寄生虫的人工培养及动物模型 第一节 寄生虫的人工培养 一、溶组织内阿米巴培养 可分有菌培养(xenic culture)和无菌培养(axenic culture) （一）有菌培养 主要用Robinson’s培养基，不仅可以培养溶组织内阿米巴，也可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿米巴。一般应用6ml~7ml或更小的螺旋有盖培养管。 1．组成成分： （1）盐水琼脂斜面：溶解15g琼脂粉和7g~8g氯化钠于1000ml蒸馏水中，分装在小试管中高压灭菌(121℃,15min)，当琼脂冷却至75℃左右倾放使其形成斜面。 （2）红霉素：将0.5g实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中，加入20ml 70%乙醇溶解，4℃放置2h以上，而后加灭菌水至50ml。 （3）米粉：梗米粉经高压消毒或180℃干燥灭菌。 （4）配制50mmol邻苯二甲酸氢钾，pH6.3，高压灭菌。 （5）血清：56℃ 30min灭活，甚至未灭活的牛或马血清均可使用。 （6）R溶液贮存液：NaCl 50g (NH4) 2SO4 10g 柠檬酸.2H2O 20g MgSO4.7H2O 0.5g KH 2PO4 5g 乳酸(90%纯度) 4ml，加水至950ml，调节pH至7.0，最终调节容量至1000ml，分装高压灭菌，制备成贮存工作液。使用时将100ml贮存液加入850ml双蒸水，调节pH7.0分装高压灭菌。 （7）BR溶液：25ml R工作液与1个克隆的大肠杆菌，37℃振摇培养48小时。 （8）BRS溶液：在上述BR溶液中加入等量血清，继续培养24~48小时即可。 2．操作步骤 在含琼脂斜面的培养试管中加入10mg米粉、120(l红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS液4:1混合液，加入少量(约50mg)粪便，混匀，37℃培养24小时后，移去培养上清液，加适量入4:1混合液并加入60(l红霉素和米粉。37℃继续培养48小时后，取米粉与粪渣混合物一滴，以碘液染色或直接观察有无滋养体；若未发现虫体再加入米粉，再培养24小时观察。若虫体阳性可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续培养，即为转种。 （二）无菌培养 最常用是BIS-33培养基，为液体培养基。培养在6ml的玻璃有盖培养管中，由于阿米巴为兼性厌氧代谢，故应紧盖管盖，并呈5(的角度放置。虫体对培养基和血清的要求甚高，甚至水质也会影响其生长，并非一般实验室可行。目前我国生产的培养基试剂尚不能成功培养虫体。BIS-33培养基含三个组分，即营养液、维生素混合液、成牛血清。 （1）营养液：K2HPO4 1.0g KH 2PO4 0.6g NaCl 2g L~半胱氨酸~HCl 1g 维生素C 0.2g 枸橼酸铁胺 22.8mg 葡萄糖 10g 消化蛋白胨，酵母提取物 30g 溶于600ml双蒸水中，调节pH至6.8，最终容量调至870ml，分装，高压消毒后，冷却至-20(贮存。 （2）维生素培养液 有多种，如下一种是最易配制的。 