后用溶剂浸出,经适当处理,配合仪器联用 。 此法实际上是只用薄 层 分离提纯 。
含磷农药浸出后用 硫酸 /高氯酸 变成 磷酸 。 然后与 钼酸铵作用生成磷 钼 酸 。
PO43- + 12MoO42- + 27H+ = H7P（ Mo2O7） 6 +10H2O
磷钼酸还原成磷钼酸蓝：
H7P（ Mo2O7） 6 + 2 SnCl2 + 4HCl=
H7P（ Mo2O7） 5 + Mo2O5+ SnCl4 + 2H2O
分析过程
取下有机磷药斑于离心试管中,加如少量丙酮或甲酸浸出,离心分离,反复三次 。 合并浸取液,挥发溶剂,加 50% 硫酸 6滴,4滴高氨酸 。 小心加热至澄清,加 1滴酚酞,NaOH中和至微红,1mol/L的硫酸中和至无色,得样品液 。
称取 KH2PO40.4394g,少量蒸馏水溶解后定容至
100mL,取 10ml 稀释至 100mL,得含磷 10μg的工作液 。 加 1%的 （ NH4） 2MoO4/1mol/L硫酸 3mL,加水至
10mL,摇匀后加一滴 SnCl2/HCl,再摇匀用 650nm波长测吸光度 A。 如此制作工作曲线,用样品液照工作液方法处理得 A样,从而查出样品农药含量 （ μg/
mL） 。
农药含量计算与影响因素
农药含量 = 含磷量 （ μg ） × k × 提取液体积 /
点样体积 × 样重
注意,用农药标准样代替 KH2PO4时 误差较小
反应时的酸度 (生成钼蓝时 )0.48—— 1.44mol/LH+
薄 层 吸附剂含 P有干扰用盐酸浸泡含吸附剂,反复漂洗 ;Fe3+ 与钼蓝形成混合物,降低吸光度,可以加
NaF消除 。
SiO32-与钼酸铵形成黄色 H9Si（ Mo2O7） 6还原时也生成硅钼蓝,可以用柠檬酸或酒石酸来 -控制 MoO42浓度从而达到控制 MoO42-与 SiO32-作用 ； AsO43-与
MoO42-作用可用 Na2SO3除去 。
斑点面积计算法,
色斑面积计算法主要是依 S.T Purdg原理：
A1/2 = mlgw + C
其中 A为斑点面积,C为常数,m为待定系数,w为农药质量 。
对每种农药定量线性范围应由多次实验测出,
对于农药标准品,A1/2s = mlgws + C
对于稀释农药的标准品：
A1/2d = mlgwd + C。 d为稀释倍数。
常数 m,c的确定联立两方程，解出 m,c。
m = （ A1/2s － A1/2d ） /（ lgws － lgwd ）
m = （ A1/2s － A1/2d ） /lg（ ws/wd）
分析式样,A1/2 = mlgw + C
A1/2 = A1/2s + （ lgw－ lgws ）×（ A1/2s － A1/2d ）
/（ lgws - lgwd ）
lgw = （ lgws － lgwd ） × （ A1/2 － A1/2s ） /
（ A1/2s － A1/2d ） + lgws
lgw = lgd × （ A1/2 － A1/2s ） / （ A1/2s － A1/2d ）
+ lgws
薄层色谱扫描定量法
对已分离的斑点类似于分光光度法,只 是扫描测定在薄层上进行 。
其准确度 受吸附剂粒度,形状,厚度,显色条件,斑点大小,边缘清晰度的影响 。
扫描测定时,光束射到一个非匀相表面,散射光作用使光电倍增管作用的消光值与被测物质含量不符合 Lambert-Beer定律 。 为此在一般扫描仪中 （ 岛津 -910型双波段扫描仪 ） 设计了一系列如双波段,曲线扫描,校正曲线直线法,背景校正等技术 。 使测定达预期效果 。
扫描光波选择
1.对可见光有吸收的斑点直接用可见光扫描 。
2.对紫外光有吸收的斑点,直接用紫外光扫 。
3.具有激发荧光的物质,直接用发射荧光扫
4,上述均没有的,化学处理 （ 显色 ） 后扫
此法分两步：
1,按薄层色谱要求和程序处理,分离显色后直接上机扫
2,配制待测标准系列,与待测样相同条件下展开,分离显色后扫描测定,作校正仪器用 。
