第三章 发酵工艺条件的确定
? 主讲人：刘萍
第三章 发酵工艺条件的确定
? 第一节 培养基的选择和确定
? 第二节 培养条件的确定
第一节 培养基的选择和确定
? 一,培养基的营养成分
? 二、培养基的用途
? 三、发酵培养基的选择
? 四,培养基成分的营养 与作用
? 五,培养基确定 方 法
? 六、正交试验在培养基确定中的应用
一,培养基的营养成分
? 微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的
酶．将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂
肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细
胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现
的。
? 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和
产物合成所需的能源，包括 碳源、氮源、无机
元素、生长因子及水、氧气 等。对于大规模发
酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须
重视培养基 原料的价格和来源 。
微生物的营养来源
? （ 1）能源
? 自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚
铁盐。
? 异养菌：碳水化合物等有机物，石油
天然气和石油化工产品，如醋酸。
? （ 2）碳源,
? 碳酸气；
? 淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液
等
? 石油、正构石蜡，天然气
? 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品
? （ 3）氮源
? 豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，
酒糟水等有机氮
? 尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐等无机氮
? 气态氮
? (4)无机盐
? 磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等其他矿盐
? 铁、锰、钴等微量元素
? 其他
? （ 5）特殊生长因子
? 硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇
等
二、培养基的用途
? 筛选菌种
? 保藏菌种
? 检验杂菌
? 培养种子
? 发酵 生产
（一）、培养基的分类
（二）、发酵生产中的
培养基类型
（一）、培养基的分类
? （ 1） 按培养基组成物质的化学成分
? 合成培养基, 天然培养基 。
? （ 2） 按物理性质
? 固体, 液体
? （ 3） 按用途
? 选择性培养基, 鉴别培养基, 富集培养
基等
? （ 1） 天然培养基
? 是采用化学成分还不清楚或化
学成分还不恒定的各种植物和动物
组织或微生物的浸出物, 水解液等
物质 (例如牛肉膏, 酵母膏, 麦芽汁,
蛋白胨等 )制成的 。
? 适合于各类异养微生物生长,
而一般自养微生物都不能生长 。
（ 2）合成培养基
? 是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成
的 。 成分精 确, 重复性强, 可以减少不能控制
的因素
? 适用于在实验室范围作有关营养, 代谢,
分类鉴定, 生物测定及选育菌种, 遗传分析等
定量研究工作 。
? 但一般微生物在合成培养基上生长较慢,
有些微生物营养要求复杂, 在合成培养基上不
能生长 。
（ 3）半合成培养基
? 多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳
源, 氮源和生长因子的来源, 再适当加入一些
化学药品以补充无机盐成分, 使其更能充分满
足微生物对营养的需要 。
? 大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖 。 因
此, 在微生物工业生产上和试验研究中被广泛
使用 。
? （ 1） 液体培养基：常用于大规模的工业
生产及生理代谢等基本理论研究工作 。
? 发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基 。
? 根据微生物对氧的要求情况, 分别作静止
或通风搅拌培养 。
? 在菌种筛选工作和菌种培养工作中, 也常
用液体培养基进行摇瓶培养
? 微生物在液体培养基中生长的情况有时也
可用作鉴定菌种的参考 。
生理代谢
菌种筛选 种子培养
发酵培养
? （ 2） 固体培养基
? 分类：斜面试管, 平板等
? 是在液体培养基中加入凝固剂配
成的, 最常用的凝固剂是琼脂 。
? 作用,
? 固体培养基在菌种的分
离, 保藏, 菌落特征的观察,
活菌计数和鉴定菌种方面是
不可缺少的 。
? 在制曲, 酶制剂, 柠檬
酸等生产中, 用来培养霉菌
等的固体种子和发酵培养基
是由麸皮等农作物加无机元
素等制成的 。
? 增殖培养基：可以配制成适合某种微生
物生长而不适合其他微生物生长, 从而
达到从自然界分离这种微生物的目的 。
? 鉴别培养基：是根据微生物能否利用培
养基中某种营养成分, 借助指示剂的显
色反应, 以鉴别不同种类的微生物 。
? 选择培养基：是在培养基内加入某种化
学物质以抑制不需要菌的生长, 而促进
某种需要菌的生长 。
（二）、发酵生产中的培养基
类型
? 工业发酵中培养基往往是依据生产
流程和作用分为,
? 斜面培养基
? 种子培养基
? 发酵培养基
? 摇瓶培养基
1．斜面培养基
? 作用：这是供微生物细胞生长繁殖用
的, 包括细菌, 酵母等的斜面培养基
以及霉菌, 放线菌生孢子培养基或麸
曲培养基等 。 这类培养基主要作用是
供给细胞生长繁殖所需的各类营养物
质 。
? 特点,
? 1.富含有机氮源, 少含或不含糖分 。 有机氮有
利于菌体的生长繁殖, 能获得更多的细胞 。
? 2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基, 则氮源
和碳源均不宜太丰富, 否则容易长菌丝而较少
形成孢子 。
? 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类, 供给必要
的生长因子和微量元素 。
2．种子培养基 (包括摇瓶种子和小罐
种子培养基 ),
? 培养种子的目的,
? 1.扩大培养, 增加细胞数量；
? 同时也必须培养出强壮, 健康, 活性高
的细胞 。 为了使细胞迅速进行分裂或菌
丝快速生长 。
? 种子培养基特点,
? 1,必须有较完全和丰富的营养物质, 特别需要
充足的氮源和生长因子 。
? 2,种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高 。
供孢子发芽生长用的种子培养基, 可添加一些
易被吸收利用的 碳源和氮源 。
? 3,种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主
要成分相近 。
3．发酵培养基
? 发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基, 它
不仅耗用大量的原材料, 而且也是决定发酵生
产成功与否的重要因素 。
? （ 1） 根据产物合成的特点来设计培养基,
对菌体生长与产物相偶联的发酵类型, 充
分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的
产物 。
对于生产氨基酸等含氮的化合物时, 它的
发酵培养基除供给充足的碳源物质外, 还应该
添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物 。
（ 2） 发酵培养基的各种营养物质的浓度应
尽可能高些, 这样在同等或相近的转化
率条件下有利于提高单位容积发酵罐的
利用率, 增加经济效益 。
? （ 3） 发酵培养基需耗用大量原料, 因此,
原料来源, 原材料的质量以及价格等必
须予以重视 。
三、发酵培养基的选择
? (1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的 基
本成分 。
? (2)有利于 减少培养基原料的单耗, 即提高单
位营养物质所合成产物数量或最大产率 。
? (3)有利于 提高培养基和产物的浓度, 以提高
单位容积发酵罐的生产能力 。
? (4)有利于 提高产物的合成速度, 缩短发酵周
期 。
? (5)尽量减少副产物的形成, 便于产物的
分离纯化 。
? (6)原料价格低廉, 质量稳定, 取材容易 。
? 7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通
气搅拌的影响, 利于提高氧的利用率,
降低能耗 。
? (8)有利于产品的分离纯化, 并尽可能减
少产生, 三废, 的物质 。
发酵培养基的设计和注意事项
? 1,提供必要的营养成分：培养基成分必
须满足细胞生长, 代谢活动和合成产物
所需的基本要求 。
? 2,配制合适的浓度：可以从发酵动力学
有关生长, 产物合成和基质利用物料平
衡的关系中大致推算所需原料或大致计
算出所需主要原料的需要量 。
? 3,主成分与其他成分的配比 。
? 4,控制合适的 pH：微生物的生长繁殖或
产物的合成往往需要 — 定的 pH环境, 在
最适 pH值下有利于加快各种酶的反应 。
因此在整个发酵过程中应使培养基的 pH
适合于微生物生长或产物合成所需 。
pH的具体控制方法
? 1,可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加
某些营养物质调节培养基的 pH,但更应在配制
培养基时考虑所用营养物质的组成成分, 使其
pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要 。
? 2,还要注意有些营养物质被利用后培养基的 pH
变化情况,
? 3,控制 pH最常用的方法是在培养基中添
加具有一定缓冲能力的物质作为营养物,
