第五篇 实验技术及抗寄生虫药物 第十七章 寄生虫病原检查技术 寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查等三个方面。本节将主要对病原检查的各种技术方法作一较全面的介绍 第一节 粪便检查 粪便检查是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法。要取得准确的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过24小时。如检查肠内原虫滋养体，最好立即检查，或暂时保存在35°C～37°C条件下待查。盛粪便的容器须洁净、干燥，并防止污染；粪便不可混入尿液及其它体液等，以免影响检查结果。具体方法如下： （一）直接涂片法（direct smear method） 用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便，连续作3次涂片，可以提高检出率。 1．蠕虫卵检查 滴一滴生理盐水于洁净的载玻片上，用棉签棍或牙签挑取绿豆大小的粪便块，在生理盐水中涂抹均匀；涂片的厚度以透过玻片隐约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如用高倍镜观察，需加盖片。应注意虫卵与粪便中的异物鉴别。虫卵都具有一定形状和大小；卵壳表面光滑整齐，具固有的色泽；卵内含卵细胞或幼虫。 2．原虫检查 活滋养体检查：涂片应较薄，方法同查蠕虫卵。气温愈接 近体温，滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。 （2）包囊的碘液染色检查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理盐水，粪便涂抹方法同上。若同时需检查活滋养体，可在玻片另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本，再盖上盖片。片中滴碘液的一侧查包囊；另一侧查活滋养体。 碘液配方：碘化钾4g，碘2g，蒸馏水100ml。 （3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前最佳的方法为金安-酚改良抗酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10%福尔马林固定保存（4℃1个月内）的含卵囊粪便都可用这三种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下： 金胺－酚（auramine-phenol）染色法： 染液配制：1g/l金胺—酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石 炭酸5.0g，蒸馏水100ml；3%盐酸酒精（第二液）：盐酸3ml，95%酒精100ml；5g/l高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾0.5g，蒸馏水100ml。 2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，10～15分钟后水洗；滴加第二液，1分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置荧光显微镜检查。 低倍荧光镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，发出乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，呈环状，核深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别。 