薄层扫描仪工作流程
流程：光源 光路系统 检测光电信号 前置放大 背景校正 曲线校正 放大 模拟积分 记录仪或计算机
操作：将待测薄层置于工作台,使斑点处于被扫描测定位置
接通线性化仪和背景补偿仪 。 随扫描进行,记录器纸上将被扫描斑点对应波峰和积分值图象用打印机打出；配有 ETA色谱仪数值处理仪,扫描结束 。 打印出农药实际含量,且精确性高,重现性好 。 CS110
扫描仪对同一样品连续扫 60次,误差只有 0.5%。 对分离后图形不规则,边缘不清晰的点,扫描定量,
可以得满意结果 。
一般 20× 20cm板上十多个点,10分钟可完成 。
薄层分析,酶抑制技术和荧光技术都是基于薄层展开后用不同的现色方法进行显色分析的技术 。 其中薄层的制备,展开和显色技术是该分析方法的基础 。
薄层技术
薄层色谱法是把固定相 （ 活性吸附剂或键合剂 ） 均匀的铺在一块平整的板上,制成薄板 。
厚度约 0.25mm。 与纸上色谱法一样,点样经展开剂展开 。
特点：操作简单,效果比纸上色谱法要好 。
显色后斑点集中并且可以定量分析 （ 与薄层扫描仪配套 ） 。
试样量少,几微克到几百微克 。
可以为高效液相色谱选择合适的固定相 。
近代薄层色谱发展的类别简介
薄层板法 （ 略 ）
圆筒色谱 （ 管状色谱 ） 法 将固定相涂渍在管的外壁上,可以减少横向扩散,宜于制备色谱用 。
如果为小孔径管就为色谱棒 。
锥形薄层色谱法 将薄层板制作成倒圆锥体。展开时可以使溶剂前沿扩大，展开剂向前沿扩散时形成速度梯度，结果抵消了谱带扩展，使试样再度浓缩。
径向薄层色谱法
两种类型：一种与圆形纸上色谱方法相似,分离效果可以提高 1.5倍；另一种是将普通薄层板点样处固定相刮去,使展开剂只能通过点样处狭窄部分向前方弧形展开 。
连续展开法
在密闭槽中进行上行展开,
展开剂移动一定距离后即终了 。
顶板蒸发展开
用盖带有槽孔的展开槽，使部分薄层板露出槽外。
展开时，槽里的展开剂不能蒸发，当上升到槽外时就蒸发。这种展开法能够缩短展开剂移动满的斑点之间的距离，不能够提高分离效能。
开口槽展开法
薄层板在没有上盖的展开槽中展开 。 展开过程中展开剂随时可以蒸发 。 越往上蒸发越快 。 当展开剂到达一定高度时,上行展开剂与蒸发展开剂速率相等,此时形成了负的速度梯度,提高了移动慢的组分的分离度,而降低了移动快的组分的分离度 。
热板展开法
在薄层板的背面用热块加热 。 在高分离度区域加热,形成溶剂速度梯度和溶剂极性梯度,
从而改善分离度并可使斑点高度浓缩,提高痕量组分的检测灵敏度 。
连续展开是分离结构相似的多组分的有效方法 。 为了防止蒸发时色谱条件受槽外条件影响和展开剂污染空气,可以用在薄板顶端加吸附剂 （ 多层滤纸 ） 吸附展开剂的方法 。
梯度展开法与双向展开法
梯度展开法
展开过程中不断按照一定比例改变展开剂中溶剂的组成 。
这种方法有时能够提高分离效果,特别是反相薄层色谱中常用 。
双向展开法
将试样点在薄层板的一角,先沿一个方向展开 。 取出薄层板,干燥后旋转 90 o,然后再用同一种展开剂或换另一种展开剂沿另一方向展开 。 使前一次展开后的重叠斑点得以分离 。
双向展开法特点
双向展开法还可以用以检测对光、热、酸、
碱不稳定的组分。试样斑点经第一次展开后用光照或加热或用酸碱处理，旋转 90 o，再用相同的展开剂在相同条件下展开，凡是在对角线上的斑点都是稳定的，凡是不在对角线上的点都是分解产物或反应产物。
多次展开法
试样经一次展开不能的到很好的分离结果时,
是薄层板上的溶剂挥发后重新用展开剂展开 。
如此反复多次,直到有满意分离结果为止 。
单向或双向多次展开
同一种展开剂单向或双向多次展开，反复展开时由于后沿比前沿移动快，可以使散开的斑点合拢，提高检测灵敏度。用两种或两种以上不同的展开剂分别进行多次展开，可以将不同的的组分分开，称为阶梯式展开或多极展开。
薄层色谱分析方法
薄层色谱主要用于定性分析，重要的指标是
Rf i 。