如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使
用容易产生生理酸性或碱性使培养基 pH
波动太大的物质 。
? 4,避免产生微生物不能利用的物质或形成沉
淀
? 葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作
用形成深褐色物质 。 这种物质不被微生物利用 。
因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌,
而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内 。
? 硫酸铵中的 SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙,
因此二者也不宜直接配成培养基 。
? 5,注意代谢调节物的影响,
? 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或
抑制发酵产物的形成 。
? 前体物质
? 诱导剂
? 阻遏物
? 抑制剂
? 金属离子
(1)添加有关前体物质,
? 前作物质：是指当添加到发酵培养基中
的某些化学物质基本上不改变其分子结
构而直接进入产物中的小分子物质, 从
而在一定条件下控制产物的合成方向和
提高产量 。
? 在发酵中添加前体物质将有利于产物的
合成和显著提高产量, 如苯乙酸及其衍
生物被认为是青霉素的前体物质 。
(2)添加诱导物,
? 目前工业用微生物酶多数为诱导酶, 如蛋白酶,
淀粉酶, 纤维素酶等 。
? 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成 。
? 酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物 。
? 在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导
物, 例如淀粉, 糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化
酶的诱导物 。 只有添加这些物质的培养基, 才
能获得高产 。
(3)注意阻遏物或抑制剂的影响
? 培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物
均能影响酶的合成, 降低发酵产量 。
? 有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物
的产量, 最早利用抑制剂提高中间代谢
物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸
钠 。
? 在培养基配制时必须注意加入有益的抑
制剂, 而避免混入有害的抑制物 。
? 6,金属离子的影响,
? 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感, 因
为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活
剂 。
? 因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制 。
如柠檬酸发酵中铁, 锰和锌离子都能明显影响
产量, 钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用,
而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的, 这
些在培养基配制时都必须予以注意 。
四、培养基组成物质的营养与
作用
? 碳素化合物
? 氮素化合物
? 水
? 微量元素 (无机盐类 )
? 生长因子
碳素化合物 营养源对微生物生长发育的影响
(1)碳素化合物的作用
? 构成菌体成分的重要元素,
? 产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料,
? 同时又是化能异养型微生物的能量来源。
（ 2） 碳源种类
? 糖：单糖中的己糖, 寡糖中的蔗糖, 麦
芽糖, 棉子糖, 多糖中的淀粉, 纤维素,
半纤维素, 甲壳质和果胶质等, 其中淀
粉是大多数微生物都能利用的碳源 。
? 有机酸如糖酸, 柠檬酸, 反丁烯二酸,
琥珀酸, 苹果酸, 丙酮酸, 酒石酸等 。
? 醇类中甘露醇, 甘油, 低浓度的乙醇 。
? 脂肪酸如甲酸, 乙酸, 丙酸, 丁酸等低级脂肪
酸都可用作碳源 。 油酸和亚油酸等高级脂肪酸
可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用,
低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长, 但浓度
较高时往往有 毒害作用 。
? 正烷烃：一般是指从石油裂得到的 14C至 18C的
直链烷烃混合物 。
葡萄糖,
? 是最易利用的糖，并且作为加速微生物
生长的一种有效的糖。
? 过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，
以致培养基中的溶解氧不能满足需要。
? 糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，是蔗糖
厂的副产物。含有较丰富的糖、氨素化合物和
无机维生素等，是微生物工业的价廉物美的原
料。
? 淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖
后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。
来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、
小麦淀粉和甘薯淀。
? 油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用
下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参
与下，氧化成水和 CO2。因此用脂肪作
碳源时需比糖代谢供给更多的氧。
(2)氮素化合物
? 氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主
要元素, 而蛋白质和核酸是微生物原生
质的主要组成部分 。 氮素一般不提供能
量, 但硝化细菌却能利用氨作为氮源和
能源 。
? 就某一类微生物而言，由于其合成能力
的差异，对氮营养的需要也有很大区别。
? 氮的来源可分为无机氮和有机氮,
? 有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子
饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、
酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝
体和酒糟等。
? 它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，
水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。
? 有机氮源特点,
? 含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸
? 还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生
素及生长因子。
? 玉米浆：是玉米淀粉生产中的副产物，
其中固体物含量在 50％。还含有有机酸、
还原糖、磷、微量元素、生长素。
? 由于玉米浆的来源不同，加工条件
也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。
? 无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。
? 微生物对其吸收利用比有机物快，所以
也称速效氮。
? 利用无机氮时应注意引起的 pH变化。
? 实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏
等作为有机氮源，工业生产上常用硫酸
铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、
麸皮等原料作氮源。
(3)水
? （ 1） 水是良好的溶剂, 菌体所需要的营养物
质都是溶解于水中被吸收的 。
? （ 2） 渗透, 分泌, 排泄等作用都是以水为媒
介的；
? （ 3） 水直接参与代谢作用中的许多反应 。 所
以, 水在生物化学反应中占有极为重要的地位 。
? （ 4） 水的比热高, 能有效地吸收代谢过程中
所放出的热, 使细胞内温度不致骤然上升 。
? （ 5） 水是热的良导体, 有利于放热, 可调节
细胞的温度 。
(4)微量元素 (无机盐类 )
? 无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质 。
主要功用是,
? ① 构成菌体成分；
? ② 作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；
? ③ 调节渗透压, pH值, 氧化还 原电位等；
? ④ 作为自养菌的能源 。
? 无机元素包括主要元素 (又称大量元素 )和微量
元素两类, 这是依据微生物对它们需要量的大
小划分的 。
? 主要元素有 P,S,Mg,K,Ca等；
? 微量元素有 Fe,Cu,Mn,Zn,Mo,Co,B等 。
? 当盐浓度太高时, 对微生物生长有抑制作用,
而在较低浓度 时却能刺激生长 。
? 一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料
等都含有微量元素 。
? 磷,
? 是核酸和蛋白质的必要成分，也是 ATP
的成分。
? 在代谢途径调节方面，起着重要作用。
促进微生物生长，但过量时，许多产物
的合成受抑制。
? 钙：培养基中钙盐过多时，会形成磷酸
钙沉淀。可分别消毒或逐步补加。
? 镁：处于离子状态时，是许多酶的辅酶
的激活剂，不但影响基质的氧化，也影
