浙江工业大学：生物工程设备：10第十章 new离子交换、吸附与层析分离设备

第十章 离子交换、吸附与层析分离设备 离子交换和吸附、层析的内容是很丰富的，机理是多种多样的。 根据物质吸附性质的不同，可用吸附法进行分离；根据分子电离（电负性）的差异，可用离子交换法、电泳法和等电聚焦法等进行分离；根据分子形状和大小的不同，可用凝胶过滤层析、膜分离、超滤法等分离；根据配体特异性的不同，可用亲和层析法进行分离。本章主要就工业上较常用的离子交换、吸附与层析的原理及设备进行叙述。 第一节 离子交换过程原理与设备 离子交换法是应用合成的离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在交换剂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物质从交换剂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。生物工业中最常用的交换剂为离子交换树脂。离子交换树脂是能在水溶液中交换离子的固体，其分子可以分成三个部分：－部分是交联的具有三维空间立体结构的网络骨架，通常不溶于酸、碱和有机溶媒，化学稳定性良好；一部分是联结在骨架上的功能基（活性基）；一部分是活性基所带的相反电荷的离子，称为可交换离子。惰性不溶的网络骨架和活性基联成一体，不能自由移动。活性离子则可以在网络骨架和溶液间自由迁移。当树脂发生离子交换时，其上的活性离子与溶液中的同性离子，按与树脂的化学亲和力不同产生交换过程。最先在工业上应用的离子交换树脂是无机类高分子，叫硅酸铝钠，俗称泡沸石，继而发现了磺化煤和磺化酚-醛树脂，以及后来发现的苯乙烯-二乙烯苯共聚体和铵盐型苯乙烯-二乙烯苯共聚体等。这些品种的树脂交换量、化学稳定性和物理稳定性都不太理想，后来在50年代发现的新型大孔离子交换树脂，由于其良好的稳定性、较高的交换容量而被广泛的应用。 离子交换的一般流程如下： （1）原料液的预处理，使得流动相易于被吸附剂吸附； （2）原料液和离子交换树脂的充分接触，使吸附进行； （3）淋洗离子交换树脂，以去除杂质； （4）把离子交换树脂上的有用物质解吸并洗脱下来； （5）离子交换树脂的再生。 离子交换技术是分离精制生物产品的主要工业手段之一，如细胞色素C的精制用弱酸性阳离子交换树脂；ADP与ATP可用强碱性阴离子交换树脂进行分离精制；弹性酶（Elastase） 用Amberlite CG-50树脂进行分离；肝素、硫酸软骨素等用多孔型或大孔型强碱性阴离子交换树脂进行分离；胰岛素的分离纯化用DEAE-C（阴离子交换纤维素）等。 一、离子交换过程原理 （一）离子交换树脂的分类 离子交换树脂按活性基团的性质不同可分为阳离子交换剂（cation exchanger）和阴离子交换剂（anion exchanger）。前者对阳离子具有交换能力，活性基团为酸性；后者对阴离子具有交换能力，活性基团为碱性。阴阳离子交换剂又根据其活性基团的电离程度强弱不同，分为强酸性阳离子交换剂和弱酸性阳离子交换剂、强碱性阴离子交换剂和弱碱性阴离子交换剂。强离子交换剂的离子化率基本不受pH的影响，离子交换作用的pH范围广，而弱离子交换剂的离子化率受pH的影响大，离子交换作用的pH范围小。 另外，根据离子交换剂的材料也可分为两类：第一类是包含合成树脂骨架的多孔弹性颗粒，通常是苯乙烯和二乙烯苯共聚而成的聚苯乙烯树脂，用线状聚合苯乙烯交联而成网状 结构，改变原始单体的化学组成，使三维结构的骨架基质与所需的离子基团或功能团连接，见表10-1所示。例如带强酸性基团的树脂可以用乙烯基苯磺酸代替某些苯乙烯或者磺化苯乙烯-二乙烯苯的共聚物制得，类似地，带有强碱性基团或弱碱性基团的树脂可以通过用苯乙烯的类似衍生物部分替代苯乙烯或通过共聚物的衍生物作用来制取。制备的离子交换树脂的聚苯乙烯骨架有不同的交联度，它取决于二乙烯苯的初始进料量，高交联度对转盐时树脂颗 表10-1 聚苯乙烯型离子交换树脂的特性 名 称 类 型 功 能 团  732或Dowex50 强酸性阳离子交换树脂 
 724或IRC-50 弱酸性阳离子交换树脂 
 711或Dowex1 强碱Ⅰ型阴离子交换树脂 
 763或Dowex2 强碱Ⅱ型阴离子交换树脂 
 704或IR-45 弱碱性阴离子交换树脂 
 701或Dowex3 弱碱性阴离子交换树脂 
;

  表10-2 多糖类离子交换树脂的特性 名称 类型 功能团  DEAE-纤维素和DEAE-葡萄糖 阴离子交换 纤维素 树脂（弱碱性）或葡聚糖 
 CM-纤维素和CM-葡萄糖 阴离子交换 纤维素 树脂（弱酸性）或葡聚糖 
 磷酸-纤维素 磷酸-葡聚糖 阴离子交换 纤维素 树脂（强酸性）或葡聚糖 
 苯甲酰化DEAE（B-DEAE）-纤维素和（B-DEAE）-葡聚糖 阴离子交换树脂（弱碱性） 
 粒的体积变化减小是有利的。然而，即使是最低的交联度也会产生一个致密的母体，阻滞许多生物大分子渗透进入树脂颗粒并阻碍有效的分离。此外，聚苯乙烯－碱性树脂的疏水特性常使蛋白质变性，由于这些原因，这类树脂常用于分离离子型小分子（如多肽，糖磷酸脂、抗生素等）。 第二类离子交换剂是多糖类骨架的离子交换树脂，见表10-2。它是通过对先存在于多糖上的羟基基团进行化学改性制得的。多糖的多羟基特性使得生成物的化学改性是相当随机的。这些利用纤维素或葡聚糖骨架改性的多糖材料，目前广泛应用在离子交换分离生物大分子上。 （二）离子交换树脂的性能评价 离子交换树脂一般不溶于水、一般的酸碱溶液和有机溶剂，是一种具有良好化学稳定性的高分子聚合物。同时，离子交换树脂必须具备一定的理化性能。 1．外观 大多数商品树脂多制成球形，其直径为0.2~1.2mm。球形的优点是增大比表面积、提高机械强度和减少流体阻力。普通凝胶型树脂是透明的球珠，大孔树脂呈不透明的雾状球珠。随合成原料、工艺条件不同，树脂的颜色也有所不同，一般有黄、白、黄褐、红棕等几种颜色。 2．膨胀度 各种离子的交换树脂，都含有极性很强的交换基团，因此亲水性极强，但由于交联后具有立体型的网状结构，因而不溶于水，具有亲水凝胶的性质，吸水就膨胀，脱水就收缩。膨胀是可逆地进行的，其程度随树脂的交联度、相反离子的种类和浓度、外部溶液的浓度而变化，一般的商品树脂，每克干树脂可吸附0.5~1.0克水分，交联度较低的树脂，每克吸附1.0~3.0克水分。交联度大的树脂，膨胀度小，因而由于实验条件的变化而引起的膨胀度的差异就小。但交联度小的树脂，会显著膨胀或收缩，往往造成操作上的种种困难。 3．交联度 树脂的性质随着作为交联剂的DVB的含量不同而有所差异。合成树脂时，单体中DVB 的含量百分数称为交联度，在商品树脂中，通常是8%~12%。但合成时，通过改变它和苯乙烯的混合比，可制出不同含量的产品。一般说来，交联度越大，树脂越坚固，在水中不易溶胀。而交联度减少，树脂变得柔软，容易溶胀。 4．交换容量 交换容量是单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数，是表征树脂交换能力的主要参数。其表示方法有重量交换容量和体积交换容量两种，后一种较直观的反映生产设备的能力。交换容量的测定方法如下，对于阳离子交换剂，先用盐酸将其处理成氢型后，称重并测其含水量，同时称数克离子交换剂，加入过量已知浓度的NaOH溶液，待反应达到平衡后，测定剩余的NaOH摩尔数，就可求得该阳离子交换剂的交换容量。对于阴离子交换剂，不能利用与上述相对应的方法，即不能用碱将其处理成羟型后测定交换容量。这是因为，羟型离子交换剂在高温下容易分解，含水量不易准确测定，并且用水清洗时，羟型离子交换剂易吸附水中的CO2而使部分成为碳酸型。所以，一般将阴离子交换剂转换成氯型后测定其交换容量。取一定量的氯型阴离子交换剂装入柱中，通入硫酸钠溶液，用铬酸钾为指示剂，用硝酸银溶液滴定流出液中的氯离子，从而可根据洗脱交换下来的氯离子量，计算交换容量。 蛋白质等生物大分子与小分子化合物的离子交换特性有很大差别：蛋白质的分子量大，树脂孔道对其空间排阻作用大，不能与所有的离子交换活性中心接触；离子交换吸附的蛋白质分子会妨碍其他蛋白质与未吸附蛋白质的离子交换基团发生作用，并阻碍蛋白质扩散进入到其他交换区域；蛋白质带多价电荷，在离子交换中一般可与多个离子交换基发生作用。