第二章 生产中常用菌种的分离、
选育和保藏
主讲人：韩北忠
刘 萍
带图象分析系统的微生物菌种
显微观察装置
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
? 根据资料直接向有科研单位, 高等院校, 工厂
或菌种保藏部门索取或购买；
? 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 。
二、分离思路
? 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照
生产的要求, 菌种的特性, 采用各种筛选方法,
快速, 准确地把所需要的菌种挑选出来 。
? 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌, 也必
须重新进行分离纯化 。
? 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合
理先进的设备与之配合。
? 定方案,首先要查阅资料, 了解所需菌种的生
长培养特性 。
? 采样,有针对性地采集样品 。
? 增殖,人为地通过控制养分或培条件, 使所需
菌种增殖培养后, 在数量上占优势 。
? 分离,利用分离技术得到纯种 。
? 发酵性能测定,进行生产性能测定 。 这些特性
包括形态, 培养特征, 营养要求, 生理生化特
性, 发酵周期, 产品品种和产量, 耐受最高温
度, 生长和发酵最适温度, 最适 pH值, 提取工
艺等 。
三、新种分离与筛选的步骤
（ 一）采样
1、采样对象
以采集土壤为主 。 一般园田土和耕作
过的沼泽土中, 以细菌和放线菌为主,
富含碳水化合物的土壤和沼泽地中, 酵
母和霉菌较多, 如一些野果生长区和果
园内 。 采样的对象也可以是植物, 腐败
物品, 某些水域等 。
从自然界筛选
? 2,采样季节：以温度适中, 雨量不多的秋初为好 。
? 3,采土方式：在选好适当地点后, 用小萨子除去
表土, 取离地面 5-15cm处的土约 10g,盛入清洁的
牛皮纸袋或塑料袋中, 扎好, 标记, 记录采样时
间, 地点, 环境条件等, 以备查考 。 为了使土样
中微生物的数量和类型尽少变化, 宜将样品逐步
分批寄回, 以便及时分离 。
（二）增殖培养
? 为了容易分离到所需的菌种, 让无关的微生物
至少是在数量上不要增加, 可以通过配制选择性
培养基, 选择一定的培养条件来控制 。
? 例如碳源利用的控制, 可选定糖, 淀粉, 纤维
素, 或者石油等, 以其中的一种为唯一碳源, 那
么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,
而其它微生物就可能死亡或淘汰 。 这样对下阶段
的纯种分离就会顺利得多 。
（三）培养分离
? 尽管通过增殖培养效果显著, 但还是处于微
生物的混杂生长状态 。 因此还必须分离, 纯化 。
在这 — 步, 增殖培养的选择性控制条件还应进
一步应用, 而且控制得细一点, 好一点 。 纯种
分离的方法有划线分离法, 稀释分离法 。
（四）筛 选
? 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条
件, 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验, 以
求得适合于工业生产用菌种 。
（五）毒性试验
? 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的,
将其作为生产菌种应当十分当心, 尤其与食品
工业有关的菌种, 更应慎重 。 据有的国家规定,
微生物中除啤酒酵母, 脆壁酵母, 黑曲霉, 米
曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,
其他微生物作为食用, 均需通过两年以上的毒
性试验 。
第二节 培养分离
? 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要
和基础的步骤 。
? 到目前为止, 还没有一种分离培养方法能揭示
一个试样中所包含的所有微生物总数和种类 。
? 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种
类的菌株；在工业微生物筛选过程中, 应及时调
整检测方法, 以与各种不同类型的生长和代谢之
微生物相适应 。
? 因此, 建立一更为科学的和针对性不强的分离方
法是必要的 。
一、成功的分离培养方法
(1)认真考它所需产品的特征和生产过程；
(2)制订初步的筛选标准；
(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程 。
二、培养分离中要解决的问题
1,,分离什么和从哪里分离出?”
2,必须充分考虑所分离微生物的生产能力, 生
长速度, 生物群体培养和产品生产工艺及其提
纯的难易和费用, 工业生产发酵罐中稳定性及
遗传操作的难易程度等 。
3,选择适宜的培养分离方法和检测方法 。
三、将生态学方法用于培养分离
的一般思路要点
? 1,罗列出所要分离的微生物类群；
? 2,根据所采集样本的各种生态参数, 描述所要
分离的微生物之生态系统或栖息地,
? 3,将若干样本分成若干类型, 如植物和植物各
部, 土壤 (类型和土层 ),岩石, 水, 昆虫和发酵
食品等；
? 4,罗列出所要考察和测量的环境参数, 如 pH、
盐分, 水分, 氧化还原电势及温度等；
5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土
壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；
6．根据上述 1-5项中所获得的数据，设计分离方
法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸
出汁和培养条件；
7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法；
8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的
方法；
9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛
选意义的微生物类群。
四、自然界中细菌的分离
(一 )采样和采集方法
? 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的
细菌菌群, 特别是分离那些在唯一微环境区域
中出现的菌群时, 必须十分重视样本的采集 。
? 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲, 土样
采集器, 镊子, 解剖刀, 手套, 无菌小塑料袋
和塑料瓶等 。
采样的注意事项
1,采样时应尽可能保持相对无菌；
2,所采集的样本必须具有某种代表性；
3,采好的样必须完整地标上样本的种类及采集
日期, 地点以及采集地点的地理, 生态参数
等；
4,应充分考虑采样的季节性和时间因素, 因为
真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
? 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应
贮存于 4℃ 下，但贮存时间不宜过长。这是因
为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离
了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生
变化，微生物群体之间就会出现消长
1．土样采集方法
? 森林, 旱地, 草地可先掘洞, 由土壤下层向上层
顺序采集；
? 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆
筒采集 。 如果层次要求不严格, 可取离地面 5～
15cm处的土 。 将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻
璃瓶中 。
? 在采集植物根际土样时, 一般方法是自土壤中慢
慢拔出植物根, 在大量无菌水中浸渍约 20min,洗
去粘附在根上的土壤, 然后再用无菌水漂洗下根
部残留的土, 这部分上却为根际土样 。
2．植物体采集方法
? 在采集叶面时, 一般是用灭菌的剪刀, 打孔器,
安全刀片等, 由几片新鲜叶片的同一部位切取一
小块, 并注意不要损伤周围边缘 。
? 选择叶面时应考虑叶位, 叶龄, 叶片正反面和在
一片叶上的取样部位 。
? 采集植物根及根系时, 方法与根际土样采集方法
相似 。 将洗净的根装入采样袋中, 采集根系时,
一般与根际土样一起保存 。
3．水样采集方法
? 用于细菌检测的水样应收集于 100m1干净, 灭菌
的广口塑料瓶中 。
? 由于表层水中含有泥沙, 故在采样时应在较深的
静水层中采集水样 。
? 方法是：握住采样瓶底浸入水中 30-50cm处, 然后
瓶口朝下打开瓶盖, 让水样进入 。 如果有急流存
在的话, 应直接将瓶口反向于急流 。 采集瓶从水
中取出时应迅速并带有较大的弧度 。 水样不应装
满采样瓶 。 所有水样都应在 24h之内迅速进行检测,
或者 4℃ 下贮存 。
(二 )生态学参数及培养基
的组成原则
1,加入培养基中的天然提取物种类和用量, 环境
生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶
剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类 。
2,就分离培养基的组成而言, 部分培养基中必须
含有 10-50%的天然提取物 。 加入培养基中的天然
提取物, 部分培养基中则应含有多种碳, 氮源,
如几丁质, 纤维素或果胶 。
3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂 (如放线菌
酮和制霉素 )，掺加浓度一般为 50μg／ m1,以
抑制真菌的生长。
4、琼脂平板在使用前应置于 37℃ 培养箱中孵育 l、
2天。
5、培养基的生物物理学参数，如 pH及盐分也应调
节到与试样的生态系统参数值相近。
土中细菌的富集培养与分离
? 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进
行富集。
? 但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技
术才能很好地被分离培养 。
富集方法
? 运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若
干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来
激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富
集技术。
? 富集可以促进抗性的产生并维持下来。
? 土样中细菌的富集：适度稀释后，取 0.1m1涂布已
添加及未添加富集底物 (如几丁质、纤维素等 )的土
浸出汁平板。
? 植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液
适度培养取样，洗涤，取 1ml经适度稀释后涂布平
板。
? 水中细菌的分离：水样通过 0.22μm无菌滤膜，取
出滤膜用 1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用
样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压
印分离法。
水中细菌分离的简易富集技术
? 在无菌的, 用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培
养, 定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；
? 在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖, 多糖
及蛋白质等, 同样可以促进水中微生物的增殖 。
? 培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的
生长 。
? 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌, 附着材
料,, 如无菌的植物组织或土壤浸出液 。
? 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性
细菌, 中温菌和嗜高温菌 。
次代培养及纯化步骤
1,涂布的平板经培养后, 如生长出菌落, 则按涂布
不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落
对琼脂平板进行分类 。
2,用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添
加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上 。
3,筛选平板经培养后, 按生长出菌落的形态学特征
如色素, 菌落形态等进行最初分组 。
4,将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离
琼脂平板上进行筛选 。
五、放线菌的分离
? (一 )采样及采集方法
? 应尽可能实行无菌操作。
? 所采集的样本应具有一定的代表性 。
? 样本采集完后, 应及时处理或在 4℃ 下贮存,
贮存试样处应与划线, 筛选平板分开, 贮存时
间不宜过长 。
(二 )生态学参数
? 放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参
数有温度, pH,离子强度, 氧化还原电势和
底物浓度 。
（三）培养基的组成原则
? 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物
的琼脂平板上进行的 。 除嗜温性放线菌外, 其
他放线菌一般在培养 4-20天内在分离平板上缓
慢形成菌落 。
? 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉
菌素或放线菌酮, 以抑制真菌的繁殖 。
? 选择性地添加抗生素 。
? 分离琼脂平板制备好后, 一般皆应在 37℃ 培养
箱中存放 3天 。
放线菌的分离
? 土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，
无菌海绵压印土样后压印平板后培养。
? 植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以
减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培
养。也可洗下微生物后振荡培养。
? 水中放线菌的分离,为使所要分离的放线菌的数量
种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉
积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。
次代培养及纯化
? 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异,
作初步的鉴定和区分 。
? 通过高倍放大进行镜检, 可了解气生和营养孢子
形成情况 。
? 成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是
所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而
肉眼识别不同的生长形态, 从而初步地加以鉴定,
在分离放线菌时显得尤为重要 。
? 将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的
钩形针或无菌牙签挑取, 点接到琼脂平板上进行
影印培养, 以进一步筛选和分离 。
六,真菌分离
1,利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落
分散, 利于计数, 分离和鉴定 。 这里主要是利
用营养成分的减少而使生长减慢, 并由此限制
真菌的迁涉生长 。
2,改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分
离 。
3,有时, 真菌子实体形成必须有光线, 这在分
离培养时应加以考虑 。
4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种
或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技
术。
富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变
来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如
以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富
集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。
5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减
少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生
素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。
真菌的分离方法
? 土中真菌的分离：稀释法, 混入法, 压贴法,
粘附法, 浮选法, 注射器采集法, 土过筛法,
庶糖密度梯度离心法 。
? 植物材料中真菌的分离：植入法, 压贴法, 洗
涤法, 浸泡法 。
? 水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离 。 饵诱
技术常用于水中真菌的富集 。
? 子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体
组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一
小块无菌滤纸上培养 。
七、生产选种
? 是在长年累月的生产实践中, 在培养工艺条
件没有任何可见变更情况下, 突然发现某些批次
生产水平提高较大, 这就有可能是个别自然变异
朝更好的方向变的细胞, 在这种条件下很适应于
培养条件, 并逐渐显示出它的生长优势, 这种优
势的发展, 促使它优良的生产性能表露 。 进行类
似新种筛选分离, 达到获得新的优良生产菌种的
目的 。
第三节 工业菌种的育种方针
? 工业菌种的育种,
是运用遗传学原理和技术对某个用于特定
生物技术目的的菌株进行的多方位的改造 。 通
过改造, 可使现存的优良性状强化, 或去除不
良性质或增加新的性状 。
工业菌种育种的方法
? 诱变
? 基因转移
? 基因重组
育种过程
? 包括下列 3个步骤,
? (1)在不影响菌种活力的前提下, 有益基因型
的引入 。
? (2)希望基因型的选出 。
? (3)改良菌种的评价 (包括实验规模和工业生产
规模 )。
选择育种方法时综合考虑的因素
(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系 (如批
式或连续发酵试验 )；
(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的
明了程度；
(3)经济费用 。
? 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少,
则多半采用随机诱变, 筛选及选育等技术,
? 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的
认识, 则可选择基因重组等手段进行定向育种 。
工业菌种改良方法
(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加