Rf i=xi /Y
Xi：溶质 i从点样点所行距离；
Y：溶剂所行距离
Rf影响因素：溶剂极性，吸附剂活度，薄层厚度，层析缸中溶剂蒸汽饱和度，空气湿度。
固相选择：如前所述。
操作,制板、晾干、活化、点样、展开、显色 （计算 Rf）
溶剂（展开剂）选择
溶剂（展开剂）选择：略。
一般情况下用用混合溶剂剂调节极性。
弱极性溶剂：石油醚、烃、卤烃
中等极性：乙醚、丙酮、醇，
强极性,水，吡啶 酸
商品农药和已知种类的残留农药一般都选定了薄层条件。
25种常见有机磷农药展开系统吸附剂 /展开剂
1.硅胶 /：甲苯
2.硅胶 /乙酸乙酯与 CH2Cl2(1:1)
3.硅胶 /己烷－丙酮（ 4,1）
4.聚酰胺 /己烷－丙酮（ 4,1）
5.聚酰胺 /己烷－醋酸（ 19,1）
6.聚酰胺 /甲醇－水（ 1,1）
7.聚酰胺 /乙醇－水－氨水（ 4,4,2）
聚酰胺薄板制备与展开实例
1g吸附剂加入 50mL带磨口塞的三角瓶中，再依次加入 2mL甲醇,1mLCHCl3和 2mL乙酸乙酯。每加一种溶剂充分振摇，使十分均匀。
取待涂片放在大玻璃片上，排一条。两边放等厚玻片下垫厚片（厚度与薄层同）将浆倒在装好的玻璃片上，用玻璃棒推均匀。通风干燥后可用。
展开注意事项（色谱过程）
点样后一定要使溶剂挥发至干；缸内蒸汽一定要饱和，二次展开一定要将薄板晾干后再展开。
薄层分析的显色的一般要求
显色要求
显色，少干扰或易排除
物质组成恒定，符合一定化学式，待测物含量与色斑大小、的深浅有定量灵敏度好高，检出限量足够小。
有色物要足够稳定
显色条件
显色尽可能完成，可以加入过量显色剂
酸度调节
适宜温度
显色时间要求短几种显色记剂及显色方法
显色：不同显色剂有不同显色法
色谱分析关键措施之一是显色显色剂 被显色物质 显 色 方 法 色 斑
AgNO3/NH3 有机 Cl.Br 1.0ml1MagNO3+5mol/L
NH3－丙酮 185ml。 灰或棕日光或紫外光照 5min
PdCl2 含硫有机物 0.1gPdCl2+1MH2SO4
5ml.溶解后 +100ml H2O,黄色
I2 多数农药 加热固体碘，使汽化熏薄板 5－ 10min。 黄色荧光硅胶 有紫外吸收农药 GF254,HF254制版，
展开后挥发干溶剂，
紫外照射下观察 紫色斑
AgNO3显色方法应用实例
亦有涂板时将 AgNO3深入吸附剂内。
方法 1：
0.1 g AgNO3溶于 20mL苯氧乙醇，加丙酮至
200mL,加 3%H2O2于暗处保存。喷到板上后紫外照 10min。浅棕色背景上有紫斑。检出限量 0.05ug－ 0.1ug。
方法 2：
0.17g AgNO3+1mLH2O+5mL浓 NH3·H 2O
使用方法及色斑同上，
检出极限 0.05ug— 0.1ug
AgNO3显色方法与原理
方法 3：
1g AgNO3+1mL水 +95%乙醇至 100mL，喷薄板。
检出极限 0.05ug。
显色原理,农药中的 -x与 Ag+在吸附表面，紫外照射下生成 Ag3 Cl2·AgCl·nAg2Cl和
AgClO,Ag ;Ag2O,AgCl
苯氧乙醇作用：加速 AgNO3 与 R-X的反应。
H2O2防背景过深，紫外加速 AgCl分解，亦可加速农药分解，故可以先照薄板 10-15min后再喷 AgNO3，
再照 2-3min。此法特点是显色快，防背景变黑。
NH3水和苯氧乙醇同用效果更好芳香胺显色法
六种芳胺可以用于薄层显色：
N,N-二甲苯胺,对苯二胺,联苯胺,联
（邻甲苯胺）,二苯胺,乙基苯胺。
在硅胶板上喷 10%联苯胺 /丙酮后 经日光或紫外照射显色。
芳香胺显色其不足之处是灵敏度不高，色调不稳，只作定性或半定量分析。
芳胺显色的结果农 药种类检出限量 /μ g
0.02— 0.2 0.2— 2.5 2.5 — 10
DDE 无色 浅土黄 深土黄
DDT 黄色 绿黄 叶绿
DDD 无色 弱棕 明棕林丹 浅蓝 鲜蓝 深蓝芳胺显色的结果农药种类检出限量 /μ g