因此，蛋白质的交换容量远低于小分子化合物的交换容量。 5．滴定曲线 滴定曲线是检验和测定离子交换剂性能的重要数据，可参考如下方法测定。 分别向几个大试管中加入1g氢型（或羟型）离子交换剂，其中一个试管加入50ml 0.1mol／L的NaCl溶液，其他试管亦加入相同体积的溶液，但含有不同量的0.1mol／L的NaOH（或HCl），使其发生离子交换反应。强酸（碱）性离子交换剂放置24ｈ，弱酸（碱）性离子交换剂放置７日。达到平衡后，测定各试管中溶液的pH值。以每克干离子交换剂加入的NaOH（或HCl）为横坐标，以平衡pH值为纵坐标作图，就可得到滴定曲线。强酸（或强碱）性离子交换剂的滴定曲线开始是水平的，到某一点突然升高（或降低），表明在该点交换剂上的离子交换基团已被碱（或酸）完全饱和；弱酸（或弱碱）性离子交换剂的滴定曲线逐渐上升（或下降），无水平部分。利用滴定曲线的转折点，可估算离子交换剂的交换容量，而由转折点的数目，可推算不同离子交换基团的数目。同时，滴定曲线还表示交换容量随pH的变化。因此，滴定曲线比较全面地表征了离子交换剂的性质。 （三）离子交换的理论基础 1．静力学 离子交换过程是按化学当量关系进行的。平衡状态与过程的方向无关。如果有Na-型的磺酸树脂放在氯化钠的溶液中，当交换开始后，Na+和Cl-可以透过固液界面自由扩散，扩散的结果是一定量的Na+和Cl-透过界面，形成如下组成的相：即Na+和Cl- 在界面的两边（树脂相和溶液相）都有。而RSO3-因不能透过固-液界面而留在了树脂相。 当扩散达到道南（Donnan）平衡时，即两边电解质的化学电位相等时：
（10-1） 而一种电解质的化学电位为其离子化学电位之和，即：
（10-2）
（10-3） 式中
、μ——树脂相和溶液相的化学位；
、a——树脂相和溶液相的活度。 由上式可得出，当界面两边离子的活度相等时，电解质在界面的两边达到平衡。 另外，由于离子在各自的相达到电中性，即：
及

（10-4） 所以，
这就是说，当达到道南平衡时，由于树脂固定阴离子的排斥，外界溶液相的NaCl的浓度将大于树脂相。在稀电解质溶液中，只有很少的游离电解质能扩散到交换树脂中。 在稀溶液中，两离子在树脂相的浓度比与在溶液中两离子的浓度比成线形关系，即
（10-5） 式中 Z1、、Z2 ——分别表示两离子的价数； m1、、m2——分别表示在树脂相两离子的浓度； c1、、c2 ——分别表示在溶液相两离子的浓度； K——表示离子交换常数。 上式对有机离子也适用，如对有机大离子，则必须修正：
（10-6） 式中 m——对有机大离子的交换容量。 2．动力学 由于树脂放入水溶液中表面就会始终存在一层薄膜，所以离子交换过程一般包含有下列五个步骤。 （ｌ）液相中的反离子Ａ扩散到树脂表面； （２）反离子Ａ从树脂表面再扩散到树脂内部的活性中心； （３）反离子Ａ与树脂上反离子Ｂ发生交换反应； （４）解吸离子Ｂ自树脂内部扩散到树脂表面； （５）Ｂ离子再从树脂表面扩散到溶液中。 其中（１）和（５）为外部扩散，（２）和（４）为内部扩散，（３）为化学交换反应。整个交换反应的控制步骤是扩散。至于究竟内部扩散还是外部扩散属控制步骤，要随操作条件而变。一般来说，液相速度愈快或搅拌愈激烈，浓度愈稀，颗粒愈大，吸附愈弱，则愈是趋向于内部扩散控制，相反，液体流速慢，浓度浓，颗粒细，吸附强，则愈是趋向于外部扩散控制。一般来说对于吸附有机大分子时，因大分子在树脂内扩散速度慢，所以常为内部扩散控制。 （四）离子交换平衡 在没有需要分离的溶质存在的情况下，离子交换剂表面的离子基团R（R+或R—）一直被其反离子覆盖，液相中的反离子浓度为常数。而溶质与反离子带有相同的电荷，溶质的吸附是基于其与离子交换基团相反电荷的静电引力。典型的离子交换过程发生下列反应： 阴离子交换
（10-7a） 阳离子交换

（10-7b） 式中 R+、R-——分别代表阴离子交换基和阳离子交换基； U——表示反离子； X——表示溶质。 离子交换的平衡常数为：
（10-8a）
（10-8b） 如一单价强电解质XH在一阴离子交换树脂上发生交换，XH被完全解离，分配系为
（10-9a） 由式（10-7a）和（10-8a）可得分配系数与反离子浓度的关系
（10-10a） 即分配系数与反离子浓度成反比，随着离子强度的增大，离子交换的分配系数下降。 如XH为单价弱电解质，即XH 仅发生部分解离，则解离平衡常数为
（10-11） 则分配系数为
（10-9b） 故由式（10-8a）和（10-9b）、（10-11）可得
（10-10b） 当KaX→∞时，上式即为（10-10a）。从（10-10a）或（10-10b）可知
（10-12a） 式中 m1——单位反离子浓度下溶质的分配系数。 如对上式两边取对数，则lnm与ln[U-]呈线形关系，斜率为-1。若反离子与溶质的离子价分别为a和b，离子交换反应为
（10-13） 离子交换平衡常数为
（10-14） 由上式可得分配系数为
（10-12b） （五）离子交换树脂和操作条件的选择 选择合适的树脂是应用离子交换法的关键。选用树脂的主要依据是被分离物的性质和分离目的。树脂的选用，最重要的一条是根据分离要求和分离环境，保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。一般来说，对强碱性产物宜选用弱酸性树脂，用强酸性树脂固然也能吸附，但解吸较困难。对弱碱性产物宜选用强酸性树脂，若选用弱酸性树脂则因弱酸、弱碱所成的盐易水解故不易吸附。弱酸性产物宜用强碱性树脂；强酸性产物宜用弱碱性树脂。选择树脂还应考虑其交联度大小，多数生物产物分子都较大，应选择交联度较低的树脂。但交联度过小会影响树脂的选择性，且易粉碎，造成使用过程中树脂流失，故选择交联度的原则是：在不影响交换容量的条件下，尽量提高交联度。 必须指出，用离子交换树脂吸附酶等蛋白质是有困难的，因为酶在吸附、解吸过程中会失活。将树脂骨架由憎水性改为亲水性，如经过加工的纤维素所制得的离子交换剂，现已被用于提取酶。俄罗斯开发了一种以三嗪为骨架的羧基树脂，可用来提取胞外酶。 应注意选择合适的操作条件，最重要的操作条件是交换时溶液的pH值。合适的pH值须满足三个条件：（1）pH值应在产物的稳定范围内；（２）使产物能离子化；（３）使树脂能解离。树脂的型式也应注意，对酸性树脂可以用氢型或钠型，对碱性树脂可以用羟型或氯型。－般来说，对弱酸性和弱碱性树脂，为使树脂能离子化，应采用钠型或氯型，而对强酸性和强碱性树脂，可以采用任何型式。但如产物在酸性、碱性下易破坏，则不宜采用氢型或羟型树脂。溶液中产物浓度的影响一般说来低价离子增加浓度有利于交换上树脂，高价离子在稀释时容易被吸附． 根据化学平衡，洗脱条件总的选择原则是：尽量使溶液中被洗脱离子的浓度降低。显然洗脱条件一般应和吸附条件相反，如吸附在酸性下进行，解吸应在碱性下进行；如吸附在碱性下进行，解吸应在酸性下进行。为使在解吸过程中，pH不致变化过大，有时宜选用缓冲液作为洗脱剂，如产物在碱性下易破坏，可以采用氨水等较缓和的碱性洗脱剂。如单靠pH变化洗不下来时，可以试用有机溶媒。选择有机溶媒的原则是能和水混合，且对产物溶解度要较大。 二、离子交换设备 目前已出现的离子交换设备按结构型式分为罐式、塔式、槽式等。按操作方式分为间歇式、周期式与连续式；根据两相接触方式的不同，又可分为固定床、移动床、流化床等。固定床设备是现今应用得最多的离子交换设备，它具有设备结构简单、操作管理方便、树脂磨损少等优点，同时存在设备管线复杂、阀门多、树脂利用率相对较低等弊端。此外，使用单一交换柱不能连续生产，多柱串联虽可实现连续生产，但势必增加设备投资，并且使操作复杂化。固定床设备的弊病限制了它的发展，使之日益面临新型设备的挑战。为适应现代化生产的要求，各国学者都将注意力集中在连续式设备的开发及应用研究上，先后研制出多种实用的离子交换设备，将离子交换技术又向前推进了一步。 （一）间歇式离子交换设备 一般的离子交换罐为具有椭圆形封头的圆筒形设备，其圆筒体的长和筒径之比一般为2~3，也有高至5的。树脂层高度约占圆筒高度的50~70%，须留有充分的空间，已备反冲时树脂层的扩胀。在交换罐的上部有溶液分布装置，以使含有被交换离子的溶液、解吸液或再生剂能在整个罐截面上均匀地通过树脂层。圆筒体的底部与椭圆形底之间常装有多孔板、筛网及滤布以支持树脂层，或者用块石英石或卵石直接铺于罐底以支持树脂层。罐顶应有人孔或者手孔，大型交换罐的人孔也可以装在罐壁上，以便于装卸树脂。视镜孔和孔灯可以在罐顶也可以在罐壁上。罐顶部的被吸附溶液、解吸液、软水进口可合用一个进口管与罐顶相连，罐底的各种液体出口及反洗水进口和压缩空气进口也可合用一个总进出口。另外，罐顶上应有压强表、排空口及反洗水出口。交换罐一般用钢板制成，内壁衬橡胶。附属管道一般为硬聚氯乙烯管，阀门可用聚氯乙烯、不锈钢或橡皮膜阀门。常用的离子交换罐见图10-1及图10-2。