特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来
提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的
代谢步骤, 由此提供一个旁路代谢途径 。
(2)增加前体物的浓度 。
(3)改变代谢途径, 减少无用副产品的生成以及提
高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物, 前体或产
品的耐受力 。
(4)抑制或消除产品分解酶 。
(5)改进菌种外泌产品的能力 。
(6)消除代谢产品的反馈抑制 。 如诱导代谢产品
的结构类似物抗性 。
提高特定基因的表达水平
? (1)引入强转录及翻译信号, 可通过在一高效
表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引
入强启动子；修改现有表达信号, 提高基因
效力等 。
? (2)诱导解除基因表达抑制的突变 。
改进菌种的生长效率
? 提高菌株对底物的利用率方法,
? a,通过确定并改变代谢中的耗能部分 ;
? b,由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现 。
? c,赋予菌种对多种底物, 特别是价廉而丰富的
底物的利用能力, 由此可降低操作费用 。
第四节 诱变育种
? 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机
率并不很高, 一个基因的自然突变频率仅 10-6-
10-10左右 。
? 诱变育种：以诱发突变为基础的育种, 是迄今
为止国内外提高菌种产量, 性能的主要手段 。
诱变 物理、化学或生物诱变方法
一、诱变剂和诱变处理
? 物理诱变剂：射线如紫外线, X— 射线, γ—
射线, 快中子；
? 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的
是紫外线 。 许多高产菌株的选育都用过紫外线,
对于一般实验室, 中小型工厂都适用, 也很安
全 。
? 其他的几种射线都是电离性质的, 有一定的穿
透力, 一般都由专业人员在专门的设备中使用,
否则有一定危险性 。
化学诱变剂,
化学因子如碱基类似物, 5— 氟尿嘧啶, 烷化剂等 。
化学诱变剂中使用最多, 最有效的是烷化剂 。
使用化学诱变剂的优缺点,
1,大多数情况下, 就突变数量而言, 要比电离辐射
更有效 。
2,化学诱变剂是很经济的, 因为只需要少量的
合适的诱变剂, 设备是实验室的一般玻璃器皿,
一个蒸气罩 。 而用电离辐射 ± 行工作时, 设备
费用大, 并要注意安全性 。
3,大部分诱变剂是致癌剂, 所以在使用中必须
非常谨慎, 要避免化学诱变剂与皮肤接触,，
且切勿吸入其蒸气, 有人对某些诱变剂极其敏
感, 甚至未直接接触就会过敏, 这就更要当心 。
诱变剂的选择
1,碱基类似物和羟胺具有很高的特异性, 但很少使
用, 回复突变率高, 效果不大 。
2,亚硝酸和烷化剂应用的范围较广, 造成的遗传损
伤较多 。 其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为
,超诱变剂,, 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变
剂之一 。
3,吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全
中断 。
4,紫外线仍十分有效 。 电离辐射是造成染色体
巨大损伤的最好诱变剂, 它能造成不可回复的
缺突变 。 但它可能影响邻近基因的性能 。
二、诱变育种步骤
?出发菌株的选择
?处理菌悬液的制备
?诱变处理
?中间培养
?分离和筛选
(一 )出发菌株的选择
1,自然界新分离的野生型菌株, 对诱变处理较
敏感, 容易达到好的效果 。
2,在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较
相像, 也是良好的出发菌株 。
3,每次诱变处理都有一定提高的菌株, 往往多
次诱变能积累较多的提高 。
4,出发菌株开始时可以同时选 2～ 3株, 在处理
比较后, 将更适合的出发菌株留作继续诱变 。
5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细
胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部
分是隐性的，特别是高产基因。
6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱
变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会
使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂
是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的
作用于休止期，就可选用孢子。
(二 )处理菌悬液的制备
? 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的,
活力类似的菌悬液, 为此要进行合适培养基的
培养, 并要离心, 洗涤, 过滤 。
(三 )诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍, 结
合诱变对象的实际, 设计诱变处理方案 。
(四 )中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前, 有
一个表现延迟的过程, 即细胞内原有酶量的稀
释过程 (生理延迟 ),需 3代以上的繁殖才能将
突变性状表现出来 。 这个过程对今后的筛选和
获得稳定菌株都是极为重要的 。
方法,
让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小
时, 以让细胞的遗传物质复制, 让细胞繁殖几
代, 以得到纯的变异细胞 。 这样, 隐性的变异
就会显现出来, 若不经液体培养基的中间培养,
直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞
同时存在于一个菌落内的可能, 形成混杂菌落,
以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化 。
(五 )分离和筛选
? 筛选分初筛和复筛 。 初筛以迅速筛出大量的达到
初步要求的分离菌落为目的, 以量为主 。
? 复筛则是精选, 以质为主, 也就是以精确度为主 。
因此在具体方法上就有差异,
例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与
某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的
大小来挑取参加复筛者, 而将 90%的菌落淘汰 。
在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的
菌株, 最后才能选得优秀菌株 。 在以后的复筛阶
段, 还应不断结合自然分离, 纯化菌株 。
紫外线的诱变育种
? 紫外线诱变一般采用 15W紫外线杀菌灯, 波长
为 2537A,灯与处理物的距离为 15～ 30cm,照
射时间依菌种而异, 一般为几秒至几十分钟 。
一般我们常以细胞的死亡率表示, 希望照射的
剂量死亡率控制在 70～ 80%为宜 。
? 被照射的菌悬液细胞数，细菌为 106个／ ml左
右，霉菌孢子和酵母细胞为 106～ 107个／ ml。
由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，
约 0.5～ 1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工
进行搅拌，使照射均匀。
? 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时
和照射后的处理应在红灯下进行。
(二 )操作步骤
1,将细菌培养液以 3000r／ min离心 5min,倾去上清
液, 将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤 。
2,将菌悬液放入一巳灭菌的, 装有玻璃珠的三角瓶
内用手摇动, 以打散菌体 。 将菌液倒入有定性滤纸
的漏斗内过滤, 单细胞滤液装入试管内, 一般处于
浑浊态的细胞液含细胞数可达 108个／ ml左右, 作
为待处理菌悬液 。
3,取 2～ 4m1制备的菌液加到直径 9cm培养皿内,
放入一无菌磁力搅拌子, 然后置磁力搅拌器上,
15W紫外线下 30cm处 。 在正式照射前, 应先开紫
外线 10min,让紫外灯预热, 然后开启皿盖正式
在搅拌下照射 10～ 50s。 操作均应在红灯下进行,
或用黑纸包住, 避免白炽光 。
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各 o.5ml进
行稀释分离，计数活菌细胞数。
5．取照射菌液 2ml于液体培养基中 (300ml三角
瓶内装 30ml培养液 ),120r／ min振荡培养 4～ 6h。
6．取中间培养液稀释分离、培养。
7．挑取菌落进行筛选。
亚硝基胍诱变曲霉菌
? N— 甲基 — N'- 硝基 -N- 亚 硝 基胍 (NGN,
MNNG或 TG)对真核或原核微生物都有强烈的
诱变作用 。 其精确的作用机制尚不很清楚, 据
认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下
生成亚硝酸, 直接作用于细胞内的 DNA复制系
统, 从而诱发了变异 。 MNNG的诱变作用随 pH
的升高而增强 。
? (二 )操作步骤
1,单孢子悬液制备 取斜面, 加入 6ml 0.1mol／ L
pH6.o的磷酸缓冲液, 用接种环刮下孢子, 振荡
试管, 立即通过带滤纸漏斗过滤, 由此制得单孢
子悬液, 若孢子液浑浊状, 其孢子浓度可达 l06个
／ ml,此为待处理孢子悬液 。
2,MNNG溶液的制备 用分析天平称取 2mg,加
入 2ml 0.1mol／ L pH 6.0磷酸缓冲液, 于暗处振荡
溶解 。
3．诱变处理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢
子悬液中,30℃ 振荡 30min，立即稀释 1000倍停
止作用，然后以 10-2,10-4两个稀释度分离培养，
30℃ 3天后计数。
4．死亡率计算 将未处理的孢子液 1ml加入 1ml
磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离,30℃ 下培
养 3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡
率。
5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选,
第五节 营养缺陷型的选育
? 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某
些营养物质如氨基酸, 维生素和碱基等的能力,
必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才
能正常生长的变异株 。
? 与营养缺陷型对应的是野生型 。
? 能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培
养基 (MM)；
? 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充
培养基 (SM)；
? 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基
(CM),如牛肉膏蛋白胨培养基, 麦芽汁培养基
等 。
营养缺陷型的用途
? 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大 。
目前生产氨基酸, 核苷酸的菌种都是各种类型
的缺陷型 。 要研究代谢途径, 育种技术都必须
有营养缺陷型的菌株为材料 。
筛选营养缺陷型的步骤
? 诱变
? 淘汰野生型
? 检出缺陷型
? 确定生长谱
一、诱变方法
? 物理诱变
? 化学诱变
二、淘汰野生型
? 抗生素法：野生型能在 MM中生长, 而缺陷型
不能, 于是将诱变处理液在 MM中培养短时让
野生型生长, 处于活化阶段, 而缺陷型无法生
长, 仍处于休眠状态 。 由于细菌或酵母对一些
抗生素敏感, 于是就相应加入一定量的抗生素,
结果活化状态的野生型就被杀死, 保存了缺陷
型 。 一般细菌可以采用青霉素, 酵母可采用制
霉菌素 。
? 菌丝过滤法：对于霉菌, 因孢子生长后会长出
菌丝体, 就可用滤纸过滤法将菌丝滤去, 而缺
陷型孢子却因未发芽而不能滤过 。
三、检出缺陷型
? 原理：在固体基本培养基和完全培养基上, 生
长情况完全不同, 缺陷型在 CM上生长良好,
而在 MM上则不生长, 野生型都能生长 。
? 具体方法：影印法、点种法、夹层法
? 1,将一较平皿直径小 1cm的金属圆筒蒙上一层灭
菌的丝绒, 用金属夹夹住, 灭菌 。
? 2,将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻
轻一压, 使之成为印模, 标记方位 。
? 3,将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记
的同一方位上先后轻轻一压, 此菌印模即复印于
上 。
(一 )影印法
? 4, 将 CM和 MM在恒温箱中培养 。
? 5,二平皿相同方位进行比较, 即可发现在
MM平皿上长出的菌落少于 GM平板上的 。 MM上未
长而相应于 CM上长出的那几个菌落就可能是缺
陷型 。
? 此法要求平皿上菌落不能太多, 菌落之间应有
一定间隔 。
(二 )点种法
? 也就是任意法 。
? 用接种针或牙签将 CM上长出的菌落在 MM和
CM两副平板上接种, 依次在相应位置点种,
然后一起培养, 观察其生长情况 。
? 此法结果明确, 但工作量大 。
(三 )夹层法
? 先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基, 凝固后
涂上一层含菌的 MM,凝固后再倒一薄层 MM
琼脂培养基, 培养 24h,将出现的菌落标记,
然后倒上一层 CM琼脂培养基, 再培养 。 这时
第二批长出的菌落就可能是缺陷型 。
? 此法缺点是, 结果有时不明确, 而且将缺陷型
菌落从夹层中挑出并不很容易 。
四、营养缺陷型生长谱的确定
? 验证确定是缺陷型后, 就需确定其缺陷的因
子, 即生长谱测定 。
生长谱测定的方法
? 将缺陷型菌株培养后, 收集菌体, 制备成细胞悬
液, 与 MM培养基 (融化并凉至 50℃ )混合并倾注平
皿 。 待凝固后, 分别在平皿的 5～ 6个区间放上不
同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤
纸圆片 。 培养后会在某组合区长出, 就可测得所
需营养 。 — 个平皿测一个菌 。
? 以不同组合的营养混合物与融化凉至 50℃ 的 MM
培养基混合铺成平皿, 然后在这些平皿上划线
接种各个缺陷型菌株于各相应位置, 培养后根
据在这些组合长出可推知其营养因子 。 在 5～ 6
个平皿上可测 20株菌以上 。
第六节 基因育种
? 基因重组育种：是运用体外 DNA各种操作或修
改手法获得目的基因, 再借助于病毒, 细菌质
粒或其他载体, 将目的基因转移至新的宿主细
胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表
达, 或者通过细胞间的相互作用, 使一个细胞
的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给
另 — 个细胞的方法 。
一个完整的基因克隆过程包括以
下步骤
? １, 获得待克隆的 DNA片段 （ 基因 ） ；
? ２, 目的基因与载体在体外连接；
? ３, 重组 DNA分子导入宿主细胞；
? ４, 筛选, 鉴定阳性重组子；
? ５, 重组子的扩增与／或表达 。
2.2
基因重组
一、质粒的特点
1,质粒的存在并非微生物生命活动必需 。
2,每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数 。
不同类型的质粒其拷贝数各异, 同一质粒在不同
条件下, 拷贝数也可能差异很大, 有严紧型和松
弛型两种 。
3,质粒 DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是
共价, 闭环状 DNA(CCC DNA)；其次是由于 —
条链有缺口而产生的开环 DNA(ocDNA)；第三种
是由双环分子两段均断裂而产生的线性 DNA。
质粒载体
二、各类质粒所赋予宿主细胞的
不同表现型
抗生素抗性：抗生素的产生；大肠杆菌素的产
生；肠毒素的产生；复杂有机化合物的降解；限
制性核酸内切酶和修饰酶的产生；杀伤性能。
在自然条件下，许多质粒可经细菌接合或相似
方式在宿主间相互转移。在实验室条件下，质粒
也可经人工手段将其转化入宿主细胞内。
三、质粒 DNA的提取方法
? 细菌培养和质粒扩增；
? 细菌的收获和裂解；
? 质粒 DNA的提取 。
四、遗传转化
转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离的
DNA片段，将其同源部分进行碱基配对，组合到自
己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。
(二 )操作步骤,
质粒 DNA转化感受态大肠杆菌
1．从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入 10ml肉汤培养基
中,37℃ 培养过夜。
2．取 0.5ml培养物接入 50ml肉汤中，无菌添加 0.4ml
2.5mol／ LMgCl2，于 37℃ 振荡培养。
3．将 o.1mol／ L CaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中
冷却。
4．当培养物 OD600在 o.5～ o.8左右时，开始收获
细胞 (大约需 2～ 2.5h),
5．将培养物置冰浴中冷却 10min。
6．取 10ml培养物置 2个冷离心管中弃去上清液。
7．加入 1ml 0.1mol／ L CaCl2，再加 0.9ml
CaCl2，置冰浴中放置 20min。
8,3000r／ min离心 10min，弃去上清液,
9．加入 1ml 0.1mol／ L CaCl2，重新悬浮细胞，
置冰浴中保存。
10．加入 1～ 20μ l待转化质粒 DNA溶液。
11．在冰上放置 20min，在 37℃ 处理 2min。再插入
冰中．加入 0.9m1肉汤 37℃ 静置培养 90min。
12．以不同的量涂布选择培养基平板。
13．于 37℃ 培养过夜。鉴定转化菌落。
常用的遗传转化系统
? 1、自然系统
? 2、人工诱导（完整细胞）
（ 1）二价阳离子系统,Ca2+,Ca2++Mg2+,Mg2+，
Ca2++辅助噬菌体,Tris+Ca 2+
（ 2）单价阳离子系统,PEG+Li+/Cs+/Rb+
（ 3）冻融系统
（ 4） Triton处理：人工诱导（ PEG/原生质体）
重组 DNA中常用的工具酶
? 包括限制性核酸内切酶, DNA连接酶,
DNA聚合酶, 逆转录酶等,
限制性内切酶
? 切开 DNA分子所需的酶：每
一种酶都有其各自的作用
位点 。
? 常用限制性内切酶
? 种类及特性
W,Arber,H,O,Smith
限制性内切酶的剪切方式
? 粘性未端：切开后的两段 DNA各留下一个尾,
这 2个尾的核苷酸顺序完全一样, 中是方向相
反 。 它们之间是互补的, 在适当条件下可以再
连接一起 。
其它工具酶
? 连接酶
T4 DNA
? 修补工具酶
DNA聚合酶 I
? 末端加工酶
S1核酸酶, 碱性磷酸单脂酶
? 末端转移酶
人工加 polyA 或 polyT 尾
? 反转录酶
载体－宿主系统
