1
韩 北 忠
中国农业大学 食品学院
Han Bei-zhong,Prof,PhD
College of Food Science & Nutritional Engineering
China Agricultural University
抗 生 素 发 酵 生 产 技 术
Antibiotics Fermentation Production
2
1,概述
2,生产前期研究
3,生产菌改良
4,生产工艺过程
5,发酵条件的控制
6,提取和精制
1,Introduction
2,Research in Lab
3,Strain improvement
4,Production processing
5,Fermentation control
6,Isolation & purification
抗 生 素 发 酵 生 产 技 术
Antibiotics Fermentation Production
3
抗生素
是生物在其生产活动过
程中所产生，并能
在低微浓度下有选
择性地 抑制或杀灭
其他微生物或肿瘤
细胞的 有机物 。
Antibiotics
Any organic substances
produced by various
organisms that have the
power of arresting the
growth of other
microorganisms or of
destroying them,
1,概 述 Introduction
4
历史
? 1929年，英国弗莱
明发现青霉素
? 二战期间，大规模
发酵生产
? 世界上最早用于临
床的抗菌素
History
? Penicillin was discovered
by Fleming in 1929,
? World War II,fermented
in large-scale
? The first major antibiotic
to be commercialized
1,概 述 Introduction
5
根据抗生素的作用机制分类 (Modes of Action of Antibiotics)
? 抑制细胞壁合成 (Cell Wall Synthesis), 青霉素
? 抑制细胞膜功能 (Cell Membrane Damage), 多烯类抗生素
? 抑制蛋白质合成 (Protein Synthesis), 四环素
? 抑制核酸合成 (Nucleic Acid Synthesis), 丝裂霉素
分 类 Classification
1,概 述 Introduction
6
复制
翻译 转录
7
根据抗生素的化学结构分类
? β-内酰胺类 (β-lactam),青霉素类 (penicillins)
头孢菌素类 (cephalosporins)
? 氨基糖苷类 (aminoglycosides), 链霉素、庆大霉素
? 大环内酯类 (macrolides), 红霉素、麦迪加霉素
? 四 环 类 (tetracyclines), 四环素、土霉素
? 多 肽 类 (polymyxin), 多粘菌素
分 类 Classification
1,概 述 Introduction
8
H
N
O N
S CH3
CH3 H
COO-
H
?-lactam ring β-内酰胺 环
R
natural penicillin R = CH2-CO-
9
β-内酰胺 环
10
两性霉素
Antibiotics are so complex they can only be
synthesized in a living system
11
? 产生菌的筛选
? 抗菌性试验
? 提取、精制、鉴定
? 毒性试验
? 药理和临床试验
? Screening of a strain
? Antimicrobial trial
? Isolation,purification and
identification
? Toxicological trial
? Medicinal & clinical trial
2,生产前期研究
Research in Lab
12
Agar diffusion assay
agar plate
琼脂培养基
lawn of test bacteria
测 试 菌 苔
filter papers soaked
with test compounds
含 药 物 滤 纸
zones of inhibition
(no growth) 抑菌圈
13
分 析 仪 器
Analytical instruments
现代分析仪器,
? 核磁共振
? 毛细管电泳
? 气相色谱
? 高效液相色谱
? 质谱
Modern analytical instruments,
? Nuclear magnetic resonance (NMR)
? Capillary electrophoresis (CE)
? Gas chromatography (GC)
? High performance liquid
chromatography (HPLC)
? Mass spectroscopy (MS)
Automation Sensitivity Accuracy
自 动 灵 敏 准 确
14
人工诱变法,
紫外线, X-线,r-线
照射
亚硝基胍,亚硝酸、
秋水仙素、氮芥等
诱变剂处理
Conventional strain selection
? Physical mutagen
eg,Ultraviolet Radiation
? Chemical mutagen
eg,Nitrosoguanidine (NTG)
? Improved strain can be
selected empirically
3,抗生素 生产菌改良
Strain Improvement
15
基因工程
Genetic Engineering
3,抗生素 生产菌改良
Strain Improvement Recombinant DNA
Technology
（ DNA重组技术 ）
克隆
16
Strain Improvement Scale-up
Strain
出发菌株
Agar plate
平板技术
Primary
shake flask
Evaluation
摇瓶培养
Secondary
shake flask
evaluation
different media
二级摇瓶培养
各种培养基
Lab fermentor
evaluation
Production
Condition
小型发酵罐
模拟生产条件
Master
cell bank
Working
cell bank
Inoculum
Development
菌种扩大培养
Pilot plant
Evaluation
中试生产
Production
Evaluation
生产
6000
300 30
3 1
Possible
recycle
17
18
Scale-up（ 比拟放大）
models
EL Gadden Jr
< 10 dm3
? Good product
? Good productivity
> 200 m3
? Same productivity?