0.02— 0.2 0.2— 2.5 2.5— 10
艾氏剂 无色 极弱黄绿 浅黄绿异狄氏剂无色 极弱粉红 粉红六六六 极浅蓝 鲜蓝 深蓝克菌丹 极浅酒瓶绿 鲜酒瓶绿 深酒瓶绿一般显色剂的不足
一般显色剂对同类农药缺乏选择性。
例：硫代磷酸酯用 pH（刚果红）指示剂显色机理是硫元素被氧化剂氧化成硫酸或水解成硫代磷酸而显色。
显色灵敏性 二硫代 >硫醇型 >硫酮型
不含硫的农药不显色常用 PH指示剂显色种类及颜色
刚果红； 3.0（蓝） ———— 5.2（红）
溴酚蓝,3.1（黄） ———— 4.6（蓝）
溴甲酚绿,4.0（黄） ——— 5.6（蓝 )
4-对硝基苄基吡啶作显色剂
4-对硝基苄基吡啶是灵敏的烃化剂在一定 PH
条件下显色 。 其显色机理如下：
兰色
N CH 2 N
+
O -
O P
O
O
O X
R
R P
O
O
O
R
R
N + CH 2 N
+
O -
O
P
O
O
O
R
R
N + CH 2 N +
O -
O
OH -
P
O
O
O
R
R
N CH N +
O -
O
其它显色法
四乙撑五胺或吗啉在控制一定酸度下使平衡向有色物方向移动。
HgNO3(亚汞 )-NH3显色法中，含硫有机水解成活性 S,生成 HgS和 Hg，显黑斑，显色中辅助试剂不可少
NH 2 N H N H N H N H 2
常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量
（ ug ）
农药种类柠檬酸 /硝酸亚汞 /氨黑色 浅灰 0.02—
0.03
含 S的磷酸酯苯氧乙醇 /
硝酸银 /氨黑色 浅灰 0.02—
0.1
有机氯二苯胺 /氯化锌绿 /橙 /紫 蓝 5— 20 有机氯磷酸酯常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量
（ ug ）
农药种类溴 /刚果红 蓝 红 0.2— 0.5 含 S的磷酸酯
NBP四乙撑五胺蓝 白 0.2— 0.5 磷酸酯（二嗪红色）
溴 /溴酚蓝 黄 蓝 0.1— 0.5 含 S的磷酸酯四溴苯酚磺酸乙酯 /硝酸银蓝紫 黄 0.05—
1.0
含 S的磷酸酯常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量
（ ug ）
农药邻联苯胺 /
碘化钾黄绿蓝 白 0.2— 0.5 有机氯、有机氟对硝基偶氮氟硼酸盐蓝紫 橙 0.01— 10 磷酸酯 /氨基甲酸酯双硫腙 黄红 浅绿 0.02 有机汞二氯化钯 蓝 /黄 /褐 白 0,5— 3.0 含 S,P氯的酯类化合物常见薄层显色法灵敏度及其范围指示剂 斑点 底色 检出限量（ ug ）
农药
N— 2,6 — 二氯 —
对苯并醌亚胺蓝 无 微克级 氨基甲酸酯氨基安替比林 /铁氰化钾红 紫 /
黄微克级 氨基甲酸酯磷酸 /鞣酸 /丙酮 洋红 无 1.0 天然除虫菊酯其它显色剂：碘蒸汽；硝酸银 /溴甲酚绿；氯亚明丁；
亮绿；孔雀绿；二氯醌亚胺；邻 — 联二茴香胺；靛红 /
硫酸等显色剂（法）。
薄层 -酶抑制技术
薄层 -酶抑制技术是薄层显色技术的特殊方法。
特点：灵敏度高，适应性广，可以检出化学显色检不出的物质
显色原理：有机磷与氨基甲酸酯农药对辅乳动物毒性在于抑制中枢和周围神经系统胆碱酯酶。
胆碱酯酶分解乙酰胆碱和醋酸，其它酯类也会水解成显色物质。而农药所在之处，由于胆碱酯酶被抑止则基质物质不能水解显色，
所以在有色背景上出现无色斑点。故酶抑制技术实际上是酶水解基质显色而非农药显色。
酶种来源
1,动物肝脏酯酶
2,人血浆或血清
3,马血清或黄鳝胆碱酯酶
4,蜜蜂或蝇头的脑酯酶
5,牛胰腺酵素或酸性磷酸酯酶
6,动物羧酸酯酶酶基质
各种乙酰胆碱,乙酸萘酯,羧酸酯,乙酰羟基吲哚等
1,乙酸羟基吲哚及其衍生物
2,乙酸 α -萘酯及其衍生物
3,卤化乙酰胆碱
4,乙酸靛酯
5,磷酸硝基苯酯