改良抗酸（modified acid-fast method）染色法： 染色液配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4g，95% 酒精20ml，石炭酸8ml，蒸馏水100ml；10%硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10ml，蒸馏水90ml（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中）；20g/l孔雀绿液（第三液）：20g/l孔雀绿原液1ml，蒸馏水10ml。 2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，1.5～10分钟后水洗；滴加第二液，1～10 分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置显微镜下观察。 经染色后，卵囊呈玫瑰红色，圆形或椭圆形，背景为绿色。如染色（1.5分钟）和脱色（2分钟）时间短，卵囊内子孢子边界不明显；如染色时间长（5～10分钟）脱色时间需相应延长，子孢子边界明显。卵囊内子孢子均染为玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共4个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。 不具备荧光镜的实验室，亦可用本方法先染色，然后在光镜低、高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好，可提高检出速度和准确性。 金胺－酚染色－改良抗酸复染法 用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是：先用金胺酚染色后，再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察，卵囊同抗酸染色法所见，但非特异性颗粒被染成兰黑色，两者颜色截然不同，极易鉴别，使检出率和准确性大大提高。 （二）厚涂片透明法（改良加藤法）（modified Kato’s thick smear） 厚涂片透明法适于蠕虫卵检查。取约50mg（已用100目不锈钢筛除去粪渣）粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油—孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开（20×25mm）。置于30～36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干，即可镜检。 玻璃纸准备：将玻璃纸剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油—孔雀绿溶液（含纯甘油100ml、水100ml和1ml 3%孔雀绿水溶液）中至少浸泡24小时，至玻璃纸呈现绿色。 使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间，如粪膜厚透明时间短，虫卵难以发现；如透明时间过长则虫卵变形，也不易辨认。如，检查钩虫卵时，透明时间宜在30分钟以内。 (三)浓聚法（concentration method） 沉淀法（sedimentation method）原虫包囊和蠕虫卵的比重 大可沉积于水底，有助于提高检出率。但比重较小的钩虫卵和某些原虫包囊则效果较差。 重力沉淀法：即自然沉淀法。本法主要用于蠕虫卵检查，蠕 虫卵比重大于水，可沉于水底，使虫卵浓集。加之，经水洗后，视野清晰，易于检查。有些虫卵，如钩虫卵，比重较轻，应用此法效果不佳。本法缺点为费时，操作烦琐。 取粪便20～30g、加水制成混悬液，用金属筛（40～60孔）或2、3层湿纱布过滤，再加清水冲洗残渣；过滤粪液在容器中静置25分钟，到去上液，重新加满清水，以后每隔15～20分钟换水一次（共3～4次），直至上清液清晰为止。最后倒去上清液，取沉渣作涂片镜检。检查血吸虫卵时，沉淀时间不宜过长，尤在室温高于15( C时，卵内毛蚴易孵化。