1．反吸附离子交换罐 在反吸附离子交换罐中，被交换的溶液由罐的下部导入，其流速和粘度以使树脂在罐内呈沸腾状态而不溢出罐外为宜，交换后的溶液则由罐顶的出口溢出。反吸附除可以省去菌丝过滤（如被交换的溶液为发酵液）这一工序外，还具有液固两相接触面大而且较均匀，操作时不产生短路、死角，以及流速大和生产周期短等优点，因此解吸后所得的产品质量较高。但反吸附时树脂的饱和度不及正吸附的高。此外罐内树脂高度要比正吸附时低一点，以免树脂外溢。反吸附交换罐的结构可见图10-3。
2．固定床离子交换设备 这种操作方式使用最广，设备结构较为简单，操作也很方便。离子交换树脂的下部要用多孔陶土板、粗粒无烟煤、石英砂等作为支撑体。被处理的溶液从树脂上方加入，经过分布管使液体均匀分布于整个树脂的横截面。加料可以是重力加料，也可以是压力加料，后者要求设备密封。料液与再生剂可以从树脂上方通过各自的管道和分布器分别进入交换器，树脂支撑下方的分布管则便于水的逆洗。柱式离子交换器可用不锈钢、硬塑料制作，常常用有衬里的碳钢制造，管道、阀门一般均用塑料制成。固定床离子交换器的再生方式分成顺流与逆流两种。逆流再生有较好的效果，再生剂用量可减少；但要发生树脂层的上浮。 如将阳、阴两种树脂混合起来，则制成混合离子交换设备。将混合床用于抗生素等生物产品的精制，可避免采用单床时溶液变酸（通过阳离子柱时）及变碱（通过阴离子柱时）的现象，因而可减少目标产物的破坏。单床及混合床固定式离子交换装置见图10-4所示。
另外，有一些离子交换器既可用于固定床的操作，也可用于流化床的操作。该装置的示意图见图10-5，主要由以下几个部分组成：一个正相计量泵，可在0——1000的范围内调整流速；一个用玻璃制成的柱体，装有一个活塞以适应不同的体积；三个贮槽，分别装有去离子水，HCl和NaCl；三个阀门，这三个阀门必须都关闭或者只有其中的一个打开；两个四通阀，见图10-6，决定料液向上或向下以及料液通过床层或留在贮槽；两个pH电极，在床进口或出口的位置测量料液的pH值；一个pH计；用于数据测量的计算机。该装置可用于流化床或固定床的操作，当料液向下流过床层时，则为固定床的操作，而当料液由下向上流过床层时，则为流化床的操作。除了能方便地进行两种操作的转换外，还可通过pH电极实现料液的在线监控。

3．薄膜压滤式离子交换设备 当溶质的吸附扩散变得非常慢的时候，细微分开的树脂就会有利于吸附。而大颗粒的树脂由于可利用的表面积非常得小或者溶质到达颗粒内部需要较长的时间，而不利于吸附。但是细微分开的树脂存在着严重的水力方面的问题。在通常的工业生产条件下，液体用相同的方式通过它们，几乎是不可能的。原因是树脂的细微分开的粉状结构使得流体流过时阻力非常得大。与普通的箱式压滤机类似的薄膜压滤器可以很好地解决这个问题。它的内部是由一系列的塑胶过滤板排列而成许多小腔，并包有滤布。这种薄膜压滤器在每一层滤布后面都有膨胀膜，当腔内的树脂饼扩张或压缩时，膨胀膜就会被扩张或被压缩。这样就能保证当液体流过树脂饼时，树脂饼的状态始终是稳定的，也解决了流体阻力的问题。其设备结构见图 10-7。
该设备的操作可分为三个步骤：（1）树脂的填充，将粉状的树脂与水或另外一些合适的试剂混合制成泥浆状，用空气隔膜泵将泥浆状物打入膜压滤器。整个填充过程需要大约2个小时。（2）树脂的循环，给膜加压，使溶液流经树脂时能通过压滤器的特殊的洗涤口。（3）树脂的再生，通过特殊的洗涤口，树脂实现再生。 该设备对于料液中重金属的去除，生物大分子如蛋白质、核酸、糖类的分离等都适用。 4．活动式自动化离子交换设备 中国环境科学研究院“八五”期间研制了1台活动式自动化离子交换再生设备(见图10-8)。设备采用模块式设计，总体构成分为主体设备、电控柜、工艺参数监测柜、微机系统4个部分。主体设备设有4个工位，分别进行装柱、交换处理、树脂再生、淋洗操作。工况变换通过旋转系统带动树脂柱转到相应工位来实现。树脂柱旋转与各工位液路管道的对接与脱开，是由特别设计的管柱自动衔接头和旋转定位系统来完成的。此外，设备还包括各种进排液管道系统，高位水箱，中间循环槽，电路系统及动力设备等。主体设备结构紧凑，设计科学，树脂利用率高，且密封性好，保证了安全生产以及清洁的操作环境。电控柜设有多个小控制箱，用以控制主体设备运行。控制箱上设有手动和自动开关，打入自动由微机控制，打入手动则可人为施控。工艺参数监测柜上设有各种监测箱，不仅能显示各种工艺参数(温度、流量、pH值、液位等)的瞬时值，还能将这些模拟量传给计算机系统。计算机对监测柜传送来的模拟量，进行处理，计算、贮存、显示、打印输出，同时把控制主设备的信号输出到电控柜，最终控制主设备的运行。该控制系统实现了工艺参数自动监测、主设备动作自动控制的闭环控制方式，从而更为科学。有效地避免了人为误操作可能带来的各种谬误，使设备正常、高效的运行得到可靠的保障。
（二）半连续移动床式离子交换设备 移动床离子交换设备是一种半连续式离子交换装置，交换、再生、清洗过程在装置中特定位置完成，而将这些过程在装置中串联在一起，各种液体周期性地在特定的部位流动。该设备的特点：离子交换与树脂再生、清洗分别在设备的不同单元中进行。系统中设置多个阀门用来控制树脂流向，并根据工艺要求，借助水力将树脂输送到相应单元进行各种操作。 移动床式的主要优点是：生产率相同时所需树脂量比固定床少；再生剂利用率及树脂饱和程度高，因而再生剂用量少；被处理物料的纯度高，质量均匀；操作自动化程度高，可连续出料等。它的缺点是设备数量较多，操作管理较为复杂。 早期的移动床设备，如希金斯连续离子交换设备，阿萨希移动床设备，已经在工业上得到了应用，并取得了较好效果。80年代以来，仍不断出现各种改进的移动床设备。如美国 1992年报道的Carlson等人研制的连续式移动床离子交换系统 (见图10-9)，包括水处理柱、再生清洗柱和一些辅助的中间循环柱。系统运行过程为：待处理液进入处理柱后，树脂随待处理液一起在柱内流动，同时进行交换反应。树脂悬浮液流到中间循环柱，进行固液分离，处理水外排。当再生信号发出，水处理系统内部分树脂进入饱和树脂存贮柱，同时有再生好的树脂补充过来。尔后，存贮柱内的树脂进入再生柱再生。该装置可实现水处理，饱和树脂再生以及再生好树脂返回等过程同时进行，从而达到连续产水的目的。与传统移动床设备不同的是，该装置设有一些传感器，用以监测水中某种离子浓度、pH值等指标。当指标达到预定值时，可发出信号，控制树脂进出再生系统。这种控制方式，比时控方法更为灵活可靠，科学性更强。
（三）连续式离子交换设备 1．一般连续式离子交换设备 固定床的离子交换操作中（指正吸附操作），交换仅限于在很短的交换带中进行，因此树脂利用率低，生产周期长。若采用连续逆流式操作则可避免上述缺点，且交换速度快，产品质量均匀，连续化生产便于自动化控制。但连续离子交换过程中的树脂破损很大，设备及操作较复杂且不易控制。图10-10和图10-11为连续逆流离子交换设备的示意图。 连续式离子交换设备按料液流动的方法又可分为重力和压力两种。压力流动式是由再生洗涤塔和交换塔组成。交换塔为多室式，每室树脂和溶液的流动为顺流，而对于全塔来说

树脂和溶液却为逆流，连续不断地运行。再生和洗涤共用一塔，水及再生液与树脂均为逆流。从树脂层来看，连续式装置的树脂在装置内不断流动，但它又在树脂内形成固定的交换层，具有固定床离子交换器的作用；另一方面，它在装置中与溶液顺流呈沸腾状态，因此又具有沸腾床离子交换的作用。其工作流程见图10-12。这种装置的主要优点是能连续生产、供液不间断，而且效率高；树脂利用率及再生饱和程度高，因而再生液耗量较省；操作管理较为方便。它的缺点是树脂磨损较大。重力流动式又称双塔式，这种装置的主要优点是被处理液与树脂的流向为逆流。工作流程见图10-13。