6,α -N-苯甲酰基 -DL赖氨酸 -对硝基苯胺盐酸盐 （ CBAPNA） 只适用于胰酶乙酰胆碱 -溴百里酚蓝显色法
显色原理,乙酰胆碱被酶分解出胆碱与乙酸,
然后用溴百里酚蓝显色； pH6.2（ 黄色 ） ——
7.6（ 兰色 ） 。 反应方程式如下：
CH 3
O
O
N
+
C H 3
C H 3
CH 3
CH 3
O
O H
OH
N
+
C H 3
C H 3
CH 3
+
乙酸 -β -萘酯固蓝 B盐显色法
酶分解出 β -萘酚与固蓝盐 B显紫红色
乙酰羟基吲哚显色法
利用水解产生 β -羟基吲哚与氧气产生靛蓝
（ 蓝底白斑 ） 。
O C H 3OCH 3
N 2
+
N 2
+
Z n C l
2 -
N
H
O H
N
H
O
N
H
O
醋酸靛酯显色法
利用醋酸靛酯水解产生靛酚蓝显色。
靛酚蓝（兰色）
C H
3
O
N
O
O
OH
2
CH
3
O
O H
N
O
O H
+
TCL-EI技术基质显色情况酶 机 质 斑点 底色乙酸 -β -萘酯固蓝 B盐 白 紫红吲哚乙酸酯 白 蓝
5— 溴吲哚乙酸酯 白 蓝 /紫红
5— 溴 — 6— 氯吲哚乙酸酯 白 粉红乙酰胆碱 +溴百里酚蓝 蓝 黄
TCL-EI技术基质显色情况酶 机 质 斑点 底色
5— 溴 — 4— 氯吲哚乙酸酯 白 蓝绿吲哚酚 +固蓝 RR 白 粉红
5— 溴 — 4— 氯吲哚乙酸酯 +固蓝 RR
白 粉红酶液制备
从动物肝制取酶液
动物肝 一份 3(去筋膜 ;脂 )加三份蒸馏水,匀浆离心分离,取清液 -备用,用时 5-20倍稀释 。
从动物 血清制取酶液
刚抽出马血,不加抗凝剂练凝,取清液备用 。
用时加 1-5倍水稀释 (保质 1年 )。 将清液加如
22% Na2SO4 溶液 (1:22),于 37℃ 静置 24小时,
去沉降,可以延长储存期,还可 改善斑点模糊的情况 。
机质及显色剂
基质
1,乙酸萘脂 10mg 溶于 5-6 mL无水乙醇
2,乙酸羟基吲哚 15mg溶于 5 mL无水乙醇 (或
20mg加 2mL 无水乙醇,用时加 8mLPH=9.4的硼酸液混合 ).
3,乙酸 靛酯 1.5 mg溶于 15mL无水乙醇,
显色剂,20-25mg固蓝盐 B溶于 16mL蒸馏水
1.65gK3Fe(CN)6 +1.84 g K4Fe(CN)6溶于 100mL
蒸馏水
缓冲溶液,0.2M三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 25
mL+20mL0.1MHCl蒸馏水至 100mL (pH=8.32).
显色方法展开后的薄板,喷酶工作液至湿润状态,调恒温箱温度 37-38℃ 相对湿度 80-90%,酶 活化
30分钟,取出喷基质,数十分钟显色衬斑,
酶液与基质液配比
酶,鼠肝酯酶或马血清工作液,B盐 16mL与酯液 6mL 混合 — 乙酸萘酯固盐 B显色法,
乙酸羟基吲哚 — 牛肝酯酶或马血清工作液
Tris/HCl 4 mL +2mol/LNaCl5mL
+1mol/LCaCl2 0.2mL +K3Fe(CN)6 与
K4Fe(CN)6 2 mL +蒸馏水 13mL+5mL乙酸羟基吲哚或乙酸靛酯混合。
基质应用条件乙酸 — 5—— 溴羟基吲哚基质
动物肝酶与 Tris/HCl 1:8稀释成工作液
对多种氨基甲酸酯农药检出限量为 0.1-10毫微克,
乙酸 靛 酯基质
基质 15mL与 K3Fe(CN)6 与 K4Fe(CN)6 2 5mL混合
蜜蜂脑酶与 Tris/HCl 1:25混合
牛肝酯酶和胰酶素用于 TCL-E1检测有机氯农药,许多酶抑制剂在生物体内是弱作用,有时转化成它们的氧化类同物可能有强抑制作用,可能足够的抑制能力,
酶抑制剂转化剂和薄层厚度
发烟 HNO3，
稀溴 /水,溴蒸汽,溴代琥珀酰亚胺 (NBS)，
双氧水 /乙酸,间氯过氧苯甲酸,
紫外光,双氧水 /氨 。
酶抑制剂的薄层比一般薄层厚一些,一般为