? 载体 (vector)是携带外源 DNA进入宿主细胞进
行扩增和表达的 DNA；
? 一般是通过改造质粒, 噬菌体或病毒等构建的 。
载体应具备以下条件,
? １、能在适当的宿主细胞中复制；
? ２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克
隆位点）以便外源 DNA插入；
? ３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
? ４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时
载体 DNA与宿主 DNA便于分离；
? ５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适
应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元
件。
宿主细胞必须符合以下条件
? １、对载体的复制和扩增没有严格的限制；
? ２、不存在特异的内切酶体系降解外源 DNA；
? ３、在重组 DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；
? ４、重组缺陷型，不会产生体内重组；
? ５、容易导入重组 DNA分子；
? ６、符合重组 DNA操作的安全标准。
目的基因的获取
? 一、通过建立基因文库分离靶基因
? 基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性
内切酶。
? cDNA：用 mRNA反转录成单链 DNA，再经 DNA聚合
酶的作用产生双链 DNA。可去除真核生物基因
中不表达的内含子。
? 二、化学合成法制备 DNA片段
? 从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传
密码，再依照密码合成基因。
? 三、聚合酶链反应法扩增基因片段
? 对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以
通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组 DNA
或 cDNA模板扩增得到目的基因片段。
PCR技术
? 根据需扩增片段的两端设计引物。
? 使 DNA解链（高温），引物结合于基因的两端
（低温），在合适温度下开始合成（链延长）
反应。
? 特点：需要很少的 DNA模板，且能直接从基因
组中得到目的基因。
DNA扩增
PCR反应
DNA片断的克隆
载体的条件,
a 复制起点
b 适宜的限制酶切点
c 选择标记
? DNA分子的体外连接
DNA片段的体外连接是重组 DNA技术的关键 。
DNA连接是由 DNA连接酶催化完成的 。
一,DNA连接酶
? DNA连接酶催化两条双链 DNA片段相邻的 5’-磷酸
和 3’-羟基间形成磷酸二酯键 。
? 在分子克隆中最有用的的 DNA连接酶是来自Ｔ４
噬菌体的 DNA 连接酶 。
? T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于,
? １, 连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；
? ２, 连接双链 DNA分子间的平端；
? ３, 在双链平端的 DNA分子上添加合成的人工接
头或适配子 。
重组 DNA导入宿主菌
? 体外连接的重组 DNA分子必须导入适当的受体
细胞中才能大量的复制, 增殖和表达 。 根据所
采用的载体的性质, 将重组 DNA分子导入受体
可有不同的方法 。
一、转 化
? 指以细菌质粒为载体, 将外源基因导入受体细
胞的过程 。 转化时, 细菌必须经过适当的处理
使之处于感受态－即容易接受外源 DNA的状态,
然后利用短暂热休克使 DNA导入细菌宿主中 。
? 此外还可用电穿孔法转化细菌, 它的优点是操
作简便, 转化效率高, 适用于任何菌株 。
二、转染和感染
? 利用噬菌体 DNA作为载体时可经两种方式导入
受体菌 。 一种是感染, 即在体外将噬菌体 DNA
包装成病毒颗粒, 然后使其感染受体菌 。 另一
种方式是转染, 即在 DNA连接酶作用下使噬菌
体 DNA环化, 再象重组质粒一样地转化进受体
菌 。 但习惯上常把以噬菌体 DNA为载体构建成
的重组子导入细胞的过程统称为转染 。
重组克隆的筛选与鉴定
? 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选
出含有阳性重组子的菌落, 并鉴定重组子的正
确性 。
? 通过细菌培养以及重组子的扩增, 获得所需的
基因片段的大量拷贝 。 进一步研究该基因的结
构, 功能, 或表达该基因的产物 。
一、抗药性标志的筛选
? 如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如 ampr
或 tetrr, 转化后只有含这种抗药基因的转化子
细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落,
这样就可将转化菌与非转化菌区别开来 。 如果重
组 DNA时将外源基因插入标志基因内, 该标志基
因失活, 通过有无抗菌素培养基对比培养, 还可
区分单纯载体或重组载体 （ 含外源基因 ） 的转化
菌落 。
二,β －半乳糖苷酶系统筛选
? 很多载体都携带一段细菌的 lacZ基因, 它编
码 β －半乳糖苷酶 N-端的 146个氨基酸, 称为 α
－肽, 它表达 β －半乳糖苷酶的 C-端肽链 。
? 当载体与宿主细胞同时表达两个片段时, 宿主
细胞才有 β －半乳糖苷酶活性, 使特异的底物
X-gal 变为兰色化合物, 这就是所谓的 α －互
补 。
? 而重组子由于基因插入使 α －肽基因失活, 不
能形成 α －互补, 在含 X-gal的平板上, 含阳性
重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑 。
? 三, 菌落快速裂解鉴定法
? 从平板上直接挑选菌落裂解后, 直接电泳检测载体
质粒大小, 判断有无插入片段存在, 该法适于插入
片段较大的重组子初筛 。
? 四, 内切酶图谱鉴定
? 经初筛鉴定有重组子的菌落, 小量培养后, 再分离
出重组质粒或重组噬菌体 DNA,用相应的内切酶切
割, 释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重
组子, 还要用内切酶消化鉴定插入的方向 。
重组 DNA的鉴定
遗传学方法
第七节 杂交育种
(一 )细菌杂交
? 在细菌中实现杂交的种类尚不多, 主要是大肠杆
菌, 其他还有鼠伤寒沙门氏菌, 铜绿假单胞菌,
淋病奈氏球菌等 。
? 大肠杆菌中存着致育因子 F,有 F因子为 F+,没有
F因子称 F-。
? F因子存在于细胞中形式：游离状态 (F+细胞 )；
整合状态, 即 F因子插入胞核质的一定位置上
(Hfr细胞 )。
? F因子有明显的感染性, 大肠杆菌的接合, 实质
上是 F因子的转移, 所以 F+和 Hfr称供体菌, 而 F-
称受体菌 。
（ 二）酵母杂交育种技术
? 1,酵母繁殖方式
? 酵母为单细胞型真菌, 一般以出芽方式生殖, 在通
常情况下, 繁殖体为双倍体, 但经过特定条件的诱
导, 可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁
殖体 。
? 单倍体细胞具 α 及 ε 2两种交配型 。 两种交配型
细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交
配, 恢复为双倍体；同一交配型细胞之间, 则因
细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配 。
? 在生活过程中, 酵母细胞还可以形成三倍体, 四
倍体, 多倍体或非整倍体细胞 。
? 2、酵母杂交
? 一般而言, 杂交育种运用了酵母的单双倍生
活周期, 将不同基因型和相对的交配型的单倍
体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞, 经筛选
便可获得新的遗传性状 。
? 酵母的杂交方法有孢子杂交法, 群体交配法,
单倍体细胞杂交法和罕见交配法 。 就啤酒酵母
而言, 运用罕见交配法更易获得结果 。
第八节 原生质体育种
? 原生质体育种技术主要有原生质体融合, 原生
质体转化技术, 此外尚有原生质体诱变育种等 。
? 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法 。
? 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是
1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上
提出来的 。
一、原生质体融合育种的特点
(一 )杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下
形成类似于球形的原生质体 。
(二 )受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任
何一株都可能起受体或供体的作用, 因此有利
于不同种属间微生物的杂交 。
(三 )遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二
亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的
过程 。
(四 )存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合
子的可能性 。
（ 五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株 。
(六 )提高菌株产量的潜力较大 。
(七 )有助于建立工业微生物转化体系 。
二、原生质体融合育种步骤
1,标记菌株的筛选和稳定性验证 。
2,原生质体制备 。
3,等量原生质体加聚乙二醇促进融合 。
4,涂布于再生培养基, 再生出菌落 。
5,选择性培养基上划线生长, 分离验证, 挑取
融合子进一步试验, 保藏 。
6,生产性能筛选 。
三、原生质体融合育种的要点
（ 一 ） 标记菌种的选择
获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种,
筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株 。 这里最
重要的是标记必须稳定 。
采用抗药性菌株除可作标记外, 在实验室
中还可排除杂菌污染的干扰 。 为的是确证融合
的成功, 可以采用多标记菌种 。
(二 )原生质体的制备
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加
入细胞壁分解酶, 将细胞壁分离剥离, 结果剩
下由原生质膜包住的类似球状的细胞, 它保持
原细胞的一切活性 。
在放线菌和细菌中, 制备原生质体主要采用
溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素
酶等 。
影响原生质体制备的因素
1,菌体的前处理
为了使酶作用的效果好一些, 可将菌作一些
前处理 。 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素 。
2,菌体的培养时间
为了使细胞易于原生质体化, 一般选择增殖
期的菌体 。
3, 酶浓度
对于不同种属的微生物, 不仅对酶的种类要
求不同, 就是对酶的浓度也有差异 。 另外, 最
佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化 。
? 4．酶处理温度
? 5．破壁时的 pH值
? 6．渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保
护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物
的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，
蔗糖等有机物和 KCl和 NaCl等无机物。
第九节 筛选新的代谢产物
一、开发新的代谢产物的途径
? (1)从自然界分离新的微生物菌株，或采用新
的检阅方法筛选新的代谢产物。
? (2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。
? (3)利用微生物转化改造代谢产物的结构。
(4)通过原生质体融合获得新的代谢产物。
? (5)DNA重组技术。
二、筛选微生物新的代谢产物
的程序
突变型菌株的筛选
? 一、产量性状突变株的筛选
三、筛选微生物代谢产物的目标
? 筛选克服抗生素抗性菌株的活性物质；
? 筛选抗肿瘤, 抗病毒的活性物质；
? 研究有药理活性的酶抑制剂及免疫调节剂；
? 寻找食品工业最好的酵母培养物；
? 筛选降解有害物质的微生物以及治疗上具有低
毒, 长效的化学药物等 。
四、筛选微生物代谢产物的方法
? (一 )直接方法
? 为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途, 在
体外试验测得活性后, 可以将培养液的有效成
分直接作用于机体, 观察被测样品的疗效 。
? 这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体
内治疗试验 。
? (二 )间接方法
? 筛选医用抗生素, 可用细茵, 真菌, 病毒或肿
瘤模型, 寻找抗细菌, 抗真菌, 抗病毒, 抗肿
瘤抗生素, 酶抑制剂, 免疫制剂等有效物质 。
? 在预筛选时, 多用琼脂平扳扩散抑菌法 。 通过
预筛选, 直接测定最初分离物的生物活性, 能
加速筛选过程 。
五、检测系统
? 筛选过程的成功依赖于排除那些已知的或并非
需要的代谢产物的检验方法, 这样才能识别出
人们需要的化合物 。
性能签别
? 性能鉴别是分离和筛选微生物代谢产物中最基
础的工作 。
? 鉴别可分为两方面,
一是对微生物方面进行形态, 培养, 生化功
能答试验观察, 并确定微生物产生菌的类群；
? 二是从化学的早期鉴别来鉴别微生物的代
谢产物 。 化学的早期鉴别一般对产生菌所产生
的代谢产物进行纸上层析, 薄板层析, 纸上电
泳, 抗茵谱, 高压电泳, 紫外分光光度法, 液
相和气相色谱等试验, 井获得各种图谱, 与已
知图谱进行比较鉴别 。
? 如果认为是有实用前途的代谢产物, 则要进一
步大量培养, 并进行动物试验, 毒性考查, 药
物代谢等实验, 并进行提高发酵水平和改善提
取工艺的工作, 以备投入生产 。
? 如果是新的代谢产物, 一般要进一步确定其化
学结构, 井在此基础上进行合成法的研究或进
行化学改造, 研究结构与生物活性的相互关系,
并对作用机制, 生物合成过程作进一步的研究 。
菌种筛选方法
? 诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之
几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细
胞中的少数。
? 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得
最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学
筛选方案和手段。
菌种筛选方案
? 初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌
株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使
优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，测
定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快
速、简单。
? 复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，
复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生
产指标。
菌种筛选的手段
? 初筛
? 从菌体形态变异分析
? 平皿快速检测法 具体的有纸片培养显色法、变
色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等
? 摇瓶培养法摇瓶培养法也可用于初筛。 初筛的
摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，
从大量菌株中选出 10-20%较好的菌株，淘汰
80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个
菌株培养 3瓶，选出 3-5个较好的菌株，再做进
一步比较，选出最佳的菌株 。
特殊变异菌的筛选方法
营养缺陷型突变株的筛选
经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进
行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防
止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营
养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和
鉴别营养缺陷型等步骤。
? 抗性突变菌株的筛选 抗性突变株的筛选相对比
较容易，只要有 10-6频率的突变体存在，就容
易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次
性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。
一次性筛选法 噬菌体抗性菌株、耐高温菌株
阶梯性筛选法药物抗性突变株。
? 组成酶变异株的筛选
许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底
物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些
酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，
而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的
影响。
具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和
诱导抑制物法。
? 1) 恒化器法：常被用于微生物的“驯化”。在
培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，
菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株
则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速
率较快。
? 为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中
的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化
器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶
变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一
步的纯化分离。
? 2) 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和
含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分
离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。
? 当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的
