第六章 发酵工程基本操作
? 主讲人：刘萍
第一节 严格消毒灭菌
? 控制有害微生物主要有以下几种措施
（一）灭菌（ sterilization）
? 采用强烈的理化因素使任何物体内外
部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力
的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措
施等。
? 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指
菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀
死后，其细胞发生溶化、消失的现象 。
（二）消毒（ disinfection）
? 从字义上来看，消毒就是消除毒害，
这里的, 毒害, 就是指传染源或致病菌
的意思，英文中的, dis-infection”也是
,消除传染, 的意思。
? 所以，消毒是一种采用较温和的理化因
素，仅杀死物体表面或内部一部分对人
体有害的病原菌，而对被消毒的物体基
本无害的措施。
（三）防腐（ antisepsis）
防腐就是利用某种理化因素完全抑制
霉腐微生物的生长繁殖，从而达到
防止食品等发生霉腐的措施。
（ 1）低温
（ 2）缺氧
（ 3）干燥
（ 4）高渗
（ 5）高酸度
（ 6）防腐剂
（四）化疗（ chemotherapy）
? 化疗即化学治疗。它是利用具有高度选
择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对
宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿
主体内病原微生物的生长繁殖，借以达
到治疗该传染病的一种措施。
? 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。
最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺
胺类药物和中草药中的有效成分等。
除菌的方法
? 培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高
压加热法）
? 空气的过滤除菌
? 紫外线或电离辐射
? 化学药物灭菌
（一）高温杀菌作用的种类
? 高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核
酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它
可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏
细胞膜上的类脂质成分等。
? 湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由
于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更
易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而
加速其变性。
1．干热灭菌法,将金属制品或清洁玻璃器皿放
入电热烘箱内，在 150～ 170℃ 下维持 1～ 2小时
后，即可达到彻底灭菌的目的。
在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、
原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。
灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能
用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。
2．湿热灭菌法
? 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。
? 多数细菌和真菌的营养细胞在 60℃ 左右
处理 5～ 10min后即可杀死；
? 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用
80℃ 以上的温度处理才能杀死；
? 而细菌的芽孢最耐热，一般要在 120℃ 下
处理 15min才能杀死。
（ 1）常压法
? 巴氏消毒法（ pasteurization） 用于牛奶、啤酒、
果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种
消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病
原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而
又不影响它们的风味。
? 巴氏消毒法是一种低温消毒法
? 低温维持法：在 63℃ 下保持 30分钟可进行牛奶
消毒；
? 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在 72℃ 下保
持 15秒钟即可。
? 间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。
适用于不耐热培养基的灭菌。
? 方法是：将待灭菌的培养基在 80～ 100℃ 下蒸
煮 15～ 60分钟，以杀死其中所有微生物的营养
细胞，然后置室温或 37℃ 下保温过夜，诱导残
留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过
夜，如此连续重复 3天，即可在较低温度下达
到彻底灭菌的效果。
（ 2）加压法
? 常规加压灭菌法
? 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底
驱尽后将锅密闭，再继续加热至 121℃ （压力
为 1kg／ cm2或 15磅／英寸 2），时间维持 15～
20分钟，也可采用在较低的温度（ 115℃,即
0.7kg／ cm2或 10磅／英寸 2）下维持 35分钟的方
法。
? 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机
构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的
灭菌。
连续加压灭菌法
? 在发酵行业里也称, 连消法, 。此法只
在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。
? 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不
断地进行加热、维持和冷却，然后才进
入发酵罐。培养基一般在 135～ 140℃ 下
处理 5～ 15秒钟。
连续加压灭菌法优点
① 因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又
可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了
原料的利用率，比, 实罐灭菌, （ 120℃, 30
分钟）提高产量 5～ 10％；
②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所
以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的
利用率；
③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；
④适宜于自动化操作；
⑤降低了操作人员的劳动强度。
（二）影响加压蒸汽灭菌效果
的因素
? （ 1）灭菌物体含菌量的影响。
? 天然原料尤其是麸皮等植物性原料配
成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹
化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。
? （ 2）灭菌锅内空气排除程度的影响
? 检验灭菌锅内空气排除度，可采用
多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时
装有压力表和温度计，其次是将待测气
体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听
到, 扑扑, 声而未见有气泡冒出，也可
证明锅内已是纯蒸汽了。
? （ 3）灭菌对象 pH的影响
? （ 4）灭菌对象的体积。要防止用常规的
压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培
养基的灭菌。
? （ 5）加热与散热速度。这两段时间也对
灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使
科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌
操作中对这些技术细节都应加以注意。
（三）高温对培养基成分的有
害影响及其防止
消除高温有害影响的措施
? （ 1）采用特殊加热灭菌法
? （ 2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，
应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合
并；
? （ 3）对含 Ca2+或 Fe3+的培养基与磷酸盐
先作分别灭菌，然后再混合，就不易形
成磷酸盐沉淀；
（ 4）对含有在高温下易破坏成分的培养基
（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌
（在 112℃ 即 0.57kg／ cm2或 8磅／英寸 2下
灭菌 15分钟）或间歇灭菌；
（ 5）在大规模发酵工业中，可采用连续加
压灭菌法进行培养基的灭菌
(二 )灭菌设备
l、高压蒸汽灭菌 生产中使用高压蒸汽灭菌锅
的型号很多
手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。
立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培
种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。
灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽
培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶
(袋 )。但投资太大，适合大型菌种场使用。
? 2．常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是
用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适
于一般生产单位和专业户使用。大小可
根据需要而定，但最大的锅每次装料也
最好不超过 500公斤。
3．烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干
燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。
第四节 培养基的灭菌
３, 湿热灭菌的基本原理,
湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌 。 蒸汽冷
凝时释放大量潜热, 并具有强有强大的
穿透力, 在高温和水存在时, 微生物细
胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性