? Limitations?
模 拟
19
摇 瓶 发 酵
Shake-flask fermentation
? 10-50 ml in 125-500 ml flask
? Batch only
? Limited control,temperature
? Slow metabolizing carbohydrate
? Ambient pressure
? Buffers needed to control pH
? In-process sampling difficult
? Volume decrease by evaporation
? Solid growth on side walls
? Antifoam not needed
? Agitation limited,shaker speed
? No control of dissolved oxygen
? 装液量,10% (~250ml)
? 间歇培养
? 温控受限制
? 代谢碳水化合物慢
? 常压
? 缓冲液控制 pH
? 在线取样难
? 容量减少
? 瓶壁上结垢
? 无需消泡
? 搅拌受限制
? 无法控制溶解氧
20
搅 拌 罐 发 酵
Stirred tank fermentation
? 10-100,000升容量
? 间歇和补料培养
? 连续控制,pH,温度
? 需要铵盐或氨气
? 2 大气压
? 无需 缓冲液
? 在线取样易
? 补料,容量增加
? 生长均匀一致
? 需消泡
? 多种搅拌
? 控制溶解氧,通气,加压
? 10-100,000 liter vessels
? Batch and feed possible
? Continuous control,pH,temperature
? Ammonium salts or ammonia needed
? Pressure at two atmospheres possible
? No buffers necessary
? In-process sampling easy
? Volume increase by sugar feed
? Very uniform growth
? Antifoam often required
? Wide variety of impellers and baffles
? Dissolved oxygen controlled by
aeration,pressure
21
摇 瓶 发 酵
Shake-flask
? 装液量,10% (~250ml)
? 间歇培养
? 温控受限制
? 代谢碳水化合物慢
? 常压
? 缓冲液控制 pH
? 在线取样难
? 容量减少
? 瓶壁上结垢
? 无需消泡
? 搅拌受限制
? 无法控制溶解氧
? 10-100,000升容量
? 间歇和补料培养
? 连续控制,pH,温度
? 需要铵盐或氨气
? 2 大气压
? 无需 缓冲液
? 在线取样易
? 补料,容量增加
? 生长均匀一致
? 需消泡
? 多种搅拌
? 控制溶解氧,通气,加压
搅 拌 罐 发 酵
Stirred tank
22
菌种 → 种子制备
→ 发酵
→ 发酵液预处理
→ 提取及精制
→ 成品包装
Strain → Preparation of seed
→ Fermentation
→ Treatment of broth
→ Isolation & purification
→ Package of product
4,抗生素生产工艺过程
Antibiotics Production Processing
23 A scheme of the material flow in an antibiotic production
24 A scheme of the material flow in an antibiotic production
连消
发酵罐
缓冲罐
种子罐
25
发酵生产原料 Materials for Fermentation
Carbon source,
? Beet & cane molasses
? Glucose,lactose,starch
? Ethanol,methanol
? Glycerol
? Maltose syrup,corn syrup
? Cottonseed oil,peanut oil,soy oil
? Lard oil
? Methyl oleate
? Tallow
碳源,
? 甜菜和甘蔗糖蜜
? 葡萄糖，乳糖，淀粉
? 乙醇，甲醇
? 甘油
? 麦芽糖浆，玉米糖浆
? 绵 籽 油，花生油，豆油
? 猪油
? 油酸甲酯
? 油脂
26
氮源,
? 绵 籽 粉
? 玉米粉和玉米浸出液
? 大豆粉和大豆面
? 花生粉
? 菜籽粉
? 牛血，酪蛋白水解液
? 乳清
? 鱼粉
? 酵母
? 酵母膏
? 肉粉和骨粉
Nitrogen source,
? Cotton seed meal
? Corn meal & steep liquor
? Soybean meal & flour
? Peanut meal
? Rapeseed meal
? Beef blood,Casein hydrolysate
? Whey
? Fish meal
? Whole yeast
? Yeast extract
? Meat & bone meal
发酵生产原料 Materials for Fermentation
27
培 养 基 Media for Cell Growth & Final production
Components Range %
组 成
Glucose/ sucrose 3.0-5.0
葡萄糖 / 蔗糖
Starch 淀粉 3.0-5.0
Corn steep liquor 3.0-5.0
Calcium carbonate 0.5-1.0
碳酸钙
Phosphate 磷酸盐 0.1-0.5
Ammonium sulphate 0.1-1.0
硫酸胺
Urea 尿素 0.1-0.5
Oil 油 0.1-0.5
Fermentation 发酵培养基
Components Range %
组 成
Glucose 0.5-1.0
Starch 0.5-5.0
Corn steep liquor 5.0-8.0
玉米浸提液
Soy flour 1.0-5.0
Phosphate 0.1-1.0
Ammonium sulphate 0.5-1.0
and fed periodically
Oil 1.0
and fed continuously
Corn syrup fed continuously
玉米糖浆 连续加料
Tank seed 种子培养基
28
Stirred tank Fermentation 搅拌发酵
tp
ogoCgF ogiC
o l o l lk A C V?