培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，
但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水
解酶，而诱导型菌株就不能合成。
? 将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异
株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导
型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两
类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占的
比例将逐渐增大。
? 3) 诱导抑制剂法：有些化合物能阻止某些诱导
酶的合成，当在诱导物和诱导抑制剂同时存在
的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株
不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型
变异株能够利用底物进行生长繁殖。
第十节 工业微生物菌种保藏技术
? 在生产发酵中, 具有高产有重要经济价值
的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保
存和长期保藏, 对于一成功的工业发酵过程极
为重要 。
一、理想的菌种保藏方法应具备
的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在；
(2) 保证高产突变株不改变表型和基因型, 特别
是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的
高产能力 。
(3)菌种保藏的基本措施是低温, 干燥, 真空 。
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；
(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；
(3) 转接培养或斜面传代保藏；
(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
2.1 冷冻保藏
? 冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的
方法 。
? 通过冷冻, 使微生物代谢活动停止 。 一般而言,
冷冻温度愈低, 效果愈好 。 为了获得满意的冷
冻结果, 通常应在培养物中加入一定的冷冻保
护剂 。 冷冻保藏时温度要求在 -20℃ 以下, 同时
应认真掌握好冷冻速度和解冻速变 。
? 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难 。
冷冻保藏种类
一, 普通冷冻保藏技术 (-20℃ )
二, 超低温冷冻保藏技术 (-60一 -80℃ )
三, 液氮冷冻保藏技术
普通冷冻保藏技术 (-20℃)
? 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接
到试管或指管肉, 然后贮藏于一冰箱的冷藏室中,
或于温度范围在 -5～ -20℃ 的普通冰箱 (-20℃ )中 。
或者, 将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上, 待
生长适度后, 将试管或瓶口用橡胶塞严格封好, 同
上置于冰箱中保存 。
? 用此方法可以维持若干微生物的活力 1— 2年 。
? 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再
用来保藏 。
? 保藏过程中应注意控制保藏温度, 培养瓶或试
管应严格密封 。
? 这一方法虽简便易行, 但不适宜多数微生物的
长期保藏 。
二、超低温冷冻保藏技术 (-60一 -80℃)
? 要求长期保藏的微生物菌种, 一般都要求在 -60℃ 以
下进行保藏 。
? 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是,
? 1,离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；
? 2,用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；
? 3,加入等体积的 20％ 甘油或 10％ 二甲亚砜；
? 4,混匀后分装入冷冻指管或安瓿中, 于 -70℃ 超
低温冰箱中保藏 。
?
? 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含 10％
甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰
箱的冷冻速度一般控制在 1-2℃ ／ min。若干细
菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏 5年而活
力不受影响。
三、液氮冷冻保藏技术
(一 )冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中, 最常用的冷冻保护剂是二
甲亚砜和甘油, 最终使用浓度一般为甘油 10
％, 二甲亚砜 5％ 。 所使用的甘油 — 般用高压
蒸汽灭菌, 而二甲亚砜最好为过滤灭菌 。
(二 )液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤
1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入 5ml含
10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制
成孢子及菌体细胞悬液； 0.5～ lml分装玻璃安瓿或
液氮冷藏专用塑料瓶,
(2)从浸没培养物制备菌悬液,
在浸没培养液中加入等体积 20%无菌甘油；
轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则
需先用玻璃珠打散； 0.5-lml分装玻璃安瓿或液
氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；
将所有封好的安瓿置于 5℃ 冰箱中 3min，以使细
胞和悬浮培养基之间达到平衡。
2,控速冷冻,
(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中, 然后置于
一较大的金属容器中；
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；
(3)以 1-2℃ /min的致冷速度降温, 直到温度达到相
对温度之上几度的细胞冻结点 (通常为 -30℃ )；
(4)补加一定量的液氮至系统中, 使细胞在冻结点
时尽可能快地发生相变；
(5)细胞冻结后, 将致冷速度降为 1℃ /min,直到
温度达 -50℃ ；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相 (-)96℃ )或
气相 (-156℃ )中保存 。
如果无控速冷冻机, 则一般可将安瓿或液氮瓶
置于一 70℃ 冰箱中冷冻 4h,然后迅速移入液氮
罐中保存 。
(三 )复苏
1,从液氮罐中取出所需的安瓿, 立即置于冰浴中；
2,迅速将安瓿置于 37-40℃ 水浴中, 并轻轻摇动以
加速解；
3．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有
2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反
复抽吸数次，然后取 0.1-0.2ml (约 4,8滴 )转接入
琼脂斜面上。
2.2 冻干保藏
? 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使
冻结的细胞悬液中的水分升华, 使培养物干燥 。
此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法
之一 。
? 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂, 目前国
内常用脱脂乳和蔗糖, 国外尚有运用动物血清
等的 。
? 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏 10
年之久而不丧失活力 。 而且经冻干后的菌株无
需进行冷冻保藏, 便于运输 。
培养物的冻干过程
(二 )操作步骤
1,启动冷冻干燥器的致冷单元 。 当冷凝器的温度达
到 -40℃ 时启动真空泵, 使真空度达到 2.67～
4.00Pa。
2,将冷冻槽置于歧管之下方 。 槽中装入 2／ 3体积的
异丙醇, 然后插入温度计及可调温控仪降温探
头, 打开降温探头控制醇浴温度在 -40℃, 这 — 过
程约需 30min。
3,每支斜面加入 2ml 20％ 的脱脂乳, 然后用巴氏吸
管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液,
最终菌株浓度一般要求在 106CFU／ m1,用细菌浸没
培养物来保藏时, 加入 40％ 的脱脂乳, 混合制成含
106CFU／ ml的均悬液 。
4,取下安瓿上的棉塞, 然后用 lml移液管分装安
瓿 (0.2ml／瓿 ),重新塞好棉塞 。
5,轻轻振荡安瓿, 以使细胞重新悬浮 。 将安瓿
与歧管相联后迅速置于醇浴中, 然后调节温控
装置 。 使细胞悬液迅速冻结 。
6,15min后，将歧管与真空泵相通。
7,维持 -40℃ 的醇浴温度 90-120min,然后调节温
控装置 。 使醇浴温度上升至 -10℃, 维持 2h。
8,关掉可调温控装置的降温探头, 让醇浴温度上
升至室温 (25℃ ),
9,在冷冻干燥的最初 4h内应定期测真空度, 在安
瓿置于真空下后 1h内, 真空度必须达到 13.33Pa，
并于菌悬液接近干燥时逐渐降到 2.67～ 4.0Pa。
10, 在真空状态下, 让安瓿保存在冷冻干燥机
中至少 16h以获得完全干燥 。
11,干燥后, 在 2.67～ 4.00Pa的真空度下封瓶,
12,在所有安瓿都封盖好后, 撤去真空 。
13,关闭真空泵 。
14,关闭冷凝器 。
(三 )冻干菌种的保藏与再生
1,保藏：冷冻干燥后的培养物在低于 5℃ 下保藏 。
较低的保藏温度 (-20～ -70℃ )对于培养物的长期
稳定更好 。
2,复苏,
(1)在超净工作台中用 70％ 酒精棉球擦洗安瓿, 然
后用砂轮在安瓿中锉一道沟 。
(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿, 然后用手掰
开安瓿,
(3)在安瓿中加入 0.5～ 1ml营养液体培养基, 慢慢
旋转安瓿, 使冻干菌种复水 。 然后将此转接到
一含有再生培养基的无菌试管中, 或直接接种
琼脂斜面或涂布平板 。
(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状, 可以将此
直接振落入盛有 l～ 2ml液体培养基的试管中,
轻轻振荡 5～ l0min,然后用此悬液接种适宜的
再生培养基 。
2.3 其他保藏方法
一、传代保藏
二、矿物油中浸没保藏
一、传代保藏
? 将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代, 然后在
一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法 。
? 可用于实验室中若干菌种的保藏 。
? 此法最为简单和经济, 且不要求任何特殊的设
备 。
? 但此方法易发生培养基干枯, 菌体自溶, 基因
突变 。
? 因此要求在基本培养基上传代为好, 目的是能
淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平 。
? 斜面培养物应在密闭容器中于 5℃ 保藏, 以防
止培养基脱水并能降低代谢活性 。
? 此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏
方法 。
二、矿物油中浸没保藏
? 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室
温下保藏, 此方法简便有效 。
? 可用于丝状真菌, 酵母, 细菌和放线菌的保
藏 。 特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以
在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏
更为有效 。
? 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜
的培养基上生长, 然后注入经 170℃ 下灭菌 1-2h的
矿物油, 矿物油的用量以高出培养物 1cm为宜 。
? 以液体石蜡作为保藏方法时, 应对需保藏的菌株
预先作试验 。 因为某些菌株在液体石蜡下生长还
十分明显, 有些菌株如某些假丝酵母还会同化液
体石蜡, 也有的对液体石蜡保藏敏感 。 所有这些
菌株都不能用液体石蜡保藏 。 为了预防不测, 一
般保藏株 2～ 3年也应做一次存活试验 。
不同菌种保藏方法比较
2.4 基因工程菌的保藏
? 由载体质粒等携带的外源 DNA片段通常是
遗传不稳定的, 且很易丢失其外源质粒复
制子 。 质粒基因通常为宿主细胞生长非必
需 。
? 一般情况下当细胞丢失这些质粒时, 生长
速度会加快 。
? 当培养基中加入抗生素时, 抗生素提供了一有
利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择
压 。 而且在运用基因工程菌进行发酵时, 抗生
素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的
协调 。
? 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂
的培养基中 。
2.5 微生物活力和稳定性测定
? 所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持
菌种的优良性状不变 。
? 在保藏时定期检测菌种活力, 以确定保藏培养
物的保藏期限和保藏方法的可靠性, 以及确定
在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传
稳定性 。
? 对工业微生物生产菌种来说, 建议保藏菌种的
形态学和生化特征 (如代谢产物的产生, 酶活
力, 遗传特征及生化指标 )应在保藏后加以检
测和确定 。
? 加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养
物的稳定性 。 在一给定温度下通过对高温下短
期活力丧失程度检测, 可以用来预测嗜酸乳杆
菌的稳定性 。
? 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括
在保藏 6个月, 1年或更长时间后存活百分率 (或
存活单位 )。 细胞群体的形态学特征或一些特别
的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性, 以
及实验室中, 中试车间中和生产发酵中产品滴
度的稳定性, 后者极为重要 。
选育和保藏
主讲人：韩北忠
刘 萍
带图象分析系统的微生物菌种
显微观察装置
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
? 根据资料直接向有科研单位, 高等院校, 工厂
或菌种保藏部门索取或购买；
? 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 。
二、分离思路
? 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照
生产的要求, 菌种的特性, 采用各种筛选方法,
快速, 准确地把所需要的菌种挑选出来 。
? 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌, 也必
须重新进行分离纯化 。
? 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合
理先进的设备与之配合。
? 定方案,首先要查阅资料, 了解所需菌种的生
长培养特性 。
? 采样,有针对性地采集样品 。
? 增殖,人为地通过控制养分或培条件, 使所需
菌种增殖培养后, 在数量上占优势 。
? 分离,利用分离技术得到纯种 。
? 发酵性能测定,进行生产性能测定 。 这些特性
包括形态, 培养特征, 营养要求, 生理生化特
性, 发酵周期, 产品品种和产量, 耐受最高温
度, 生长和发酵最适温度, 最适 pH值, 提取工
艺等 。
三、新种分离与筛选的步骤
（ 一）采样
1、采样对象
以采集土壤为主 。 一般园田土和耕作
过的沼泽土中, 以细菌和放线菌为主,
富含碳水化合物的土壤和沼泽地中, 酵
母和霉菌较多, 如一些野果生长区和果
园内 。 采样的对象也可以是植物, 腐败
物品, 某些水域等 。
从自然界筛选
? 2,采样季节：以温度适中, 雨量不多的秋初为好 。
? 3,采土方式：在选好适当地点后, 用小萨子除去
表土, 取离地面 5-15cm处的土约 10g,盛入清洁的
牛皮纸袋或塑料袋中, 扎好, 标记, 记录采样时
间, 地点, 环境条件等, 以备查考 。 为了使土样
中微生物的数量和类型尽少变化, 宜将样品逐步
分批寄回, 以便及时分离 。
（二）增殖培养
? 为了容易分离到所需的菌种, 让无关的微生物
至少是在数量上不要增加, 可以通过配制选择性
培养基, 选择一定的培养条件来控制 。
? 例如碳源利用的控制, 可选定糖, 淀粉, 纤维
素, 或者石油等, 以其中的一种为唯一碳源, 那
么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,
而其它微生物就可能死亡或淘汰 。 这样对下阶段
的纯种分离就会顺利得多 。
（三）培养分离
? 尽管通过增殖培养效果显著, 但还是处于微
生物的混杂生长状态 。 因此还必须分离, 纯化 。
在这 — 步, 增殖培养的选择性控制条件还应进
一步应用, 而且控制得细一点, 好一点 。 纯种
分离的方法有划线分离法, 稀释分离法 。
（四）筛 选
? 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条
件, 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验, 以
求得适合于工业生产用菌种 。
（五）毒性试验
? 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的,
将其作为生产菌种应当十分当心, 尤其与食品
工业有关的菌种, 更应慎重 。 据有的国家规定,
微生物中除啤酒酵母, 脆壁酵母, 黑曲霉, 米
曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,
其他微生物作为食用, 均需通过两年以上的毒
性试验 。
第二节 培养分离
? 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要
和基础的步骤 。
? 到目前为止, 还没有一种分离培养方法能揭示
一个试样中所包含的所有微生物总数和种类 。
? 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种
类的菌株；在工业微生物筛选过程中, 应及时调
整检测方法, 以与各种不同类型的生长和代谢之
微生物相适应 。
? 因此, 建立一更为科学的和针对性不强的分离方
法是必要的 。
一、成功的分离培养方法
(1)认真考它所需产品的特征和生产过程；
(2)制订初步的筛选标准；
(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程 。
二、培养分离中要解决的问题
1,,分离什么和从哪里分离出?”