变性, 致使微生物在短时间内死亡 。
? 由于湿热灭菌有经济和快速等特点, 因
此被广泛用于工业生产 。
? 用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求
是,
? 既要达到一定的灭菌程度,
? 又要尽量减少营养成分的破坏。
（一）理论灭菌时间
? 某些分子的分解和分子内部的重新排列
的反应属于单分子反应。
? 杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但
其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋
白质变性，这种反应属与单分子反应，
因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循
单分子反应方程。
τ =(2.303/k)log(No/Ns)
τ -- -灭菌时间 （ 秒 ）
k---反应速度常数, 与菌的种类和加热温度有关 （ s－１ ）
No---灭菌开始时, 污染的培养基中杂菌个数 （ 个／ ml）
Ns---经过灭菌时间 T后, 残存活菌个数 （ 个／ ml）
（二）灭菌温度与菌反应速度
常数的关系
灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系,
k=Ae-E/RT
K—— 菌死亡的速度常数 （ 1／秒 ）, 当反应物的浓度为单位浓度时,
则反应速度常数在数值上等于反应速度
A—— 阿累尼乌斯常数 （ 1／秒 ）
R—— 气体常数 （ 1.987*4.817焦／开／摩尔 ）
T—— 绝对温度（开）
二、影响培养基灭菌的因素
? 1,pH值的影响
? pH值对微生物的耐热性影响很
大, pH为 6.0~8.0时微生物最
不易死亡, pH <6.0时氢离子
易渗入微生物的细胞内 。
? 2,培养基成分
? 培养基的成分中, 油脂, 糖类, 蛋白质
都是传热的不良介质, 会增加微生物的
耐热性, 使灭菌困难 。
? 浓度较高的培养基相对需要较高温度和
较长时间灭菌 。
? 高浓度的盐类, 色素则削弱其耐热性,
故较易灭菌 。
? 3,培养基中的颗粒物质
? 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反
之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对
培养基灭菌影响不大，但在培养基混有
较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体
时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。
三、灭菌的实际操作
? （ 一 ） 空罐灭菌
? 空罐灭菌也称空消 。 无论是种子罐, 发酵罐,
还是尿素 （ 或液氨 ） 罐, 消泡罐, 当培养基
（ 或物料 ） 尚未进罐前对罐进行预先灭菌, 为
空罐灭菌 。
? 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢, 空
罐灭菌要求温度较高, 灭菌时间较长, 只有这
样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢 。
? （ 二 ） 实罐灭菌
? 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热, 达到预定
灭菌温度后, 维持一定时间, 再冷却到发酵温
度, 然后接种发酵, 这叫做实罐灭菌, 又称分
批灭菌 。
? 操作要点,
? 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进
入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持
一定的时间。这就是所谓的, 三路进气, 。
培养基连消工艺流程图
? （ 2）过滤除菌法
? 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使
大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，
从而达到除菌目的。在体外培养时，
过滤除菌大多用于遇热容易变性而失
效的试剂或培养液。
? 目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。
关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。
? 滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石
棉板过滤器（ Seitz滤器）、素烧瓷过滤器
以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点是
无法去除其中的病毒和噬菌体。
? （ 3）其他方法
? 在配制培养基时，为避免发生沉淀，一
般应按配方逐一加入各种成分。
? 另外，加入 0.01％ EDTA或 0.01％ NTA
（氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中，
可防止金属离子发生沉淀。
? 最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯
等对个别成分进行灭菌处理。
三、化学杀菌剂或制菌剂
（一）表面消毒剂
? 常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度
各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其
在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起
刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制
菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。
? 表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能
用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。
? 为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采
用在临床上最早使用的消毒剂 —— 石炭酸作为
比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。
? 所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能
杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石
炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间
为 10分钟，而供试菌定为 Salmonellatyphi（伤
寒沙门氏菌）。
消 毒 试 验
? ⑴ 以人工染菌实物为消毒对象, 模拟现场表面
污染大肠杆菌液 。
? ⑵ 消毒前采样：放置无菌规格板, 取无菌棉拭
于含 5ml稀释液试管中沾湿, 在规格板空心处旋
转自左至右涂抹整个区域
? ⑶ 消毒后采样：在前采样地点旁用 0.05％ 过氧
乙酸溶液消毒物体表面, 30分钟后将无菌棉 拭
于含 5ml采样液试管中沾湿, 作为消毒后样液 。
? ⑷ 将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释
⑸ 培养待凝固后 37℃ 培养 24～ 48小时, 作菌落
计数 。
灭菌效果监测
? １, 高压蒸气灭菌效果监测
? (1) 高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器
不同部位, 观察灭菌后指示卡颜色变化 。
? (2)芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪杆菌芽
胞 105cfu/ml的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌
后作细菌计数测定。 对照是不经灭菌的菌片，
芽胞完全被杀灭或杀来率达 99.9999％为合格。
? ２, 紫外线消毒效果监测
? ⑴ 微型紫外线强度计：使用时打开仪器开关,
装入电池, 打开电源开关, 接通电源, 将测
定电压转换开关拨至电压一方, 此时指针应超
过中线 。
? 测定时, 将测定电压转换开关拨至测定一方,
打开紫外线灯照射２分钟后, 将紫外线灯强度
计置于紫外线灯下垂直１Ｍ的中央进行照射,
直至仪表指针稳定, 所示之值即为该紫外线灯
的强度值 (uw/cm2) 。
? (2)紫外线强度与消毒剂量指示卡,
? 测定灯管强度时, 将卡片置于离紫外灯
管１Ｍ的中央处, 将图案一面朝向灯管,
照射一分钟 （ 照射时间要准确 ） 后, 图
案正中涂层由白色变为紫红色 。 与周围
相应色块相比, 可测知所照射的强度 。
? 新灯管以不低于 100uw/cm2为合格，
旧灯管低于 70uw/cm2应更换。
第二节 空气的净化
一、空气中微生物的分布
? 空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和
空气中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而
异。
?,北方气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多，
离地面越高，含菌量越少；一般每升高 10米，
空气中的含菌量就降低一个数量级；
? 城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌
量较少，一般城市空气中杂菌数为 3000~8000
个／米 3 。
? 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较多，
也有酵母，霉菌和病毒。
? 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰
尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为
103~104个／米 3。
? 灰尘粒子的平均大小约 0.6μ m左右，所以空气
除菌主要是去除空气中的微粒 (0.6-1μ m ）
二、空气除菌
? 工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同
而异 。
? 半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格, 一
般无需复杂的空所净化处理；
? 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养, 进入发酵
罐前空气必须进行冷却, 脱水, 脱油和过滤除菌等
处理 。
（二）发酵对空气无菌程度
的要求
? 好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要
作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济
的。
? 发酵对无菌空气的要求是,无菌，无灰尘，无
杂质，无水，无油，正压等几项指标；
? 发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵
过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。
? 在工程设计中一般要求 1000次使用周期中只允许
有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为
N=10-3
二、空气除菌的方法
? （ 一 ） 辐射杀菌
? （ 二 ） 热杀菌
? （ 三 ） 静电除菌
? （ 四 ） 过滤除菌
3．辐射灭菌法
? 最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌 。 2537?
波长的紫外线具有极强烈的杀菌效力, 它的主要
作用是使微生物的 DNA分子产生的胸腺嘧啶的二
聚体, 导致细胞死亡 。
? 无菌室常用的紫外灯功率为 30W,安装在操作台
上方一米左右高处, 每次照射 15-30min既可 。
? 紫外线有很强的杀菌力, 但穿透力很弱, 一张薄
纸即可完全挡住紫外线, 因此待灭菌物品必须置
于紫外光直接照射下, 而且在一定范围内作用强
度与距离平方成反比 。
? 此外，紫外线对人体组织有一定刺激作用，眼
睛、皮肤受照射后会产生某些症状，所以工作
人员在无菌室操作时应关闭紫外灯
热灭菌
? 原理：基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热
变性而得以实现。
? 热空气进入培养系统之前，一般均需用压缩机
压缩，提高压力。
? 空气压缩后温度能达到 200度以上，保持一定
时间后，便可实行干热杀菌。
? 利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理
对制备大量无菌空气有特别意义。
? 实际应用中需考虑培养装置与空气压缩机的相
对位置，连接压缩机与培养装置的管道的灭菌
以及管道长度等。
静电除菌
? 静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘埃，
同时也除去微生物。
? 原理：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除
尘灭菌目的。
? 对于一些直径小的微粒，所带电荷小，不能被
吸附而沉降。
介质过滤除菌
? 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质
过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质
层中，而达到除菌的目的。
? 从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，
目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂
广泛采用的方法。
发酵生产中制备无菌空气的大
致过程
一、对空气除菌流程的要求
? 要制备较高无菌程度，具有一定压力的无菌空气，
它的流程设备有空气压缩机。
? 附属设备要求尽量采用新技术，提高效率，减少设
备，精简设备投资、运转费用和动力消耗，简便操
作。
? 流程的制订就根据所在的地理、气候环境和设备条
件而考虑。
? 在环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风
的条件，以降低过滤器的负荷，提高空气的无
菌程度；
? 在温暖潮湿的南方，要加强除水设施，以确保
和发挥过滤器的最大除菌效率；
? 在压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除
油雾的污染等等。
二、空气除菌流程分析
? 要保持过滤器有比较高的过滤效率, 应维持一
定的气流速度和不受油, 水的干扰 。
? 气流速度可由操作来控制；
? 要保持不受油, 水干扰则要有一系列冷却, 分
离, 加热的设备来保证空气的相对湿度在
50%～ 60%的条件下过滤 。
高空取气管
? 高空取气管是远离地面几十米
的管子。一般而言，地面附近
空气中所含的 微生物和灰尘等
均比高空空气中含的多，据资
料介绍，每升高 10米，空气中
杂菌可降低一个数量级，因此
从高空取气要比从低空取气有
利得多。
油水分离器
? 其内部同时采用直接拦截,
惯性碰撞, 布朗扩散及凝
聚等机理, 能有效地去除
空气中的水, 油雾, 尘埃,
内部不锈钢丝网可清洗,
使用寿命长 。
两级分离、冷却、加热的空气
除菌流程
１ —— 粗过滤器 ２ —— 压缩机 ３ —— 贮罐
４ —— 冷却器 ５ —— 丝网分离器 ６ —— 过滤器
高效前置过滤除菌流程
１ —— 高效前置过滤器 ２ —— 压缩机 ３ —— 贮罐
４ —— 冷却器 ５ —— 丝网分离器 ６ —— 加热器
７ —— 过滤器
空气净化的流程
? 吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤
? 进入空气压缩机（ 120-150度）
? 冷却（ 20-25度），除去油、水，再加热至 30-
35度。
? 最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净
度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。
二、过滤除菌设备原理
? 概述,
? 目前发酵工厂采用的空气过滤设备大多数是传
统的深层过滤设备，滤层厚度一般为 1～ 2米，
所用的过滤介质一般是棉花、活性炭，也有采
用玻璃纤维、焦炭等。
? 对不同的材料，材料的不同规格，材料的填充
情况不同，都会得到不同的过滤效果。为了制
取适合要求的无菌空气，就得深入研究深层过
滤的各种关系。
（一）深层过滤原理
? 深层过滤所用的过滤介质 — 棉花的纤维直径一
般为 16~20微米 。
? 充填系数为 8%时, 棉花纤维所形成网格的孔隙
为 20～ 50微米, 微粒大小为 (0.5-2微米 )。
? 微粒随气流通过滤层时, 滤层纤维所形成的网
格阻碍气流前进, 使气流出现无数次改变运动
速度和运动方向, 绕过纤维前进；
? 这些改变引起微粒以对滤层纤维产生惯性冲击,
阻拦, 重力沉降, 布朗扩散, 静电吸引等作用
而把微粒滞留在纤维表面上 。
纤维介质阻留微粒的机制
? 1,阻拦截留：微粒随空气气流向前运动, 当
气流为层流时, 随气流运动的粒子在接近纤维
表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附
捕集, 这种作用称之为阻拦截留 。
空气流速愈小, 纤维直径愈细, 阻拦截留作
用愈大 。 但是在介质过滤的除尘除菌中, 阻拦
截留并不起主要作用 。
? 2,惯性碰撞截留：空气气流流速大时, 气流中
的微粒具有较大的惯性力 。 当微粒随气流以一定
速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运
动方向时, 由于微粒具有的惯性作用使它们仍然
沿原来方向前进碰撞到纤维表面, 产生摩擦粘附
而使微粒被截留在纤维表面, 这种作用称惯性碰
撞截留 。
截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力,
所以, 气流速度愈大, 惯性力大, 截留效果也愈
好 。 此外, 惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关,
纤维愈细, 捕集效果愈好 。 惯性碰撞截面在介质
除尘中起主要作用 。
? 3,布朗扩散运动：直径小于 1μ 的微粒在运
动中往往产生 — 种不规则的布朗运动, 使微粒
间相互凝集成较大的粒子, 从而发生重力沉降
或被介质敲留 。 但是这种作用只有在气流速度
较低时才较显著 。
４、重力沉降 作用 机理
? 重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受
的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易
沉降。
? 就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作
用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才
起作用。
? 一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边
界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留
的捕集效率。
５、静电吸附作用机理
? 干空气对非导体的物质相对运动磨擦时, 会产
生诱导电荷, 纤维和树脂处理过的纤维, 尤其
是一些合成纤维更为显著 。
? 悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电
荷, 如枯草杆菌孢子 20%带正电荷, 20%带负电
荷, 15%中性, 这些带电的微粒会受带异性电
荷的物体所吸引而沉降 。
? 此外，表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭
的大部分过滤效能应是表面吸附的作用。
空气过滤除菌 介质
? １、棉花
? ２、玻璃纤维
? ３、活性炭
? ４、超细玻璃纤维纸
? ５、石棉滤板
? ６, 烧结材料过滤介质
? ７, 新型过滤介质
影响介质过滤效率的因素
? 介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其
他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率
越高。
? 对于相同介质，过滤效率与介质滤层厚度、介
质填充密度和空气流量有关。
提高过滤除菌效率的措施
? 鉴于目前所采用的过滤介质均需要干燥条件下
才能进行除菌，因此需要围绕介质来提高除菌
效率。
? （ 1）设计合理的空气预处理设备，选择合适的
空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。
? （ 2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌
效率高的过滤介质。
? （ 3）保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫
生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预
处理。
? （ 4）降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如
使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去
油，提高进入过滤器的空气温度。
过滤器失效
? 压缩空气进入过滤器后便引起活性炭颗粒之间
相互顶撞与摩擦，久而成为粉末 (灰化 )，活性
炭的体积也逐渐变小，于是过滤器内的空间逐
渐增大，到达 -定程度时，便会发生棉花成
90° 翻身现象。这样空气便会未经过滤而进入
罐内，引起染菌。
? 棉花经过多次加热灭菌后，颜色逐渐变深，靠
近过滤器壁的棉花，因经受夹层蒸汽的烤干，
受热更为剧烈，更容易变成粉末，而被空气带
走，造成过滤层有缝隙，使过滤层疏松而漏
风．甚至还因过高的压力和过长时间的烘烤而
引起棉花活性炭着火的事故。
（二） 过滤器的结构
? １、棉花 — 活性炭过滤器
? 棉花是最常用的过滤介质, 通常要用纤维不太
长的原棉, 因为它具有一定的弹性, 虽然几经
湿热灭菌, 干燥后仍能保持原有的疏松状态 。
棉花的过滤阻力较活性炭大 （ 10~12倍 ） 。
? 活性炭通常被加工成粒状, 其过滤效率比棉花
低, 但具有阻力小, 吸附力强 （ 可吸附空气中