or
olsClcVt
oloC
29
5,发 酵 控 制 Fermentation Control
Sample Analysis
?pH
?DO
?Sugar
?Ammonia
?Phosphate
?Sulphate
?Products
?Precursors
?Contamination
Pressure probe
Level probe
pH probe
Temp,probe
DO probe
Antifoam
Acid/Base
Cooling
Air/agitation
Sugar/Oil
feed
30
Scale
Weight Signal
Pump Speed
Amplifier
Controller
Supervisory
Computer
Flow Rate Control 流量控制
31
发 酵 控 制 Fermentation control
32
? 菌种 (strain)：产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum)
? 孢子培养 (spore cultivation),25 oC,6-7 d
? 种子培养 (seed cultivation),25 oC, 2-3 d
? 发酵培养 (fermentation),22-26 oC,6-7 d
? 加糖控制 (sugar feeding)：残糖降至 0.6％
青 霉 素 发 酵 (1)
Penicillin Fermentation
33
? 补氮 (nitrogen feeding)：氨控制在 0.01-0.05％
? 前体 (precursor)：残余苯乙酰胺 0.05-0.08％
? 温度控制 (temperature)：前期 25-26 oC
后期 23 oC
? 通气与搅拌 (aeration & stir),1, 0.8 VVM
? 泡沫 (foam)：天然油脂,如豆油
青 霉 素 发 酵 (2)
Penicillin Fermentation
34
Penicillin Fermentation Profile 变化曲线
韩 北 忠
中国农业大学 食品学院
Han Bei-zhong,Prof,PhD
College of Food Science & Nutritional Engineering
China Agricultural University
抗 生 素 发 酵 生 产 技 术
Antibiotics Fermentation Production
2
1,概述
2,生产前期研究
3,生产菌改良
4,生产工艺过程
5,发酵条件的控制
6,提取和精制
1,Introduction
2,Research in Lab
3,Strain improvement
4,Production processing
5,Fermentation control
6,Isolation & purification
抗 生 素 发 酵 生 产 技 术
Antibiotics Fermentation Production
3
抗生素
是生物在其生产活动过
程中所产生，并能
在低微浓度下有选
择性地 抑制或杀灭
其他微生物或肿瘤
细胞的 有机物 。
Antibiotics
Any organic substances
produced by various
organisms that have the
power of arresting the
growth of other
microorganisms or of
destroying them,
1,概 述 Introduction
4
历史
? 1929年，英国弗莱
明发现青霉素
? 二战期间，大规模
发酵生产
? 世界上最早用于临
床的抗菌素
History
? Penicillin was discovered
by Fleming in 1929,
? World War II,fermented
in large-scale
? The first major antibiotic
to be commercialized
1,概 述 Introduction
5
根据抗生素的作用机制分类 (Modes of Action of Antibiotics)
? 抑制细胞壁合成 (Cell Wall Synthesis), 青霉素
? 抑制细胞膜功能 (Cell Membrane Damage), 多烯类抗生素
? 抑制蛋白质合成 (Protein Synthesis), 四环素
? 抑制核酸合成 (Nucleic Acid Synthesis), 丝裂霉素
分 类 Classification
1,概 述 Introduction
6
复制
翻译 转录
7
根据抗生素的化学结构分类
? β-内酰胺类 (β-lactam),青霉素类 (penicillins)
头孢菌素类 (cephalosporins)
? 氨基糖苷类 (aminoglycosides), 链霉素、庆大霉素
? 大环内酯类 (macrolides), 红霉素、麦迪加霉素
? 四 环 类 (tetracyclines), 四环素、土霉素
? 多 肽 类 (polymyxin), 多粘菌素
分 类 Classification
1,概 述 Introduction
8
H
N
O N
S CH3
CH3 H
COO-
H
?-lactam ring β-内酰胺 环
R
natural penicillin R = CH2-CO-
9
β-内酰胺 环
10
两性霉素
Antibiotics are so complex they can only be
synthesized in a living system
11
? 产生菌的筛选
? 抗菌性试验
? 提取、精制、鉴定
? 毒性试验
? 药理和临床试验
? Screening of a strain
? Antimicrobial trial
? Isolation,purification and
identification