2．ISEP系统 （1）ISEP系统的工作原理 ISEP系统是首次开发成功的一种真正连续的离子交换系统，此系统由美国先进分离技术公司（Advanced Separation Technologies Inc.）于1986年开始开发，经过不断完善，目前已成功的应用在各种不同的产业领域中。 ISEP是由一个水平转盘和30个短小固定床构成的，如图10-14所示。固定床和转盘以规定速率连续旋转，每个床柱中都装有吸附介质(如离子交换树脂等)，每个树脂柱的上部和下部均有接管，与由小电机驱动的分配器旋转端管嘴相接。树脂床的转盘由第二个电机驱动，它与旋转阀的转速同步。分配器旋转端与含有20个均匀分布槽口的分配器固定端相匹配，当ISEP运行时，流入或流出这些固定槽口的液流是恒定的、不间断的。当转盘旋转360°时，每个树脂柱都将经历一次完整的吸附循环——即吸附、再生(或洗脱)，以及一次或二次淋洗。当某一床柱从一个槽口下部移开时，液流暂时停止流动，直到床柱转移到与另一槽口相通，从而保证树脂床柱在任何时候只能接受来自一个槽口的液流。ISEP采用短树脂床，以使树脂在操作中得以最大限度的利用。在吸附循环中，床柱内的树脂无论是处于耗竭状态，还是处于再生状态，任何部位均无闲置，这使ISEP所用树脂量大大少于常规的离子交换系统。小容积树脂床与液流(再生剂，淋洗水)的逆流流动相结合，使树脂床再生和清洗时所需的再生剂量减少，稀释程度降低。 （2）ISEP系统的优点 固定床吸附一般适用于除去低浓度化合物的工艺，固定床的实用尺寸可在4～24hrs内连续操作。固定床的主要缺点是:吸附剂不能得到有效利用；再生用化学品消耗量过大；由于低进料浓度的限制，应用受到限制，而ISEP连续系统采用能够改善接触效率的逆向流动工艺，克服了上述缺点。ISEP设计灵活，为其应用提供了新的领域，用以替代在工业分离中存在某些严重缺陷的脉冲床。ISEP系统是一种完全革新的分离工艺技术，在已有的吸附、离子交换和过滤技术的基础上，由AST公司经多年研制开发而成，不同于传统的固定床（Fixed Bed）、脉冲床（Pulse Bed）、模拟移动床（Simulated Moving Bed）等工艺。ISEP系统可用于分离、精制和回收各种工业用水及其他溶液中的特定有效物质及有害物质，此系统可使用传统的吸附剂，如：离子交换树脂、活性炭及合成吸附剂等。由于系统是连续运行，ISEP不需要设置备用设备；离子交换树脂再生时也不必中断正常的生产。由于多柱（20/30交换柱）吸附以及在稳定状态下连续运行，ISEP系统可以处理杂质浓度较高的物料，保证产品具有稳定的成分和浓度。同时，因非活性树脂用量的减少及采用多通道逆向流动再生方式，离子交换树脂的用量及再生剂和洗涤水的消耗量可大大减少。因为ISEP能使多级分离步骤同时进行，所以越是复杂的分离过程，越能发挥其优越性。 （3）ISEP的操作方式　　 操作方式有:①平行流动；②带向上流动的平行流动；③串联流动；④双通道串联流动；⑤带排干液体的串联流动；⑥再循环流动；⑦脉冲料液置换。 逆向流动系统作业是ISEP工艺的关键技术之一，其优点是用固定床等所不可能达到的。如一个装有树脂的容器需要洗涤时，树脂几乎是完全充满了容器，外部液体空间的体积等于树脂内部液体的体积。通过扩散将达到一个平衡，使离开容器的液体，其残存自由离子的浓度为起始夹带于树脂中液体浓度的一半。采用ISEP逆流洗涤法将比4级固定床体系多除去310%的树脂内的离子，(若用3级洗涤，多除去256%的离子)。逆流再生也能达到类似的相对效率。多个串联的树脂床，逆流作业也可用于吸附中，可将进料液中离子型物质之浓度降到很低的水平，并确保出口树脂达到完全饱和，ISEP具有利用高效率的逆流洗涤和逆流再生能力，并有利用再生淋洗水作为再生稀释剂之能力，往往能把用水量、化学品用量和废水排放量，减少到因定床操作所需量的50～80%，还能使洗脱液中的物质达到“高浓度”。
（4）ISEP系统的应用 这种新的生产技术在通过玉米发酵赖氨酸的工艺中得到肯定。自从连续离子交换设备问世后，六年中它使得赖氨酸的生产在经济上发生了变革。该设备代替了大多数从发酵液中提取赖氨酸的传统方式。现今，该连续分离技术控制了世界上70%的赖氨酸产品的生产。全球六大赖氨酸生产厂家均使用连续离子交换分离设备，已经获得了比传统的间歇固定床分离更高的收率和更经济的生产方式。 在操作中，一个转盘，其上排列着12，20或30根小的固定离子交换床的树脂柱，在一个特别的二合一的分配器下方缓慢的以稳定的速率旋转。当床根据正常的离子交换工艺的4个步骤按顺序运转时，分配器引导所有的水流通过交换床。当转盘完成一周的旋转后，赖氨酸已回收，同时树脂在另一个循环中再次使用。从本质上说，转盘和二合一分配器的旋转槽口是唯一转动的部分。他们每天可旋转6至12周。两台电机可提供低耗能旋转。固定床系统所需的30根或更多的阀门仅由一个二合一的分配器代替。 （四）离子交换膜与电渗析 离子交换膜和电渗析技术是在离子交换技术的基础上发展起来的新技术。离子交换膜电渗析法广泛应用于海水淡化、水处理除盐、化工生产的提纯、分离、合成以及综合利用、废水处理等方面。近年来，已应用在生物产品如蛋白质的分离上。 1．离子交换膜 离子交换膜是将离子交换树脂制成薄膜的形式而得到的，它和离子交换树脂的性质基本上相似。和离子交换树脂一样，按功能团不同，离子交换膜可以分为阳离子交换膜和阴离子交换膜。按构造组成的不同，离子交换膜又可以分为异相膜、均相膜和半均相膜。异相膜是将离子交换树脂磨成粉末，借助于惰性粘合剂（如聚氯乙烯、聚乙烯或聚乙烯醇等），由机械混炼加工成膜，由于粉末之间充填着粘合剂，因而膜的组成是不均匀的。均相膜以聚乙烯薄膜为载体，首先在苯乙烯、二乙烯苯溶液中溶胀，并以偶氮二异丁晴为引发剂，在加热加压条件下，在聚乙烯主链上接枝聚合而生成交联结构的共聚体。如果用浓硫酸磺化则制得阳膜；如以氯甲醚使共聚体氯甲基化，再经胺化则制成阴膜。异相膜的电阻较大，电化学性能比均向膜差；机械强度却比均相膜好。在水处理中一般都用异相膜。半均相膜是用聚乙烯粒子浸在苯乙烯、二乙烯苯后，加热聚合，经磺化制得阳膜或氯甲基化，再经胺化制得阴膜。这种半均相膜已应用于抗生素工业中。离子交换膜在电渗析中的应用主要由于它具有选择透过的性能，既阳离子交换树脂能透过阳离子，而不能透过阴离子，而阴离子交换膜只能透过阴离子而不能透过阳离子。将阳膜浸入溶液中，如膜上阳离子和溶液中阳离子不同，则要发生离子交换；如膜上阳离子和溶液中阳离子相同，则由于膜的骨架带强的负电荷，因此只有阳离子才能进入膜内，阴离子则被排斥在膜外。当在膜的两侧通以电流时，则阳离子能透过阳膜而趋向阴极，阴离子则受阻而留在溶液中。 壳聚糖是一种有着很好成膜特性的天然生物高分子聚合物。壳聚糖交联膜具有阴离子交换作用，是一种阴离子交换膜，其性能较好，具有较强的选择透过性。周亚光等使用的壳聚糖交联膜，是由1%的壳聚糖醋酸溶液，加入一定量金属离子的盐溶液，静止30分钟后将络合金属离子的壳聚糖醋酸溶液倒入一定量的25%戊二醛溶液中，经淋洗、红外干燥而制得的。在湿法冶金壳聚糖交联膜电渗析方法，分离去除Cl-、F-以及AsO-2，效果很好。 在蛋白质的分离和纯化时，使用吸附多孔膜层析可克服许多传统的填充床层析的限制因素。微孔膜的载体相对于传统的珠式载体有很多优点，因为它们不被压缩而且不受扩散的限制。因此，使用微孔膜具有生产能力高、操作时间短等优点。近年来，在蛋白质的分离和纯化时，人们将功能化多聚物刷（polymer brushes）连到微孔膜上制成了一种新的层析剂，见图10-15。这种功能化的多聚物刷均匀地附在微孔中空纤维膜的孔表面，通过光诱导聚合以及后来的化学修饰交叉形成一定厚度的膜。通过多聚刷的静电排斥，由于蛋白质的三维结构形成的过程中，通过离子交换多聚物刷，在多层被俘获。通过小孔上的多聚物刷，蛋白质溶液渗入膜，通过离子交换作用，理想的蛋白质捕获率可获得，而且扩散阻力可忽略。蛋白质的捕获过程见图10-16所示。