当检查包囊时，换水间隔时间宜延长至约6小时（图 17-1）。 图17-1 粪便自然沉淀法及毛蚴孵化法  （2）离心沉淀法（centrifugal sedimentation method）：将上述滤去粗渣的粪液离心（1500-2000rpm/min）1～2分钟，倒去上液，注入清水，再离心沉淀，如此反复沉淀3～4次，直至上液澄清为止，最后倒去上液，取沉渣镜检。本法省时、省力，适用于临床检验。 （3）汞碘醛离心沉淀法（merthiolate-iodine-formaldehyde centrifugation sedimentation method, MIFC）：本法既可浓集，又可固定和染色，适用于原虫包囊、滋养体及蠕虫卵和幼虫的检查。如准确称取1g粪便，即可作蠕虫卵的定量检查。 取粪便1g，加适量（约10ml）汞碘醛液，充分调匀，用2层脱脂纱布过滤，再加入乙醚4ml，摇2分钟，离心（2000rpm/min）1～2分钟，即分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物4层。吸弃上面3层，取沉渣镜检。 汞碘醛配制： 汞醛（MF）液：1/1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40%）25ml， 甘油50ml，蒸 馏水200ml。 2）卢戈氏液：碘5g，碘化钾10g，蒸馏水100ml。 检查时取汞醛液2.35ml及5%卢戈氏液0.15ml混合备用。但混合液保存8小时后即变质，不应再用；碘液亦不宜于1周后再用。 （4）醛醚沉淀法（formalin-ether sedimentation）：取粪便1～2g置于小容器内，加水10～20ml调匀，将粪便混悬液经2层纱布（或100目金属筛网）过滤，离心（200rpm/min）2分钟；倒去上层粪液，保留沉渣，加水10ml混匀，离心2分钟；倒去上液，加10%甲醛7ml。5分钟后加乙醚3ml，塞紧管口并充分摇匀，取下管口塞，离心2分钟；即可见管内自上而下分为4层。取管底沉渣涂片镜检。 本法不仅浓集效果好，而且不损伤包囊和虫卵的形态，易于观察和鉴定。对于含脂肪较多的粪便，本法效果优于硫酸锌漂浮法。但对布氏嗜碘阿米巴包囊、贾第虫包囊及微小膜壳绦虫卵等的检查效果较差。 2．浮聚法（flotation method）利用比重较大的液体，使原虫包囊或蠕虫卵上浮，集中于液体表面，常用的方法有两种： (1)饱和盐水浮聚法（brine flotation）：此法用以检查钩虫 卵效果最好，也可用于检查其它线虫卵和微小膜壳绦虫卵。但不适于检查吸虫卵和原虫包囊。用竹签取黄豆粒大小的粪便置于浮聚瓶（高3.5cm，直径约2cm的圆形直筒瓶）中，加入少量饱和盐水调匀，再慢慢加入饱和盐水至液面略高于瓶口，以不溢出为止。此时在瓶口覆盖一载玻片，静置15分钟后，将载玻片提起并迅速翻转，镜检（图 17-2）。 图17-2 饱和盐水浮聚法   饱和盐水配制： 将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内，不断搅动，直至食盐不再溶解为止。 （2）硫酸锌离心浮聚法（zinc sulfate centrifugal flotation method）：此法适用于检查原虫包囊、球虫卵囊、线虫卵和微小膜壳绦虫卵。取粪便约1g，加10—15倍的水，充分搅碎，按离心沉淀法过滤，反复离心3—4次，至清水为止，最后倒去上清液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸锌液（33%的溶液），调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约1cm处，离心1分钟。用金属环钩取表面的粪液置于载玻片上，加碘液一滴（查包囊），镜检。钩取标本时，用金属环轻轻接触液面即可，切勿搅动。离心后应立即取标本镜检，如若放置时间超过1小以上，会因包囊或虫卵变形而影响观察效果。 （3）蔗糖离心浮聚法：此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。