350-500 毫微米,为酶基质提供较充分的支持介质,可获得低色与抑制斑较强的反差 。
酶浓度过大或过多会覆盖抑制部分,会使斑点被显色物所盖,
薄层荧光分析技术
荧光产生原理
荧光,一个电子从最低激发单线态回到基态时发射的光子 。 其 放出量子的能量低于吸收量子的能量 。
薄 层 原位荧光测定技术中以近紫外和可见光作激发光,荧光侧在可见光区 。
农药测定技术中可以用以下方法：
1,薄 层 背景猝灭,斑点荧光 ；
2,背景荧光,斑点 猝 灭 。
物质结构与荧光的关系
一般刚性,平面 芳香结构有利于发生荧光 ;
给电子基，如 -OH,-NH2 倾向于增强荧光,
空间张力和吸电子基使荧光 熄灭或减弱,可旋转弯曲的分子有 损于 受激能量 。
有些农药分子本身具备荧光特性,有些要经过处理才有荧光。
农药预处理方法
本身不产生荧光的农药分子经过化学反应，
使之转变成产生荧光的分子。
水解使农药生成荧光离子或化合物,。如羟基苯并 吡喃 (蝇毒磷 )；
含氨基苯甲酸 (谷硫磷 )。
2-氨基苯并咪唑 (苯莱特 )N-羟基萘甲酰胺。
西维因及其代谢物水解成萘酚阴离子。
配位基基交换产生荧光
配位基基交换产生荧光是指农药水解产物与金属配合物反应,交换出金属鳌合物中可以产生荧光的配体阴离子 。
如脱叶磷水解产生丁硫醇,丁硫醇可以把 8—
羟基 喹啉 磺酸的 钯 螯合物中的 8 羟基 喹啉 交换出来,而显荧光 (在氯化镁存在下 )。
含 硫 有机磷化合物经 溴活化 处理生成 溴化氢,
溴化氢 置换 螯合物中配体而显荧光 。
钙黄绿素金属鳌合物与某些农药配基交换 。
影响荧光的因素
吸附剂上的溶剂可以显著影响荧光强度和波长 。 极性溶剂比烃类溶剂更能增强荧光 。
如 5— 无 取代的黄 酮,在非极性溶剂中无荧光,
而在极性溶剂中强荧光 。
在薄层上喷上非瑟酮,能在弱荧光或非荧光底板上显农药光斑 。 用于氨基甲酸酯极性农药最小检出限量为 10-60微克,
PH值和温度对荧光的影响
PH值改变往往使荧光明显改变 。 如含硫有机物磷农药经 Br2 处理,产生 HBr,在农药斑点的酸性条件下,喷上 DDQ (2,3-二氯 -5，
6-二氰基对苯醌 )的中性溶液,在农药斑的酸性条件下 DDQ强烈发荧光 。
热处理,某些原有荧光的农药经热处理,使荧光激发和发射峰显著向长波方向移动 。 并增加强度,其结果是使检出限量更小 。 如 2-
（ 2— 吡喃 ） -苯并咪唑,在薄 层 上加热处理后最小检出限量从 1000微克提高到 2微克,
荧光标记
荧光标记是荧光试剂取代无荧光农药分子中一个简单原子,形成有荧光化合物的过程 。
许多含羰基官能团的农药,通常用 2-（ 二 苯乙酰 ） -1，
3-茚满二酮 -1-腙和 2-羟 -5-甲氧基苯甲酰肼或 5-甲氧基 -2-硝基水杨酰肼标记 。
用于标记含羰基农药分子的荧光试剂
N
NH 2
O
O
C 6 H 5
H 5 C 6
O H
O
C H 3
O
NH
N H 2
NO 2
O
C H 3
O
NH
N H 2
O H
含伯仲叔胺的农药的荧光标记
经还原或水解生成伯仲叔胺的农药一般用 DS氯化物,
NBD氯化物（ 4-氯 -7-硝基 -2-1,3-恶二唑）和荧光胺等标记形成了强荧光衍生物 。
如甲氨基酸脂农药水解产物酚和甲胺,苯胺基甲酰脂和取代脲除草剂产生苯胺等,荧光胺只与伯胺产生衍生物 。
SO 2 Cl
N
CH 3
CH 3
Cl N
+
O
-
O
NH N H
O
标记伯、仲、叔胺农药分子的荧光试剂荧光显色技术 实例
氯化钯 — 钙黄叶绿素显色：农药斑显色法
适用范围：含硫有机磷农药
原理：在盐酸介质中 Pd2+与二硫代或硫代物型磷酸分别形成 1:1型或者 1,2型螯合物,在白色薄底上现黄褐斑,
检测出限量 为 微克级 。
加钙黄绿素和钙黄绿素蓝,金属荧光试剂所发荧光可被副族金属离子 猝 灭 。 猝 灭的荧光试剂喷于活性硫的农药斑上 。 游离出钙黄绿素,荧光很强,检出限量可达 10-150毫克级,
试剂配制