2. 电渗析技术 电渗析制备无盐水的原理见图10-17、10-18。 该装置为一三槽电渗析池。设开始时三室中都有氯化钠溶解，则当通直流电流后，中间室的Cl-通过阴膜，趋向阳极，在阳极上发生电极反应产生Cl2；中间室的Na+通过阳膜，趋向阴极，在阴极上发生电极反应，产生H2和NaOH，而中间室的NaCl则越来越少，而得到无盐水。

大型的电渗析装置如图10-19所示，两端是两块青铅制成的电极，电极四周及外侧用硬聚氯乙烯加以保护和绝缘。电极室、淡化室、浓缩室均由2毫米厚的聚氯乙烯制成，称为隔板，隔板大小应与膜相同，隔板四角有进水和出水孔，隔板中有互相连通的流水槽，槽中还固定有薄网板，使水流通过时具有一定的流速，并保持一定程度的湍动，以增加电渗析的效果。 与通常用离子交换树脂制备无盐水不同，用离子交换膜时不需要再生，脱盐连续地靠电能来实现的，因而操作方便，节省酸碱，避免排放大量废酸、废碱，有利于环境的整治。在三槽电渗析槽中，电极反应消耗电能很大。为节省电能，工业上多用多槽式装置。因为电极反应所消耗的能量，不论层数多少都为定值，故工业上电渗析装置多由几百对膜。目前某些抗生素工厂已采用电渗析制备无盐水。 三、离子交换设备的计算 离子交换过程的平衡及速度常因所处理的物系的性质和操作条件的不同而有很大的差异。在生产操作中，料液中含有的不少杂质及操作条件的限制，都影响树脂对目标产物的交换容量。因此，离子交换设备的设计应根据小设备的实验结果进行放大。 （一）固定床的放大 固定床的放大通常有两种方式：根据单位树脂床体积中所通过的溶液的体积流量或单位树脂床截面积上所通过的溶液的体积流量相同的原则进行。 1．据单位树脂床体积中所通过的溶液的体积流量相同的原则进行放大 单位树脂床体积中所通过的溶液的体积流量也可称为交换器负荷，可以用ml（溶液）/ml（湿树脂）·min或m3（溶液）/m3（湿树脂）·h表示。此值的倒数即溶液与树脂的接触时间。保证在小设备和大设备中此值相同，即说明两者的接触时间相同。根据此法放大，树脂床的几何形状即高径比不是一个决定因素，但一般可维持大设备和小设备有相同的几何形状，即相同的高径比。因此根据此原则放大的计算，十分方便，只要知道大设备中的溶液体积流量是小设备的若干倍，就立即知道大设备中湿树脂的装量是小设备的若干倍，从而很容易算出大设备中湿树脂的体积是多少，至于操作时间等条件完全可与小设备的相同。 交换器的负荷为
（10-15） 式中
——交换器的容量，m3/m3·h；
——通过溶液的体积流量，m3/h；
——湿树脂的体积，m3。 若下标1代表小设备的操作条件，下标2代表大设备的操作条件。当
时，
（10-16） 则大设备中的树脂体积为
（10-17） 上式中F2/F1即为放大倍数m，故上式也可写为
（10-18） 若以H代表树脂床高，D代表树脂床直径，
，
或
，
（10-19）因
（10-20） 故
（10-21） 或
（10-22） 因此，大设备的直径及高度为
（10-23）
（10-24） 2．根据单位树脂床截面积上所通过溶液的体积流量相同的原则进行放大 单位树脂床截面积上通过溶液的体积流量可以用ml（溶液）/cm2·min或m3（溶液）/m2·h来表示。此值即为溶液通过树脂床的线速度。根据此法放大时，要维持大设备与小设备的树脂床层高度相同，仅直径加大，以保证两者线速度相同，实际上也是保证两者接触时间相同。 线速度为
或
（10-25） 式中
——线速度，m/h；
——树脂床截面积，m2。 当W1=W2时
（10-26）
（10-27）
（10-28）
（10-29）
（10-30）
（10-31） 用此法计算出来的树脂体积M2实际上和上法计算的结果相同。因考虑到解吸对高径比较高的罐，解吸浓度比较高，故一般系用前法放大较好，不过用前法放大时，树脂床高度增加了，线速度也相应的增加，流体阻力也增大了。 （二）连续逆流离子交换设备的计算 连续逆流离子交换设备的计算方法可以仿照萃取、吸收等操作过程的计算。一般可用图解法求得操作过程中的理论级数。进行图解时，首先应有被交换离子在树脂中及在溶液中的平衡数据。如用小标1表示进口的浓度，下标2表示出口的浓度，操作线可用下式来表示
（10-32） 式中
——溶液流量，ml/min；
——溶液中目标产物的浓度，mg/ml；
——树脂流量，g/min；
——树脂上目标产物的浓度，mg/g。 将两端的极端浓度（
，
）及（
，
）的坐标用直线相连即为操作线，然后在操作线和平衡曲线间画出阶梯和读出理论级数。传质方程式可用下式来表示：
　　　　　　 （10-33） 式中
——溶液流量，m3/h；
——交换柱高度，m；
——交换柱截面积，m2； γa——交换柱中树脂的视重度，kg/m3；
——溶液浓度，mg/L；
——与同一截面上树脂浓度相平衡的溶液浓度，mg/L；
——溶液总传质系数，m/h；
——树脂颗粒的比表面积，m2/m3。 在一定设备及溶液中，A为常数，γa仅与H有关，当H值固定时，
　　　　　　　　　　　　　 （10-34）
　　　　　　　　　　　　　　 （10-35） 上式等号左边的积分值可用图解积分求得，因此已知H值可求得KLa值，或已知KLa值可求得H值。 第二节 吸附过程原理及设备 吸附(Adsorption)是利用适当的吸附剂，在一定的操作条件下，使有用目标产物或有害成分被吸附剂吸附，富集在吸附剂表面，然后再以适当的洗脱剂将吸附的物质从吸附剂上解吸下来，从而达到浓缩和提纯的目的，这样的过程称为吸附操作。当物质从流体相（气体或液体）浓缩到固体表面从而实现分离的过程称为吸附作用。在表面上能发生吸附作用的固体微粒称为吸附剂，而被吸附的物质称为吸附质。 按吸附剂对吸附质的吸附作用可分为三类，即物理吸附、化学吸附和交换吸附。 吸附剂和吸附质通过分子间范德华力而产生的吸附作用称为物理吸附。物理吸附无选择特异性，但随着物系的不同，吸附量可相差很多。物理吸附不需要较高的活化能，在低温条件下也可进行。物理吸附通常是可逆的，在吸附的同时，被吸附的分子由于热运动离开固体表面而发生解吸。 由于固体表面原子的价，未完全被相邻原子所饱和，还有剩余的成键能力，吸附剂与吸附质之间发生电子转移，发生化学反应而产生吸附作用称为化学吸附。化学吸附的选择性较强，即一种吸附剂只对某种或特定几种物质有吸附作用。化学吸附与物理吸附不同，需要一定的活化能。由于化学吸附生成化学键，因而只能是单分子层吸附。 吸附剂表面如为极性分子或离子所组成，则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层，同时在吸附剂与溶液间发生离子交换，这种吸附称为交换吸附。交换吸附的能力由离子的电荷决定，离子所带电荷越多，它在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力就越强。 分离过程中的吸附操作应用最广的是物理吸附，化学吸附的应用较少，而交换吸附在生物工程的下游技术中应用越来越广泛。 吸附操作广泛应用于各种生产领域的分离过程，如除臭、脱色、去盐、吸湿、防潮以及制备软水、无盐水等方面。固体吸附与生物工程关系密切，在原料液处理、除臭、目标产物的分离、精制等方面发挥着重要的作用。早期使用的吸附剂有高岭土、氧化铝、凝胶型离子交换树脂、活性碳、分子筛等。近年来合成的大孔网状聚合物吸附剂，与经典的活性炭吸附剂相比，有很多优点，在各个领域得到了广泛的应用。随着新吸附剂的出现及应用技术的进步，吸附法已广泛渗透到水处理、金属冶炼、原子能科学技术、海洋资源开发、食品加工、医药卫生和环境保护等领域。 一、吸附过程与原理 （一）吸附法基本概念 固体吸附剂可分为非多孔和多孔性物质两类。非多孔性固体具有很小的比表面积，如将固体物质粉碎成微粒，则可增大其比表面积。而多孔性固体由于其颗粒内存在着微孔，比表面可以很大。非多孔性固体的比表面仅决定于外表面积，而多孔性固体比表面积是由外表面积和比外表面积大几百倍的内表面积所组成的，并且内表面具有较大的吸附能力，故一般应用多孔性固体物质作为吸附剂。 固体表面分子或原子所处的状态与固体内部分子或原子所处的状态有所不同，见图10-20。固体内部分子或原子受到的作用力是对称的，即作用力总和为零，分子处于平衡状态。而在界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，因此界面分子所受力是不对称的，作用力的合力方向指向固体内部，即处于表面层的固相分子始终受到一种力的作用，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在其表面形成多分子层或单分子层。