溶液A：烟酰胺45mg; 盐酸维生素B6 4mg; 泛酸钙 23mg; 盐酸硫胺 5mg; 维生素 B12 1.2mg，均溶于双蒸水，定容至25ml; 溶液B：核黄素7mg(加0.1N NaOH数微升使其易溶解)加双蒸水至45ml; 溶液C：叶酸5.5mg(加0.1N NaOH数微升使其易溶解) 加双蒸水至45ml; 溶液D：d-生物素2mg，加双蒸水至45ml; 溶液E：DL-6,8-硫辛酸1mg，溶于5ml 95%乙醇中，加入500mg Tween 80并定容至200ml，0.2(m滤膜过滤灭菌，4℃暗处保存。 （3）成牛血清 成牛血清需经4小时左右灭活方可用于培养，但需避免反复冻融。 （4）完全培养剂 营养液87ml，成牛血清10ml或15ml，维生素混合液2ml，混合，冷藏，随时可用。应用6ml的螺旋有盖培养管，36(0.5℃培养，72~96小时转种一次。可将向有菌培养的滋养体与37℃的BIS-33培养基混匀，使米粉等粗颗粒自然沉淀，取含滋养体的上清液通过滤纸，400g 2min离心，弃上清液。将含滋养体的沉淀溶入含青霉素、链霉素、卡那霉素、多粘菌素的BIS-33培养液中，并加入数滴福尔马林固定的短膜虫，在6ml螺旋有盖培养管中培养。24小时后可见滋养体贴附试管壁，换一次培养液，继续培养48小时或72小时后转种，使其逐渐转为无菌培养，并可进一步克隆化。 二、阴道毛滴虫培养 可分有菌培养和无菌培养。 1．有菌培养 主要是肝胨糖培养基。一般应用12ml或6ml的螺旋有盖培养管，可从病人阴道后穹隆取材直接放入培养管中，加入青霉素1000u/ml，链霉素1mg/ml，以除去杂菌，36(0.5℃培养。 具体配制方法为，取小牛肝脏60g，清洗粉碎，浸入400ml蒸馏水中，4℃过夜。而后煮沸1小时左右，纱布过滤，最终调节容量至400ml，分装，4℃贮存。取100ml上述肝浸汤加入蛋白胨2g和葡萄糖0.5g，调节pH至5.5~6.0，5ml或2.5ml分装，20分钟高压灭菌，使用前加入15%灭活牛血清。 2．无菌培养 应用前述的BIS-33培养基，将pH调节至5.8，应用10%成牛血清，培养管如同阿米巴培养所用。从有菌转入无菌时，应加入适量适当的抗菌素以杀死细菌，例如青霉素、链霉素、卡那霉素等。 三、蓝氏贾第鞭毛虫培养 蓝氏贾第鞭毛虫可以直接从病人粪便或十二指肠液或胆汁中直接进行无菌培养，而无需从有菌培养或混合培养(monoxenic culture)转化。所用试管如溶组织内阿米巴无菌培养所述，培养温度36(0.5℃。培养基即为BIS-33，但可作如下改良即：① L-半胱氨酸-HCl加倍；② 每1升培养液加入500mg 脱氢牛胆汁(dehydrogenate bovine bile)；③ pH为7.0~7.2；④ 培养液以0.2(m的滤膜过滤除菌，在过滤前高速离心可以除去较大的杂质以便过滤。⑤ 应用10%的成牛血清。⑥ 无需维生素混合液。 四、隐孢子虫培养 在隐孢子虫生活史中只有囊合子和子孢子可以从实验动物或感染者分离，而后进行体外培养。首先将实验动物或感染者粪便捣成匀浆，过滤，而后与饱和盐水混匀，1000g 15min离心。取含囊合子的上层液，以双蒸水3: 1稀释，4000g 15min离心。沉淀以0.1%硫代硫酸盐溶液洗涤、离心，沉淀再溶于生理盐水，以Percoll梯度分离，所得囊合子加入适当抗菌素可在4℃中贮存6~8周。