响蛋白质的合成。以硫酸镁加入，但在
碱性溶液中会形成沉淀。
(5)生长因子
? 广义说, 凡是微生物生长不可缺少的微量有机
物质都称为生长因子 (又称生长素 ),包括氨基
酸, 嘌呤, 嘧啶, 维生素等；狭义说, 生长素
仅指维生素 。
? 与微生物有关的维生素主要是 B族维生素,
这些维生素是各种酶的活性基的组成部分, 没
有它们, 酶就不能活动 。
? 凡是缺少合成生长素类物质的微生物 (即缺少
了合成生长素 过程中的某种酶 ),统称为营养缺
陷型 。
五、培养基确定方法
? （ 1） 首先必须做好调查研究工作,
了解菌种的来源, 生活习惯, 生理生
化特性和一般的营养要求 。
? 工业生产主要应用细菌, 放线菌, 酵
母菌和霉菌四大类微生物 。 它们对营
养的要求既有共性, 也有各自的特性,
应根据不同类型微生物的生理特性考
虑培养基的组成 。
? （ 2） 其次, 对生产菌种的培养条件, 生
物合成的代谢途径, 代谢产物的化学性
质, 分子结构, 一般提炼方法和产品质
量要求等也需要有所了解, 以便在选择
培养基时做到心中有数 。
? （ 3） 最好先选择一种较好的化学合成培养基
做基础, 开始时先做一些摇瓶试验 ;
? 然后进一步做小型发酵罐培养, 摸索菌种对各
种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢
产物的能力 。
? 注意培养过程中的 pH变化, 观察适合于菌种生
长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同 pH，
不断调整配比来适应上述各种情况 。
? （ 4） 注意每次只限一个变动条件 。 有了初步结果
以后, 先确定一个培养基配比 。
? 其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵
的影响, 即对各种无机元素的营养要求, 试验其
最高, 最低和最适用量 。
? 在合成培养基上得出一定结果后, 再做复合培养
基试验 。
? 最后试验各种发酵条件和培养基的关系 。 培养基
内 pH可由添加碳酸钙来调节, 其他如硝酸钠, 硫
酸铵也可用来调节 。
? （ 5） 有些发酵产物, 如抗生素等, 除了
配制培养基以外, 还要通过中间补料法,
一面对碳及氮的代谢予以适当的控制,
一面间歇添加各种养料和前体类物质,
引导发酵走向合成产物的途径 。
? （ 6） 根据生产和科学研究的需要选择培养基
? 工业上, 液体深层培养具有占地面积小,
发酵效率高, 操作方便, 易于机械化相自动
化生产, 降低劳动强度等优点 。 所以, 发酵
工业中大多采用液体培养基培养种子和进行
液体发酵, 并根据微生物对氧气的要求, 分
别作表面静止培养或深层通气培养 。
? 实验室或制种车间进行固体培养常采
用试管, 扁瓶和培养皿 。 工业生产中也
常采用固体原料, 如小米, 大米, 铁皮,
马铃署等直接制作斜面, 或在茄子瓶表
面培养霉菌, 放线菌 。
? 具有设备简单, 投资少, 易推广等优点 。
? 大规模生产中, 固体培养的缺点是占地
面积多, 劳动强度大, 生产稳定性差 。
? (7)根据经济效益选择培并基原料
? 考虑经济节约, 尽量少用或不用主粮, 努力节
约用粮, 或以其他原料代粮 。
? 糖类是主要的碳源 。 碳源的代用方向主要是寻
找植物淀粉, 纤维水解物, 以废糖蜜代替淀粉,
糊精和葡萄糖, 以工业葡萄糖代替食用葡萄糖 。
同时, 使用稀薄的培养基, 适当减少碳氮配比
? 石油作为碳源的微生物发酵不但可以生产以粮
食为碳源的发酵产品 。
? 有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆
饼粉, 花生饼粉, 食用蛋白胨和酵母粉等含有
丰富蛋白质的原料 。
? 代用的原料可以是棉籽饼粉, 玉米浆, 蚕蛹粉,
杂鱼粉, 黄浆水或麸汁, 饲料酵母, 石油酵母,
骨胶, 菌体, 酒糟, 以及各种食品工业下脚料
等 。 这些代用品大多蛋白质含量丰富, 贷源充
足, 价格低廉, 便于就地取材, 方便运输 。
正交试验在培养基确定中的应用
因素水
平
玉米粉
（％）
A
豆饼粉
（％）
B
蛋白胨
（％）
C
PH
D
1
0.5
4
0.5
5.0
2
1.0
5
0.6
5.5
3
1.5
6
0.7
6.0
正交表因素水平
因素水
平
玉米粉
（％）
A
豆饼粉
（％）
B
蛋白胨
（％）
C
PH
D
1 0.5 4 0.5 5.0
2
1.0
5
0.6
5.5
3
1.5
6
0.7
6.0
第二节 培养工艺的确定方法
? 一、培养条件
? 二、菌种扩大培养
? 温度
? pH值
? 氧
? 种龄
? 接种量
一、培养条件
1．温度
? 通常在生物学范围内每升高 10℃, 生长速度就加
快一倍, 所以温度直接影响酶反应, 对于微生物
来说, 温度直 接影响其生长和合成酶 。
? 机体的重要组成如蛋白质, 核酸等都对温度较敏
感, 随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏 。
? 微生物可生长的温度范围较广, 总体说在 -10—
95℃ 。
温度
? 任何微生物的牛长都需要有最适的生长
温度, 在此温度范围内微生物生长繁殖
最快 。
? 如果所培养的微生物能承受稍高一些的
温度进行生长和繁殖, 这对生产有很大
的好处, 即可减少污染杂菌的机会和夏
季培养所需降温的辅助设备, 因此培养
耐高温的菌种有一定的生产现实意义 。
2,pH值
? 培养基中的 pH值与微生物生命活动有着密切关
系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的
pH范围。
? 微生物通过其活动也能改变环境的 pH值 。
? 发酵过程中, 控制发酵液的 pH值是控制生产
的指标之一, pH值过高, 过低都会影响微生物
的生长繁殖以及代谢产物的积累 。
? 控制 pH值不但可以保证微生物良好的生长, 而
且可以防止杂菌的污染 。
? 培养基 pH在发酵过程中能被菌体代谢所改
变 。 若阴离子 (如醋酸根, 磷酸根 )被吸收
或氮源被利用后产生 NH3, 则 pH上升；阳
离子 (如 NH4,K+ )被吸收或有机酸的积累,
使 pH下降 。
? 一般来说, 高碳源培养基倾向于向酸性 pH
转移, 高氮源培养基倾向于向碱性 pH转移,
这都跟碳氮比直接有关 。
3．氧
? 微生物对氧的需要不同, 是由于依赖获
得能量的代谢方面的差异 。 好气性菌主
要是有氧呼吸或氧化代谢, 厌气菌为厌
气发酵 (分子间呼吸 ),兼性厌气菌则两者
兼而有之 。
? 不同微生物或同一微生物的不同生长
阶段对通风量的要求也不相同 。
通风和搅拌
? 通气可以供给大量的氧 。
? 通气量与菌种, 培养基性质, 培养阶段
有关 。
? 通气量的多少, 最好按氧溶解的多少来
决定 。 只有氧溶解的速度大于菌体的吸
氧量时, 菌体才能正常地生长和合成酶 。
因此随着菌体繁殖, 呼吸增强, 必须按
菌体的吸氧量加大通气量, 以增加溶解
氧的量 。
? 搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液
混合, 保证氧的最大限度溶解, 并且
搅拌有利于热交换, 使培养液的温度
一致, 还有利于营养物质和代谢物的
分散 。 此外, 挡板则有助于搅拌, 使
其效果更好 。
? 一般来说, 若培养罐深, 搅拌转速大, 通气管
开孔小或多, 气泡在培养液内停留时间就长,
氧的溶解速度就大, 而且在这些因素确定下,
培养基的粘度越小, 氧的溶解速度也越大 。
? 搅拌可以提高通气效果, 但是过度地剧烈搅拌
会导致培养液大量涌泡, 容易增加杂菌污染的
机会, 液膜表层的酶容易氧 化变性, 微生物细
胞也不宜剧烈搅拌 。
种龄与接种量
? 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜,
菌种过嫩或过老, 不但延长发酵周期,
而且会降低产量 。
? 接种量的大小直接影响发酵周期 。
? 大量地接入培养成熟的菌种的优点,
? 1.可以缩短生长过程的延缓期, 因而缩短了发酵周
期, 提高了设备利用率,
? 2,节约了发酵培养的动力消耗,
? 3.并有利于减少染菌机会,
? 一般都将菌种扩大培养, 进行两级发酵或三级发酵 。
? 接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比 。
? 接种量过多也无必要 。 因培养种子费时, 而且过多
地移人代谢废物, 反而 会影响正常发酵 。
二、菌种扩大培养
工业微生物菌种培养的类型
? 工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两
大类型 。
? 静置培养法即将培养基盛于发酵容器中, 在接
种后, 不通空气进行发酵, 又称为嫌气性发酵 。
? 通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌
居多, 它们生长的环境必须供给空气, 以维持一
定的溶解氧水平, 使菌体迅速生长和发酵, 又称
为好气性发酵 。
? 在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养
和固体培养两大类型, 其中每一类型又有表面 培
养与深层培养之分 。
(三）主要培养方法及特点
? 1,种子扩大培养阶段
? (1)液体培养法 包括液体试管, 三角瓶摇床
振荡或回旋式培养 。 摇瓶通气量大小与摇瓶机
型式, 转数, 振程 (或偏心距 ),三角瓶容量,
装料量有关 。
? (2)表面培养法 包括茄子瓶, 克氏瓶或瓷盘
培养 。
? (3)固体培养法 包括三角瓶, 蘑菇瓶, 克氏
瓶, 培养皿等麸皮培养 。
2．大规模生产阶段
? (1)表面培养
? (2)固体培养
? (3)液体深层培养
? (4)载体培养
(1)表面培养
? 表面培养是一种好氧静置培养方法
? 针对容器内培养基物态又分为液态表面
培养和固态表面培养 。
? 相对于容器内培养基体积而言, 表面积
越大, 越易促进氧气由气液 (气固界面向
培养基内传递, 包括茄子瓶, 克氏瓶或
瓷盘培养 。
? 这种培养方法菌的生长速度与培养基深
度有关, 单位体积的表面积越大, 生长
速度也越快 。
? 氧的供给常成为发酵的限速因素, 所以
发酵周期长, 占地面积大 。