? Toxicological trial
? Medicinal & clinical trial
2,生产前期研究
Research in Lab
12
Agar diffusion assay
agar plate
琼脂培养基
lawn of test bacteria
测 试 菌 苔
filter papers soaked
with test compounds
含 药 物 滤 纸
zones of inhibition
(no growth) 抑菌圈
13
分 析 仪 器
Analytical instruments
现代分析仪器,
? 核磁共振
? 毛细管电泳
? 气相色谱
? 高效液相色谱
? 质谱
Modern analytical instruments,
? Nuclear magnetic resonance (NMR)
? Capillary electrophoresis (CE)
? Gas chromatography (GC)
? High performance liquid
chromatography (HPLC)
? Mass spectroscopy (MS)
Automation Sensitivity Accuracy
自 动 灵 敏 准 确
14
人工诱变法,
紫外线, X-线,r-线
照射
亚硝基胍,亚硝酸、
秋水仙素、氮芥等
诱变剂处理
Conventional strain selection
? Physical mutagen
eg,Ultraviolet Radiation
? Chemical mutagen
eg,Nitrosoguanidine (NTG)
? Improved strain can be
selected empirically
3,抗生素 生产菌改良
Strain Improvement
15
基因工程
Genetic Engineering
3,抗生素 生产菌改良
Strain Improvement Recombinant DNA
Technology
（ DNA重组技术 ）
克隆
16
Strain Improvement Scale-up
Strain
出发菌株
Agar plate
平板技术
Primary
shake flask
Evaluation
摇瓶培养
Secondary
shake flask
evaluation
different media
二级摇瓶培养
各种培养基
Lab fermentor
evaluation
Production
Condition
小型发酵罐
模拟生产条件
Master
cell bank
Working
cell bank
Inoculum
Development
菌种扩大培养
Pilot plant
Evaluation
中试生产
Production
Evaluation
生产
6000
300 30
3 1
Possible
recycle
17
18
Scale-up（ 比拟放大）
models
EL Gadden Jr
< 10 dm3
? Good product
? Good productivity
> 200 m3
? Same productivity?
? Limitations?
模 拟
19
摇 瓶 发 酵
Shake-flask fermentation
? 10-50 ml in 125-500 ml flask
? Batch only
? Limited control,temperature
? Slow metabolizing carbohydrate
? Ambient pressure
? Buffers needed to control pH
? In-process sampling difficult
? Volume decrease by evaporation
? Solid growth on side walls
? Antifoam not needed
? Agitation limited,shaker speed
? No control of dissolved oxygen
? 装液量,10% (~250ml)
? 间歇培养
? 温控受限制
? 代谢碳水化合物慢
? 常压
? 缓冲液控制 pH
? 在线取样难
? 容量减少
? 瓶壁上结垢
? 无需消泡
? 搅拌受限制
? 无法控制溶解氧
20
搅 拌 罐 发 酵
Stirred tank fermentation
? 10-100,000升容量
? 间歇和补料培养
? 连续控制,pH,温度
? 需要铵盐或氨气
? 2 大气压
? 无需 缓冲液
? 在线取样易
? 补料,容量增加
? 生长均匀一致
? 需消泡
? 多种搅拌
? 控制溶解氧,通气,加压
? 10-100,000 liter vessels
? Batch and feed possible
? Continuous control,pH,temperature
? Ammonium salts or ammonia needed
? Pressure at two atmospheres possible
? No buffers necessary
? In-process sampling easy
? Volume increase by sugar feed
? Very uniform growth
? Antifoam often required
? Wide variety of impellers and baffles
? Dissolved oxygen controlled by
aeration,pressure
21
摇 瓶 发 酵
Shake-flask
? 装液量,10% (~250ml)
? 间歇培养
? 温控受限制
? 代谢碳水化合物慢
? 常压
? 缓冲液控制 pH
? 在线取样难
? 容量减少
? 瓶壁上结垢
? 无需消泡
? 搅拌受限制
? 无法控制溶解氧
? 10-100,000升容量
? 间歇和补料培养
? 连续控制,pH,温度
? 需要铵盐或氨气