（二）常用吸附剂 吸附剂是物质吸附分离过程得以实现的基础。目前在吸附分离过程中常用的吸附剂主要有活性炭、硅胶、活性氧化铝、合成沸石（分子筛）和大网格吸附剂等。在生物产品的分离过程中，针对不同的混合物系及不同的净化度要求需采用不同的吸附剂。 1．活性炭 活性炭是目前最普遍使用的吸附剂，它是一种多孔含碳物质的颗粒粉末，常用于生物加工产品的脱色和除臭等过程。生产活性炭的原料是一些含碳物质如木材、泥炭、煤、石油焦炭、骨、椰子壳、坚果核等，其中无烟煤、烟煤和果壳是主要原料。活性炭具有吸附能力强，分离效果好，来源比较容易，价格比较便宜等优点。但是活性炭很难控制标准，而且色黑质轻，容易污染环境，因此应用受到限制。 2．硅胶 硅胶有天然和人工合成之分。天然的硅胶即多孔SiO2，通常称为硅藻土，人工合成的就称为硅胶。目前作为生物分离所用吸附剂一般都采用人工合成的硅胶，因为人工合成的多孔SiO2杂质少，品质稳定，耐热耐磨性好，而且可以按需要的形状，粒度和表面结构制取。硅胶在吸附操作特别是层析操作中应用广泛。 目前制取硅胶的工艺，以水玻璃为原料，与无机酸（H2SO4、HCl或HNO3）作用，反应生成沉淀H2SiO3，经老化缩水、成型、洗涤、干燥、焙烧后，即可制得各种成品，图10-21为沉淀法制造硅胶的工艺流程示意图。 3．氧化铝 活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适用于亲脂性成分的分离，广泛应用于醇、酚、生物碱、染料、核苷类、氨基酸、蛋白质以及维生素、抗生素等物质的分离。活性氧化铝价格便宜、再生容易，活性易控制；但操作不便，手续繁琐，处理量有限，因此限制了其在工业生产中的大规模应用。 4．大孔网状聚合物吸附剂 大孔网状聚合物吸附剂在合成的过程中没有引入离子交换功能团，只有多孔的骨架，其性质与活性炭、硅胶的性质相似。如美国Rohm and Haas公司生产的Amberlite XAD1~5(聚苯乙烯，即苯乙烯和二乙烯苯的共聚树脂)和XAD6~8（聚酯，以甲基丙烯酸酯为交联剂）等均为大网格聚合物吸附剂。大孔网状聚合物吸附剂是一种非离子型多聚物，它能够借助范德华力从溶液中吸附各种有机物质。此类吸附剂机械强度高，使用寿命长，选择性吸附性能好，吸附质容易脱附，并且流体阻力小，常应用于微生物制药行业，如抗生素和维生素等的分离浓缩。我国曾有人采用D6的大孔网状聚合物吸附剂吸附赤霉素，用75%的丙酮洗脱，一次结晶收率为40%。 5．W-Way沸石 加拿大的W—Way天然沸石(Na4K4)(Al8Si40O96).24H2O是特有的火山矿石，它属于含水铝硅酸盐类，包括氢、氧、铝和硅等元素。这些元素组成了蜂窝状的结构。由于沸石结构中含有许多通道或者小孔，就使得它们的表面积非常的大。另外，它的结构中含有负电荷，这样就使得它具有非常大的阳离子交换能力。除了用于一般的气体和液体的吸附外，沸石还可用于离子交换，其离子交换能力见表10-3所示。 表10-3 W-Way沸石的离子交换能力 离子交换能力  NH4 48%  Cu 57%  Pb 85%  Zn 48%  Cd 82%  （三）吸附剂的性能要求 在实际工业应用分离生物产品时，常常由于不同的生物产品及不同的纯化要求，而采用不同的吸附剂，但作为吸附剂一般都有如下的主要性能要求。 1．大的比表面积 在分离过程中，应用较多的吸附一般多为物理吸附，吸附通常只发生在固体表面几个分子直径的厚度区域，单位面积固体表面所吸附量非常小，因此作为工业用的吸附剂，必须有足够大的比表面积。 2．颗粒大小均匀 固体吸附剂的外形通常为球形和短柱形，也有其他如无定形颗粒的，其颗粒直径通常为0.6mm到1.5cm，工业固定床用吸附剂颗粒一般为直径1～ｌ０ｍｍ左右；吸附剂颗粒大小均匀，可使流体通过床层时分布均匀，避免产生流体的返混现象，提高分离效果。吸附剂的颗粒大小及形状将影响到固定床的压力降，因此应根据工艺的具体条件适当选择。 3．具有一定的吸附分离能力 使用吸附剂的目的在于实现工艺上对生物有效成分的分离浓缩，因此，吸附剂均应具有在某一特定条件下对某种产品的分离纯化能力。该能力一般需通过适当试验方法来测定。 4．具有一定的商业规模及合理的价格 工业用吸附剂由于使用量较大及连续性操作，因此要求具有商业化生产的规模及稳定的物理、化学性质。同时由于在工业上大量使用，其价格的合理性也是重要参数之一。 （四）吸附平衡 当吸附剂达到平衡时，其吸附量m与溶液浓度C和温度的关系称为吸附平衡关系。当温度一定时，吸附量只是浓度C的函数。m与C的关系曲线称为吸附等温线。由于吸附剂与吸附物之间的作用力不同，吸附剂表面状态不同，因此吸附等温线也会相应的不同，如图10-22所示。最普遍的是凸型（b），呈一条双曲型饱和曲线，这样的图形，一般是单分子层吸附，一旦吸附达到饱和，就不再继续进行，（c）是一条渐进于纵坐标的渐进曲线，表明是一种多分子层吸附，而（d）是一种直线型等温线。 许多抗生素、类固醇、激素在溶液中的吸附过程经常用佛罗因德希（Freundlich）经验公式来描述：
（10-36） 式中
——单位质量的吸附剂所吸附的吸附质量，g/g；
——吸附质的平衡浓度，g/m3；
，
——经验常数，一般1<n<10。
Langnuir第一个建立了单分子层吸附等温线方程。他在推导吸附等温线方程时提出下列假定：吸附是在活性中心上进行，这些活性中心具有均匀的能量，而且相隔较远，因此吸附质分子间无相互作用力；每一个活性中心只能吸附一个分子，即形成单分子吸附层。根据气体吸附和溶液中吸附是相似的过程出发，可以认为吸附速度应该和溶液浓度C和吸附剂表面未被占据的活性中心数目成正比；而解吸速度应该和吸附剂表面为该溶质占据的活性中心数目成正比。设：ｍ为每克吸附剂所吸附的溶质量，m∞为每克吸附剂所有活性中心都被分子占据时的吸附量，（ｍ∞-m）为吸附剂表面未被占据的活性中心数。所以： 吸附速度
解吸速度=
当达到平衡时：
，令b=
所以
（10-37） 式（10-37）称为Langnuir方程式。其图示曲线见图10-22所示。 当溶液的浓度C很高时，1+bC≈bC，m≈m∞，则处于饱和状态，不可能有更多的分子被吸附；当溶液的浓度很稀时，1+bC≈1，m≈m∞bC，被吸附的吸附量与溶液的浓度呈线形关系；而当浓度处于中间范围时，可用对Langnuir方程式取倒数或者倒乘以C的方法使之线形化。 二、吸附操作方式 吸附按操作方式的不同可分为两种。－种是分批式吸附，一般是在带有搅拌的反应罐中，将吸附剂依次加人到含有目标产物的溶液中进行搅拌混合，然后用离心的方法将产物逐个分离；另一种是连续式吸附，使含目标产物的溶液连续的通过一根或多根填充有吸附剂的柱，流出液用一个分部收集器收集，或者将一定流量和浓度的料液恒定地连续送入置有纯溶剂和定量的新鲜吸附剂的连续搅拌罐式反应器中（CSTR）经吸附后，以同样流量排出残液。 （一）分批（间歇）式吸附 在分批式吸附中，先将吸附剂加入到溶液中，吸附剂如果恰好能吸附所需的生物分子，那么待吸附完全后将其从溶液中分离出来，然后从吸附剂上抽提或淋冼下来；如果吸附的是杂质，则溶液经吸附剂处理后，再将其分离，能除去杂质。吸附通常在pH值大约为５或６的弱酸性溶液和低的电解质浓度下进行，因此，当溶液中有大量的盐存在时，最好先透析以除去盐。通常吸附剂和溶液之间的平衡很快就能达到，并且吸附剂的分离容易，离心只需几分钟，吸附剂就会沉降下来。 分批式吸附操作中常用的典型吸附剂有磷酸钙离子交换吸附剂、亲和吸附剂、疏水吸附剂和免疫吸附剂等。吸附完成后，用水洗脱以回收目标产物或者洗去杂质。吸附剂絮凝沉降或过滤的方法洗涤后应回收利用。在大规模生产中，必须采用高速搅拌以使吸附剂分散在洗脱液或洗涤液中，利于产物的回收以及吸附剂的回收利用。 在大规模生产中，间歇方法具有操作简便、处理量大、速度快的优点。除了可提纯有用目标产物外，还可以去除一些杂质。在酶的纯化中，应用较广。 分批吸附有两个基本的限制条件：吸附平衡和质量平衡。吸附平衡式如下：
（10-38） 而质量平衡式如下：