? 优点是不需要深层培养时的搅拌和通气,
节省动力 。 如醋酸, 柠檬酸发酵和曲盘
制曲 。
? 固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体
培养, 统称曲法培养 。 它起源于我国酿造
生产特有的传统制曲技术 。 其最大特点是
固体曲的酶活力高 。
(2)固体培养
? 固体培养具有以下优点,
①原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适
量水分、无机盐等。培养基组成简单。
② 防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进
行增殖的特性, 在这种条件下, 细菌生长不好, 因
此不易引起细菌污染 。
③ 通气：无论浅盘或深层固体通风制曲, 可以在曲房
周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度,
并且能根据菌种在不同生理时期的需要, 灵活加以
调节 。 在固体培养中, 氧气是由基质粒子间空隙的
空气直接供给微生物, 比液体培养时的用通气 搅拌
供给氧气节能 。
(3)液体深层培养
? 用液体深层发酵罐从罐底部通气, 送入的空气
由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解 。
这种由罐底部通气搅拌的培养方法, 相对于由
气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来
讲, 称为深层培养法 。
? 特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求
以及不同生理时期的通气, 搅拌, 温度, 与培
养基中氢离子浓度等条件, 选择最佳培养条件 。
深层培养基本操作的 3个控制点
? ① 灭菌：发酵工业要求纯培养, 因此在
发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌 。
所以发酵罐具有蒸汽夹套, 以便将培养
基和发酵罐进行加热灭菌, 或者将培养
基由连续加热灭菌器灭菌, 并连续地输
送于发酵罐内 。
? ② 温度控制：培养基灭菌后, 冷却至培养温度
进行发酵, 由于随着微生物的增殖和发酵会发
热, 搅拌产热等, 所以为维持温度恒定, 须在
夹套中以冷却水循环流过 。
? ③ 通气, 搅拌：空气进入发酵罐前先经空气
过滤器除去杂菌, 制成无菌空气, 而后由罐底
部进人, 再通过搅拌将空气分散成微小气泡 。
为了延长气泡滞留时间, 可在罐内装挡板产生
涡流 。 搅拌的目的除了溶解氧之外, 可使培养
液中微生物均匀地分散在发酵罐内, 促进热传
递, 以及为调节 pH而使加入的酸和碱均匀分散
等 。
几种深层培养法
? ① 放大法
? ②两步法
? ③控制培养法
? ④分批发酵法 (间歇发酵法 )
? ⑤ 连续培养法
? ⑥补料分批培养法 (流加法 )
① 放大法,
? 将微生物在摇瓶基础上逐级放大以实现
大规模生产 。
? 在厌气发酵时问题归结为如何从大型发
酵罐中除去发酵热 。 为此考虑到如何利
用发酵时生成的二氧化碳引起的液体流
动和辅助搅拌, 以提高冷却效率, 这只
需进行发酵罐传热面积的设计即可 。
? 但在好氧培养中, 大多以氧的供给为基准进行
放大 。 一般从实验室规模到工厂生产要经过
3— 5级放大步骤 。
? 放大过程中应考虑,
? a,氧传递速度相等 。
? b,比较搅拌桨叶顶端速度 。
? c,比较单位液量所需的搅拌动力 。
? d,混合时间相同 。
? e,雷诺准数相同 。
? f,通过反馈控制尽量能使重要环境因子一致 。
② 两步法
? ② 两步法：酶制剂生产两步法的特点是将菌体
生长条件 (营养期 )与产酶条件 (自我繁殖期 )区分
开来 。 菌种先在丰富的培养基上大量繁殖, 然
后收集菌体浓缩物, 洗涤后再转入添加诱导物
的产酶培养基, 在此期间, 菌体积累大量的酶,
一般不再繁殖, 营养成分或诱导物得到充分利
用 。
? 在氨基酸的两步法液体深层培养中, 每一步
菌种和培养基等均不相同 。 第一步属有机酸发
酵或氨基酸发酵 。 第二步是在微生物产生的某
种酶作用下把第一步的产物转化为所需的氨基
酸, 这 种生产方法又称为酶转化法 。
③ 控制培养法
? 了解发酵罐内部的变化情况, 掌握短暂时间内
状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微
生物代谢活动的影响, 并以此为基础进行控制
培养, 以达到产物生成的最优培养条件 。
? 用测定状态变量的传感器取得数据, 经电子计
算机进行综合分析, 再将其结果作为反馈调节
的信号, 将环境 (培养条件 )控制于给定的基准
内 。 这就叫做电子计算机控制发酵 。 目前已大
量用于露天大罐啤酒发酵 。
④ 分批发酵法 (间歇发酵法 )
? 先将空罐杀菌, 培养基装入发酵罐, 接
种之后进行培养, 在培养过程中, 培养
基成分减少, 微生物增殖 。 微生物周围
的环境随时间而变化, 是一种非稳态操
作法 。
? 此法不易染菌, 但很难采用控制基质等
浓度的方法来增大 发酵生产能力 。 目前
多用在酒精, 氨基酸, 抗生素生产中 。
⑤ 连续培养法
? 在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时, 将
含有微生物和产物的培养液, 从发酵罐中连续
放出, 叫做连续培养法 。
? 其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进
行长期持续的培养, 该系统的稳态被叫做恒化
器 。 同时包含了流入和流出, 属开放系统, 故
变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大 。 从
技术上也很难保证流入和流出速度的一致 。
? 连续培养用于废水处理, 葡萄糖酸发酵, 酒精
发酵等工业中 。
⑥ 补料分批培养法 (流加法 )
? 在分批培养时, 不断地供给培养基, 但
所需产物不到一定时刻不放出的方法,
称为补料分批 培养法 。
? 用于面包酵母, 氨基酸, 抗生素等工业 。
(4)载体培养
? 载体培养脱胎于曲法培养, 同时又吸收了液体培
养的优点, 是近年来新发展的一种培养方法 。
? 特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之
类的固态基质作为微生物的载体, 营养成分可以
严格控制, 发酵结束, 只需将菌体和培养液挤压
出来进行抽提, 载体又可以重新使用 。
? 载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌, 多孔结
构既有足够 的表面积, 又能允许空气流通 。
3．影响种子培养的条件
? 菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的
扩大培养 。
? 影响种子罐培养的主要因素包括营养条
件, 培养条件, 染菌的控制, 种子 的级
数和接种量控制等 。
泡沫
? （ 1） 泡沫的作用,
? 培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和
合成酶有关, 泡沫的持久存在影响着微生
物对氧的吸收；
? 妨碍二氧化碳的排除, 因而破坏其生理代
谢的正常进行, 不利于发酵；
? 由于泡沫大量生成, 致使培养液的容量一
般只能等于种子罐容量的一半左右, 大大
影响了设备的利用率, 甚至发生跑料, 招
致染菌, 造成巨大损失 。
? （ 2） 产生泡沫的原因
? 通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入, 形成
气泡；
? 培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动
产生气泡；
? 培养基中某些成分 (如蛋白质及其他胶体物质 )
的分子, 在气泡表面排列形成坚固的薄膜 。 因
此, 气泡不易破裂, 聚成泡沫层 。
? （ 3） 培养过程的消泡措施
? 机械法
? 化学法 。 发酵工业常用的消泡剂, 有各种天然的
动植物油及来自石油化工生产的矿物油, 改性油,
表面活性剂等 。 而新型的有机硅聚合物如硅油,
硅树脂等, 则具有效率高, 用量省, 无毒性, 无
代谢性, 同时兼有提高微生物合成酶等多种优良
特性, 是一类有发展前途的消泡剂 。
? 泡沫的控制除了添加消泡剂外, 改进培养基成分
也是相辅相成的一个重要方面 。
染菌的控制
? （ 1） 染菌的原因
? 归结起来是：设备, 管道, 阀门漏损, 灭菌不
彻底；
? 空气净化不好；
? 无菌操作不严或菌种不纯等 。
? （ 2） 染菌的控制
? 必须加强接种室的消毒管理工作, 定期检查消毒效
果, 严格无菌操作技术 。
? 如果新菌种不纯, 则需反复分离, 直至完全纯粹为
止 。 对于已出现杂菌菌落或噬菌斑的试管斜面菌种,
应予废弃 。 在平时应经常分离试管菌种, 以防菌种
衰退, 变异和污染杂菌 。
? 对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制, 对种子
质量更要严格掌握, 必要时可将种子罐冷却, 取样
做纯种试验, 确证种子无杂菌存在, 才能向发酵培
养 基中接种 。
种子罐级数的确定
? 种子罐的级数愈少, 愈有利于简化
工艺及控制
? 并可减少种子罐污染杂菌的机会
? 减少消毒及值班工作量
? 减少因种子罐生长异常而造成的发
酵波动 。
确定方法
? 菌种的性质 (如菌种传代后的稳定性 )
? 孢子瓶中的孢子数, 孢子发芽及菌丝繁
殖速度
? 发酵罐中种子培养液的最低接种量
? 种子罐与发酵罐的容积比 。
? 随产物的品种及生产规模而定
? 随着工艺条件的改变作适当的调整 。
第三节 厌氧培养
? 厌氧培养在发酵工业研究上是很重要的, 发酵
工业中的制酒等混合发酵过程有大量厌氧微生
物的有益作用, 特别是对己酸菌, 丁酸菌, 甲
烷菌等的研究 。
? 细菌在有氧环境中进行代谢时, 常产生超氧离
子 (O-)与过氧化氢 (H202),有强烈的杀菌作用 。
厌氧菌过氧化氢酶 )和过氧化物酶, 不能破坏超
氧离子和 H202,易被杀伤, -故在有氧时不能生
长 。
?