2,必须充分考虑所分离微生物的生产能力, 生
长速度, 生物群体培养和产品生产工艺及其提
纯的难易和费用, 工业生产发酵罐中稳定性及
遗传操作的难易程度等 。
3,选择适宜的培养分离方法和检测方法 。
三、将生态学方法用于培养分离
的一般思路要点
? 1,罗列出所要分离的微生物类群；
? 2,根据所采集样本的各种生态参数, 描述所要
分离的微生物之生态系统或栖息地,
? 3,将若干样本分成若干类型, 如植物和植物各
部, 土壤 (类型和土层 ),岩石, 水, 昆虫和发酵
食品等；
? 4,罗列出所要考察和测量的环境参数, 如 pH、
盐分, 水分, 氧化还原电势及温度等；
5．列出生物系统中有用的自然底物，如森林土
壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；
6．根据上述 1-5项中所获得的数据，设计分离方
法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸
出汁和培养条件；
7．用标准方法作对照来评价生态学分离方法；
8．根据待检材料的生态参数需要，修改已知的
方法；
9．运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛
选意义的微生物类群。
四、自然界中细菌的分离
(一 )采样和采集方法
? 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的
细菌菌群, 特别是分离那些在唯一微环境区域
中出现的菌群时, 必须十分重视样本的采集 。
? 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲, 土样
采集器, 镊子, 解剖刀, 手套, 无菌小塑料袋
和塑料瓶等 。
采样的注意事项
1,采样时应尽可能保持相对无菌；
2,所采集的样本必须具有某种代表性；
3,采好的样必须完整地标上样本的种类及采集
日期, 地点以及采集地点的地理, 生态参数
等；
4,应充分考虑采样的季节性和时间因素, 因为
真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
? 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应
贮存于 4℃ 下，但贮存时间不宜过长。这是因
为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离
了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生
变化，微生物群体之间就会出现消长
1．土样采集方法
? 森林, 旱地, 草地可先掘洞, 由土壤下层向上层
顺序采集；
? 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆
筒采集 。 如果层次要求不严格, 可取离地面 5～
15cm处的土 。 将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻
璃瓶中 。
? 在采集植物根际土样时, 一般方法是自土壤中慢
慢拔出植物根, 在大量无菌水中浸渍约 20min,洗
去粘附在根上的土壤, 然后再用无菌水漂洗下根
部残留的土, 这部分上却为根际土样 。
2．植物体采集方法
? 在采集叶面时, 一般是用灭菌的剪刀, 打孔器,
安全刀片等, 由几片新鲜叶片的同一部位切取一
小块, 并注意不要损伤周围边缘 。
? 选择叶面时应考虑叶位, 叶龄, 叶片正反面和在
一片叶上的取样部位 。
? 采集植物根及根系时, 方法与根际土样采集方法
相似 。 将洗净的根装入采样袋中, 采集根系时,
一般与根际土样一起保存 。
3．水样采集方法
? 用于细菌检测的水样应收集于 100m1干净, 灭菌
的广口塑料瓶中 。
? 由于表层水中含有泥沙, 故在采样时应在较深的
静水层中采集水样 。
? 方法是：握住采样瓶底浸入水中 30-50cm处, 然后
瓶口朝下打开瓶盖, 让水样进入 。 如果有急流存
在的话, 应直接将瓶口反向于急流 。 采集瓶从水
中取出时应迅速并带有较大的弧度 。 水样不应装
满采样瓶 。 所有水样都应在 24h之内迅速进行检测,
或者 4℃ 下贮存 。
(二 )生态学参数及培养基
的组成原则
1,加入培养基中的天然提取物种类和用量, 环境
生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶
剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类 。
2,就分离培养基的组成而言, 部分培养基中必须
含有 10-50%的天然提取物 。 加入培养基中的天然
提取物, 部分培养基中则应含有多种碳, 氮源,
如几丁质, 纤维素或果胶 。
3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂 (如放线菌
酮和制霉素 )，掺加浓度一般为 50μg／ m1,以
抑制真菌的生长。
4、琼脂平板在使用前应置于 37℃ 培养箱中孵育 l、
2天。
5、培养基的生物物理学参数，如 pH及盐分也应调
节到与试样的生态系统参数值相近。
土中细菌的富集培养与分离
? 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进
行富集。
? 但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技
术才能很好地被分离培养 。
富集方法
? 运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若
干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来
激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富
集技术。
? 富集可以促进抗性的产生并维持下来。
? 土样中细菌的富集：适度稀释后，取 0.1m1涂布已
添加及未添加富集底物 (如几丁质、纤维素等 )的土
浸出汁平板。
? 植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液
适度培养取样，洗涤，取 1ml经适度稀释后涂布平
板。
? 水中细菌的分离：水样通过 0.22μm无菌滤膜，取
出滤膜用 1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用
样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压
印分离法。
水中细菌分离的简易富集技术
? 在无菌的, 用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培
养, 定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；
? 在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖, 多糖
及蛋白质等, 同样可以促进水中微生物的增殖 。
? 培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的
生长 。
? 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌, 附着材
料,, 如无菌的植物组织或土壤浸出液 。
? 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性
细菌, 中温菌和嗜高温菌 。
次代培养及纯化步骤
1,涂布的平板经培养后, 如生长出菌落, 则按涂布
不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落
对琼脂平板进行分类 。
2,用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添
加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上 。
3,筛选平板经培养后, 按生长出菌落的形态学特征
如色素, 菌落形态等进行最初分组 。
4,将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离
琼脂平板上进行筛选 。
五、放线菌的分离
? (一 )采样及采集方法
? 应尽可能实行无菌操作。
? 所采集的样本应具有一定的代表性 。
? 样本采集完后, 应及时处理或在 4℃ 下贮存,
贮存试样处应与划线, 筛选平板分开, 贮存时
间不宜过长 。
(二 )生态学参数
? 放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参
数有温度, pH,离子强度, 氧化还原电势和
底物浓度 。
（三）培养基的组成原则
? 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物
的琼脂平板上进行的 。 除嗜温性放线菌外, 其
他放线菌一般在培养 4-20天内在分离平板上缓
慢形成菌落 。
? 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉
菌素或放线菌酮, 以抑制真菌的繁殖 。
? 选择性地添加抗生素 。
? 分离琼脂平板制备好后, 一般皆应在 37℃ 培养
箱中存放 3天 。
放线菌的分离
? 土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，
无菌海绵压印土样后压印平板后培养。
? 植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以
减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培
养。也可洗下微生物后振荡培养。
? 水中放线菌的分离,为使所要分离的放线菌的数量
种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉
积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。
次代培养及纯化
? 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异,
作初步的鉴定和区分 。
? 通过高倍放大进行镜检, 可了解气生和营养孢子
形成情况 。
? 成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是
所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而
肉眼识别不同的生长形态, 从而初步地加以鉴定,
在分离放线菌时显得尤为重要 。
? 将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的
钩形针或无菌牙签挑取, 点接到琼脂平板上进行
影印培养, 以进一步筛选和分离 。
六,真菌分离
1,利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落
分散, 利于计数, 分离和鉴定 。 这里主要是利
用营养成分的减少而使生长减慢, 并由此限制
真菌的迁涉生长 。
2,改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分
离 。
3,有时, 真菌子实体形成必须有光线, 这在分
离培养时应加以考虑 。
4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种
或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技
术。
富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变
来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如
以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富
集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。
5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减
少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生
素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。
真菌的分离方法
? 土中真菌的分离：稀释法, 混入法, 压贴法,
粘附法, 浮选法, 注射器采集法, 土过筛法,
庶糖密度梯度离心法 。
? 植物材料中真菌的分离：植入法, 压贴法, 洗
涤法, 浸泡法 。
? 水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离 。 饵诱
技术常用于水中真菌的富集 。
? 子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体
组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一
小块无菌滤纸上培养 。
七、生产选种
? 是在长年累月的生产实践中, 在培养工艺条
件没有任何可见变更情况下, 突然发现某些批次
生产水平提高较大, 这就有可能是个别自然变异
朝更好的方向变的细胞, 在这种条件下很适应于
培养条件, 并逐渐显示出它的生长优势, 这种优
势的发展, 促使它优良的生产性能表露 。 进行类
似新种筛选分离, 达到获得新的优良生产菌种的
目的 。
第三节 工业菌种的育种方针
? 工业菌种的育种,
是运用遗传学原理和技术对某个用于特定
生物技术目的的菌株进行的多方位的改造 。 通
过改造, 可使现存的优良性状强化, 或去除不
良性质或增加新的性状 。
工业菌种育种的方法
? 诱变
? 基因转移
? 基因重组
育种过程
? 包括下列 3个步骤,
? (1)在不影响菌种活力的前提下, 有益基因型
的引入 。
? (2)希望基因型的选出 。
? (3)改良菌种的评价 (包括实验规模和工业生产
规模 )。
选择育种方法时综合考虑的因素
(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系 (如批
式或连续发酵试验 )；
(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的
明了程度；
(3)经济费用 。
? 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少,
则多半采用随机诱变, 筛选及选育等技术,
? 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的
认识, 则可选择基因重组等手段进行定向育种 。
工业菌种改良方法
(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加
特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来
提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出新的
代谢步骤, 由此提供一个旁路代谢途径 。
(2)增加前体物的浓度 。
(3)改变代谢途径, 减少无用副产品的生成以及提
高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物, 前体或产
品的耐受力 。
(4)抑制或消除产品分解酶 。
(5)改进菌种外泌产品的能力 。
(6)消除代谢产品的反馈抑制 。 如诱导代谢产品
的结构类似物抗性 。
提高特定基因的表达水平
? (1)引入强转录及翻译信号, 可通过在一高效
表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引
入强启动子；修改现有表达信号, 提高基因
效力等 。
? (2)诱导解除基因表达抑制的突变 。
改进菌种的生长效率
? 提高菌株对底物的利用率方法,
? a,通过确定并改变代谢中的耗能部分 ;
? b,由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现 。
? c,赋予菌种对多种底物, 特别是价廉而丰富的
底物的利用能力, 由此可降低操作费用 。
第四节 诱变育种
? 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机
率并不很高, 一个基因的自然突变频率仅 10-6-
10-10左右 。
? 诱变育种：以诱发突变为基础的育种, 是迄今
为止国内外提高菌种产量, 性能的主要手段 。
诱变 物理、化学或生物诱变方法
一、诱变剂和诱变处理
? 物理诱变剂：射线如紫外线, X— 射线, γ—
射线, 快中子；
? 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的
是紫外线 。 许多高产菌株的选育都用过紫外线,
对于一般实验室, 中小型工厂都适用, 也很安
全 。
? 其他的几种射线都是电离性质的, 有一定的穿
透力, 一般都由专业人员在专门的设备中使用,
否则有一定危险性 。
化学诱变剂,
化学因子如碱基类似物, 5— 氟尿嘧啶, 烷化剂等 。
化学诱变剂中使用最多, 最有效的是烷化剂 。
使用化学诱变剂的优缺点,
1,大多数情况下, 就突变数量而言, 要比电离辐射
更有效 。
2,化学诱变剂是很经济的, 因为只需要少量的