（10-39） 式中 Y、YF—— 分别为溶液中的最终浓度和进料浓度； q、qF ————分别为吸附剂上的最终浓度和进料浓度； H——为料液量； W——为吸附剂的量。 由上述两式可得：
（10-40） 上式即为线形的操作线方程。也可对上述吸附相平衡式和质量平衡式，使用图解法或解析法求解。如图10-23所示。
（二）连续式吸附 连续式吸附比较适用于产品的大规模分离，其吸附曲线如图10-24所示。 吸附开始前，搅拌罐内装有纯溶剂以及量为ｗ的新鲜吸附剂，当恒定浓度为YF的料液，以恒定的流速Ｈ连续的流人搅拌罐时，随着时间的变化吸附剂上溶质的浓度q不断地变化。而不断流出反应罐的溶液的浓度ｙ也随时间的变化而变化，由于反应罐内搅拌十分均匀，因此出口溶液的浓度与罐内浓度相等。整个吸附过程处于稳态条件，各种吸附曲线如图所示。当不发生吸附时，流出液的溶质的浓度也会随时间的变化而变化；如果吸附速率非常地快，那么出口液中溶质的浓度将迅速达到一个很低的值，然后缓慢增加；当吸附剂都为溶质饱和时，吸附速率较缓慢，反应罐出口中的吸附浓度与无吸附时呈相同的规律上升；在大多数的情况下，吸附过程介于缓慢吸附和快速吸附之间，吸附速率为一有限值。
三、 吸附设备 （一）固定床吸附 固定床（fixed bed）吸附是分离溶质所采用的最普遍也是最重要的操作形式之一，一般多采用吸附塔设备。所谓固定床即内部填充吸附剂颗粒的柱式吸附塔，含目标产物的料液连续的从吸附塔的一端流入，溶质被吸附剂吸附后，从吸附塔的另一端流出。从吸附塔入口开始，吸附剂吸附的吸附质浓度不断上升达到饱和，其饱和（最大）吸附浓度q0与入口料液浓度c0达到平衡，即q0=f（c0）。当吸附塔内溶质的吸附接近饱和时，溶质开始从塔中流出，出口浓度逐渐上升，到某一时刻其浓度突然急剧增大，此时称为吸附过程的穿透点。此时，应立即停止操作。如继续操作，最后达到入口料液的溶质浓度，即吸附达到完全饱和，输入的溶质全部流出吸附塔。吸附过程中吸附塔出口溶质浓度的变化曲线称为穿透曲线。达到穿透点所用的操作时间称为穿透时间。 当吸附操作达到穿透点时，继续进料不仅对吸附量的增加效果不大，而且由于出口溶质浓度急剧增大，造成目标产物的损失。故需在穿透点处立即停止吸附操作，转入吸附质洗脱和吸附剂再生操作。吸附剂再生后可重新使用。吸附过程中，吸附塔内某位置处溶质的吸附达到饱和时，该位置处的液相浓度和固相浓度不再改变。而在该位置的下游区域，由于尚未达到饱和吸附，液固相溶质浓度均低于饱和浓度。因此，吸附塔内液固两相均存在近似同步的浓度分布。 1．固定床吸附的理论基础 尽管固定床吸附设备简单，操作也相当直观，但要进行动力学分析却很复杂。因为固定床吸附过程是不稳定的，非线性的，而且，吸附剂粒子是非均相的。穿透曲线的预测是固定床吸附过程设计与操作的基础。－般固定床吸附操作多采用轴向扩散模型分析。轴向扩散模型是理想的平推流动中叠加一个轴向返混，返混程度用轴向扩散系数表示。 该模型的建立基于如下假设： （1）在与流体流动方向垂直的每一截面上，具有均匀的径向浓度； （2）在每一截面及流体流动方向上，流体速率和轴向扩散系数均为恒定值； （3）溶质浓度为流动距离的连续函数。 吸附过程可用四个基本的方程来描述。将固定床分成液相和固相两部分，由此可得第一个固定床吸附过程的连续性方程为：
（10-41） 式中 ε——液相的体积分率既床层空隙率；
——液体在柱内的空柱速度；
——轴向弥散系数；
——入口到微分元的距离即流体流动方向的距离。 其中，等式左边代表液相内溶质的积累量；等式右边第一项相当于流入与流出微元体溶质量之差，第二项是床层内的轴向弥散，最后一项是被吸附剂吸附的溶质量。轴向弥散主要是由湍流引起的，其值比分子扩散系数要大得多，因此在多数情况下可从上面的方程式中忽略掉。 第二个方程，即被吸附溶质的吸附速率可以表示为：
（10-42） 与连续搅拌罐中的吸附操作类似，吸附速率γ取决于吸附机理，可由溶质从液相主体传递到吸附剂表面的传递速率和在吸附剂颗粒内的反应限制。此时
（10-43） 式中
——单位床层体积内吸附速率，kg/m3·s；
——吸附速率常数；
——与吸附剂上溶质浓度相互平衡的溶液中溶质浓度。 最后一个关键公式是吸附等温线公式，例如Frenundlich公式：
（10-44） 这个公式给出了吸附质在吸附剂和溶液中浓度的平衡关系。 上述四个方程式所表述的固定床吸附过程的动力学是非线性的互相关联的，所以只能用数值计算的方法求解，求解过程非常复杂，而且常常不能很好地拟合实验数据。并且由于固定床吸附还存在有返混，对于不同的吸附剂和吸附质，其传质系数K相差很大，吸附速率不仅受控于液内传递速率，而且受控于吸附剂内的扩散速率，因此由上述联立方程组得出的数值解与实验结果常有较大的误差。吸附设备的设计和计算需凭借经验公式或实验数据进行计算。有两种较实用的计算方法：近似计算法和穿透曲线微分计算法。 （二）扩张床吸附 扩张床（Expanded bed）吸附是20世纪90年代首先由英国剑桥大学Chasae HA等人在研究流化床吸附的基础上发展起来的，能在床层膨松状态下实现平推流的扩张床吸附技术。应用该技术可直接从细胞破碎液中提取出较纯的目标产物，固液分离和吸附同时进行，相当于合并了除细胞碎片和初步纯化于一个操作中，减少了操作步骤，缩短了操作时间，节约了生产成本，被称为近几十年来出现的第一个新的单元操作，短短几年，EBA技术的应用研究迅速发展，见表10-4。不同学者都证明，EBA技术是一种可以直接从含颗粒料液中提取生物大分子的新技术。 表10-4 有代表性的EBA技术的研究 作 者 物 系 考察内容 结 果  H.A. Chase等 酵母匀浆IgG-酵母系统 EBA的设备，床层和介质颗粒的流体动力学性质，稳定扩张的实现条件，影响吸附效果的因素 设计制造可供EBA使用的吸附柱，通过对影响吸附效果的诸因素的考察，进行了过程优化  Maria-Regina Kula等 连续培养固定化杂交瘤细胞产生的抗体 床层流体动力学性质及纯化效果 床层高径比对轴向扩散系数有较大影响  Ann-Kristin Barnfield Frej等 大肠杆菌匀浆 吸附条件和过程放大 EBA技术可以放大，匀浆直接进料，收率约为95 %，产物可达电泳纯  1．扩张床吸附剂 开发适用的扩张床吸附基质是扩张床技术应用的关键之一。扩张床中使用的吸附剂必须易于流态化，并能实现稳定的分级。这一要求取决于介质的物性，其中包括颗粒密度及其分布、颗粒尺寸、床层空隙率等。吸附剂可形成稳定扩张床的吸附剂主要有两类。－类是磁性粒子，在外部磁场作用下，磁性粒子呈现稳定的膨胀状态。但磁性粒子扩张床的缺点是设备复杂，需要换热设备分散电磁场热，在反复洗脱过程中磁性粒子的稳定性较差。另一类广泛研究和应用的吸附剂有一定粒径或密度分布，在液体流速的分级作用下，大粒径或高密度吸附剂分布于床层底部附近，而小粒径或低密度吸附剂分布于床层的顶部，从而在床层内形成稳定的吸附剂分布。此类吸附剂主要有两种：一种是在一惰性的高密度核外包上一层亲水性的天然高分子材料，如琼脂糖—石英砂、琼脂糖—不锈钢、葡聚糖—硅胶、纤维素—二氧化钛等；另一种是直接用高密度的材料，如多孔玻璃、全氟聚合物等。合成共聚物作为基质在固定床层析中得到了广泛的应用。 市售交联琼脂糖凝胶类吸附剂存在一定粒径分布，可形成稳定的扩张床，但由于多糖凝胶与水溶液的密度差很小，形成扩张床的液体流速很低（10~30cm/h）。为此，Pharmacia生物技术公司等开发了扩张床专用的高密度吸附剂，如多孔玻璃和STREAMLINETM（交联琼脂糖凝胶内包埋晶体石英，以提高吸附剂密度）等。高密度吸附剂的膨胀床流速约100~300cm/h。在较高流速下进行扩张床吸附操作，使流速远高于菌体细胞或其碎片的终端速率，有利于微粒子透过扩张床。 Mc Creath等以全氟碳化物为增重内核，交联覆盖聚乙烯醇，得到一种无孔基质，密度为2.2ｇ/ｍＬ，粒径为50～80μｍ，表现出快速的吸附动力学特征，因为无孔，洗脱、清洗更为简单、迅速，但基质的比表面积偏低(6～8ｍ2/ｇ)，导致吸附容量较低。Pai等制备出一种超大孔结构的交联纤维素硬基质，孔半径达3μｍ，基质在很大的流速范围内维持十分低的等理论板高度(HELP)和较高的吸附容量，同样可以实现高流速下的扩张床方式洗脱。Gordon等使用共混沉积法包埋超细TiO2颗粒，制备出另一类纤维素基质，其各方面的性能与STREAMLINETM相当，但粒径较大(125～600μｍ)，操作流速增大了许多。 2．扩张床的吸附过程 液固流化床的机理已广泛研究过，但针对扩张床的研究还比较少。扩张床是一种广义流化床，稳定扩张时通过床层的流体流速应在最小流态化速度和夹带(自由沉降)速度之间。　　介质颗粒的直径较小，一般其雷诺数Rep＜20所以