厌氧培养的方法
? (1) 深层穿刺分离培养：用一根 18-
20mm直径的玻璃管, 截成 180-200mm
长, 洗净烘干 。 一头塞入橡皮塞, 加
入 2/3管长的营养琼脂, 塞上胶塞或塑
料帽, 灭菌, 凉至凝固 。 穿刺接 |种或
待分离物 。 培养后可见到生长的厌氧
微生物菌落 。 此时拔出橡皮塞, 用无
菌刀切割, 分离再培养 。 此法对于一
般厌氧微生物适用 。
? (2)深层穿刺与化学吸氧相结合：深层穿
刺后, 在培养基上部加一层非脱脂棉,
再加一层脱脂棉, 上面加入焦性没食子
酸和 Na2℃ O3粉末的混合物, 用胶塞或塑
料帽盖紧 。 焦性没食子酸和 Na2℃ O3在有
湿气 (即水分 )存在的条件下缓慢作用吸氧
和放出 CO2,造成厌氧状态, 强化了厌氧
条件 。
? (3)液体培养基法：液体培养基法主要是
在培养基中加入一定的还原物质并隔绝
空气 。 常见的有庖肉培养基法, 硫乙醇
酸钠法, 牛心脑浸液培养基法等 。
? (4)厌氧罐培养法,
? 碱 性 焦 性 没 食 子 酸 法, 焦 性 没 食 子 酸 与
Na2℃ O3反应可释放出 ℃ O2并吸收环境中的氧 。
? ⑤ 厌氧箱培养法：厌氧培养箱由厌氧环境操作
箱、恒温培养箱、高度真空传递箱、气路控制
系统、箱架、瓶架等部分组成。培养箱的温度
能自行调节控制，气路安排合理，能任意输入
所需气体和准确调节流量。箱内备有紫外灯，
可消毒操作室内空气。使用厌氧培养箱进行厌
氧微生物分离培养时，整个操作过程可在正压
℃ O2或氮气下进行，使整个接种过程在无氧状
态。因此，厌氧培养箱在分离，研究极端专性
厌氧菌时更有其优势。
? 主讲人：刘萍
第三章 发酵工艺条件的确定
? 第一节 培养基的选择和确定
? 第二节 培养条件的确定
第一节 培养基的选择和确定
? 一,培养基的营养成分
? 二、培养基的用途
? 三、发酵培养基的选择
? 四,培养基成分的营养 与作用
? 五,培养基确定 方 法
? 六、正交试验在培养基确定中的应用
一,培养基的营养成分
? 微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的
酶．将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂
肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细
胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养来实现
的。
? 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和
产物合成所需的能源，包括 碳源、氮源、无机
元素、生长因子及水、氧气 等。对于大规模发
酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须
重视培养基 原料的价格和来源 。
微生物的营养来源
? （ 1）能源
? 自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚
铁盐。
? 异养菌：碳水化合物等有机物，石油
天然气和石油化工产品，如醋酸。
? （ 2）碳源,
? 碳酸气；
? 淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液
等
? 石油、正构石蜡，天然气
? 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品
? （ 3）氮源
? 豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，
酒糟水等有机氮
? 尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐等无机氮
? 气态氮
? (4)无机盐
? 磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等其他矿盐
? 铁、锰、钴等微量元素
? 其他
? （ 5）特殊生长因子
? 硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇
等
二、培养基的用途
? 筛选菌种
? 保藏菌种
? 检验杂菌
? 培养种子
? 发酵 生产
（一）、培养基的分类
（二）、发酵生产中的
培养基类型
（一）、培养基的分类
? （ 1） 按培养基组成物质的化学成分
? 合成培养基, 天然培养基 。
? （ 2） 按物理性质
? 固体, 液体
? （ 3） 按用途
? 选择性培养基, 鉴别培养基, 富集培养
基等
? （ 1） 天然培养基
? 是采用化学成分还不清楚或化
学成分还不恒定的各种植物和动物
组织或微生物的浸出物, 水解液等
物质 (例如牛肉膏, 酵母膏, 麦芽汁,
蛋白胨等 )制成的 。
? 适合于各类异养微生物生长,
而一般自养微生物都不能生长 。
（ 2）合成培养基
? 是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成
的 。 成分精 确, 重复性强, 可以减少不能控制
的因素
? 适用于在实验室范围作有关营养, 代谢,
分类鉴定, 生物测定及选育菌种, 遗传分析等
定量研究工作 。
? 但一般微生物在合成培养基上生长较慢,
有些微生物营养要求复杂, 在合成培养基上不
能生长 。
（ 3）半合成培养基
? 多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳
源, 氮源和生长因子的来源, 再适当加入一些
化学药品以补充无机盐成分, 使其更能充分满
足微生物对营养的需要 。
? 大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖 。 因
此, 在微生物工业生产上和试验研究中被广泛
使用 。
? （ 1） 液体培养基：常用于大规模的工业
生产及生理代谢等基本理论研究工作 。
? 发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基 。
? 根据微生物对氧的要求情况, 分别作静止
或通风搅拌培养 。
? 在菌种筛选工作和菌种培养工作中, 也常
用液体培养基进行摇瓶培养
? 微生物在液体培养基中生长的情况有时也
可用作鉴定菌种的参考 。
生理代谢
菌种筛选 种子培养
发酵培养
? （ 2） 固体培养基
? 分类：斜面试管, 平板等
? 是在液体培养基中加入凝固剂配
成的, 最常用的凝固剂是琼脂 。
? 作用,
? 固体培养基在菌种的分
离, 保藏, 菌落特征的观察,
活菌计数和鉴定菌种方面是
不可缺少的 。
? 在制曲, 酶制剂, 柠檬
酸等生产中, 用来培养霉菌
等的固体种子和发酵培养基
是由麸皮等农作物加无机元
素等制成的 。
? 增殖培养基：可以配制成适合某种微生
物生长而不适合其他微生物生长, 从而
达到从自然界分离这种微生物的目的 。
? 鉴别培养基：是根据微生物能否利用培
养基中某种营养成分, 借助指示剂的显
色反应, 以鉴别不同种类的微生物 。
? 选择培养基：是在培养基内加入某种化
学物质以抑制不需要菌的生长, 而促进
某种需要菌的生长 。
（二）、发酵生产中的培养基
类型
? 工业发酵中培养基往往是依据生产
流程和作用分为,
? 斜面培养基
? 种子培养基
? 发酵培养基
? 摇瓶培养基
1．斜面培养基
? 作用：这是供微生物细胞生长繁殖用
的, 包括细菌, 酵母等的斜面培养基
以及霉菌, 放线菌生孢子培养基或麸
曲培养基等 。 这类培养基主要作用是
供给细胞生长繁殖所需的各类营养物
质 。
? 特点,
? 1.富含有机氮源, 少含或不含糖分 。 有机氮有
利于菌体的生长繁殖, 能获得更多的细胞 。
? 2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基, 则氮源
和碳源均不宜太丰富, 否则容易长菌丝而较少
形成孢子 。
? 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类, 供给必要
的生长因子和微量元素 。
2．种子培养基 (包括摇瓶种子和小罐
种子培养基 ),
? 培养种子的目的,
? 1.扩大培养, 增加细胞数量；
? 同时也必须培养出强壮, 健康, 活性高
的细胞 。 为了使细胞迅速进行分裂或菌
丝快速生长 。
? 种子培养基特点,
? 1,必须有较完全和丰富的营养物质, 特别需要
充足的氮源和生长因子 。
? 2,种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高 。
供孢子发芽生长用的种子培养基, 可添加一些
易被吸收利用的 碳源和氮源 。
? 3,种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主
要成分相近 。
3．发酵培养基
? 发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基, 它
不仅耗用大量的原材料, 而且也是决定发酵生
产成功与否的重要因素 。
? （ 1） 根据产物合成的特点来设计培养基,
对菌体生长与产物相偶联的发酵类型, 充
分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的
产物 。
对于生产氨基酸等含氮的化合物时, 它的
发酵培养基除供给充足的碳源物质外, 还应该
添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物 。
（ 2） 发酵培养基的各种营养物质的浓度应
尽可能高些, 这样在同等或相近的转化
率条件下有利于提高单位容积发酵罐的
利用率, 增加经济效益 。
? （ 3） 发酵培养基需耗用大量原料, 因此,
原料来源, 原材料的质量以及价格等必
须予以重视 。
三、发酵培养基的选择
? (1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的 基
本成分 。
? (2)有利于 减少培养基原料的单耗, 即提高单
位营养物质所合成产物数量或最大产率 。
? (3)有利于 提高培养基和产物的浓度, 以提高
单位容积发酵罐的生产能力 。
? (4)有利于 提高产物的合成速度, 缩短发酵周
期 。
? (5)尽量减少副产物的形成, 便于产物的
分离纯化 。
? (6)原料价格低廉, 质量稳定, 取材容易 。
? 7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通
气搅拌的影响, 利于提高氧的利用率,
降低能耗 。
? (8)有利于产品的分离纯化, 并尽可能减
少产生, 三废, 的物质 。
发酵培养基的设计和注意事项
? 1,提供必要的营养成分：培养基成分必
须满足细胞生长, 代谢活动和合成产物
所需的基本要求 。
? 2,配制合适的浓度：可以从发酵动力学
有关生长, 产物合成和基质利用物料平