在进行体外培养前囊合子可以1.75%的低氯溶液(hypochlorite)处理7min，而后转入人结肠癌细胞 (Caco-2)、牛输卵管上皮细胞或猴肾上皮细胞 (MDBK)的培养瓶中以相应的细胞培养液培养，囊合子可以增殖，但少于动物肠内培养，可用于研究宿主细胞与病原体的相互关系和药物筛选。 五、利什曼原虫培养 （一）前鞭毛体培养 1．培养基 主要有NNN(3N)培养基和USMARU培养基。 NNN培养基可以分固体部分和液体部分。固体部分：1.4g琼脂、0.6g氯化钠加入90ml双蒸水，加热溶解，每4ml或1.5ml分装入12ml或6ml培养管中，121℃ 15min灭菌，而后加入去纤维素的兔血至15%含量，混合并放成斜面，4℃保存。液体部分为少量的灭菌双蒸水，还可加入青霉素和链霉素。培养温度在20~27℃左右。USMARU培养基是将“Bacto”血琼脂4g溶于双蒸水中，以后制法如NNN培养基。 2．操作步骤 取皮肤或组织、骨髓的活检标本加入培养管中， 20~25℃培养。每2~3天取极少量培养液观察是否有前鞭毛体，一旦发现有前鞭毛体则应立即取数滴培养液转入新鲜培养基中。 另有Schneider’s Drosophila 培养基根据昆虫血淋巴液的成份加胎牛血清配制而成。虫体在此培养基中生长良好，但价格昂贵。 有许多株的利什曼原虫还可以成功地培养在一些哺乳动物细胞培养液的混合液中，例如MEM、RPMI 1640或199培养基。 （二）无鞭毛体培养 利什曼原虫的无鞭毛体寄生在哺乳动物的单核吞噬细胞内，也可以体外培养在这类细胞内，例如可在巨噬细胞培养株J774G8内培养或在直接从外周血分离的巨噬细胞内培养。前者巨噬细胞分裂，且虫体大量增殖，但有时会混有前鞭毛体。后者则适用于短期的实验，虽然虫体自身增殖，但巨噬细胞并不分裂。无鞭毛体还可以生长在无细胞的培养基中。这种无鞭毛体可以被巨噬细胞迅速吞噬，并在细胞内分裂，可转化为前鞭毛体。一般培养温度为33℃，每96小时转种一次。 六、疟原虫培养 疟原虫培养可以分红细胞内期和红细胞外期。红细胞内期培养中四种人体疟原虫仅恶性疟原虫可以成功地在体外长期培养。疟原虫培养比较复杂，需要?“O”型人红细胞、人血清及由3%氧气、4%二氧化碳和93%氮气组成的气体充在培养瓶内。当然还需要基本的培养液例如RPMI1640等，而且必须每天更换。整个培养系统也必须是无菌状态的。这里例举一种培养方法：取新鲜“O”型抗凝全血，离心使血清与红细胞分离开来。血清按一次需要量分装于小容量的无菌瓶或试管中，-20℃保存。红细胞以RPMI1640洗涤三次后，悬浮在等量的含10%人血清的RPMI1640中，4℃保存，可使用2~3周。市售的RPMI1640液体培养液或粉末培养基溶解过滤灭菌后，加入HEPES和谷胱苷肽，使最终浓度分别为25mmol/l和0.6%，成为完全的RPMI1640的培养液。培养时取病人血，以RPMI1640洗涤2次，再加入含15%人血清的完全RPMI1640培养液，使再成为含量约为0.2%~0.4%的悬液。取悬液8ml置35cm2（70ml）无菌细胞培养瓶中，再加入红细胞悬液，使其最终成为3%~5%红细胞悬液，充入上述混合气体，紧盖瓶盖，37℃培养箱中培养。一般24小时更换培养液一次。换液时尽量不晃动细胞层，不触及红细胞，以消毒吸管除去老培养液。加入等量新鲜的含15%人血清的完全RPMI1640培养液后再轻轻悬浮细胞，37℃继续培养。同时定时吸取少量沉淀细胞涂成簿血片，姬氏染色，了解虫体生长情况。