取粪便约5g，加水15-20ml，以260目尼龙袋或4层纱布过滤。取滤液离心5-10分钟，吸弃上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸馏水320ml，石炭酸6.5ml）再离心，然后如同饱和盐水浮聚法，取其表面膜镜检（高倍或油镜）。卵囊透明无色，囊壁光滑，内含一小暗点和发出蛋黄色的子孢子。隐孢子虫的卵囊在漂浮液中浮力较大，常紧贴于盖片之下，鉴于1小时后卵囊脱水变形不易辨认，故应立即镜检。也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖容液。 常见蠕虫卵、包囊的比重见表17—1。 表17－1 蠕虫卵、包囊的比重 虫卵或包囊 比重   华支睾吸虫卵 1.170－1.190 姜片吸虫卵 1.190 肝片形吸虫卵 1.200 日本血吸虫卵 1.200 带绦虫卵 1.140 微小膜壳绦虫卵 1.050 钩虫卵 1.055－1.080 鞭虫卵 1.150 蛲虫卵 1.105－1.115 受精蛔虫卵 1.110－1.130 未受精蛔虫卵 1.210－1.230 毛圆线虫卵 1.115－1.130 溶组织内阿米巴包囊 1.060－1.070 结肠内阿米巴包囊 1.070 微小内蜒阿米巴包囊 1.065－1.070 蓝氏贾第鞭毛虫包囊 1.040－1.060   3．尼龙袋集卵法 本法主要用于血吸虫卵的浓集。先将120目/吋（孔径略大于血吸虫卵）的尼龙袋套于260目/吋（孔径略小于血吸虫卵）的尼龙袋内（两袋的底部均不粘合，分别用金属夹夹住）。取粪便30g，放入搪瓷杯内加水捣碎调匀，经60目/吋 铜筛滤入内层尼龙袋，然后将两个尼龙袋一起在清水桶内缓慢上下提动洗滤袋内粪液，或在自来水莲蓬头下缓缓冲洗，至袋内流出清水为止。将120目/吋尼龙袋提出，弃取袋内粪渣，取下260目/吋 尼龙袋下端金属夹，将袋内粪渣全部洗入三角量杯内，静置15分钟。倾去上清液，吸沉渣镜检。或将沉渣倒入三角烧瓶内作血吸虫毛蚴孵化。 本法有费时短、虫卵丢失少等优点，并可避免在自然沉淀过程中孵出的毛蚴在换水时被倒掉。 （四）毛蚴孵化法（miracidium hatching method） 为依据血吸虫卵内的毛蚴在适宜温度的清水中，短时间内可孵出的特性而设计的方法，适用于早期血吸虫病患者的粪便检查。取粪便约30g，先经重力沉淀法浓集处理，将粪便沉渣倒入三角烧瓶内，加清水（城市中须用去氯水）至瓶口，在20～30℃的条件下，经４～６小时后用肉眼或放大镜观察结果。如见水面下有白色点状物作直线来往游动，即是毛蚴。必要时也可以用吸管将毛蚴吸出镜检。如无毛蚴，每隔４～６小时（２４小时内）观察一次。气温高时，毛蚴可在短时间内孵出，因此在夏季要用１.２％食盐水或冰水冲洗粪便，最后一次才改用室温清水（图 17-1）。 毛蚴促孵法：将用沉淀法处理后的粪便沉渣置于三角瓶内，不加水，或将粪便置于吸水纸上，再放在２０～３０℃温箱中过夜。检查时，加清水，２小时后就可见到孵出的毛蚴。采用此法，毛蚴孵出时间较一致，数量也较多。 （五）肛门拭子法（anal swab）：　适用于肛周产卵（蛲虫），或常可在肛门附近发现虫卵（带绦虫卵）的检查。 1．棉签拭子法 先将棉签浸泡在生理盐水中，取出时挤去过多的盐水，在肛门周围搽拭，随后将棉签放入盛有饱和盐水的试管中，用力搅动，迅速提起棉签，在试管内壁挤干盐水后弃去，再加饱和盐水至管口处，覆盖一截玻片，务使其接触液面，５分钟后取下载玻片镜检。也可将擦拭肛门的棉签放在盛清水的试管中，经充分浸泡，取出，在试管内壁挤去水分后弃去。试管静置10分钟，或经离心后，倒去上液，取沉渣镜检。 2．透明胶纸法（cellophane tape） 用长约６cm，宽约２cm的透明胶纸有胶面，粘贴肛门周围的皮肤，取下后将有胶面平贴在玻片上，镜检。 （六）钩蚴培养法（culturmethod for hookworm larvae）为根据钩虫卵内幼虫在适宜条件下可在短时间内孵出的原理设计的方法。