衡的关系中大致推算所需原料或大致计
算出所需主要原料的需要量 。
? 3,主成分与其他成分的配比 。
? 4,控制合适的 pH：微生物的生长繁殖或
产物的合成往往需要 — 定的 pH环境, 在
最适 pH值下有利于加快各种酶的反应 。
因此在整个发酵过程中应使培养基的 pH
适合于微生物生长或产物合成所需 。
pH的具体控制方法
? 1,可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加
某些营养物质调节培养基的 pH,但更应在配制
培养基时考虑所用营养物质的组成成分, 使其
pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要 。
? 2,还要注意有些营养物质被利用后培养基的 pH
变化情况,
? 3,控制 pH最常用的方法是在培养基中添
加具有一定缓冲能力的物质作为营养物,
如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使
用容易产生生理酸性或碱性使培养基 pH
波动太大的物质 。
? 4,避免产生微生物不能利用的物质或形成沉
淀
? 葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作
用形成深褐色物质 。 这种物质不被微生物利用 。
因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌,
而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内 。
? 硫酸铵中的 SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙,
因此二者也不宜直接配成培养基 。
? 5,注意代谢调节物的影响,
? 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或
抑制发酵产物的形成 。
? 前体物质
? 诱导剂
? 阻遏物
? 抑制剂
? 金属离子
(1)添加有关前体物质,
? 前作物质：是指当添加到发酵培养基中
的某些化学物质基本上不改变其分子结
构而直接进入产物中的小分子物质, 从
而在一定条件下控制产物的合成方向和
提高产量 。
? 在发酵中添加前体物质将有利于产物的
合成和显著提高产量, 如苯乙酸及其衍
生物被认为是青霉素的前体物质 。
(2)添加诱导物,
? 目前工业用微生物酶多数为诱导酶, 如蛋白酶,
淀粉酶, 纤维素酶等 。
? 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成 。
? 酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物 。
? 在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导
物, 例如淀粉, 糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化
酶的诱导物 。 只有添加这些物质的培养基, 才
能获得高产 。
(3)注意阻遏物或抑制剂的影响
? 培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物
均能影响酶的合成, 降低发酵产量 。
? 有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物
的产量, 最早利用抑制剂提高中间代谢
物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸
钠 。
? 在培养基配制时必须注意加入有益的抑
制剂, 而避免混入有害的抑制物 。
? 6,金属离子的影响,
? 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感, 因
为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活
剂 。
? 因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制 。
如柠檬酸发酵中铁, 锰和锌离子都能明显影响
产量, 钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用,
而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的, 这
些在培养基配制时都必须予以注意 。
四、培养基组成物质的营养与
作用
? 碳素化合物
? 氮素化合物
? 水
? 微量元素 (无机盐类 )
? 生长因子
碳素化合物 营养源对微生物生长发育的影响
(1)碳素化合物的作用
? 构成菌体成分的重要元素,
? 产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料,
? 同时又是化能异养型微生物的能量来源。
（ 2） 碳源种类
? 糖：单糖中的己糖, 寡糖中的蔗糖, 麦
芽糖, 棉子糖, 多糖中的淀粉, 纤维素,
半纤维素, 甲壳质和果胶质等, 其中淀
粉是大多数微生物都能利用的碳源 。
? 有机酸如糖酸, 柠檬酸, 反丁烯二酸,
琥珀酸, 苹果酸, 丙酮酸, 酒石酸等 。
? 醇类中甘露醇, 甘油, 低浓度的乙醇 。
? 脂肪酸如甲酸, 乙酸, 丙酸, 丁酸等低级脂肪
酸都可用作碳源 。 油酸和亚油酸等高级脂肪酸
可被不少放线菌和真菌作为碳源和能源利用,
低浓度的高级脂肪酸可刺激细菌生长, 但浓度
较高时往往有 毒害作用 。
? 正烷烃：一般是指从石油裂得到的 14C至 18C的
直链烷烃混合物 。
葡萄糖,
? 是最易利用的糖，并且作为加速微生物
生长的一种有效的糖。
? 过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，
以致培养基中的溶解氧不能满足需要。
? 糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，是蔗糖
厂的副产物。含有较丰富的糖、氨素化合物和
无机维生素等，是微生物工业的价廉物美的原
料。
? 淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖
后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。
来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、
小麦淀粉和甘薯淀。
? 油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用
下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参
与下，氧化成水和 CO2。因此用脂肪作
碳源时需比糖代谢供给更多的氧。
(2)氮素化合物
? 氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主
要元素, 而蛋白质和核酸是微生物原生
质的主要组成部分 。 氮素一般不提供能
量, 但硝化细菌却能利用氨作为氮源和
能源 。
? 就某一类微生物而言，由于其合成能力
的差异，对氮营养的需要也有很大区别。
? 氮的来源可分为无机氮和有机氮,
? 有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子
饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、
酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝
体和酒糟等。
? 它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，
水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。
? 有机氮源特点,
? 含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸
? 还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生
素及生长因子。
? 玉米浆：是玉米淀粉生产中的副产物，
其中固体物含量在 50％。还含有有机酸、
还原糖、磷、微量元素、生长素。
? 由于玉米浆的来源不同，加工条件
也不同，因此玉米浆的成分有较大波动。
? 无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。
? 微生物对其吸收利用比有机物快，所以
也称速效氮。
? 利用无机氮时应注意引起的 pH变化。
? 实验室中常用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏
等作为有机氮源，工业生产上常用硫酸
铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、
麸皮等原料作氮源。
(3)水
? （ 1） 水是良好的溶剂, 菌体所需要的营养物
质都是溶解于水中被吸收的 。
? （ 2） 渗透, 分泌, 排泄等作用都是以水为媒
介的；
? （ 3） 水直接参与代谢作用中的许多反应 。 所
以, 水在生物化学反应中占有极为重要的地位 。
? （ 4） 水的比热高, 能有效地吸收代谢过程中
所放出的热, 使细胞内温度不致骤然上升 。
? （ 5） 水是热的良导体, 有利于放热, 可调节
细胞的温度 。
(4)微量元素 (无机盐类 )
? 无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质 。
主要功用是,
? ① 构成菌体成分；
? ② 作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；
? ③ 调节渗透压, pH值, 氧化还 原电位等；
? ④ 作为自养菌的能源 。
? 无机元素包括主要元素 (又称大量元素 )和微量
元素两类, 这是依据微生物对它们需要量的大
小划分的 。
? 主要元素有 P,S,Mg,K,Ca等；
? 微量元素有 Fe,Cu,Mn,Zn,Mo,Co,B等 。
? 当盐浓度太高时, 对微生物生长有抑制作用,
而在较低浓度 时却能刺激生长 。
? 一般在复合培养基中由于加入许多动植物原料
等都含有微量元素 。
? 磷,
? 是核酸和蛋白质的必要成分，也是 ATP
的成分。
? 在代谢途径调节方面，起着重要作用。
促进微生物生长，但过量时，许多产物
的合成受抑制。
? 钙：培养基中钙盐过多时，会形成磷酸
钙沉淀。可分别消毒或逐步补加。
? 镁：处于离子状态时，是许多酶的辅酶
的激活剂，不但影响基质的氧化，也影
响蛋白质的合成。以硫酸镁加入，但在
碱性溶液中会形成沉淀。
(5)生长因子
? 广义说, 凡是微生物生长不可缺少的微量有机