有害物质, 如油, 水 ） 的特点, 通常与棉花介
质一起使用, 减少过滤层的阻力 。
? 棉花活性炭过滤器的过滤效率可达 99%,
? 其过滤介质装填为,
? 上部和下部装填棉花, 其厚度为总过滤层的 2*
（ 1/4~1/3）, 中间再装入 1/2~1/3厚度的活性
炭 。 一般棉花的填充密度为 150~200公斤 /米 3，
活性炭 40~450公斤 /米 3。
? 孔板 —— 金属丝网 —— 麻布织品 —— 棉
花 —— 麻布织品 —— 活性炭 —— 麻布织品 ——
棉花 —— 麻布织品 —— 金属丝网 —— 孔板
按入式过滤器
1、便于迅速更换
2、活塞型滤芯与壳体密封，防止未过滤的气体
绕过滤芯
3、防腐蚀滤芯：不锈钢芯以增强结构性能；气
流阻力低；采用缝焊以提高强度
4、新型 "矩阵混合纤维 "介质有效表面积大，确
保高效率；开放区大，尽量减少压降
5、涂膜封闭式泡沫套筒抗油类和酸类物质的腐
蚀，防止液体重新混入气流，确保高效率
6、不含石硅树脂
7、可承受 65℃ 的高温
微生物的培养方法
氧的供需
? 实验室中，通过摇瓶机往复运动或偏心旋转运
动供氧。
? 中试规模和生产规模的培养装置采用通入无菌
压缩空气并同时进行搅拌的方式。
? 近年来开发出无搅拌装置的节能培养设备，如
气升式发酵罐。
? 细胞对鼓泡通气和机械搅拌产生的剪切作用敏
感。
? 在常压下（ 20℃ ）达到平衡时，氧在水中的溶
解度仅为 6.2ml／ L（ 0.28mmol）。这些氧只能
保证氧化 8.3mg（即 0.046mmol）葡萄糖，仅相
当培养基中常用葡萄糖浓度的 1‰ 。
? 除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养料一般
都可保证微生物使用几小时至几天。
? 对好氧菌来说，生长的限制因子几乎总是氧的
供应。
? 只有将培养液装成浅层时，氧才不至于成为限
制因子。
提高溶氧速率的措施
? 在进行液体培养时，一般可通过增加液体与氧
的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率,
? 具体措施有,
? ①浅层液体培养；
? ②利用往复式或旋转式摇床（ shaker）对三角
瓶培养物作振荡培养；
? ③在深层液体培养器的底部通入加压空气，并
用气体分布器使其以小气泡形式均匀喷出；
? ④对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上
设置阻挡装置。
在实验室进行好氧菌培养
的具体方法
? （ 1）试管液体培养装液量可多可少。此法的
通气效果一般均不够理想，仅适合培养兼性厌
氧菌。
? （ 2）三角瓶浅层培养在静止状态下，三角瓶
内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对
微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此
法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。
? （ 3）摇瓶培养 即将三角瓶内培养液用 8层纱
布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同时降低
瓶内的装液量，把它放到往复式或旋转式摇床
上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。
? （ 4）台式发酵罐体积一般为几升至几十升，
并有多种自动控制和记录装置。
氧的性质及发酵液中实际需氧量
? 难溶气体，在 25度和 105 Pa时，氧在纯水中的
溶解度为 0.25mol/m3 。
? 对于发酵液中每小时在 1 m3 培养液中需要氧
是溶解量的 750倍。如果中断供氧，菌体会在
几秒钟内耗尽溶氧。
细胞对氧的需求
? 氧作为受氢体
? 氧直接参与一些生物反应
微生物的吸氧量
? 常用呼吸强度和耗氧速率表示。
? 呼吸强度：单位质量的干菌体在单位时间内所
吸取的氧量,QO2, 表示微生物的绝对耗氧量。
? 耗氧速率：单位体积培养液在单位时间内的吸
氧量,r。
? 二者关系：呼吸强度表示微生物的绝对吸氧量，
但当培养液中有固体成分存在时，测定困难。
用耗氧速率表示。
? r= QO2 c(X)
? c(X) 发酵液中菌体的浓度
? 在培养过程中不需要使溶解氧浓度达到或接近
饱和值，而只要超过某一临界氧浓度即可。
? 当不存在其他限制性基质时，如果溶氧浓度高
于临界值，细胞的比耗氧速率保持恒定；
? 如果溶氧浓度低于临界值，细胞的比耗氧速率
大大下降，这时细胞处于半厌氧状态。
临界溶氧浓度
? 满足微生物呼吸的最低氧浓度。在临界氧浓度
以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而
显著下降。
? 好氧微生物临界氧浓度大约是饱和浓度的 1-25
％。
发酵对溶解氧的影响
? 培养基的成分和浓度显著影响耗氧。
? 菌龄
? 菌体的耗氧量
? 溶氧高发酵条件最适条件下发酵或排除有毒代
谢产物培养加有利于菌体的生长和产物合成，
但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。
? 需考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧
浓度。
? 最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的
特性有关 。
供氧与微生物呼吸代谢的关系
? 好氧微生物所含的氧化酶系：过氧化氢酶，细
胞色素氧化酶，黄素脱氢酶，多酰氧化酶等。
? 不同好氧微生物所含的氧化酶系的种类和数量
不面，在不同环境条件下，各种微生物的吸氧
量或呼吸强度不同。
对微生物供氧的传递过程
? 空气中的氧 (氧溶入液体的传递速度 )—— 液体
中的溶氧 (氧由液体至微生物的传递速度 )——
微生物体内的氧 (氧的利用速度 )—— 产物
? 在氧的传递过程中液膜阻力是控制因素 。
? 为了供给微生物必需的氧量, 必须注意发酵罐
的类型及运转以维持所要求的 Kla。
一 双膜理论的基本前提
? （ 1）在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界
面，在界面的气泡一侧存在着一层气膜，在界面
的液体一侧存在着一层液膜。气膜内的气体分子
和液膜中的液体分子和液膜中的液体分子都处于
层流状态，分子间无对流运动，因此氧的分子只
能以扩散方式，即籍浓度差而透过双膜。
? 另外，气泡内除开气膜以外的气体分子，处
于对流状态，称为气体主流，在空气主流空间
的任一点，氧分子的浓度相同，液体主流中也
是如此。
? （ 2）在双膜之间的界面上，氧气的分压强与
溶于液体中的氧的浓度
? （ 3）传质过程处于稳定状态，传质途径上各
点的氧的浓度不随时间而变。
氧传递的动力和阻力
? 在氧从气泡传递到细胞内要克服一系列的阻力，
相对大小取决于流体力学特性、温度、细胞活性
和浓度、液体的组成、界面特性以及其他因素。
? 传递过程的总推动力是气相与细胞内的氧分压之
差。
? 气液相间的氧传递阻力：气膜和液膜中。
? 液固相间的氧传递：细胞或细胞周围的液膜阻
力可忽略。
? 在发酵工业生产上如何保证发酵中氧的供给, 以
满足生产菌对氧的需求, 是稳定和提高生产, 降
低成本的关键之一 。
? 在发酵中氧究竟够不够, 即产量是否受到氧的限
制, 单凭通气量大小是难于确定的 。
? 了解通气搅拌对发酵的影响, 最简便有效的办法
便是就地测量发酵液中氧的浓度 。 从氧浓度变化
曲线可以看出氧供需的规律及对生产的影响 。
? 溶氧可作为发酵中氧是否足够的度量, 发酵异常
情况的指示, 发酵中间控制的手段之一和考查设
备及工艺条件对氧供需与产物形成影响的指标之
一 。
氧在水中的溶解度
? 培养液中氧的溶解比水中还小，因为氧的溶解
度随着温度的升高而下降，随着培养液固形物
的增多，或粘度的增加而下降。
? 长期以来深层通风培养普遍使用机械搅拌罐，
由于罐的直径与通风管径相差悬殊，故通入气
体的细碎与醪液的混合完全依靠机械搅拌作用。
影响氧溶解效果的因素
? 发酵罐结构如高径比
? 挡板安置情况
? 罐内压与发酵液深度
? 搅拌器型式
? 搅拌转速
? 通风量
? 培养基组成。
? 主要是搅拌转速与通风量。
机械搅拌可以提高通风效果
的原因
? 搅拌将通入的空气打碎成细泡，增加了气液接
触面积
? 小气泡从罐底上升到液面的速度要比大气泡慢，
这又使气液接触的时间增加
? 由于搅拌使液体形成湍流，使气泡不是直线上
升而是成螺旋线上升，延长了气泡在液体中运
动的时间与路程
? 由于液体呈湍流运动因而减少了气泡周围的液
膜厚度，增加了氧扩散到液体中的速度。
发酵过程中溶解氧的变化
? 每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律。
? 明显下降：需氧量超过供氧量，使溶氧浓度明
显下降，出现一个低峰，产生菌的摄氧率同时
出现高峰。发酵液中的菌浓也不断上升。粘度
一般在这个时期也会出现一高峰阶段。这都说
明产物物菌正处在对数生长期。
? 过了生长阶段，需氧量有所减少，溶氧浓度以
过一段时间的平衡阶段或上随之上升后，就开
始形成产物，溶氧浓度也不断上升。低峰出现
的时间和低峰溶氧浓度随菌种、工艺和设备供
氧能力不同而异。
? 发酵中后期，对于分批发酵，溶氧浓度变化比
较小。菌体已进入静止期，呼吸强度变化不大。
? 外界补料，溶氧的变化随补料时的菌龄、补入
物质的种类和剂量不同而不同。如补糖，则摄
氧率增加，溶氧浓度下降。
? 在生产后期，菌体衰老，呼吸强度减弱，溶氧浓
度逐步上升，菌全自溶，溶氧浓度会明显上升。
发酵过程中比耗氧速率的变化
? 对数生长初期，比耗氧速率达到最大值，但此
时细胞浓度低，摄氧率并不高。随着细胞浓度
的迅速增高，培养液的摄氧率增高，在对数生
长后期达到峰值。
? 对数生长阶段结束，比耗氧速率下降，摄氧率
下降。
? 基质耗尽，细胞自溶，摄氧率使迅速下降。
发酵过程中溶氧变化异常原因
? 耗氧或供氧出现了异常因素或发生了障碍
? 1、引起溶氧异常下降的原因,
? （ 1）污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗
? （ 2）菌体代谢发生异常，需氧要求增加
? （ 3）某些设备或工艺控制发生故障或变化，如
搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢；消泡剂加入
过多
? （ 4）影响供氧的工艺操作如停止搅拌、闷罐等。
引起溶氧异常升高的原因
? 主要是耗氧出现改变，如菌体代谢异常，耗氧
能力下降,
? 污染烈性噬菌体
? 溶氧监测的作用
? （ 1）从发酵液中的溶解氧浓度变化，可以了
解微生物生长代谢是否异常
? （ 2）工艺控制是否合理
? （ 3）设备供氧能力是否充足。
溶解氧浓度的控制
? 溶氧浓度决定因素：供氧和需氧两方面。当发
酵的供氧量大于需氧量，溶氧浓度就上升，直
到饱和。
? 供氧控制：设法提高氧传递的推动力和液相体
积氧传递系数 Kla值。
? 需氧控制：需氧量受菌体浓度、基质种类、和
浓度及培养条件等因素影响，以菌浓影响最明
显。
? 发酵液摄氧率随菌浓增加而按比例增加
? 氧的传递速率随菌浓的对数关系减少。
? 控制菌的比生长速率比临界值略高一点的水平，
达到最适浓度，是控制最适溶氧的重要方法。
? 最适菌浓度的控制方法：通过控制基质浓度。
如利用溶氧的变化自动控制补糖速率，间接控
制供氧速率和 pH值，实现菌体生长、溶氧和 pH
值三位一体的控制体系。
三 测量体积溶氧系数的方法
? （一）亚硫酸盐氧化法
? 用铜离子作为催化剂，溶解在水中的氧能立即
氧化其中的亚硫酸根离子，使之成为硫酸根离
子，其氧化反应的速度在较大的范围内与亚硫
酸根离子的浓度无关。实际上是氧分子一经溶