加冷开水约１ml于洁净试管内（１×10cm），将滤纸剪成与试管等宽但较试管稍长的Ｔ字型纸条，用铅笔书写受检者姓名或编号于横条部分。取粪便约0.2～0.4g，均匀地涂抹在纸条竖部的上部2/3处，再将纸条插入试管，下端浸泡在水中，以粪便不接触水面为度。在20 ～30℃条件下培养。培养期间每天沿管壁补充冷开水，以保持水面高度。3天后用肉眼或放大镜检查试管底部。钩蚴在水中常作蛇行游动，虫体透明。如未发现钩蚴，应继续培养观察至第5天。气温太低时可将培养管放入温水（30℃左右）中数分钟后，再行检查（图 17-3）。 图17-3 钩蚴培养法   此法亦可用于分离人体肠道内各种阿米巴滋养体及人毛滴虫滋养体，且能提高检出率。但是，每管粪便量应为1.0g；适宜温度为25～30℃；培养时间为２～４天。临床上为了及时报告致病原虫，可于培养４８小时后镜检。 （七）虫卵计数法（egg count）　虫卵计数用于估计人体内寄生虫的感染度，常用司徒尔（Ｓtoll）氏法，即司氏稀释虫卵计数法（图 17-4）。 图 17-4 司徒氏稀释虫卵记数瓶在（左）及吸管（右） 图17-5 定量板  用特制的三角烧瓶（或普通三角烧瓶），容量为65ml左右，在烧瓶的颈部相当于56和60ml处，有两个刻度。先把0.1ml/L NaOH溶液到入瓶内至56ml处，再慢慢地加入粪便，到液面上升到60ml处，然后放进玻璃珠10余颗，用橡胶塞塞紧瓶口，充分摇动，使其成为十分均匀的混悬液。 计数时充分摇匀，用有刻度的小吸管吸取0.075或0.15ml粪液置于载玻片上，加盖片，在低倍镜下计数全片的虫卵数，乘以200（0.075ml）或100（吸0.15ml）即得每克粪便虫卵数。由于粪便的性状明显地影响估算结果，因此不成形的粪便的虫卵数应再乘粪便性状系数，即半成形粪便×1.5，软湿形粪便×2，粥状粪便×3，水泻粪便×4。 每克粪便含卵数×24小时粪便克数 雌虫数=———————————————————— 已知雌虫数每天排卵总数 成虫总数=雌虫总数×2 （八）定量透明法 定量透明法适用于各种粪便内蠕虫卵的检查及计数。此法系应用改良聚苯乙烯作定量板（图21—6），大小为40×30×1.37mm，模孔为一长圆孔，大小为8×4mm，两端呈半圆形，所取的粪样平均为41.7mg。操作时将大小约4×4cm的100目尼龙网或金属筛网覆盖在粪便标本上，自筛网上用刮片刮取粪便，置定量板与载玻片上，用一手的两指压住定量板的两端，将刮片上的粪便填满模孔，刮去多余粪便。掀起定量板，载玻片上留下一个长形粪样，然后在粪条上覆盖含甘油—孔雀绿溶液的大小约为5.0～2.6cm的玻璃纸条，展平后加压，使玻璃纸下的粪便铺成长椭圆形。经1～２小时粪便透明后置镜下计数。将所得虫卵数×24，再乘上述粪便性状系数，即为每克粪便虫卵数（eggs per gram， EPG）常见蠕虫的每条雌虫每天排卵数如21—2。 （九）淘虫检查法 为考核驱虫疗效，常需从粪便中淘取蠕虫进行鉴定与计数。取患者服药后24～72小时的全部粪便，加水搅拌，用筛（40目）或纱布滤出粪渣，经水反复冲洗后，倒在盛有清水的大型玻皿内。检查混杂在粪渣中的虫体时，应在玻皿下衬以黑纸。 （十）带绦虫孕节检查法 绦虫节片用清水洗净，置于两节玻片之间，轻轻压平，对光观察内部结构，并根据子宫分支情况鉴定虫种。也可以用注射器从孕节后端正中部插入子宫内徐徐注射炭素墨水或卡红，待子宫分支显现后计数。 卡红染液配制：钾明矾饱和液100ml，卡红3g，冰醋酸10ml。混和液置于37℃温箱内过夜，过滤后即可应用。 表 17-2 各种蠕虫每条雌虫每日排卵数* 虫 名 产卵数/日/条（平均数）   华支睾吸虫 1600－4000（2400） 姜片虫 15000—48000（25000） 卫氏并殖吸虫 10000—20000 日本血吸虫 1000—3500 猪带绦虫 30000—50000/孕节 牛带绦虫 97000—124000/孕节 十二指肠钩虫 10000—30000（24000） 美洲钩虫 5000—10000（9000） 蛔虫 234000—245000（240000） 鞭虫 1000—7000（2000）  * 来源于不同资料的数目可能不同。 