物质都称为生长因子 (又称生长素 ),包括氨基
酸, 嘌呤, 嘧啶, 维生素等；狭义说, 生长素
仅指维生素 。
? 与微生物有关的维生素主要是 B族维生素,
这些维生素是各种酶的活性基的组成部分, 没
有它们, 酶就不能活动 。
? 凡是缺少合成生长素类物质的微生物 (即缺少
了合成生长素 过程中的某种酶 ),统称为营养缺
陷型 。
五、培养基确定方法
? （ 1） 首先必须做好调查研究工作,
了解菌种的来源, 生活习惯, 生理生
化特性和一般的营养要求 。
? 工业生产主要应用细菌, 放线菌, 酵
母菌和霉菌四大类微生物 。 它们对营
养的要求既有共性, 也有各自的特性,
应根据不同类型微生物的生理特性考
虑培养基的组成 。
? （ 2） 其次, 对生产菌种的培养条件, 生
物合成的代谢途径, 代谢产物的化学性
质, 分子结构, 一般提炼方法和产品质
量要求等也需要有所了解, 以便在选择
培养基时做到心中有数 。
? （ 3） 最好先选择一种较好的化学合成培养基
做基础, 开始时先做一些摇瓶试验 ;
? 然后进一步做小型发酵罐培养, 摸索菌种对各
种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢
产物的能力 。
? 注意培养过程中的 pH变化, 观察适合于菌种生
长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同 pH，
不断调整配比来适应上述各种情况 。
? （ 4） 注意每次只限一个变动条件 。 有了初步结果
以后, 先确定一个培养基配比 。
? 其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵
的影响, 即对各种无机元素的营养要求, 试验其
最高, 最低和最适用量 。
? 在合成培养基上得出一定结果后, 再做复合培养
基试验 。
? 最后试验各种发酵条件和培养基的关系 。 培养基
内 pH可由添加碳酸钙来调节, 其他如硝酸钠, 硫
酸铵也可用来调节 。
? （ 5） 有些发酵产物, 如抗生素等, 除了
配制培养基以外, 还要通过中间补料法,
一面对碳及氮的代谢予以适当的控制,
一面间歇添加各种养料和前体类物质,
引导发酵走向合成产物的途径 。
? （ 6） 根据生产和科学研究的需要选择培养基
? 工业上, 液体深层培养具有占地面积小,
发酵效率高, 操作方便, 易于机械化相自动
化生产, 降低劳动强度等优点 。 所以, 发酵
工业中大多采用液体培养基培养种子和进行
液体发酵, 并根据微生物对氧气的要求, 分
别作表面静止培养或深层通气培养 。
? 实验室或制种车间进行固体培养常采
用试管, 扁瓶和培养皿 。 工业生产中也
常采用固体原料, 如小米, 大米, 铁皮,
马铃署等直接制作斜面, 或在茄子瓶表
面培养霉菌, 放线菌 。
? 具有设备简单, 投资少, 易推广等优点 。
? 大规模生产中, 固体培养的缺点是占地
面积多, 劳动强度大, 生产稳定性差 。
? (7)根据经济效益选择培并基原料
? 考虑经济节约, 尽量少用或不用主粮, 努力节
约用粮, 或以其他原料代粮 。
? 糖类是主要的碳源 。 碳源的代用方向主要是寻
找植物淀粉, 纤维水解物, 以废糖蜜代替淀粉,
糊精和葡萄糖, 以工业葡萄糖代替食用葡萄糖 。
同时, 使用稀薄的培养基, 适当减少碳氮配比
? 石油作为碳源的微生物发酵不但可以生产以粮
食为碳源的发酵产品 。
? 有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆
饼粉, 花生饼粉, 食用蛋白胨和酵母粉等含有
丰富蛋白质的原料 。
? 代用的原料可以是棉籽饼粉, 玉米浆, 蚕蛹粉,
杂鱼粉, 黄浆水或麸汁, 饲料酵母, 石油酵母,
骨胶, 菌体, 酒糟, 以及各种食品工业下脚料
等 。 这些代用品大多蛋白质含量丰富, 贷源充
足, 价格低廉, 便于就地取材, 方便运输 。
正交试验在培养基确定中的应用
因素水
平
玉米粉
（％）
A
豆饼粉
（％）
B
蛋白胨
（％）
C
PH
D
1
0.5
4
0.5
5.0
2
1.0
5
0.6
5.5
3
1.5
6
0.7
6.0
正交表因素水平
因素水
平
玉米粉
（％）
A
豆饼粉
（％）
B
蛋白胨
（％）
C
PH
D
1 0.5 4 0.5 5.0
2
1.0
5
0.6
5.5
3
1.5
6
0.7
6.0
第二节 培养工艺的确定方法
? 一、培养条件
? 二、菌种扩大培养
? 温度
? pH值
? 氧
? 种龄
? 接种量
一、培养条件
1．温度
? 通常在生物学范围内每升高 10℃, 生长速度就加
快一倍, 所以温度直接影响酶反应, 对于微生物
来说, 温度直 接影响其生长和合成酶 。
? 机体的重要组成如蛋白质, 核酸等都对温度较敏
感, 随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏 。
? 微生物可生长的温度范围较广, 总体说在 -10—
95℃ 。
温度
? 任何微生物的牛长都需要有最适的生长
温度, 在此温度范围内微生物生长繁殖
最快 。
? 如果所培养的微生物能承受稍高一些的
温度进行生长和繁殖, 这对生产有很大
的好处, 即可减少污染杂菌的机会和夏
季培养所需降温的辅助设备, 因此培养
耐高温的菌种有一定的生产现实意义 。
2,pH值
? 培养基中的 pH值与微生物生命活动有着密切关
系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的
pH范围。
? 微生物通过其活动也能改变环境的 pH值 。
? 发酵过程中, 控制发酵液的 pH值是控制生产
的指标之一, pH值过高, 过低都会影响微生物
的生长繁殖以及代谢产物的积累 。
? 控制 pH值不但可以保证微生物良好的生长, 而
且可以防止杂菌的污染 。
? 培养基 pH在发酵过程中能被菌体代谢所改
变 。 若阴离子 (如醋酸根, 磷酸根 )被吸收
或氮源被利用后产生 NH3, 则 pH上升；阳
离子 (如 NH4,K+ )被吸收或有机酸的积累,
使 pH下降 。
? 一般来说, 高碳源培养基倾向于向酸性 pH
转移, 高氮源培养基倾向于向碱性 pH转移,
这都跟碳氮比直接有关 。
3．氧
? 微生物对氧的需要不同, 是由于依赖获
得能量的代谢方面的差异 。 好气性菌主
要是有氧呼吸或氧化代谢, 厌气菌为厌
气发酵 (分子间呼吸 ),兼性厌气菌则两者
兼而有之 。
? 不同微生物或同一微生物的不同生长
阶段对通风量的要求也不相同 。
通风和搅拌
? 通气可以供给大量的氧 。
? 通气量与菌种, 培养基性质, 培养阶段
有关 。
? 通气量的多少, 最好按氧溶解的多少来
决定 。 只有氧溶解的速度大于菌体的吸
氧量时, 菌体才能正常地生长和合成酶 。
因此随着菌体繁殖, 呼吸增强, 必须按
菌体的吸氧量加大通气量, 以增加溶解
氧的量 。
? 搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液
混合, 保证氧的最大限度溶解, 并且
搅拌有利于热交换, 使培养液的温度
一致, 还有利于营养物质和代谢物的
分散 。 此外, 挡板则有助于搅拌, 使
其效果更好 。
? 一般来说, 若培养罐深, 搅拌转速大, 通气管
开孔小或多, 气泡在培养液内停留时间就长,
氧的溶解速度就大, 而且在这些因素确定下,
培养基的粘度越小, 氧的溶解速度也越大 。
? 搅拌可以提高通气效果, 但是过度地剧烈搅拌
会导致培养液大量涌泡, 容易增加杂菌污染的
机会, 液膜表层的酶容易氧 化变性, 微生物细
胞也不宜剧烈搅拌 。
种龄与接种量
? 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜,
菌种过嫩或过老, 不但延长发酵周期,
而且会降低产量 。
? 接种量的大小直接影响发酵周期 。
? 大量地接入培养成熟的菌种的优点,
? 1.可以缩短生长过程的延缓期, 因而缩短了发酵周
期, 提高了设备利用率,
? 2,节约了发酵培养的动力消耗,
? 3.并有利于减少染菌机会,
? 一般都将菌种扩大培养, 进行两级发酵或三级发酵 。
? 接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比 。
? 接种量过多也无必要 。 因培养种子费时, 而且过多
地移人代谢废物, 反而 会影响正常发酵 。
二、菌种扩大培养
工业微生物菌种培养的类型
? 工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两
大类型 。
? 静置培养法即将培养基盛于发酵容器中, 在接
种后, 不通空气进行发酵, 又称为嫌气性发酵 。
? 通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌
居多, 它们生长的环境必须供给空气, 以维持一
定的溶解氧水平, 使菌体迅速生长和发酵, 又称
为好气性发酵 。
? 在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养
和固体培养两大类型, 其中每一类型又有表面 培
养与深层培养之分 。
(三）主要培养方法及特点
? 1,种子扩大培养阶段
? (1)液体培养法 包括液体试管, 三角瓶摇床
振荡或回旋式培养 。 摇瓶通气量大小与摇瓶机
型式, 转数, 振程 (或偏心距 ),三角瓶容量,
装料量有关 。
? (2)表面培养法 包括茄子瓶, 克氏瓶或瓷盘
培养 。
? (3)固体培养法 包括三角瓶, 蘑菇瓶, 克氏
瓶, 培养皿等麸皮培养 。
2．大规模生产阶段
? (1)表面培养
? (2)固体培养
? (3)液体深层培养
? (4)载体培养
(1)表面培养
? 表面培养是一种好氧静置培养方法
? 针对容器内培养基物态又分为液态表面
培养和固态表面培养 。
? 相对于容器内培养基体积而言, 表面积
越大, 越易促进氧气由气液 (气固界面向
培养基内传递, 包括茄子瓶, 克氏瓶或
瓷盘培养 。
? 这种培养方法菌的生长速度与培养基深
度有关, 单位体积的表面积越大, 生长
速度也越快 。
? 氧的供给常成为发酵的限速因素, 所以
发酵周期长, 占地面积大 。
? 优点是不需要深层培养时的搅拌和通气,
节省动力 。 如醋酸, 柠檬酸发酵和曲盘
制曲 。
? 固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体
培养, 统称曲法培养 。 它起源于我国酿造
生产特有的传统制曲技术 。 其最大特点是
固体曲的酶活力高 。
(2)固体培养
? 固体培养具有以下优点,
①原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适
量水分、无机盐等。培养基组成简单。
② 防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进
行增殖的特性, 在这种条件下, 细菌生长不好, 因
此不易引起细菌污染 。