取 PdCl2 溶 于 浓 盐 酸 配 成 5 % 的 溶 液,用
0.1MHCl稀释成 0.05mol/L(PdCl2 MW=177.31)。
取一定的钙黄绿素 (MW=622.54),用 0.1mol/L
NaOH配成 0.02M溶液,
取 两 溶 液 按 一 定 比 例 混 合,加 入 数 滴
5 mol/LNaOH溶液,用 0,05mol/L的 H3PO4调至
pH=7.2,并稀释成 2.0× 10-4 mol/LPd2+和 1.6×
10-4mol/L钙黄绿素,或 6.0× 10-4 mol/L钙黄绿素 。
贮存数小时,可保最大 猝 灭 。 临 用前用 1:1丙酮和水稀释成工作液 。
工作液的浓度要求
工作液的浓度要求如下,
1.0× 10-4 mol/LPd2+和 8.0× 10-5mol/L钙黄绿素
5.0× 10-5mol/LPd2+和 4.0× 10-5mol/L钙黄绿素
1.0× 10-4mol/LPd2+和 3.0× 10-4mol/L钙黄绿素
显色,上述工作液喷展开后的薄板呈透明状,
二硫代磷酸酯干后一小时可在紫外光下检出 。
硫代磷酸酯的薄板放在存饱和硝酸钙溶液的密闭容器中 (相对湿度 57%)18-24小时,或在洁净的空气中同样长的时间,用 3650nm 照射，
粉红底上出现蓝色荧光。
荧光显色剂与罗丹明 B显色法
不同的荧光物质中具有 N-甲基和 N-乙基者，
对有机氮显色快,灵敏度大,Cl-干扰小,如：
N,N,N`,N`— 四乙基联苯胺； N,N`—
二甲基荧光蒽； N— 甲基咔唑,3— 氨基芘；
罗丹明 B和试卤灵。 O H
O
C O O H
N
N C H
3
C H
3
CH
3
CH
3
罗丹明 B溶液的配制
取罗丹明 B50mg溶于 50ml 水作为储备液。使用时取储备液 10mL,加于含 0.3gKBr和
0.6gKOH的 80 mL水中，喷于展开后的薄板上。置薄板于 254— 350nm下照 10— 30min，
趁薄板上有一定温度时观察，紫外背景上有黄红荧光，而农药斑点处荧光猝灭 。
板干后再喷丙酮 /水（ 1,1），荧光再现。
此显色液一天有效。
罗丹明显色 (对有机氯较灵敏 )
A溶液,25 mg罗丹明 B溶于于 25ml 水中备用 。,
B溶液,取 A溶液 5 ml与含 0.15 KBr 和 0.3g
KOH的 40 ml水溶液混合得 。
C溶液,B溶液与 丙酮混合液 (1:1)
显色,展上喷 B液后在 250或 350nm紫外光 照 1-
30分钟,底板红荧光,斑点猝灭 。 干后再喷 C
液,斑点再现 。 有机氯农药可检出至 20微克 。
薄 色谱定量方法简介
原位斑点定量法有直接法与间接法 。
直接法,面积,色阶,工作曲线 。
间接法,色谱扫描仪与光密度计 。
溶出定量：与光度计,光谱,气谱,液谱,
质谱,极谱联用 。
称重法,将色斑标记,在 Xe 或 X复写机获得色谱斑复本,剪下斑点纸片,在分析天平称重 ； 或把色谱斑吸附剂剥下称重 。 沿半对数纸的横坐标对农药称量 (纵坐标 )作图,绘制工作曲线以斑点重查典线得样品农药重,
色谱色阶比色法
将标准系列与待测样的一定量点在同一薄 层板 上展开显色 。 依面积大小,色度 深浅 概括样品定量 。 此法实际上只是半定量 。
溶出 1法,将斑点剥离后用溶剂浸出,经适当处理,配合仪器联用 。 此法实际上是只用薄 层 分离提纯 。
含磷农药浸出后用 硫酸 /高氯酸 变成 磷酸 。 然后与 钼酸铵作用生成磷 钼 酸 。
PO43- + 12MoO42- + 27H+ = H7P（ Mo2O7） 6 +10H2O
磷钼酸还原成磷钼酸蓝：
H7P（ Mo2O7） 6 + 2 SnCl2 + 4HCl=
H7P（ Mo2O7） 5 + Mo2O5+ SnCl4 + 2H2O
分析过程
取下有机磷药斑于离心试管中,加如少量丙酮或甲酸浸出,离心分离,反复三次 。 合并浸取液,挥发溶剂,加 50% 硫酸 6滴,4滴高氨酸 。 小心加热至澄清,加 1滴酚酞,NaOH中和至微红,1mol/L的硫酸中和至无色,得样品液 。