合适的诱变剂, 设备是实验室的一般玻璃器皿,
一个蒸气罩 。 而用电离辐射 ± 行工作时, 设备
费用大, 并要注意安全性 。
3,大部分诱变剂是致癌剂, 所以在使用中必须
非常谨慎, 要避免化学诱变剂与皮肤接触,，
且切勿吸入其蒸气, 有人对某些诱变剂极其敏
感, 甚至未直接接触就会过敏, 这就更要当心 。
诱变剂的选择
1,碱基类似物和羟胺具有很高的特异性, 但很少使
用, 回复突变率高, 效果不大 。
2,亚硝酸和烷化剂应用的范围较广, 造成的遗传损
伤较多 。 其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为
,超诱变剂,, 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变
剂之一 。
3,吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全
中断 。
4,紫外线仍十分有效 。 电离辐射是造成染色体
巨大损伤的最好诱变剂, 它能造成不可回复的
缺突变 。 但它可能影响邻近基因的性能 。
二、诱变育种步骤
?出发菌株的选择
?处理菌悬液的制备
?诱变处理
?中间培养
?分离和筛选
(一 )出发菌株的选择
1,自然界新分离的野生型菌株, 对诱变处理较
敏感, 容易达到好的效果 。
2,在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较
相像, 也是良好的出发菌株 。
3,每次诱变处理都有一定提高的菌株, 往往多
次诱变能积累较多的提高 。
4,出发菌株开始时可以同时选 2～ 3株, 在处理
比较后, 将更适合的出发菌株留作继续诱变 。
5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细
胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部
分是隐性的，特别是高产基因。
6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱
变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会
使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂
是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的
作用于休止期，就可选用孢子。
(二 )处理菌悬液的制备
? 这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的,
活力类似的菌悬液, 为此要进行合适培养基的
培养, 并要离心, 洗涤, 过滤 。
(三 )诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍, 结
合诱变对象的实际, 设计诱变处理方案 。
(四 )中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前, 有
一个表现延迟的过程, 即细胞内原有酶量的稀
释过程 (生理延迟 ),需 3代以上的繁殖才能将
突变性状表现出来 。 这个过程对今后的筛选和
获得稳定菌株都是极为重要的 。
方法,
让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小
时, 以让细胞的遗传物质复制, 让细胞繁殖几
代, 以得到纯的变异细胞 。 这样, 隐性的变异
就会显现出来, 若不经液体培养基的中间培养,
直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞
同时存在于一个菌落内的可能, 形成混杂菌落,
以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化 。
(五 )分离和筛选
? 筛选分初筛和复筛 。 初筛以迅速筛出大量的达到
初步要求的分离菌落为目的, 以量为主 。
? 复筛则是精选, 以质为主, 也就是以精确度为主 。
因此在具体方法上就有差异,
例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与
某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的
大小来挑取参加复筛者, 而将 90%的菌落淘汰 。
在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的
菌株, 最后才能选得优秀菌株 。 在以后的复筛阶
段, 还应不断结合自然分离, 纯化菌株 。
紫外线的诱变育种
? 紫外线诱变一般采用 15W紫外线杀菌灯, 波长
为 2537A,灯与处理物的距离为 15～ 30cm,照
射时间依菌种而异, 一般为几秒至几十分钟 。
一般我们常以细胞的死亡率表示, 希望照射的
剂量死亡率控制在 70～ 80%为宜 。
? 被照射的菌悬液细胞数，细菌为 106个／ ml左
右，霉菌孢子和酵母细胞为 106～ 107个／ ml。
由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，
约 0.5～ 1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工
进行搅拌，使照射均匀。
? 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时
和照射后的处理应在红灯下进行。
(二 )操作步骤
1,将细菌培养液以 3000r／ min离心 5min,倾去上清
液, 将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤 。
2,将菌悬液放入一巳灭菌的, 装有玻璃珠的三角瓶
内用手摇动, 以打散菌体 。 将菌液倒入有定性滤纸
的漏斗内过滤, 单细胞滤液装入试管内, 一般处于
浑浊态的细胞液含细胞数可达 108个／ ml左右, 作
为待处理菌悬液 。
3,取 2～ 4m1制备的菌液加到直径 9cm培养皿内,
放入一无菌磁力搅拌子, 然后置磁力搅拌器上,
15W紫外线下 30cm处 。 在正式照射前, 应先开紫
外线 10min,让紫外灯预热, 然后开启皿盖正式
在搅拌下照射 10～ 50s。 操作均应在红灯下进行,
或用黑纸包住, 避免白炽光 。
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各 o.5ml进
行稀释分离，计数活菌细胞数。
5．取照射菌液 2ml于液体培养基中 (300ml三角
瓶内装 30ml培养液 ),120r／ min振荡培养 4～ 6h。
6．取中间培养液稀释分离、培养。
7．挑取菌落进行筛选。
亚硝基胍诱变曲霉菌
? N— 甲基 — N'- 硝基 -N- 亚 硝 基胍 (NGN,
MNNG或 TG)对真核或原核微生物都有强烈的
诱变作用 。 其精确的作用机制尚不很清楚, 据
认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下
生成亚硝酸, 直接作用于细胞内的 DNA复制系
统, 从而诱发了变异 。 MNNG的诱变作用随 pH
的升高而增强 。
? (二 )操作步骤
1,单孢子悬液制备 取斜面, 加入 6ml 0.1mol／ L
pH6.o的磷酸缓冲液, 用接种环刮下孢子, 振荡
试管, 立即通过带滤纸漏斗过滤, 由此制得单孢
子悬液, 若孢子液浑浊状, 其孢子浓度可达 l06个
／ ml,此为待处理孢子悬液 。
2,MNNG溶液的制备 用分析天平称取 2mg,加
入 2ml 0.1mol／ L pH 6.0磷酸缓冲液, 于暗处振荡
溶解 。
3．诱变处理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢
子悬液中,30℃ 振荡 30min，立即稀释 1000倍停
止作用，然后以 10-2,10-4两个稀释度分离培养，
30℃ 3天后计数。
4．死亡率计算 将未处理的孢子液 1ml加入 1ml
磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离,30℃ 下培
养 3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡
率。
5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选,
第五节 营养缺陷型的选育
? 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某
些营养物质如氨基酸, 维生素和碱基等的能力,
必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才
能正常生长的变异株 。
? 与营养缺陷型对应的是野生型 。
? 能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培
养基 (MM)；
? 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充
培养基 (SM)；
? 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基
(CM),如牛肉膏蛋白胨培养基, 麦芽汁培养基
等 。
营养缺陷型的用途
? 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大 。
目前生产氨基酸, 核苷酸的菌种都是各种类型
的缺陷型 。 要研究代谢途径, 育种技术都必须
有营养缺陷型的菌株为材料 。
筛选营养缺陷型的步骤
? 诱变
? 淘汰野生型
? 检出缺陷型
? 确定生长谱
一、诱变方法
? 物理诱变
? 化学诱变
二、淘汰野生型
? 抗生素法：野生型能在 MM中生长, 而缺陷型
不能, 于是将诱变处理液在 MM中培养短时让
野生型生长, 处于活化阶段, 而缺陷型无法生
长, 仍处于休眠状态 。 由于细菌或酵母对一些
抗生素敏感, 于是就相应加入一定量的抗生素,
结果活化状态的野生型就被杀死, 保存了缺陷
型 。 一般细菌可以采用青霉素, 酵母可采用制
霉菌素 。
? 菌丝过滤法：对于霉菌, 因孢子生长后会长出
菌丝体, 就可用滤纸过滤法将菌丝滤去, 而缺
陷型孢子却因未发芽而不能滤过 。
三、检出缺陷型
? 原理：在固体基本培养基和完全培养基上, 生
长情况完全不同, 缺陷型在 CM上生长良好,
而在 MM上则不生长, 野生型都能生长 。
? 具体方法：影印法、点种法、夹层法
? 1,将一较平皿直径小 1cm的金属圆筒蒙上一层灭
菌的丝绒, 用金属夹夹住, 灭菌 。
? 2,将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻
轻一压, 使之成为印模, 标记方位 。
? 3,将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记
的同一方位上先后轻轻一压, 此菌印模即复印于
上 。
(一 )影印法
? 4, 将 CM和 MM在恒温箱中培养 。
? 5,二平皿相同方位进行比较, 即可发现在
MM平皿上长出的菌落少于 GM平板上的 。 MM上未
长而相应于 CM上长出的那几个菌落就可能是缺
陷型 。
? 此法要求平皿上菌落不能太多, 菌落之间应有
一定间隔 。
(二 )点种法
? 也就是任意法 。
? 用接种针或牙签将 CM上长出的菌落在 MM和
CM两副平板上接种, 依次在相应位置点种,
然后一起培养, 观察其生长情况 。
? 此法结果明确, 但工作量大 。
(三 )夹层法
? 先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基, 凝固后
涂上一层含菌的 MM,凝固后再倒一薄层 MM
琼脂培养基, 培养 24h,将出现的菌落标记,
然后倒上一层 CM琼脂培养基, 再培养 。 这时
第二批长出的菌落就可能是缺陷型 。
? 此法缺点是, 结果有时不明确, 而且将缺陷型
菌落从夹层中挑出并不很容易 。
四、营养缺陷型生长谱的确定
? 验证确定是缺陷型后, 就需确定其缺陷的因
子, 即生长谱测定 。
生长谱测定的方法
? 将缺陷型菌株培养后, 收集菌体, 制备成细胞悬
液, 与 MM培养基 (融化并凉至 50℃ )混合并倾注平
皿 。 待凝固后, 分别在平皿的 5～ 6个区间放上不
同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤
纸圆片 。 培养后会在某组合区长出, 就可测得所
需营养 。 — 个平皿测一个菌 。
? 以不同组合的营养混合物与融化凉至 50℃ 的 MM
培养基混合铺成平皿, 然后在这些平皿上划线
接种各个缺陷型菌株于各相应位置, 培养后根
据在这些组合长出可推知其营养因子 。 在 5～ 6
个平皿上可测 20株菌以上 。
第六节 基因育种
? 基因重组育种：是运用体外 DNA各种操作或修
改手法获得目的基因, 再借助于病毒, 细菌质
粒或其他载体, 将目的基因转移至新的宿主细
胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表
达, 或者通过细胞间的相互作用, 使一个细胞
的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给
另 — 个细胞的方法 。
一个完整的基因克隆过程包括以
下步骤
? １, 获得待克隆的 DNA片段 （ 基因 ） ；
? ２, 目的基因与载体在体外连接；
? ３, 重组 DNA分子导入宿主细胞；
? ４, 筛选, 鉴定阳性重组子；
? ５, 重组子的扩增与／或表达 。
2.2
基因重组
一、质粒的特点
1,质粒的存在并非微生物生命活动必需 。
2,每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数 。
不同类型的质粒其拷贝数各异, 同一质粒在不同
条件下, 拷贝数也可能差异很大, 有严紧型和松
弛型两种 。
3,质粒 DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是
共价, 闭环状 DNA(CCC DNA)；其次是由于 —
条链有缺口而产生的开环 DNA(ocDNA)；第三种
是由双环分子两段均断裂而产生的线性 DNA。
质粒载体
二、各类质粒所赋予宿主细胞的
不同表现型
抗生素抗性：抗生素的产生；大肠杆菌素的产
生；肠毒素的产生；复杂有机化合物的降解；限
制性核酸内切酶和修饰酶的产生；杀伤性能。
在自然条件下，许多质粒可经细菌接合或相似
方式在宿主间相互转移。在实验室条件下，质粒
也可经人工手段将其转化入宿主细胞内。
三、质粒 DNA的提取方法
? 细菌培养和质粒扩增；
? 细菌的收获和裂解；
? 质粒 DNA的提取 。
四、遗传转化
转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离的
DNA片段，将其同源部分进行碱基配对，组合到自
己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。
(二 )操作步骤,
质粒 DNA转化感受态大肠杆菌
1．从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入 10ml肉汤培养基
中,37℃ 培养过夜。
2．取 0.5ml培养物接入 50ml肉汤中，无菌添加 0.4ml
2.5mol／ LMgCl2，于 37℃ 振荡培养。
3．将 o.1mol／ L CaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中
冷却。
4．当培养物 OD600在 o.5～ o.8左右时，开始收获
细胞 (大约需 2～ 2.5h),
5．将培养物置冰浴中冷却 10min。
6．取 10ml培养物置 2个冷离心管中弃去上清液。
7．加入 1ml 0.1mol／ L CaCl2，再加 0.9ml
CaCl2，置冰浴中放置 20min。
8,3000r／ min离心 10min，弃去上清液,
9．加入 1ml 0.1mol／ L CaCl2，重新悬浮细胞，
置冰浴中保存。
10．加入 1～ 20μ l待转化质粒 DNA溶液。
11．在冰上放置 20min，在 37℃ 处理 2min。再插入
冰中．加入 0.9m1肉汤 37℃ 静置培养 90min。
12．以不同的量涂布选择培养基平板。
13．于 37℃ 培养过夜。鉴定转化菌落。
常用的遗传转化系统
? 1、自然系统
? 2、人工诱导（完整细胞）
（ 1）二价阳离子系统,Ca2+,Ca2++Mg2+,Mg2+，
Ca2++辅助噬菌体,Tris+Ca 2+
（ 2）单价阳离子系统,PEG+Li+/Cs+/Rb+
（ 3）冻融系统
（ 4） Triton处理：人工诱导（ PEG/原生质体）
重组 DNA中常用的工具酶
? 包括限制性核酸内切酶, DNA连接酶,
DNA聚合酶, 逆转录酶等,
限制性内切酶
? 切开 DNA分子所需的酶：每
一种酶都有其各自的作用
位点 。
? 常用限制性内切酶
? 种类及特性
W,Arber,H,O,Smith
限制性内切酶的剪切方式
? 粘性未端：切开后的两段 DNA各留下一个尾,
这 2个尾的核苷酸顺序完全一样, 中是方向相
反 。 它们之间是互补的, 在适当条件下可以再
连接一起 。
其它工具酶
? 连接酶
T4 DNA
? 修补工具酶
DNA聚合酶 I
? 末端加工酶
S1核酸酶, 碱性磷酸单脂酶
? 末端转移酶
人工加 polyA 或 polyT 尾
? 反转录酶
载体－宿主系统
? 载体 (vector)是携带外源 DNA进入宿主细胞进
行扩增和表达的 DNA；
? 一般是通过改造质粒, 噬菌体或病毒等构建的 。
载体应具备以下条件,