③ 通气：无论浅盘或深层固体通风制曲, 可以在曲房
周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度,
并且能根据菌种在不同生理时期的需要, 灵活加以
调节 。 在固体培养中, 氧气是由基质粒子间空隙的
空气直接供给微生物, 比液体培养时的用通气 搅拌
供给氧气节能 。
(3)液体深层培养
? 用液体深层发酵罐从罐底部通气, 送入的空气
由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解 。
这种由罐底部通气搅拌的培养方法, 相对于由
气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来
讲, 称为深层培养法 。
? 特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求
以及不同生理时期的通气, 搅拌, 温度, 与培
养基中氢离子浓度等条件, 选择最佳培养条件 。
深层培养基本操作的 3个控制点
? ① 灭菌：发酵工业要求纯培养, 因此在
发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌 。
所以发酵罐具有蒸汽夹套, 以便将培养
基和发酵罐进行加热灭菌, 或者将培养
基由连续加热灭菌器灭菌, 并连续地输
送于发酵罐内 。
? ② 温度控制：培养基灭菌后, 冷却至培养温度
进行发酵, 由于随着微生物的增殖和发酵会发
热, 搅拌产热等, 所以为维持温度恒定, 须在
夹套中以冷却水循环流过 。
? ③ 通气, 搅拌：空气进入发酵罐前先经空气
过滤器除去杂菌, 制成无菌空气, 而后由罐底
部进人, 再通过搅拌将空气分散成微小气泡 。
为了延长气泡滞留时间, 可在罐内装挡板产生
涡流 。 搅拌的目的除了溶解氧之外, 可使培养
液中微生物均匀地分散在发酵罐内, 促进热传
递, 以及为调节 pH而使加入的酸和碱均匀分散
等 。
几种深层培养法
? ① 放大法
? ②两步法
? ③控制培养法
? ④分批发酵法 (间歇发酵法 )
? ⑤ 连续培养法
? ⑥补料分批培养法 (流加法 )
① 放大法,
? 将微生物在摇瓶基础上逐级放大以实现
大规模生产 。
? 在厌气发酵时问题归结为如何从大型发
酵罐中除去发酵热 。 为此考虑到如何利
用发酵时生成的二氧化碳引起的液体流
动和辅助搅拌, 以提高冷却效率, 这只
需进行发酵罐传热面积的设计即可 。
? 但在好氧培养中, 大多以氧的供给为基准进行
放大 。 一般从实验室规模到工厂生产要经过
3— 5级放大步骤 。
? 放大过程中应考虑,
? a,氧传递速度相等 。
? b,比较搅拌桨叶顶端速度 。
? c,比较单位液量所需的搅拌动力 。
? d,混合时间相同 。
? e,雷诺准数相同 。
? f,通过反馈控制尽量能使重要环境因子一致 。
② 两步法
? ② 两步法：酶制剂生产两步法的特点是将菌体
生长条件 (营养期 )与产酶条件 (自我繁殖期 )区分
开来 。 菌种先在丰富的培养基上大量繁殖, 然
后收集菌体浓缩物, 洗涤后再转入添加诱导物
的产酶培养基, 在此期间, 菌体积累大量的酶,
一般不再繁殖, 营养成分或诱导物得到充分利
用 。
? 在氨基酸的两步法液体深层培养中, 每一步
菌种和培养基等均不相同 。 第一步属有机酸发
酵或氨基酸发酵 。 第二步是在微生物产生的某
种酶作用下把第一步的产物转化为所需的氨基
酸, 这 种生产方法又称为酶转化法 。
③ 控制培养法
? 了解发酵罐内部的变化情况, 掌握短暂时间内
状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微
生物代谢活动的影响, 并以此为基础进行控制
培养, 以达到产物生成的最优培养条件 。
? 用测定状态变量的传感器取得数据, 经电子计
算机进行综合分析, 再将其结果作为反馈调节
的信号, 将环境 (培养条件 )控制于给定的基准
内 。 这就叫做电子计算机控制发酵 。 目前已大
量用于露天大罐啤酒发酵 。
④ 分批发酵法 (间歇发酵法 )
? 先将空罐杀菌, 培养基装入发酵罐, 接
种之后进行培养, 在培养过程中, 培养
基成分减少, 微生物增殖 。 微生物周围
的环境随时间而变化, 是一种非稳态操
作法 。
? 此法不易染菌, 但很难采用控制基质等
浓度的方法来增大 发酵生产能力 。 目前
多用在酒精, 氨基酸, 抗生素生产中 。
⑤ 连续培养法
? 在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时, 将
含有微生物和产物的培养液, 从发酵罐中连续
放出, 叫做连续培养法 。
? 其特点是能使微生物处于恒定不变的环境中进
行长期持续的培养, 该系统的稳态被叫做恒化
器 。 同时包含了流入和流出, 属开放系统, 故
变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大 。 从
技术上也很难保证流入和流出速度的一致 。
? 连续培养用于废水处理, 葡萄糖酸发酵, 酒精
发酵等工业中 。
⑥ 补料分批培养法 (流加法 )
? 在分批培养时, 不断地供给培养基, 但
所需产物不到一定时刻不放出的方法,
称为补料分批 培养法 。
? 用于面包酵母, 氨基酸, 抗生素等工业 。
(4)载体培养
? 载体培养脱胎于曲法培养, 同时又吸收了液体培
养的优点, 是近年来新发展的一种培养方法 。
? 特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之
类的固态基质作为微生物的载体, 营养成分可以
严格控制, 发酵结束, 只需将菌体和培养液挤压
出来进行抽提, 载体又可以重新使用 。
? 载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌, 多孔结
构既有足够 的表面积, 又能允许空气流通 。
3．影响种子培养的条件
? 菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的
扩大培养 。
? 影响种子罐培养的主要因素包括营养条
件, 培养条件, 染菌的控制, 种子 的级
数和接种量控制等 。
泡沫
? （ 1） 泡沫的作用,
? 培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和
合成酶有关, 泡沫的持久存在影响着微生
物对氧的吸收；
? 妨碍二氧化碳的排除, 因而破坏其生理代
谢的正常进行, 不利于发酵；
? 由于泡沫大量生成, 致使培养液的容量一
般只能等于种子罐容量的一半左右, 大大
影响了设备的利用率, 甚至发生跑料, 招
致染菌, 造成巨大损失 。
? （ 2） 产生泡沫的原因
? 通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入, 形成
气泡；
? 培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动
产生气泡；
? 培养基中某些成分 (如蛋白质及其他胶体物质 )
的分子, 在气泡表面排列形成坚固的薄膜 。 因
此, 气泡不易破裂, 聚成泡沫层 。
? （ 3） 培养过程的消泡措施
? 机械法
? 化学法 。 发酵工业常用的消泡剂, 有各种天然的
动植物油及来自石油化工生产的矿物油, 改性油,
表面活性剂等 。 而新型的有机硅聚合物如硅油,
硅树脂等, 则具有效率高, 用量省, 无毒性, 无
代谢性, 同时兼有提高微生物合成酶等多种优良
特性, 是一类有发展前途的消泡剂 。
? 泡沫的控制除了添加消泡剂外, 改进培养基成分
也是相辅相成的一个重要方面 。
染菌的控制
? （ 1） 染菌的原因
? 归结起来是：设备, 管道, 阀门漏损, 灭菌不
彻底；
? 空气净化不好；
? 无菌操作不严或菌种不纯等 。
? （ 2） 染菌的控制
? 必须加强接种室的消毒管理工作, 定期检查消毒效
果, 严格无菌操作技术 。
? 如果新菌种不纯, 则需反复分离, 直至完全纯粹为
止 。 对于已出现杂菌菌落或噬菌斑的试管斜面菌种,
应予废弃 。 在平时应经常分离试管菌种, 以防菌种
衰退, 变异和污染杂菌 。
? 对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制, 对种子
质量更要严格掌握, 必要时可将种子罐冷却, 取样
做纯种试验, 确证种子无杂菌存在, 才能向发酵培
养 基中接种 。
种子罐级数的确定
? 种子罐的级数愈少, 愈有利于简化
工艺及控制
? 并可减少种子罐污染杂菌的机会
? 减少消毒及值班工作量
? 减少因种子罐生长异常而造成的发
酵波动 。
确定方法
? 菌种的性质 (如菌种传代后的稳定性 )
? 孢子瓶中的孢子数, 孢子发芽及菌丝繁
殖速度
? 发酵罐中种子培养液的最低接种量
? 种子罐与发酵罐的容积比 。
? 随产物的品种及生产规模而定
? 随着工艺条件的改变作适当的调整 。
第三节 厌氧培养
? 厌氧培养在发酵工业研究上是很重要的, 发酵
工业中的制酒等混合发酵过程有大量厌氧微生
物的有益作用, 特别是对己酸菌, 丁酸菌, 甲
烷菌等的研究 。
? 细菌在有氧环境中进行代谢时, 常产生超氧离
子 (O-)与过氧化氢 (H202),有强烈的杀菌作用 。
厌氧菌过氧化氢酶 )和过氧化物酶, 不能破坏超
氧离子和 H202,易被杀伤, -故在有氧时不能生
长 。
?
厌氧培养的方法
? (1) 深层穿刺分离培养：用一根 18-
20mm直径的玻璃管, 截成 180-200mm
长, 洗净烘干 。 一头塞入橡皮塞, 加
入 2/3管长的营养琼脂, 塞上胶塞或塑
料帽, 灭菌, 凉至凝固 。 穿刺接 |种或
待分离物 。 培养后可见到生长的厌氧
微生物菌落 。 此时拔出橡皮塞, 用无
菌刀切割, 分离再培养 。 此法对于一
般厌氧微生物适用 。
? (2)深层穿刺与化学吸氧相结合：深层穿
刺后, 在培养基上部加一层非脱脂棉,
再加一层脱脂棉, 上面加入焦性没食子
酸和 Na2℃ O3粉末的混合物, 用胶塞或塑
料帽盖紧 。 焦性没食子酸和 Na2℃ O3在有
湿气 (即水分 )存在的条件下缓慢作用吸氧
和放出 CO2,造成厌氧状态, 强化了厌氧
条件 。
? (3)液体培养基法：液体培养基法主要是
在培养基中加入一定的还原物质并隔绝
空气 。 常见的有庖肉培养基法, 硫乙醇
酸钠法, 牛心脑浸液培养基法等 。
? (4)厌氧罐培养法,
? 碱 性 焦 性 没 食 子 酸 法, 焦 性 没 食 子 酸 与
Na2℃ O3反应可释放出 ℃ O2并吸收环境中的氧 。
? ⑤ 厌氧箱培养法：厌氧培养箱由厌氧环境操作
箱、恒温培养箱、高度真空传递箱、气路控制
系统、箱架、瓶架等部分组成。培养箱的温度
能自行调节控制，气路安排合理，能任意输入
所需气体和准确调节流量。箱内备有紫外灯，
可消毒操作室内空气。使用厌氧培养箱进行厌
氧微生物分离培养时，整个操作过程可在正压
℃ O2或氮气下进行，使整个接种过程在无氧状
态。因此，厌氧培养箱在分离，研究极端专性
厌氧菌时更有其优势。