入液相，立即就被还原掉。剩余的 Na2SO3与过
量的碘作用,再用标定的 Na2S2O3滴定剩余的
碘,
（二） 溶氧电极法
? 溶氧电极可以看作是一种电解电池，它有两只具
有不同正电性能电极，一只是银丝做成的阴极，
另一只是铅皮卷成的阳极，这对电极装置在两端
开口的细的玻璃套管内，在靠近的阴极的一端用
一种耐用热的，只允许气体透过而不透过水及离
子的半渗透塑料膜覆盖。形成 一个有一定容积
的电池，在电池中加入数毫升电解质溶液。
? 在两极之间产生一个电位，使阳极铅变成铅离子
进入电解质溶液，同时放出的电子在阴极上把透
过半透膜 进入电池 的氧立即还原成氢阳根离子。
? 用溶阳电极与氧气分析仪相配合，可直接测量
实际发酵液中的容积传氧系数 Kla
? 式中Ｃ进，Ｃ＊为常量：Ｃ出可用氧气分析仪
自排出气体测得，Ｃ为培养液中的溶氧浓度用
溶氧电极测得。
? 主讲人：刘萍
第一节 严格消毒灭菌
? 控制有害微生物主要有以下几种措施
（一）灭菌（ sterilization）
? 采用强烈的理化因素使任何物体内外
部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力
的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措
施等。
? 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指
菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀
死后，其细胞发生溶化、消失的现象 。
（二）消毒（ disinfection）
? 从字义上来看，消毒就是消除毒害，
这里的, 毒害, 就是指传染源或致病菌
的意思，英文中的, dis-infection”也是
,消除传染, 的意思。
? 所以，消毒是一种采用较温和的理化因
素，仅杀死物体表面或内部一部分对人
体有害的病原菌，而对被消毒的物体基
本无害的措施。
（三）防腐（ antisepsis）
防腐就是利用某种理化因素完全抑制
霉腐微生物的生长繁殖，从而达到
防止食品等发生霉腐的措施。
（ 1）低温
（ 2）缺氧
（ 3）干燥
（ 4）高渗
（ 5）高酸度
（ 6）防腐剂
（四）化疗（ chemotherapy）
? 化疗即化学治疗。它是利用具有高度选
择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对
宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿
主体内病原微生物的生长繁殖，借以达
到治疗该传染病的一种措施。
? 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。
最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺
胺类药物和中草药中的有效成分等。
除菌的方法
? 培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高
压加热法）
? 空气的过滤除菌
? 紫外线或电离辐射
? 化学药物灭菌
（一）高温杀菌作用的种类
? 高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核
酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它
可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏
细胞膜上的类脂质成分等。
? 湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由
于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更
易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而
加速其变性。
1．干热灭菌法,将金属制品或清洁玻璃器皿放
入电热烘箱内，在 150～ 170℃ 下维持 1～ 2小时
后，即可达到彻底灭菌的目的。
在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、
原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。
灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能
用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。
2．湿热灭菌法
? 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。
? 多数细菌和真菌的营养细胞在 60℃ 左右
处理 5～ 10min后即可杀死；
? 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用
80℃ 以上的温度处理才能杀死；
? 而细菌的芽孢最耐热，一般要在 120℃ 下
处理 15min才能杀死。
（ 1）常压法
? 巴氏消毒法（ pasteurization） 用于牛奶、啤酒、
果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种
消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病
原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而
又不影响它们的风味。
? 巴氏消毒法是一种低温消毒法
? 低温维持法：在 63℃ 下保持 30分钟可进行牛奶
消毒；
? 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在 72℃ 下保
持 15秒钟即可。
? 间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。
适用于不耐热培养基的灭菌。
? 方法是：将待灭菌的培养基在 80～ 100℃ 下蒸
煮 15～ 60分钟，以杀死其中所有微生物的营养
细胞，然后置室温或 37℃ 下保温过夜，诱导残
留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过
夜，如此连续重复 3天，即可在较低温度下达
到彻底灭菌的效果。
（ 2）加压法
? 常规加压灭菌法
? 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底
驱尽后将锅密闭，再继续加热至 121℃ （压力
为 1kg／ cm2或 15磅／英寸 2），时间维持 15～
20分钟，也可采用在较低的温度（ 115℃,即
0.7kg／ cm2或 10磅／英寸 2）下维持 35分钟的方
法。
? 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机
构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的
灭菌。
连续加压灭菌法
? 在发酵行业里也称, 连消法, 。此法只
在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。
? 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不
断地进行加热、维持和冷却，然后才进
入发酵罐。培养基一般在 135～ 140℃ 下
处理 5～ 15秒钟。
连续加压灭菌法优点
① 因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又
可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了
原料的利用率，比, 实罐灭菌, （ 120℃, 30
分钟）提高产量 5～ 10％；
②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所
以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的
利用率；
③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；
④适宜于自动化操作；
⑤降低了操作人员的劳动强度。
（二）影响加压蒸汽灭菌效果
的因素
? （ 1）灭菌物体含菌量的影响。
? 天然原料尤其是麸皮等植物性原料配
成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹
化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。
? （ 2）灭菌锅内空气排除程度的影响
? 检验灭菌锅内空气排除度，可采用
多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时
装有压力表和温度计，其次是将待测气
体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听
到, 扑扑, 声而未见有气泡冒出，也可
证明锅内已是纯蒸汽了。
? （ 3）灭菌对象 pH的影响
? （ 4）灭菌对象的体积。要防止用常规的
压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培
养基的灭菌。
? （ 5）加热与散热速度。这两段时间也对
灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使
科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌
操作中对这些技术细节都应加以注意。
（三）高温对培养基成分的有
害影响及其防止
消除高温有害影响的措施
? （ 1）采用特殊加热灭菌法
? （ 2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，
应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合
并；
? （ 3）对含 Ca2+或 Fe3+的培养基与磷酸盐
先作分别灭菌，然后再混合，就不易形
成磷酸盐沉淀；
（ 4）对含有在高温下易破坏成分的培养基
（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌
（在 112℃ 即 0.57kg／ cm2或 8磅／英寸 2下
灭菌 15分钟）或间歇灭菌；
（ 5）在大规模发酵工业中，可采用连续加
压灭菌法进行培养基的灭菌
(二 )灭菌设备
l、高压蒸汽灭菌 生产中使用高压蒸汽灭菌锅
的型号很多
手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。
立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培
种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。
灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽
培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶
(袋 )。但投资太大，适合大型菌种场使用。
? 2．常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是