称取 KH2PO40.4394g,少量蒸馏水溶解后定容至
100mL,取 10ml 稀释至 100mL,得含磷 10μg的工作液 。 加 1%的 （ NH4） 2MoO4/1mol/L硫酸 3mL,加水至
10mL,摇匀后加一滴 SnCl2/HCl,再摇匀用 650nm波长测吸光度 A。 如此制作工作曲线,用样品液照工作液方法处理得 A样,从而查出样品农药含量 （ μg/
mL） 。
农药含量计算与影响因素
农药含量 = 含磷量 （ μg ） × k × 提取液体积 /
点样体积 × 样重
注意,用农药标准样代替 KH2PO4时 误差较小
反应时的酸度 (生成钼蓝时 )0.48—— 1.44mol/LH+
薄 层 吸附剂含 P有干扰用盐酸浸泡含吸附剂,反复漂洗 ;Fe3+ 与钼蓝形成混合物,降低吸光度,可以加
NaF消除 。
SiO32-与钼酸铵形成黄色 H9Si（ Mo2O7） 6还原时也生成硅钼蓝,可以用柠檬酸或酒石酸来 -控制 MoO42浓度从而达到控制 MoO42-与 SiO32-作用 ； AsO43-与
MoO42-作用可用 Na2SO3除去 。
斑点面积计算法,
色斑面积计算法主要是依 S.T Purdg原理：
A1/2 = mlgw + C
其中 A为斑点面积,C为常数,m为待定系数,w为农药质量 。
对每种农药定量线性范围应由多次实验测出,
对于农药标准品,A1/2s = mlgws + C
对于稀释农药的标准品：
A1/2d = mlgwd + C。 d为稀释倍数。
常数 m,c的确定联立两方程，解出 m,c。
m = （ A1/2s － A1/2d ） /（ lgws － lgwd ）
m = （ A1/2s － A1/2d ） /lg（ ws/wd）
分析式样,A1/2 = mlgw + C
A1/2 = A1/2s + （ lgw－ lgws ）×（ A1/2s － A1/2d ）
/（ lgws - lgwd ）
lgw = （ lgws － lgwd ） × （ A1/2 － A1/2s ） /
（ A1/2s － A1/2d ） + lgws
lgw = lgd × （ A1/2 － A1/2s ） / （ A1/2s － A1/2d ）
+ lgws
薄层色谱扫描定量法
对已分离的斑点类似于分光光度法,只 是扫描测定在薄层上进行 。
其准确度 受吸附剂粒度,形状,厚度,显色条件,斑点大小,边缘清晰度的影响 。
扫描测定时,光束射到一个非匀相表面,散射光作用使光电倍增管作用的消光值与被测物质含量不符合 Lambert-Beer定律 。 为此在一般扫描仪中 （ 岛津 -910型双波段扫描仪 ） 设计了一系列如双波段,曲线扫描,校正曲线直线法,背景校正等技术 。 使测定达预期效果 。
扫描光波选择
1.对可见光有吸收的斑点直接用可见光扫描 。
2.对紫外光有吸收的斑点,直接用紫外光扫 。
3.具有激发荧光的物质,直接用发射荧光扫
4,上述均没有的,化学处理 （ 显色 ） 后扫
此法分两步：
1,按薄层色谱要求和程序处理,分离显色后直接上机扫
2,配制待测标准系列,与待测样相同条件下展开,分离显色后扫描测定,作校正仪器用 。
薄层扫描仪工作流程
流程：光源 光路系统 检测光电信号 前置放大 背景校正 曲线校正 放大 模拟积分 记录仪或计算机
操作：将待测薄层置于工作台,使斑点处于被扫描测定位置
接通线性化仪和背景补偿仪 。 随扫描进行,记录器纸上将被扫描斑点对应波峰和积分值图象用打印机打出；配有 ETA色谱仪数值处理仪,扫描结束 。 打印出农药实际含量,且精确性高,重现性好 。 CS110
扫描仪对同一样品连续扫 60次,误差只有 0.5%。 对分离后图形不规则,边缘不清晰的点,扫描定量,
可以得满意结果 。
一般 20× 20cm板上十多个点,10分钟可完成 。