? １、能在适当的宿主细胞中复制；
? ２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克
隆位点）以便外源 DNA插入；
? ３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
? ４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时
载体 DNA与宿主 DNA便于分离；
? ５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适
应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元
件。
宿主细胞必须符合以下条件
? １、对载体的复制和扩增没有严格的限制；
? ２、不存在特异的内切酶体系降解外源 DNA；
? ３、在重组 DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；
? ４、重组缺陷型，不会产生体内重组；
? ５、容易导入重组 DNA分子；
? ６、符合重组 DNA操作的安全标准。
目的基因的获取
? 一、通过建立基因文库分离靶基因
? 基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性
内切酶。
? cDNA：用 mRNA反转录成单链 DNA，再经 DNA聚合
酶的作用产生双链 DNA。可去除真核生物基因
中不表达的内含子。
? 二、化学合成法制备 DNA片段
? 从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传
密码，再依照密码合成基因。
? 三、聚合酶链反应法扩增基因片段
? 对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以
通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组 DNA
或 cDNA模板扩增得到目的基因片段。
PCR技术
? 根据需扩增片段的两端设计引物。
? 使 DNA解链（高温），引物结合于基因的两端
（低温），在合适温度下开始合成（链延长）
反应。
? 特点：需要很少的 DNA模板，且能直接从基因
组中得到目的基因。
DNA扩增
PCR反应
DNA片断的克隆
载体的条件,
a 复制起点
b 适宜的限制酶切点
c 选择标记
? DNA分子的体外连接
DNA片段的体外连接是重组 DNA技术的关键 。
DNA连接是由 DNA连接酶催化完成的 。
一,DNA连接酶
? DNA连接酶催化两条双链 DNA片段相邻的 5’-磷酸
和 3’-羟基间形成磷酸二酯键 。
? 在分子克隆中最有用的的 DNA连接酶是来自Ｔ４
噬菌体的 DNA 连接酶 。
? T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于,
? １, 连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；
? ２, 连接双链 DNA分子间的平端；
? ３, 在双链平端的 DNA分子上添加合成的人工接
头或适配子 。
重组 DNA导入宿主菌
? 体外连接的重组 DNA分子必须导入适当的受体
细胞中才能大量的复制, 增殖和表达 。 根据所
采用的载体的性质, 将重组 DNA分子导入受体
可有不同的方法 。
一、转 化
? 指以细菌质粒为载体, 将外源基因导入受体细
胞的过程 。 转化时, 细菌必须经过适当的处理
使之处于感受态－即容易接受外源 DNA的状态,
然后利用短暂热休克使 DNA导入细菌宿主中 。
? 此外还可用电穿孔法转化细菌, 它的优点是操
作简便, 转化效率高, 适用于任何菌株 。
二、转染和感染
? 利用噬菌体 DNA作为载体时可经两种方式导入
受体菌 。 一种是感染, 即在体外将噬菌体 DNA
包装成病毒颗粒, 然后使其感染受体菌 。 另一
种方式是转染, 即在 DNA连接酶作用下使噬菌
体 DNA环化, 再象重组质粒一样地转化进受体
菌 。 但习惯上常把以噬菌体 DNA为载体构建成
的重组子导入细胞的过程统称为转染 。
重组克隆的筛选与鉴定
? 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选
出含有阳性重组子的菌落, 并鉴定重组子的正
确性 。
? 通过细菌培养以及重组子的扩增, 获得所需的
基因片段的大量拷贝 。 进一步研究该基因的结
构, 功能, 或表达该基因的产物 。
一、抗药性标志的筛选
? 如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如 ampr
或 tetrr, 转化后只有含这种抗药基因的转化子
细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落,
这样就可将转化菌与非转化菌区别开来 。 如果重
组 DNA时将外源基因插入标志基因内, 该标志基
因失活, 通过有无抗菌素培养基对比培养, 还可
区分单纯载体或重组载体 （ 含外源基因 ） 的转化
菌落 。
二,β －半乳糖苷酶系统筛选
? 很多载体都携带一段细菌的 lacZ基因, 它编
码 β －半乳糖苷酶 N-端的 146个氨基酸, 称为 α
－肽, 它表达 β －半乳糖苷酶的 C-端肽链 。
? 当载体与宿主细胞同时表达两个片段时, 宿主
细胞才有 β －半乳糖苷酶活性, 使特异的底物
X-gal 变为兰色化合物, 这就是所谓的 α －互
补 。
? 而重组子由于基因插入使 α －肽基因失活, 不
能形成 α －互补, 在含 X-gal的平板上, 含阳性
重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑 。
? 三, 菌落快速裂解鉴定法
? 从平板上直接挑选菌落裂解后, 直接电泳检测载体
质粒大小, 判断有无插入片段存在, 该法适于插入
片段较大的重组子初筛 。
? 四, 内切酶图谱鉴定
? 经初筛鉴定有重组子的菌落, 小量培养后, 再分离
出重组质粒或重组噬菌体 DNA,用相应的内切酶切
割, 释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重
组子, 还要用内切酶消化鉴定插入的方向 。
重组 DNA的鉴定
遗传学方法
第七节 杂交育种
(一 )细菌杂交
? 在细菌中实现杂交的种类尚不多, 主要是大肠杆
菌, 其他还有鼠伤寒沙门氏菌, 铜绿假单胞菌,
淋病奈氏球菌等 。
? 大肠杆菌中存着致育因子 F,有 F因子为 F+,没有
F因子称 F-。
? F因子存在于细胞中形式：游离状态 (F+细胞 )；
整合状态, 即 F因子插入胞核质的一定位置上
(Hfr细胞 )。
? F因子有明显的感染性, 大肠杆菌的接合, 实质
上是 F因子的转移, 所以 F+和 Hfr称供体菌, 而 F-
称受体菌 。
（ 二）酵母杂交育种技术
? 1,酵母繁殖方式
? 酵母为单细胞型真菌, 一般以出芽方式生殖, 在通
常情况下, 繁殖体为双倍体, 但经过特定条件的诱
导, 可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁
殖体 。
? 单倍体细胞具 α 及 ε 2两种交配型 。 两种交配型
细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交
配, 恢复为双倍体；同一交配型细胞之间, 则因
细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配 。
? 在生活过程中, 酵母细胞还可以形成三倍体, 四
倍体, 多倍体或非整倍体细胞 。
? 2、酵母杂交
? 一般而言, 杂交育种运用了酵母的单双倍生
活周期, 将不同基因型和相对的交配型的单倍
体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞, 经筛选
便可获得新的遗传性状 。
? 酵母的杂交方法有孢子杂交法, 群体交配法,
单倍体细胞杂交法和罕见交配法 。 就啤酒酵母
而言, 运用罕见交配法更易获得结果 。
第八节 原生质体育种
? 原生质体育种技术主要有原生质体融合, 原生
质体转化技术, 此外尚有原生质体诱变育种等 。
? 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法 。
? 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是
1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上
提出来的 。
一、原生质体融合育种的特点
(一 )杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下
形成类似于球形的原生质体 。
(二 )受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任
何一株都可能起受体或供体的作用, 因此有利
于不同种属间微生物的杂交 。
(三 )遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二
亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的
过程 。
(四 )存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合
子的可能性 。
（ 五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株 。
(六 )提高菌株产量的潜力较大 。
(七 )有助于建立工业微生物转化体系 。
二、原生质体融合育种步骤
1,标记菌株的筛选和稳定性验证 。
2,原生质体制备 。
3,等量原生质体加聚乙二醇促进融合 。
4,涂布于再生培养基, 再生出菌落 。
5,选择性培养基上划线生长, 分离验证, 挑取
融合子进一步试验, 保藏 。
6,生产性能筛选 。
三、原生质体融合育种的要点
（ 一 ） 标记菌种的选择
获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种,
筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株 。 这里最
重要的是标记必须稳定 。
采用抗药性菌株除可作标记外, 在实验室
中还可排除杂菌污染的干扰 。 为的是确证融合
的成功, 可以采用多标记菌种 。
(二 )原生质体的制备
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加
入细胞壁分解酶, 将细胞壁分离剥离, 结果剩
下由原生质膜包住的类似球状的细胞, 它保持
原细胞的一切活性 。
在放线菌和细菌中, 制备原生质体主要采用
溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素
酶等 。
影响原生质体制备的因素
1,菌体的前处理
为了使酶作用的效果好一些, 可将菌作一些
前处理 。 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素 。
2,菌体的培养时间
为了使细胞易于原生质体化, 一般选择增殖
期的菌体 。
3, 酶浓度
对于不同种属的微生物, 不仅对酶的种类要
求不同, 就是对酶的浓度也有差异 。 另外, 最
佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化 。
? 4．酶处理温度
? 5．破壁时的 pH值
? 6．渗透压稳定剂
等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保
护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物
的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，
蔗糖等有机物和 KCl和 NaCl等无机物。
第九节 筛选新的代谢产物
一、开发新的代谢产物的途径
? (1)从自然界分离新的微生物菌株，或采用新
的检阅方法筛选新的代谢产物。
? (2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。
? (3)利用微生物转化改造代谢产物的结构。
(4)通过原生质体融合获得新的代谢产物。
? (5)DNA重组技术。
二、筛选微生物新的代谢产物
的程序
突变型菌株的筛选
? 一、产量性状突变株的筛选
三、筛选微生物代谢产物的目标
? 筛选克服抗生素抗性菌株的活性物质；
? 筛选抗肿瘤, 抗病毒的活性物质；
? 研究有药理活性的酶抑制剂及免疫调节剂；
? 寻找食品工业最好的酵母培养物；
? 筛选降解有害物质的微生物以及治疗上具有低
毒, 长效的化学药物等 。
四、筛选微生物代谢产物的方法
? (一 )直接方法
? 为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途, 在
体外试验测得活性后, 可以将培养液的有效成
分直接作用于机体, 观察被测样品的疗效 。
? 这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体
内治疗试验 。
? (二 )间接方法
? 筛选医用抗生素, 可用细茵, 真菌, 病毒或肿
瘤模型, 寻找抗细菌, 抗真菌, 抗病毒, 抗肿
瘤抗生素, 酶抑制剂, 免疫制剂等有效物质 。
? 在预筛选时, 多用琼脂平扳扩散抑菌法 。 通过
预筛选, 直接测定最初分离物的生物活性, 能
加速筛选过程 。
五、检测系统
? 筛选过程的成功依赖于排除那些已知的或并非
需要的代谢产物的检验方法, 这样才能识别出
人们需要的化合物 。
性能签别
? 性能鉴别是分离和筛选微生物代谢产物中最基
础的工作 。
? 鉴别可分为两方面,
一是对微生物方面进行形态, 培养, 生化功
能答试验观察, 并确定微生物产生菌的类群；
? 二是从化学的早期鉴别来鉴别微生物的代
谢产物 。 化学的早期鉴别一般对产生菌所产生
的代谢产物进行纸上层析, 薄板层析, 纸上电
泳, 抗茵谱, 高压电泳, 紫外分光光度法, 液
相和气相色谱等试验, 井获得各种图谱, 与已
知图谱进行比较鉴别 。
? 如果认为是有实用前途的代谢产物, 则要进一
步大量培养, 并进行动物试验, 毒性考查, 药
物代谢等实验, 并进行提高发酵水平和改善提
取工艺的工作, 以备投入生产 。
? 如果是新的代谢产物, 一般要进一步确定其化
学结构, 井在此基础上进行合成法的研究或进
行化学改造, 研究结构与生物活性的相互关系,
并对作用机制, 生物合成过程作进一步的研究 。
菌种筛选方法
? 诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之
几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细
胞中的少数。
? 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得
最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学
筛选方案和手段。
菌种筛选方案
? 初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌
株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使
优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，测
定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快
速、简单。
? 复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，
复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生
产指标。
菌种筛选的手段
? 初筛
? 从菌体形态变异分析
? 平皿快速检测法 具体的有纸片培养显色法、变
色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等
? 摇瓶培养法摇瓶培养法也可用于初筛。 初筛的
摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，
从大量菌株中选出 10-20%较好的菌株，淘汰
80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个
菌株培养 3瓶，选出 3-5个较好的菌株，再做进
一步比较，选出最佳的菌株 。
特殊变异菌的筛选方法
营养缺陷型突变株的筛选
经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进
行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防
止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营
养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和
鉴别营养缺陷型等步骤。
? 抗性突变菌株的筛选 抗性突变株的筛选相对比
较容易，只要有 10-6频率的突变体存在，就容
易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次
性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。