第二节 血液检查 血液检查是诊断疟疾、丝虫病的基本方法。涂制血膜用的载玻片用前需经洗涤液处理，自来水、蒸馏水冲洗，在95%酒精中浸泡，擦干或烤干后使用。采血针用前必须消毒或用一次性针，一人一针以免交叉感染。 洗涤液配制：　常用玻璃器皿的洗涤液为铬酸洗液，含工业浓硫酸100ml重铬酸钾80g，水1000ml。先用冷水将重铬酸钾溶化，然后徐徐加入浓硫酸，同时用玻璃棒搅拌。 （一）检查疟原虫　 （1）取血与涂片：用75%酒精棉球消毒耳垂，待干后用左手拇指与食指捏着耳垂下方，并使耳垂下侧方皮肤崩紧，右手持取血针、刺破皮肤，挤出血滴。薄、厚血膜可涂制在同一张玻片上（图 17-6）。间日疟原虫宜在发作后数小时采血；恶性疟在发作初期采血可见大量环状体，1周后可见配子体。 图17-6 薄、厚血膜制作   1）薄血膜制片：在载玻片1/3与2/3交界处蘸血一小滴，以一端缘光滑的 2）载片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。操作时两载片间的角度为30~45°，推动速度适宜。理想的薄血膜，应是一层均匀分布的血细胞，血细胞间无空隙且涂血膜末端呈扫帚状。 3）厚血膜制片：于载玻片的另一端（右）1/3处蘸血一小滴（约10mm3），以推片的一角，将血滴自内向外作螺旋形摊开，使之成为直径约0.8—1cm，厚薄均匀的厚血膜。厚血膜为多层血细胞的重叠，约等于20倍薄血膜的厚度 （2）固定与染色：血片必须充分凉干否则染色时容易脱落。固定时用小玻棒蘸甲醇或无水酒精在薄血膜上轻轻抹过。如薄、厚血膜在同一玻片上，切勿将固定液带到厚血膜上，因厚血膜固定之前必须进行溶血。可用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倒去，凉干。在稀释各种染液和冲洗血膜时，如用缓冲液则染色效果更佳。缓冲液的配制如下： 磷酸氢二钠液：无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）9.64g或Na2HPO4。 2H2O 11.867g或Na2HPO47H2O 　17.872g或NaHPO4 12H2O 　23.877g，蒸馏水1000ml。 M/15磷酸二氢钾液：磷酸二氢钾（KH2PO4）9.073g，蒸馏水1000ml。使用时将上述原液按下页表配制成不同的pH缓冲液： 表17-3 缓冲液配制 pH 6.8 7.0 7.2 M/15 KH2PO4 （ml） 4.9 6.3 7.3  M/15NaH2PO4（ml） 5.1 3.7 2.7 蒸馏水（ml） 90 90 90   染色时临时配制成pH7.0或7.2的缓冲液。 常用的染色剂有姬氏染剂（Giemsa's stain）瑞士染剂（Wright's stain） 1）Giemsa染色法：此法染色效果良好，血膜褪色较慢，保存时间较久，但染色时间较长。 染液配置：姬氏染剂粉1g，甲醇50ml，纯甘油50ml 。将姬氏染剂粉置于研钵中（最好用玛瑙研钵），加小量甘油充分研磨，加甘油再磨，直至50ml甘油加完为止，倒入棕色玻瓶中。然后分几次用少量甲醇冲洗钵中的甘油染粉，倒入玻瓶直至50ml甲醇用完为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置65℃温箱内24小时或室温内一周后过滤，备用。 染色方法：用pH7.0～7.2的缓冲液，将姬氏染液稀释；比例约为15～20份缓冲液加一份姬氏染液。用蜡笔划出染色范围，将稀释的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小时（室温），再用上述缓冲液冲洗。血片凉干后镜检。 2） 快速姬氏染色法：姬氏染液1ml，加缓冲液5ml，如前法染色5分钟后用缓冲液冲洗，凉干后镜检。 3）Wright染色法： 此法操作简便，适用于临床诊断，但甲醇蒸发甚快，掌握不当易在血片上发生染液沉淀，并较易褪色，保存时间不长。多用于临时性检验。 ① 染液配制：瑞氏染剂粉0.1～０.5g，甲醇9７ml，甘油3ml。