用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适
于一般生产单位和专业户使用。大小可
根据需要而定，但最大的锅每次装料也
最好不超过 500公斤。
3．烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干
燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。
第四节 培养基的灭菌
３, 湿热灭菌的基本原理,
湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌 。 蒸汽冷
凝时释放大量潜热, 并具有强有强大的
穿透力, 在高温和水存在时, 微生物细
胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性
变性, 致使微生物在短时间内死亡 。
? 由于湿热灭菌有经济和快速等特点, 因
此被广泛用于工业生产 。
? 用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求
是,
? 既要达到一定的灭菌程度,
? 又要尽量减少营养成分的破坏。
（一）理论灭菌时间
? 某些分子的分解和分子内部的重新排列
的反应属于单分子反应。
? 杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但
其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋
白质变性，这种反应属与单分子反应，
因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循
单分子反应方程。
τ =(2.303/k)log(No/Ns)
τ -- -灭菌时间 （ 秒 ）
k---反应速度常数, 与菌的种类和加热温度有关 （ s－１ ）
No---灭菌开始时, 污染的培养基中杂菌个数 （ 个／ ml）
Ns---经过灭菌时间 T后, 残存活菌个数 （ 个／ ml）
（二）灭菌温度与菌反应速度
常数的关系
灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系,
k=Ae-E/RT
K—— 菌死亡的速度常数 （ 1／秒 ）, 当反应物的浓度为单位浓度时,
则反应速度常数在数值上等于反应速度
A—— 阿累尼乌斯常数 （ 1／秒 ）
R—— 气体常数 （ 1.987*4.817焦／开／摩尔 ）
T—— 绝对温度（开）
二、影响培养基灭菌的因素
? 1,pH值的影响
? pH值对微生物的耐热性影响很
大, pH为 6.0~8.0时微生物最
不易死亡, pH <6.0时氢离子
易渗入微生物的细胞内 。
? 2,培养基成分
? 培养基的成分中, 油脂, 糖类, 蛋白质
都是传热的不良介质, 会增加微生物的
耐热性, 使灭菌困难 。
? 浓度较高的培养基相对需要较高温度和
较长时间灭菌 。
? 高浓度的盐类, 色素则削弱其耐热性,
故较易灭菌 。
? 3,培养基中的颗粒物质
? 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反
之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对
培养基灭菌影响不大，但在培养基混有
较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体
时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。
三、灭菌的实际操作
? （ 一 ） 空罐灭菌
? 空罐灭菌也称空消 。 无论是种子罐, 发酵罐,
还是尿素 （ 或液氨 ） 罐, 消泡罐, 当培养基
（ 或物料 ） 尚未进罐前对罐进行预先灭菌, 为
空罐灭菌 。
? 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢, 空
罐灭菌要求温度较高, 灭菌时间较长, 只有这
样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢 。
? （ 二 ） 实罐灭菌
? 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热, 达到预定
灭菌温度后, 维持一定时间, 再冷却到发酵温
度, 然后接种发酵, 这叫做实罐灭菌, 又称分
批灭菌 。
? 操作要点,
? 三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进
入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持
一定的时间。这就是所谓的, 三路进气, 。
培养基连消工艺流程图
? （ 2）过滤除菌法
? 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使
大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，
从而达到除菌目的。在体外培养时，
过滤除菌大多用于遇热容易变性而失
效的试剂或培养液。
? 目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。
关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。
? 滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石
棉板过滤器（ Seitz滤器）、素烧瓷过滤器
以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点是
无法去除其中的病毒和噬菌体。
? （ 3）其他方法
? 在配制培养基时，为避免发生沉淀，一
般应按配方逐一加入各种成分。
? 另外，加入 0.01％ EDTA或 0.01％ NTA
（氮川三乙酸）等螯合剂到培养基中，
可防止金属离子发生沉淀。
? 最后，还可以用气体灭菌剂如氧化乙烯
等对个别成分进行灭菌处理。
三、化学杀菌剂或制菌剂
（一）表面消毒剂
? 常用消毒剂的种类很多，它们的杀菌强度
各不相同。但几乎都有一个共同规律，即当其
在极低浓度时，常常会对微生物的生命活动起
刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制
菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。
? 表面消毒剂是指对一切活细胞都有毒性，不能
用作活细胞内的化学治疗用的化学药剂。
? 为比较各种表面消毒剂的相对杀菌强度，常采
用在临床上最早使用的消毒剂 —— 石炭酸作为
比较的标准，并提出了石炭酸系数这一指标。
? 所谓石炭酸系数，指在一定时间内被试药剂能
杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石
炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间
为 10分钟，而供试菌定为 Salmonellatyphi（伤
寒沙门氏菌）。
消 毒 试 验
? ⑴ 以人工染菌实物为消毒对象, 模拟现场表面
污染大肠杆菌液 。
? ⑵ 消毒前采样：放置无菌规格板, 取无菌棉拭
于含 5ml稀释液试管中沾湿, 在规格板空心处旋
转自左至右涂抹整个区域
? ⑶ 消毒后采样：在前采样地点旁用 0.05％ 过氧
乙酸溶液消毒物体表面, 30分钟后将无菌棉 拭
于含 5ml采样液试管中沾湿, 作为消毒后样液 。
? ⑷ 将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释
⑸ 培养待凝固后 37℃ 培养 24～ 48小时, 作菌落
计数 。
灭菌效果监测
? １, 高压蒸气灭菌效果监测
? (1) 高压蒸气灭菌指示卡：将卡片放入灭菌器
不同部位, 观察灭菌后指示卡颜色变化 。
? (2)芽胞菌片法：将每片染有嗜热脂肪杆菌芽
胞 105cfu/ml的菌片包好、放入灭菌器内。灭菌
后作细菌计数测定。 对照是不经灭菌的菌片，
芽胞完全被杀灭或杀来率达 99.9999％为合格。
? ２, 紫外线消毒效果监测
? ⑴ 微型紫外线强度计：使用时打开仪器开关,
装入电池, 打开电源开关, 接通电源, 将测
定电压转换开关拨至电压一方, 此时指针应超
过中线 。
? 测定时, 将测定电压转换开关拨至测定一方,
打开紫外线灯照射２分钟后, 将紫外线灯强度
计置于紫外线灯下垂直１Ｍ的中央进行照射,
直至仪表指针稳定, 所示之值即为该紫外线灯
的强度值 (uw/cm2) 。
? (2)紫外线强度与消毒剂量指示卡,
? 测定灯管强度时, 将卡片置于离紫外灯
管１Ｍ的中央处, 将图案一面朝向灯管,
照射一分钟 （ 照射时间要准确 ） 后, 图
案正中涂层由白色变为紫红色 。 与周围
相应色块相比, 可测知所照射的强度 。
? 新灯管以不低于 100uw/cm2为合格，
旧灯管低于 70uw/cm2应更换。
第二节 空气的净化
一、空气中微生物的分布
? 空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和
空气中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而
异。
?,北方气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多，
离地面越高，含菌量越少；一般每升高 10米，
空气中的含菌量就降低一个数量级；
? 城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌
量较少，一般城市空气中杂菌数为 3000~8000
个／米 3 。
? 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较多，
也有酵母，霉菌和病毒。
? 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰
尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为
103~104个／米 3。
? 灰尘粒子的平均大小约 0.6μ m左右，所以空气
除菌主要是去除空气中的微粒 (0.6-1μ m ）
二、空气除菌
? 工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同
而异 。
? 半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格, 一
般无需复杂的空所净化处理；
? 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养, 进入发酵
罐前空气必须进行冷却, 脱水, 脱油和过滤除菌等
处理 。
（二）发酵对空气无菌程度
的要求
? 好气性发酵过程中需要大量的无菌空气，空气要
作到 绝对无菌在目前是不可能的，也是不经济
的。
? 发酵对无菌空气的要求是,无菌，无灰尘，无
杂质，无水，无油，正压等几项指标；
? 发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵
过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。
? 在工程设计中一般要求 1000次使用周期中只允许
有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为
N=10-3
二、空气除菌的方法