一次性筛选法 噬菌体抗性菌株、耐高温菌株
阶梯性筛选法药物抗性突变株。
? 组成酶变异株的筛选
许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底
物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些
酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，
而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的
影响。
具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和
诱导抑制物法。
? 1) 恒化器法：常被用于微生物的“驯化”。在
培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，
菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株
则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速
率较快。
? 为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中
的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化
器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶
变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一
步的纯化分离。
? 2) 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和
含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分
离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。
? 当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的
培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，
但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水
解酶，而诱导型菌株就不能合成。
? 将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异
株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导
型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两
类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占的
比例将逐渐增大。
? 3) 诱导抑制剂法：有些化合物能阻止某些诱导
酶的合成，当在诱导物和诱导抑制剂同时存在
的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株
不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型
变异株能够利用底物进行生长繁殖。
第十节 工业微生物菌种保藏技术
? 在生产发酵中, 具有高产有重要经济价值
的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保
存和长期保藏, 对于一成功的工业发酵过程极
为重要 。
一、理想的菌种保藏方法应具备
的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在；
(2) 保证高产突变株不改变表型和基因型, 特别
是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的
高产能力 。
(3)菌种保藏的基本措施是低温, 干燥, 真空 。
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；
(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；
(3) 转接培养或斜面传代保藏；
(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
2.1 冷冻保藏
? 冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的
方法 。
? 通过冷冻, 使微生物代谢活动停止 。 一般而言,
冷冻温度愈低, 效果愈好 。 为了获得满意的冷
冻结果, 通常应在培养物中加入一定的冷冻保
护剂 。 冷冻保藏时温度要求在 -20℃ 以下, 同时
应认真掌握好冷冻速度和解冻速变 。
? 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难 。
冷冻保藏种类
一, 普通冷冻保藏技术 (-20℃ )
二, 超低温冷冻保藏技术 (-60一 -80℃ )
三, 液氮冷冻保藏技术
普通冷冻保藏技术 (-20℃)
? 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接
到试管或指管肉, 然后贮藏于一冰箱的冷藏室中,
或于温度范围在 -5～ -20℃ 的普通冰箱 (-20℃ )中 。
或者, 将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上, 待
生长适度后, 将试管或瓶口用橡胶塞严格封好, 同
上置于冰箱中保存 。
? 用此方法可以维持若干微生物的活力 1— 2年 。
? 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再
用来保藏 。
? 保藏过程中应注意控制保藏温度, 培养瓶或试
管应严格密封 。
? 这一方法虽简便易行, 但不适宜多数微生物的
长期保藏 。
二、超低温冷冻保藏技术 (-60一 -80℃)
? 要求长期保藏的微生物菌种, 一般都要求在 -60℃ 以
下进行保藏 。
? 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是,
? 1,离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；
? 2,用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；
? 3,加入等体积的 20％ 甘油或 10％ 二甲亚砜；
? 4,混匀后分装入冷冻指管或安瓿中, 于 -70℃ 超
低温冰箱中保藏 。
?
? 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含 10％
甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰
箱的冷冻速度一般控制在 1-2℃ ／ min。若干细
菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏 5年而活
力不受影响。
三、液氮冷冻保藏技术
(一 )冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中, 最常用的冷冻保护剂是二
甲亚砜和甘油, 最终使用浓度一般为甘油 10
％, 二甲亚砜 5％ 。 所使用的甘油 — 般用高压
蒸汽灭菌, 而二甲亚砜最好为过滤灭菌 。
(二 )液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤
1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入 5ml含
10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制
成孢子及菌体细胞悬液； 0.5～ lml分装玻璃安瓿或
液氮冷藏专用塑料瓶,
(2)从浸没培养物制备菌悬液,
在浸没培养液中加入等体积 20%无菌甘油；
轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则
需先用玻璃珠打散； 0.5-lml分装玻璃安瓿或液
氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；
将所有封好的安瓿置于 5℃ 冰箱中 3min，以使细
胞和悬浮培养基之间达到平衡。
2,控速冷冻,
(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中, 然后置于
一较大的金属容器中；
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；
(3)以 1-2℃ /min的致冷速度降温, 直到温度达到相
对温度之上几度的细胞冻结点 (通常为 -30℃ )；
(4)补加一定量的液氮至系统中, 使细胞在冻结点
时尽可能快地发生相变；
(5)细胞冻结后, 将致冷速度降为 1℃ /min,直到
温度达 -50℃ ；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相 (-)96℃ )或
气相 (-156℃ )中保存 。
如果无控速冷冻机, 则一般可将安瓿或液氮瓶
置于一 70℃ 冰箱中冷冻 4h,然后迅速移入液氮
罐中保存 。
(三 )复苏
1,从液氮罐中取出所需的安瓿, 立即置于冰浴中；
2,迅速将安瓿置于 37-40℃ 水浴中, 并轻轻摇动以
加速解；
3．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有
2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反
复抽吸数次，然后取 0.1-0.2ml (约 4,8滴 )转接入
琼脂斜面上。
2.2 冻干保藏
? 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使
冻结的细胞悬液中的水分升华, 使培养物干燥 。
此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法
之一 。
? 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂, 目前国
内常用脱脂乳和蔗糖, 国外尚有运用动物血清
等的 。
? 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏 10
年之久而不丧失活力 。 而且经冻干后的菌株无
需进行冷冻保藏, 便于运输 。
培养物的冻干过程
(二 )操作步骤
1,启动冷冻干燥器的致冷单元 。 当冷凝器的温度达
到 -40℃ 时启动真空泵, 使真空度达到 2.67～
4.00Pa。
2,将冷冻槽置于歧管之下方 。 槽中装入 2／ 3体积的
异丙醇, 然后插入温度计及可调温控仪降温探
头, 打开降温探头控制醇浴温度在 -40℃, 这 — 过
程约需 30min。
3,每支斜面加入 2ml 20％ 的脱脂乳, 然后用巴氏吸
管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液,
最终菌株浓度一般要求在 106CFU／ m1,用细菌浸没
培养物来保藏时, 加入 40％ 的脱脂乳, 混合制成含
106CFU／ ml的均悬液 。
4,取下安瓿上的棉塞, 然后用 lml移液管分装安
瓿 (0.2ml／瓿 ),重新塞好棉塞 。
5,轻轻振荡安瓿, 以使细胞重新悬浮 。 将安瓿
与歧管相联后迅速置于醇浴中, 然后调节温控
装置 。 使细胞悬液迅速冻结 。
6,15min后，将歧管与真空泵相通。
7,维持 -40℃ 的醇浴温度 90-120min,然后调节温
控装置 。 使醇浴温度上升至 -10℃, 维持 2h。
8,关掉可调温控装置的降温探头, 让醇浴温度上
升至室温 (25℃ ),
9,在冷冻干燥的最初 4h内应定期测真空度, 在安
瓿置于真空下后 1h内, 真空度必须达到 13.33Pa，
并于菌悬液接近干燥时逐渐降到 2.67～ 4.0Pa。
10, 在真空状态下, 让安瓿保存在冷冻干燥机
中至少 16h以获得完全干燥 。
11,干燥后, 在 2.67～ 4.00Pa的真空度下封瓶,
12,在所有安瓿都封盖好后, 撤去真空 。
13,关闭真空泵 。
14,关闭冷凝器 。
(三 )冻干菌种的保藏与再生
1,保藏：冷冻干燥后的培养物在低于 5℃ 下保藏 。
较低的保藏温度 (-20～ -70℃ )对于培养物的长期
稳定更好 。
2,复苏,
(1)在超净工作台中用 70％ 酒精棉球擦洗安瓿, 然
后用砂轮在安瓿中锉一道沟 。
(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿, 然后用手掰
开安瓿,
(3)在安瓿中加入 0.5～ 1ml营养液体培养基, 慢慢
旋转安瓿, 使冻干菌种复水 。 然后将此转接到
一含有再生培养基的无菌试管中, 或直接接种
琼脂斜面或涂布平板 。
(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状, 可以将此
直接振落入盛有 l～ 2ml液体培养基的试管中,
轻轻振荡 5～ l0min,然后用此悬液接种适宜的
再生培养基 。
2.3 其他保藏方法
一、传代保藏
二、矿物油中浸没保藏
一、传代保藏
? 将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代, 然后在
一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法 。
? 可用于实验室中若干菌种的保藏 。
? 此法最为简单和经济, 且不要求任何特殊的设
备 。
? 但此方法易发生培养基干枯, 菌体自溶, 基因
突变 。
? 因此要求在基本培养基上传代为好, 目的是能
淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平 。
? 斜面培养物应在密闭容器中于 5℃ 保藏, 以防
止培养基脱水并能降低代谢活性 。
? 此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏
方法 。
二、矿物油中浸没保藏
? 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室
温下保藏, 此方法简便有效 。
? 可用于丝状真菌, 酵母, 细菌和放线菌的保
藏 。 特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以
在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏
更为有效 。
? 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜
的培养基上生长, 然后注入经 170℃ 下灭菌 1-2h的
矿物油, 矿物油的用量以高出培养物 1cm为宜 。
? 以液体石蜡作为保藏方法时, 应对需保藏的菌株
预先作试验 。 因为某些菌株在液体石蜡下生长还
十分明显, 有些菌株如某些假丝酵母还会同化液
体石蜡, 也有的对液体石蜡保藏敏感 。 所有这些
菌株都不能用液体石蜡保藏 。 为了预防不测, 一
般保藏株 2～ 3年也应做一次存活试验 。
不同菌种保藏方法比较
2.4 基因工程菌的保藏
? 由载体质粒等携带的外源 DNA片段通常是
遗传不稳定的, 且很易丢失其外源质粒复
制子 。 质粒基因通常为宿主细胞生长非必
需 。
? 一般情况下当细胞丢失这些质粒时, 生长
速度会加快 。
? 当培养基中加入抗生素时, 抗生素提供了一有
利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择
压 。 而且在运用基因工程菌进行发酵时, 抗生
素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的
协调 。
? 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂
的培养基中 。
2.5 微生物活力和稳定性测定
? 所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持
菌种的优良性状不变 。
? 在保藏时定期检测菌种活力, 以确定保藏培养
物的保藏期限和保藏方法的可靠性, 以及确定
在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传
稳定性 。
? 对工业微生物生产菌种来说, 建议保藏菌种的
形态学和生化特征 (如代谢产物的产生, 酶活
力, 遗传特征及生化指标 )应在保藏后加以检
测和确定 。
? 加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养
物的稳定性 。 在一给定温度下通过对高温下短
期活力丧失程度检测, 可以用来预测嗜酸乳杆
菌的稳定性 。
? 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括
在保藏 6个月, 1年或更长时间后存活百分率 (或
存活单位 )。 细胞群体的形态学特征或一些特别
的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性, 以
及实验室中, 中试车间中和生产发酵中产品滴
度的稳定性, 后者极为重要 。