将瑞氏染剂加入甘油中充分研磨，然后加少量甲醇，研磨后倒入瓶内，再分几次用甲醇冲洗钵中的甘油溶液，倒入瓶内，直至用完为止。摇匀，２４小时后过滤待用。一般１、２周后再过滤。 ② 染色方法：瑞氏染剂含甲醇，薄血膜不需先固定；而厚血膜则需先经溶血，待血膜干后才能染色。染色前先将溶过血的厚血膜和薄血膜一起用蜡笔划好染色范围，以防滴加染液时外溢。滴染液使覆盖全部厚、薄血膜上，３０秒至１分钟后用滴管加等量的蒸馏水，轻轻摇动载玻片，使蒸馏水和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜（染色），３～５分钟后用水缓慢从玻片一端冲洗（注意勿先倒去染液或直对血膜冲洗），凉干后镜检。 （二）检查微丝蚴 （1）新鲜血片检查：晚间9时到次晨2时取血1滴滴于载玻片上，加盖片，在低倍镜下观察，发现蛇形游动的幼虫后，仍需做染色检查，以确定虫种。 （2）厚血膜检查：厚血膜的制作、溶血、固定与姬氏液染色同疟原虫。但 需取血3滴，也可用Delafieid苏木染色法染色。该染液的配制方法如下： 取苏木素1g溶于纯酒精或95%的酒精10ml中，加饱和硫酸铝铵（8%～10%）100ml，倒入棕色瓶中，瓶口用两层纱布扎紧，在阳光下氧化２～４周，过滤，加甘油25ml和甲醇25ml，用时稀释10倍左右，将溶血、固定的厚血膜置于德氏苏木素液内10—15分钟，在1%酸酒精中分色1—2分钟，蒸馏水洗涤1—5分钟，至血膜呈蓝色，再用1%伊红染色0.5—1分钟，以水洗涤2—5分钟，凉干后镜检。 （3）活微丝蚴浓集法：在离心管内加蒸馏水半管，加血液10—12滴，再加生理盐水混匀，离心（3000rpm/min）沉淀3分钟，取沉渣检查。或取静脉血1ml， 置于盛有0.1ml 3.8%枸橼酸钠的试管中，摇匀，加水9ml，俟红细胞溶化后，再离心2分钟，倒去上清液，加水再离心，取沉渣镜检。 第三节 排泄物与分泌物等的检查 1．痰液 痰中可能查见肺吸虫卵、溶组织内阿米巴滋养体、棘球蚴的原头蚴、粪类圆线虫幼虫、蛔蚴、钩蚴、尘螨等；卡氏肺孢子虫的包囊也可出现于痰中，但检出率很低。 （1）肺吸虫卵检查：可先用直接涂片法检查，如为阴性，改为浓集法集卵， 以提高检出率。 直接涂片法：在洁净载玻片上先加1—2滴生理盐水，挑取痰液少许，最好选带铁锈色的痰，涂成痰膜，加盖片镜检。如未发现肺吸虫卵，但见有夏科—雷登晶体，提示可能是肺吸虫患者，多次涂片检查为阴性者，可改用浓集法。 浓集法：收集24小时痰液，置于玻璃杯中，加入等量10%NaOH溶液，用玻棒搅匀后，放入37℃温箱内，数小时后痰液消化成稀液状。分装于数个离心管内，以1500rpm/min离心5—10分钟，弃去上清液，取沉渣数滴涂片检查。 （2）溶组织内阿米巴大滋养体检查：取新鲜痰液作涂片。天冷时应注意镜台上载玻片保温。高倍镜观察，如为阿米巴滋养体，可见其伸出伪足并作定向运动。 （3）上述其他蠕虫幼虫及螨类等宜用浓集法检查。 2. 十二指肠液和胆汁 用十二指肠引流管抽取十二指肠液及胆汁，以直接涂片法镜检；也可以经离心浓集后，取沉渣镜检。可检查蓝氏贾第鞭毛虫滋养体、华支睾吸虫卵、肝片形吸虫卵和布氏姜片虫卵等；在急性阿米巴肝脓肿患者胆汁中偶可发现大滋养体。 检查方法：可将各部分十二指肠引流液滴于载玻片上，加盖片后直接镜检。为提高检出率，常将各部分引流液加生理盐水稀释搅拌后，分装于离心管内，以2000rpm/min，离心5—10分钟，吸取沉渣涂片镜检。如引流液过于粘稠，应先加10%NaOH消化后再离心。引流中的贾第虫滋养体常附着在粘液小块上，或虫体聚集成絮片状物。肝片形吸虫卵与姜片虫卵不易鉴别，但前者可出现于胆汁；而后者只见于十二指肠液中。 3．尿液 取尿液３～5ml，离心（2000rpm/min）3～5分钟，后取沉渣镜检。但乳糜尿需加等量乙醚，用力振荡，使脂肪溶于乙醚。然后吸去脂肪层，离心，取沉渣镜检。可查见阴道毛滴虫、微丝蚴、埃及血吸虫卵 4．鞘膜积液 主要检查班氏微丝蚴。阴囊皮肤经碘酒精消毒后，用注射器抽取鞘膜积液作直接涂片检查，也可以加适量生理盐水稀释离心，取沉渣镜检。 