? 2 大气压
? 无需 缓冲液
? 在线取样易
? 补料,容量增加
? 生长均匀一致
? 需消泡
? 多种搅拌
? 控制溶解氧,通气,加压
搅 拌 罐 发 酵
Stirred tank
22
菌种 → 种子制备
→ 发酵
→ 发酵液预处理
→ 提取及精制
→ 成品包装
Strain → Preparation of seed
→ Fermentation
→ Treatment of broth
→ Isolation & purification
→ Package of product
4,抗生素生产工艺过程
Antibiotics Production Processing
23 A scheme of the material flow in an antibiotic production
24 A scheme of the material flow in an antibiotic production
连消
发酵罐
缓冲罐
种子罐
25
发酵生产原料 Materials for Fermentation
Carbon source,
? Beet & cane molasses
? Glucose,lactose,starch
? Ethanol,methanol
? Glycerol
? Maltose syrup,corn syrup
? Cottonseed oil,peanut oil,soy oil
? Lard oil
? Methyl oleate
? Tallow
碳源,
? 甜菜和甘蔗糖蜜
? 葡萄糖，乳糖，淀粉
? 乙醇，甲醇
? 甘油
? 麦芽糖浆，玉米糖浆
? 绵 籽 油，花生油，豆油
? 猪油
? 油酸甲酯
? 油脂
26
氮源,
? 绵 籽 粉
? 玉米粉和玉米浸出液
? 大豆粉和大豆面
? 花生粉
? 菜籽粉
? 牛血，酪蛋白水解液
? 乳清
? 鱼粉
? 酵母
? 酵母膏
? 肉粉和骨粉
Nitrogen source,
? Cotton seed meal
? Corn meal & steep liquor
? Soybean meal & flour
? Peanut meal
? Rapeseed meal
? Beef blood,Casein hydrolysate
? Whey
? Fish meal
? Whole yeast
? Yeast extract
? Meat & bone meal
发酵生产原料 Materials for Fermentation
27
培 养 基 Media for Cell Growth & Final production
Components Range %
组 成
Glucose/ sucrose 3.0-5.0
葡萄糖 / 蔗糖
Starch 淀粉 3.0-5.0
Corn steep liquor 3.0-5.0
Calcium carbonate 0.5-1.0
碳酸钙
Phosphate 磷酸盐 0.1-0.5
Ammonium sulphate 0.1-1.0
硫酸胺
Urea 尿素 0.1-0.5
Oil 油 0.1-0.5
Fermentation 发酵培养基
Components Range %
组 成
Glucose 0.5-1.0
Starch 0.5-5.0
Corn steep liquor 5.0-8.0
玉米浸提液
Soy flour 1.0-5.0
Phosphate 0.1-1.0
Ammonium sulphate 0.5-1.0
and fed periodically
Oil 1.0
and fed continuously
Corn syrup fed continuously
玉米糖浆 连续加料
Tank seed 种子培养基
28
Stirred tank Fermentation 搅拌发酵
tp
ogoCgF ogiC
o l o l lk A C V?
or
olsClcVt
oloC
29
5,发 酵 控 制 Fermentation Control
Sample Analysis
?pH
?DO
?Sugar
?Ammonia
?Phosphate
?Sulphate
?Products
?Precursors
?Contamination
Pressure probe
Level probe
pH probe
Temp,probe
DO probe
Antifoam
Acid/Base
Cooling
Air/agitation
Sugar/Oil
feed
30
Scale
Weight Signal
Pump Speed
Amplifier
Controller
Supervisory
Computer
Flow Rate Control 流量控制
31
发 酵 控 制 Fermentation control
32
? 菌种 (strain)：产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum)
? 孢子培养 (spore cultivation),25 oC,6-7 d
? 种子培养 (seed cultivation),25 oC, 2-3 d
? 发酵培养 (fermentation),22-26 oC,6-7 d
? 加糖控制 (sugar feeding)：残糖降至 0.6％
青 霉 素 发 酵 (1)
Penicillin Fermentation
33
? 补氮 (nitrogen feeding)：氨控制在 0.01-0.05％
? 前体 (precursor)：残余苯乙酰胺 0.05-0.08％
? 温度控制 (temperature)：前期 25-26 oC
后期 23 oC
? 通气与搅拌 (aeration & stir),1, 0.8 VVM
? 泡沫 (foam)：天然油脂,如豆油
青 霉 素 发 酵 (2)
Penicillin Fermentation
34
Penicillin Fermentation Profile 变化曲线