? （ 一 ） 辐射杀菌
? （ 二 ） 热杀菌
? （ 三 ） 静电除菌
? （ 四 ） 过滤除菌
3．辐射灭菌法
? 最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌 。 2537?
波长的紫外线具有极强烈的杀菌效力, 它的主要
作用是使微生物的 DNA分子产生的胸腺嘧啶的二
聚体, 导致细胞死亡 。
? 无菌室常用的紫外灯功率为 30W,安装在操作台
上方一米左右高处, 每次照射 15-30min既可 。
? 紫外线有很强的杀菌力, 但穿透力很弱, 一张薄
纸即可完全挡住紫外线, 因此待灭菌物品必须置
于紫外光直接照射下, 而且在一定范围内作用强
度与距离平方成反比 。
? 此外，紫外线对人体组织有一定刺激作用，眼
睛、皮肤受照射后会产生某些症状，所以工作
人员在无菌室操作时应关闭紫外灯
热灭菌
? 原理：基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热
变性而得以实现。
? 热空气进入培养系统之前，一般均需用压缩机
压缩，提高压力。
? 空气压缩后温度能达到 200度以上，保持一定
时间后，便可实行干热杀菌。
? 利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理
对制备大量无菌空气有特别意义。
? 实际应用中需考虑培养装置与空气压缩机的相
对位置，连接压缩机与培养装置的管道的灭菌
以及管道长度等。
静电除菌
? 静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘埃，
同时也除去微生物。
? 原理：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除
尘灭菌目的。
? 对于一些直径小的微粒，所带电荷小，不能被
吸附而沉降。
介质过滤除菌
? 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质
过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质
层中，而达到除菌的目的。
? 从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，
目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂
广泛采用的方法。
发酵生产中制备无菌空气的大
致过程
一、对空气除菌流程的要求
? 要制备较高无菌程度，具有一定压力的无菌空气，
它的流程设备有空气压缩机。
? 附属设备要求尽量采用新技术，提高效率，减少设
备，精简设备投资、运转费用和动力消耗，简便操
作。
? 流程的制订就根据所在的地理、气候环境和设备条
件而考虑。
? 在环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风
的条件，以降低过滤器的负荷，提高空气的无
菌程度；
? 在温暖潮湿的南方，要加强除水设施，以确保
和发挥过滤器的最大除菌效率；
? 在压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除
油雾的污染等等。
二、空气除菌流程分析
? 要保持过滤器有比较高的过滤效率, 应维持一
定的气流速度和不受油, 水的干扰 。
? 气流速度可由操作来控制；
? 要保持不受油, 水干扰则要有一系列冷却, 分
离, 加热的设备来保证空气的相对湿度在
50%～ 60%的条件下过滤 。
高空取气管
? 高空取气管是远离地面几十米
的管子。一般而言，地面附近
空气中所含的 微生物和灰尘等
均比高空空气中含的多，据资
料介绍，每升高 10米，空气中
杂菌可降低一个数量级，因此
从高空取气要比从低空取气有
利得多。
油水分离器
? 其内部同时采用直接拦截,
惯性碰撞, 布朗扩散及凝
聚等机理, 能有效地去除
空气中的水, 油雾, 尘埃,
内部不锈钢丝网可清洗,
使用寿命长 。
两级分离、冷却、加热的空气
除菌流程
１ —— 粗过滤器 ２ —— 压缩机 ３ —— 贮罐
４ —— 冷却器 ５ —— 丝网分离器 ６ —— 过滤器
高效前置过滤除菌流程
１ —— 高效前置过滤器 ２ —— 压缩机 ３ —— 贮罐
４ —— 冷却器 ５ —— 丝网分离器 ６ —— 加热器
７ —— 过滤器
空气净化的流程
? 吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤
? 进入空气压缩机（ 120-150度）
? 冷却（ 20-25度），除去油、水，再加热至 30-
35度。
? 最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净
度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。
二、过滤除菌设备原理
? 概述,
? 目前发酵工厂采用的空气过滤设备大多数是传
统的深层过滤设备，滤层厚度一般为 1～ 2米，
所用的过滤介质一般是棉花、活性炭，也有采
用玻璃纤维、焦炭等。
? 对不同的材料，材料的不同规格，材料的填充
情况不同，都会得到不同的过滤效果。为了制
取适合要求的无菌空气，就得深入研究深层过
滤的各种关系。
（一）深层过滤原理
? 深层过滤所用的过滤介质 — 棉花的纤维直径一
般为 16~20微米 。
? 充填系数为 8%时, 棉花纤维所形成网格的孔隙
为 20～ 50微米, 微粒大小为 (0.5-2微米 )。
? 微粒随气流通过滤层时, 滤层纤维所形成的网
格阻碍气流前进, 使气流出现无数次改变运动
速度和运动方向, 绕过纤维前进；
? 这些改变引起微粒以对滤层纤维产生惯性冲击,
阻拦, 重力沉降, 布朗扩散, 静电吸引等作用
而把微粒滞留在纤维表面上 。
纤维介质阻留微粒的机制
? 1,阻拦截留：微粒随空气气流向前运动, 当
气流为层流时, 随气流运动的粒子在接近纤维
表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附
捕集, 这种作用称之为阻拦截留 。
空气流速愈小, 纤维直径愈细, 阻拦截留作
用愈大 。 但是在介质过滤的除尘除菌中, 阻拦
截留并不起主要作用 。
? 2,惯性碰撞截留：空气气流流速大时, 气流中
的微粒具有较大的惯性力 。 当微粒随气流以一定
速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运
动方向时, 由于微粒具有的惯性作用使它们仍然
沿原来方向前进碰撞到纤维表面, 产生摩擦粘附
而使微粒被截留在纤维表面, 这种作用称惯性碰
撞截留 。
截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力,
所以, 气流速度愈大, 惯性力大, 截留效果也愈
好 。 此外, 惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关,
纤维愈细, 捕集效果愈好 。 惯性碰撞截面在介质
除尘中起主要作用 。
? 3,布朗扩散运动：直径小于 1μ 的微粒在运
动中往往产生 — 种不规则的布朗运动, 使微粒
间相互凝集成较大的粒子, 从而发生重力沉降
或被介质敲留 。 但是这种作用只有在气流速度
较低时才较显著 。
４、重力沉降 作用 机理
? 重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受
的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易
沉降。
? 就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作
用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才
起作用。
? 一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边
界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留
的捕集效率。
５、静电吸附作用机理
? 干空气对非导体的物质相对运动磨擦时, 会产
生诱导电荷, 纤维和树脂处理过的纤维, 尤其
是一些合成纤维更为显著 。
? 悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电
荷, 如枯草杆菌孢子 20%带正电荷, 20%带负电
荷, 15%中性, 这些带电的微粒会受带异性电
荷的物体所吸引而沉降 。
? 此外，表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭
的大部分过滤效能应是表面吸附的作用。
空气过滤除菌 介质
? １、棉花
? ２、玻璃纤维
? ３、活性炭
? ４、超细玻璃纤维纸
? ５、石棉滤板
? ６, 烧结材料过滤介质
? ７, 新型过滤介质
影响介质过滤效率的因素
? 介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其
他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率
越高。
? 对于相同介质，过滤效率与介质滤层厚度、介
质填充密度和空气流量有关。
提高过滤除菌效率的措施
? 鉴于目前所采用的过滤介质均需要干燥条件下
才能进行除菌，因此需要围绕介质来提高除菌
效率。
? （ 1）设计合理的空气预处理设备，选择合适的
空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。
? （ 2）设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌
效率高的过滤介质。
? （ 3）保证进口空气清洁度，如加强生产场地卫
生管理，正确选择进风口，加强空气压缩前的预
处理。
? （ 4）降低进入空气过滤器的空气相对湿度，如
使用无油润滑的空气压缩机，加强空气冷却和去
油，提高进入过滤器的空气温度。
过滤器失效
? 压缩空气进入过滤器后便引起活性炭颗粒之间
相互顶撞与摩擦，久而成为粉末 (灰化 )，活性
炭的体积也逐渐变小，于是过滤器内的空间逐
渐增大，到达 -定程度时，便会发生棉花成
90° 翻身现象。这样空气便会未经过滤而进入
罐内，引起染菌。
? 棉花经过多次加热灭菌后，颜色逐渐变深，靠
近过滤器壁的棉花，因经受夹层蒸汽的烤干，
受热更为剧烈，更容易变成粉末，而被空气带
走，造成过滤层有缝隙，使过滤层疏松而漏
风．甚至还因过高的压力和过长时间的烘烤而
引起棉花活性炭着火的事故。
（二） 过滤器的结构
? １、棉花 — 活性炭过滤器
? 棉花是最常用的过滤介质, 通常要用纤维不太
长的原棉, 因为它具有一定的弹性, 虽然几经
湿热灭菌, 干燥后仍能保持原有的疏松状态 。
棉花的过滤阻力较活性炭大 （ 10~12倍 ） 。
? 活性炭通常被加工成粒状, 其过滤效率比棉花
低, 但具有阻力小, 吸附力强 （ 可吸附空气中
有害物质, 如油, 水 ） 的特点, 通常与棉花介
质一起使用, 减少过滤层的阻力 。
? 棉花活性炭过滤器的过滤效率可达 99%,
? 其过滤介质装填为,
? 上部和下部装填棉花, 其厚度为总过滤层的 2*
（ 1/4~1/3）, 中间再装入 1/2~1/3厚度的活性
炭 。 一般棉花的填充密度为 150~200公斤 /米 3，
活性炭 40~450公斤 /米 3。
? 孔板 —— 金属丝网 —— 麻布织品 —— 棉
花 —— 麻布织品 —— 活性炭 —— 麻布织品 ——
棉花 —— 麻布织品 —— 金属丝网 —— 孔板
按入式过滤器
1、便于迅速更换
2、活塞型滤芯与壳体密封，防止未过滤的气体
绕过滤芯