5．阴道分泌物 检查阴道毛滴虫。 直接涂片法： 用消毒棉签在受检者阴道后穹窿、子宫颈及阴道壁上取分泌物，然后用生理盐水涂片法镜检，即可发现活动的虫体。天气寒冷时，应注意保温。 悬滴法：先在一盖玻片周缘涂一薄层凡士林，中间滴1～２滴生理盐水。将阴道分泌物涂于生理盐水中，翻转盖片小心覆盖在一具凹孔的载玻片上，稍加压使两片粘合，液滴即悬于盖片下面，镜检。 第四节 其他器官组织检查 1．骨髓穿刺 主要检查杜氏利什曼原虫无鞭毛体。一般常作髂骨穿刺，嘱患者侧卧，暴露髂骨部位。视年龄大小，选用17～20号带有针芯的干燥无菌穿刺针，从髂骨前上棘后约1cm处刺入皮下当针尖触及骨面时，再慢慢地钻入骨内约0.5～1.0cm，即可拔出针芯，接一2ml干燥注射器，抽取骨髓液。取少许骨髓液作涂片；甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油镜检查。 2．淋巴结穿刺 （1）利什曼原虫：检出率低于骨髓穿刺，但方法简便、安全。对于以往治疗的患者，因其淋巴结内原虫消失较慢，故仍有一定价值。穿刺部位一般选腹股沟部，先将局部皮肤消毒，用左手拇指和食指捏住一个较大的淋巴结，右手用一干燥无菌6号针头刺入淋巴结。稍待片刻，拔出针头，将针头内少量淋巴结组织液滴于载玻片上，做涂片染色检查。 （2）丝虫成虫：同上法获取淋巴组织液，染色后镜检。 3．肌肉活检 （1）旋毛虫幼虫：用外科手术从患者腓肠肌、肱或股二头肌取米粒大小肌肉一块，置于载玻片上，加50%甘油一滴，盖上另一载玻片，均匀压紧，低倍镜下观察。取下之肌肉须立即检查，否则幼虫变得模糊，不易观察。 （2）并殖吸虫、裂头蚴、猪囊尾蚴：用外科手术摘取肌肉内的结节，剥除外层纤维被膜，在两张载玻片间压平、镜检。也可经组织固定后作切片染色检查。 4．皮肤及皮下 （1）囊尾蚴、裂头蚴、并殖吸虫：参见肌肉检查。 （2）皮肤利什曼原虫：在皮肤上出现丘疹和结节等疑似皮肤型黑热病患者，可选择皮损较明显之处，作局部消毒，用干燥灭菌的注射器，刺破皮损处，抽取组织液做涂片；或用消毒的锋利小剪，从皮损表面剪取一小片皮肤组织，以切面做涂片；也可用无菌解剖刀切一小口，刮取皮肤组织做涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未见原虫，可割取小丘疹或结节，固定后，作组织切片染色检查。 （3）蠕形螨：参看“蠕形螨和蠕形螨病”一节。 （4）疥螨：参看“疥螨和疥疮”一节。 5．直肠粘膜 日本血吸虫卵：用直肠镜观察后，自可疑病变处钳取米粒大小的粘膜一块，用生理盐水冲洗后，放在两个载玻片间，轻轻压平，镜检。各型血吸虫卵鉴别见表 17-4。 表 17-4 粘膜内未染色血吸虫卵之鉴别 活卵 近期变性卵 死卵（钙化卵）  颜色 淡黄至黄褐色 灰白至略黄色 灰褐色至棕红 卵壳 较薄 薄或不均匀 厚而不均匀 胚膜 清楚 清楚 不清楚 内含物 卵黄细胞或胚团或毛蚴 浅灰色或黑色小点或折光 两极可有密集的黑点含 均匀的颗粒或萎缩的毛蚴 网状结构或块状结构物   溶组织阿米巴：用乙状结肠镜观察溃疡形状，自溃疡边缘或深层刮取溃疡组织置于载玻片上，加少量生理盐水，盖上盖片，轻轻压平，立即镜检。也可取出一小块病变粘膜组织，固 定切片，染色检查。 6．肺组织 检查卡氏肺孢子虫包囊。取一小块肺组织作涂片，自然 干燥后甲醇固定，用改良银染色法进行染色。 改良银染色法染色步骤： （1）将肺涂片置于5%铬酸，氧化15分钟，温度为20℃氧化后的标本均从流水冲洗数秒。 （2）1%亚硫酸氢钠经1分钟,自来水冲洗后，蒸馏水洗涤3～4次。 （3）放入四胺银工作液内,并在60℃孵育约90分钟，至标本转至黄褐色为止。流水、蒸馏水各洗5分钟。 （4）0.1%氯化金2～5分钟，蒸馏水洗4～５次。 （5）２％硫代硫酸钠５分钟，流水至少洗１０分钟。 （6）亮缘复染４５秒。 （7）９５％，９９％，１００％乙醇逐级脱水。 （8）二甲苯透明３次，树胶封片。 染色结果显示，卡氏肺孢子虫包囊呈圆形、卵圆形或不规则的多角形，囊壁为淡褐色或深褐色。红细胞为淡黄色，其余背景呈淡绿色。 （卢思奇）