红细胞外期的培养恶性疟原虫和间日疟原虫可以成功。这对开展疟原虫疫苗研究很有意义，目前已有这方面的专著，故具体方法不在这里叙述。 七、血吸虫培养 在血吸虫的培养中，体外培养并不十分成功。以对曼氏血吸虫的研究最多，发展最快。血吸虫培养主要分为螺期虫体的培养和终宿主期虫体的培养。所选用的培养基和不同动物来源的血清对虫体的影响很大。在这方面需不断的研究，以改变目前虫体往往发育不规则、不正常或成虫产卵量少、产异常卵的情况。关于血吸虫的培养的具体方法和培养基也已有专著。 另外对猪肉绦虫、猪囊尾蚴、牛肉绦虫、钩虫、蛔虫、丝虫等的成虫或幼虫均可以在含血清的培养基中培养。这对这些虫体的生理生化、代谢、免疫、遗传的研究均有意义，但限于篇幅，不再赘述。 第二节 寄生虫的动物模型 溶组织内阿米巴 肠道阿米巴病模型：将通过中华仓鼠肝脏的增加了毒力的溶组织内阿米巴滋养体通过小鼠的肛门灌注入直肠、乙状结肠可引起大量滋养体侵入肠粘膜而引起溃疡。并可在粪便中检获滋养体、包囊或抗原。 肝阿米巴病模型：将具毒力的溶组织内阿米巴滋养体105~106注入中华仓鼠肝脏包膜下，7天后解剖可见肝脏具有占位性病变，并可在脓液中检获滋养体。 杜氏利什曼原虫 将稀释的杜氏利什曼原虫病患者稀释的组织穿刺液或人工感染杜氏利什曼原虫动物的脾、肝组织研磨匀浆0.5ml，注入中华仓鼠等动物腹腔内，1个月内解剖动物，可见其肝、脾淋巴结等含有无鞭毛体。原虫可在仓鼠体内存活六个月左右。 刚地弓形虫 将病人的组织穿刺液，注入健康小鼠腹腔内，约2~3周后取小鼠腹腔液行涂片检查，可见滋养体集于腹腔巨噬细胞内，少数散于细胞外。收集腹腔液，溶解细胞，最终过滤可以收集到纯的滋养体。被收集腹腔液的小鼠可继续培养，2~3天后继续抽腹腔液收集滋养体，可反复2~3次，但每次抽取腹腔液必须注意无菌操作。液氮保存虫株的滋养体注入健康小鼠腹腔内，约7天后取小鼠腹腔液行涂片检查，可见滋养体集于腹腔巨噬细胞内或散于细胞外。 疟原虫 四种感染人体的疟原虫的动物模型均为灵长类动物，十分昂贵。但是这些动物模型的存在为疟疾的研究提供了有利的条件，但也应探索应用小型动物作为人疟原虫的动物模型。 卡氏肺孢子虫 正常大鼠反复给予肾上腺皮质激素，使其抵抗力下降。此时人肺孢子虫可成功感染大鼠。这为卡氏肺孢子虫的形态、生活史，尤其是分子生物学和制备单克隆抗体提供了良好的模型。 旋毛虫 将含旋毛虫幼虫的肉类(含幼虫200条左右)捣碎喂养正常小鼠或大鼠，经5周左右可在动物的肌肉内检获幼虫包囊，亦可将含幼虫的肉类捣碎加酶消化，收集幼虫。直接经腹腔注入正常小鼠(或大鼠)体内，经5周亦可同样检获幼虫。 血吸虫 血吸虫常用而经济的动物模型为家兔或小鼠。将从阳性钉螺逸出的尾蚴500条~800条或40条置于盖玻片上，而后翻转覆盖于剪去腹毛浸湿的家兔或小鼠腹部。放置20分钟后移去盖玻片。感染后42天~45天，可在动物粪便中检获虫卵。 华支睾吸虫 取含有华支睾吸虫囊蚴的鱼肉，以含胃蛋白酶的消化液消化，获纯净的囊蚴，喂饲豚鼠、大白鼠、兔等，也可用猫或犬。感染后一个月即可在粪中检获虫卵。 卫氏并殖吸虫 将含有卫氏并殖吸虫囊蚴的溪蟹和蝲蛄，捣碎，用水沉淀，倾去上清液，如是反复直至肉渣去尽，留下沉渣挑取含囊蚴喂饲犬或猫；亦可以2%的胆酸盐处理洗净的囊蚴，使其内后尾蚴脱囊而出。离心后注入犬或猫腹腔中，经2~2.5个月可在粪便中检出虫卵。 (程训佳)