3、防腐蚀滤芯：不锈钢芯以增强结构性能；气
流阻力低；采用缝焊以提高强度
4、新型 "矩阵混合纤维 "介质有效表面积大，确
保高效率；开放区大，尽量减少压降
5、涂膜封闭式泡沫套筒抗油类和酸类物质的腐
蚀，防止液体重新混入气流，确保高效率
6、不含石硅树脂
7、可承受 65℃ 的高温
微生物的培养方法
氧的供需
? 实验室中，通过摇瓶机往复运动或偏心旋转运
动供氧。
? 中试规模和生产规模的培养装置采用通入无菌
压缩空气并同时进行搅拌的方式。
? 近年来开发出无搅拌装置的节能培养设备，如
气升式发酵罐。
? 细胞对鼓泡通气和机械搅拌产生的剪切作用敏
感。
? 在常压下（ 20℃ ）达到平衡时，氧在水中的溶
解度仅为 6.2ml／ L（ 0.28mmol）。这些氧只能
保证氧化 8.3mg（即 0.046mmol）葡萄糖，仅相
当培养基中常用葡萄糖浓度的 1‰ 。
? 除葡萄糖外，培养基中的无机或有机养料一般
都可保证微生物使用几小时至几天。
? 对好氧菌来说，生长的限制因子几乎总是氧的
供应。
? 只有将培养液装成浅层时，氧才不至于成为限
制因子。
提高溶氧速率的措施
? 在进行液体培养时，一般可通过增加液体与氧
的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率,
? 具体措施有,
? ①浅层液体培养；
? ②利用往复式或旋转式摇床（ shaker）对三角
瓶培养物作振荡培养；
? ③在深层液体培养器的底部通入加压空气，并
用气体分布器使其以小气泡形式均匀喷出；
? ④对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上
设置阻挡装置。
在实验室进行好氧菌培养
的具体方法
? （ 1）试管液体培养装液量可多可少。此法的
通气效果一般均不够理想，仅适合培养兼性厌
氧菌。
? （ 2）三角瓶浅层培养在静止状态下，三角瓶
内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对
微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此
法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。
? （ 3）摇瓶培养 即将三角瓶内培养液用 8层纱
布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同时降低
瓶内的装液量，把它放到往复式或旋转式摇床
上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。
? （ 4）台式发酵罐体积一般为几升至几十升，
并有多种自动控制和记录装置。
氧的性质及发酵液中实际需氧量
? 难溶气体，在 25度和 105 Pa时，氧在纯水中的
溶解度为 0.25mol/m3 。
? 对于发酵液中每小时在 1 m3 培养液中需要氧
是溶解量的 750倍。如果中断供氧，菌体会在
几秒钟内耗尽溶氧。
细胞对氧的需求
? 氧作为受氢体
? 氧直接参与一些生物反应
微生物的吸氧量
? 常用呼吸强度和耗氧速率表示。
? 呼吸强度：单位质量的干菌体在单位时间内所
吸取的氧量,QO2, 表示微生物的绝对耗氧量。
? 耗氧速率：单位体积培养液在单位时间内的吸
氧量,r。
? 二者关系：呼吸强度表示微生物的绝对吸氧量，
但当培养液中有固体成分存在时，测定困难。
用耗氧速率表示。
? r= QO2 c(X)
? c(X) 发酵液中菌体的浓度
? 在培养过程中不需要使溶解氧浓度达到或接近
饱和值，而只要超过某一临界氧浓度即可。
? 当不存在其他限制性基质时，如果溶氧浓度高
于临界值，细胞的比耗氧速率保持恒定；
? 如果溶氧浓度低于临界值，细胞的比耗氧速率
大大下降，这时细胞处于半厌氧状态。
临界溶氧浓度
? 满足微生物呼吸的最低氧浓度。在临界氧浓度
以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而
显著下降。
? 好氧微生物临界氧浓度大约是饱和浓度的 1-25
％。
发酵对溶解氧的影响
? 培养基的成分和浓度显著影响耗氧。
? 菌龄
? 菌体的耗氧量
? 溶氧高发酵条件最适条件下发酵或排除有毒代
谢产物培养加有利于菌体的生长和产物合成，
但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。
? 需考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧
浓度。
? 最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的
特性有关 。
供氧与微生物呼吸代谢的关系
? 好氧微生物所含的氧化酶系：过氧化氢酶，细
胞色素氧化酶，黄素脱氢酶，多酰氧化酶等。
? 不同好氧微生物所含的氧化酶系的种类和数量
不面，在不同环境条件下，各种微生物的吸氧
量或呼吸强度不同。
对微生物供氧的传递过程
? 空气中的氧 (氧溶入液体的传递速度 )—— 液体
中的溶氧 (氧由液体至微生物的传递速度 )——
微生物体内的氧 (氧的利用速度 )—— 产物
? 在氧的传递过程中液膜阻力是控制因素 。
? 为了供给微生物必需的氧量, 必须注意发酵罐
的类型及运转以维持所要求的 Kla。
一 双膜理论的基本前提
? （ 1）在气泡与包围着气泡的液体之间存在着界
面，在界面的气泡一侧存在着一层气膜，在界面
的液体一侧存在着一层液膜。气膜内的气体分子
和液膜中的液体分子和液膜中的液体分子都处于
层流状态，分子间无对流运动，因此氧的分子只
能以扩散方式，即籍浓度差而透过双膜。
? 另外，气泡内除开气膜以外的气体分子，处
于对流状态，称为气体主流，在空气主流空间
的任一点，氧分子的浓度相同，液体主流中也
是如此。
? （ 2）在双膜之间的界面上，氧气的分压强与
溶于液体中的氧的浓度
? （ 3）传质过程处于稳定状态，传质途径上各
点的氧的浓度不随时间而变。
氧传递的动力和阻力
? 在氧从气泡传递到细胞内要克服一系列的阻力，
相对大小取决于流体力学特性、温度、细胞活性
和浓度、液体的组成、界面特性以及其他因素。
? 传递过程的总推动力是气相与细胞内的氧分压之
差。
? 气液相间的氧传递阻力：气膜和液膜中。
? 液固相间的氧传递：细胞或细胞周围的液膜阻
力可忽略。
? 在发酵工业生产上如何保证发酵中氧的供给, 以
满足生产菌对氧的需求, 是稳定和提高生产, 降
低成本的关键之一 。
? 在发酵中氧究竟够不够, 即产量是否受到氧的限
制, 单凭通气量大小是难于确定的 。
? 了解通气搅拌对发酵的影响, 最简便有效的办法
便是就地测量发酵液中氧的浓度 。 从氧浓度变化
曲线可以看出氧供需的规律及对生产的影响 。
? 溶氧可作为发酵中氧是否足够的度量, 发酵异常
情况的指示, 发酵中间控制的手段之一和考查设
备及工艺条件对氧供需与产物形成影响的指标之
一 。
氧在水中的溶解度
? 培养液中氧的溶解比水中还小，因为氧的溶解
度随着温度的升高而下降，随着培养液固形物
的增多，或粘度的增加而下降。
? 长期以来深层通风培养普遍使用机械搅拌罐，
由于罐的直径与通风管径相差悬殊，故通入气
体的细碎与醪液的混合完全依靠机械搅拌作用。
影响氧溶解效果的因素
? 发酵罐结构如高径比
? 挡板安置情况
? 罐内压与发酵液深度
? 搅拌器型式
? 搅拌转速
? 通风量
? 培养基组成。
? 主要是搅拌转速与通风量。
机械搅拌可以提高通风效果
的原因
? 搅拌将通入的空气打碎成细泡，增加了气液接
触面积
? 小气泡从罐底上升到液面的速度要比大气泡慢，
这又使气液接触的时间增加
? 由于搅拌使液体形成湍流，使气泡不是直线上
升而是成螺旋线上升，延长了气泡在液体中运
动的时间与路程
? 由于液体呈湍流运动因而减少了气泡周围的液
膜厚度，增加了氧扩散到液体中的速度。
发酵过程中溶解氧的变化
? 每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律。
? 明显下降：需氧量超过供氧量，使溶氧浓度明
显下降，出现一个低峰，产生菌的摄氧率同时
出现高峰。发酵液中的菌浓也不断上升。粘度
一般在这个时期也会出现一高峰阶段。这都说
明产物物菌正处在对数生长期。
? 过了生长阶段，需氧量有所减少，溶氧浓度以
过一段时间的平衡阶段或上随之上升后，就开
始形成产物，溶氧浓度也不断上升。低峰出现
的时间和低峰溶氧浓度随菌种、工艺和设备供
氧能力不同而异。
? 发酵中后期，对于分批发酵，溶氧浓度变化比
较小。菌体已进入静止期，呼吸强度变化不大。
? 外界补料，溶氧的变化随补料时的菌龄、补入
物质的种类和剂量不同而不同。如补糖，则摄
氧率增加，溶氧浓度下降。
? 在生产后期，菌体衰老，呼吸强度减弱，溶氧浓
度逐步上升，菌全自溶，溶氧浓度会明显上升。
发酵过程中比耗氧速率的变化
? 对数生长初期，比耗氧速率达到最大值，但此
时细胞浓度低，摄氧率并不高。随着细胞浓度
的迅速增高，培养液的摄氧率增高，在对数生
长后期达到峰值。
? 对数生长阶段结束，比耗氧速率下降，摄氧率
下降。
? 基质耗尽，细胞自溶，摄氧率使迅速下降。
发酵过程中溶氧变化异常原因
? 耗氧或供氧出现了异常因素或发生了障碍
? 1、引起溶氧异常下降的原因,
? （ 1）污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗
? （ 2）菌体代谢发生异常，需氧要求增加
? （ 3）某些设备或工艺控制发生故障或变化，如
搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢；消泡剂加入
过多
? （ 4）影响供氧的工艺操作如停止搅拌、闷罐等。
引起溶氧异常升高的原因
? 主要是耗氧出现改变，如菌体代谢异常，耗氧
能力下降,
? 污染烈性噬菌体
? 溶氧监测的作用
? （ 1）从发酵液中的溶解氧浓度变化，可以了
解微生物生长代谢是否异常
? （ 2）工艺控制是否合理
? （ 3）设备供氧能力是否充足。
溶解氧浓度的控制
? 溶氧浓度决定因素：供氧和需氧两方面。当发
酵的供氧量大于需氧量，溶氧浓度就上升，直
到饱和。
? 供氧控制：设法提高氧传递的推动力和液相体
积氧传递系数 Kla值。
? 需氧控制：需氧量受菌体浓度、基质种类、和
浓度及培养条件等因素影响，以菌浓影响最明
显。
? 发酵液摄氧率随菌浓增加而按比例增加
? 氧的传递速率随菌浓的对数关系减少。
? 控制菌的比生长速率比临界值略高一点的水平，
达到最适浓度，是控制最适溶氧的重要方法。
? 最适菌浓度的控制方法：通过控制基质浓度。
如利用溶氧的变化自动控制补糖速率，间接控
制供氧速率和 pH值，实现菌体生长、溶氧和 pH
值三位一体的控制体系。
三 测量体积溶氧系数的方法
? （一）亚硫酸盐氧化法
? 用铜离子作为催化剂，溶解在水中的氧能立即
氧化其中的亚硫酸根离子，使之成为硫酸根离
子，其氧化反应的速度在较大的范围内与亚硫
酸根离子的浓度无关。实际上是氧分子一经溶
入液相，立即就被还原掉。剩余的 Na2SO3与过
量的碘作用,再用标定的 Na2S2O3滴定剩余的
碘,
（二） 溶氧电极法
? 溶氧电极可以看作是一种电解电池，它有两只具
有不同正电性能电极，一只是银丝做成的阴极，
另一只是铅皮卷成的阳极，这对电极装置在两端
开口的细的玻璃套管内，在靠近的阴极的一端用
一种耐用热的，只允许气体透过而不透过水及离
子的半渗透塑料膜覆盖。形成 一个有一定容积
的电池，在电池中加入数毫升电解质溶液。
? 在两极之间产生一个电位，使阳极铅变成铅离子
进入电解质溶液，同时放出的电子在阴极上把透
过半透膜 进入电池 的氧立即还原成氢阳根离子。
? 用溶阳电极与氧气分析仪相配合，可直接测量
实际发酵液中的容积传氧系数 Kla
? 式中Ｃ进，Ｃ＊为常量：Ｃ出可用氧气分析仪
自排出气体测得，Ｃ为培养液中的溶氧浓度用
溶氧电极测得。