（10-45） 夹带(自由沉降)速度由Stokes公式给出
（10-46） 式中
——最小流化态速度；
——夹带(自由沉降)速度；
——层析介质直径；
——流体粘度；
——颗粒密度；
——流体密度。 由Stokes公式计算出的理论值和实验值相差较大，特别是流体粘度较大时，实验值明显大于理论值，这与Stokes公式推导条件有关，所以使用时应对其进行修正或选用其他公式确定
。 某一高度空隙率ε和表观速率uo的关系，符合Richardson-Zaki公式给出
（10-47） 式中
——Richardson-Zaki系数。 由于扩张床内部的流动特性与固定床接近，二者都是平推流式吸附装置，所以扩张床吸 附的数学模型可用固定床的有关模型。 3．扩张床的设备结构 扩张床的设备包括充填介质的柱子、在线检测装置和收集器、以及转子流量计、恒流泵、床层高度调节器和上下两个速率分布器。其中转子流量计用来确定浑浊液进料时床层上界面的位置，并调节操作过程中变化的床层膨松程度，保证捕集效率，恒流泵用于不同操作阶段不同方向上的进料；床层高度调节器的位置可自由改变；速率分布器对床层内流体的流动影响较大，它应使料液中固体颗粒顺利通过，又能有效地截留较小的介质颗粒，除此之外，上端速率分布器还应易于调节位置，下端速率分布器要保证床层中实现平推流。 扩张床与固定床的区别在于：扩张床的床层上部安装有可调节床层高度的调节器，当液体（料液或洗脱液等）从床底以高于吸附剂最小流化速率的流速输入时，吸附剂床层产生膨胀，高度调节器上升，如图10-25所示。而固定床吸附的料液是从柱上部的液体分布器流经层析介质层，从柱的下部流出并分部收集，流体在介质层中基本上呈平推流，返混小，柱效率高，但固定床无法处理含颗粒的料液，因为它会堵塞床层，造成压力降增大而最终使操作无法进行，所以在固定床吸附前需先进行培养即预处理和固液分离。扩张床状态下床层高度一般为固定床状态的２～３倍，床层空隙率高，允许菌体细胞或细胞碎片自由通过。因此，扩张床吸附操作可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标产物。从而可节省离心或过滤等预处理过程，提高目标产物收率，降低分离纯化过程成本。
扩张床吸附综合了固定床和流化床吸附的优点，它使介质颗粒按自身的物理性质相对稳定地处在床层中的一定层次上实现稳定分级，而流体保持以平推流的形式流过床层，同时介质颗粒间有较大的空隙，使料液中的固体颗粒能顺利通过床层。扩张床吸附技术可以直接从含颗粒的料液中提取生物大分子物质，将固液分离和吸附过程结合起来。 4．扩张床的操作 扩张床的吸附操作与固定床的操作有所不同，一般操作步骤见图10-26所示。
首先确定适宜的膨胀度，用缓冲液膨胀床层，并使吸附剂颗粒在流动的液体中分级。－般认为，液速为100~300cm/h，使床层膨胀到固定床高度两倍时，吸附性能较好。然后利用多通道恒流泵，将平衡液切换成原料液，根据流量计中转子的位置和床层高度的关系调节流速，保持恒定的膨胀度并进行吸附，通过对流出液中目标产物的检测和分析，确定吸附终点。在膨胀床中，用具有一定黏度的缓冲液冲洗吸附剂，既冲走滞留在柱内的细胞或细胞碎片，又可洗去弱吸附的杂质，直至流出液中看不到固体杂质后，改用固定床操作。将配制好的洗脱剂用恒流泵从柱上部导入，下部流出，分段收集，并分析检测目标产物的活性峰位置和最大活性峰浓度。直接从浑浊液中吸附分离、纯化目标产物如蛋白质时，存在有非特异性吸附，虽经洗涤、洗脱等步骤，有些杂质可能还难以除净。为提高介质的吸附容量，必须进行清洗使介质再生，－股在使床层膨胀到堆积高度５倍左右时的清冼液的流速下，经过３小时的清洗，可以达到再生的目的。 5．扩张床吸附技术的应用和前景展望　　扩张床吸附技术有着广泛的工业应用前景，一些研究者已对此进行放大。一些主要的应用实例列于表10-5。所有的研究都表明，扩张床吸附技术将固液分离、吸附、浓缩集成在一起，大大简化了操作步骤，目标蛋白质的回收率大幅度提高。但是该技术中还有一些问题需要进一步解决。　　(1)深入研究多孔介质在扩张床中的运动，这对扩张床的设计、选用、操作、放大有直接影响。　　(2) 制造在稳定性、特异性和吸附容量方面都适于扩张床操作的介质。细胞破碎液中含大量杂质，影响吸附效果。吸附容量过大会使层析介质在吸附阶段有效密度变化较大，给床层扩张度控制带来困难。　　(3) 改进清洗过程。清洗几乎占整个操作时间的一半，而且所用清洗液条件比较苛刻，易损坏层析介质。 (三) 流化床吸附 流化床吸附操作与扩张床的床层膨胀状态不同，流化床（Fluidized bed）内吸附剂粒子呈流化状态。利用流化床的吸附过程可间歇或连续操作，图10-27为间歇流化床吸附操作示意图。吸附操作时料液从床底以较高的流速循环输入，使固相产生流化，同时料液中的溶质在固相上发生吸附或离子交换作用。连续操作中吸附剂粒子从床上方输入，从床底排出；料液在出口仅少量排出，大部分循环流回流化床，以提高吸附效率。与扩张床一样，流化床的主要优点是压降小，可处理高黏度或含固体微粒的粗料液。流化床处理含菌体细胞或细胞碎片的粗料液时，操作方式同扩张床类同。与扩张床不同的是，流化床不需特殊的吸附剂，设备结构设计也比扩张床容易，操作简便。与后述的移动床相比，流化床中固相的连续输入和排出方便，即流化床的连续化操作较容易．流化床的缺点是床内固相与液相的返混剧烈，特别是高径比较小的流化床。所以，流化床的吸附剂利用效率远低于固定床和扩张床。 表10-5 扩张床吸附技术应用实例 对象 吸附产物 介质 进料缓冲液 进料线速度，cm.h－1  酵母细胞匀浆 磷酸果糖激酶 Cibacron BlueSepharose FF 0.05 mol/L PBS0.5mol/L EDTA pH7.2 0.05mol/L PBS0.5mol/L EDTA pH7.2  酵母-IgG体系 IgG Protein ASepharose FF 0.1mol/LTris-HCl pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl pH7.5  酵母细胞匀浆 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 STREAMLINEDEAE 0.05 mol/L PBS pH6.0 0.05mol/L PBS pH6.0  酵母细胞匀浆 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶苹果酸脱氢酶 Procion RH-E7B-PVA-FEP Procion YH-E3G-PVA-FEP 0.05mol/LTris-HCl pH8.00.05 mol/L PBS pH7.6 0.05mol/L Tris-HCl pH8.00.05mol/L PBS pH7.6  大肠杆菌匀浆 重组Annexin V STREAMLINE-DEAE 0.03 mol/L醋酸铵溶液pH5.5 0.03 mol/L 醋酸铵溶液pH5.5  大肠杆菌发酵液 重组ZZ-M5 STREAMLINE-DEAE 0.05 mol/L氯化钠溶液 0.05 mol/L氯化钠溶液  
（四）移动床和模拟移动床吸附 如果吸附操作中固相可连续输入和排出吸附塔，与料液形成逆流接触流动，则可实现连续稳态的吸附操作。这种操作法称为移动床（Moving bed）操作。图10-28为包括吸附剂再生过程在内的连续循环移动床操作示意图。因为稳态操作条件下移动床吸附操作中溶质在液固两相中的浓度分布不随时间改变，设备和过程的设计与气体吸收塔或液－液萃取塔基本相同。但在实际操作中，最大的问题是吸附剂的磨损和如何通畅地排出固体粒子。为防止固相出口的堵塞，可采用床层振动或用球形旋转阀等特殊装置排出固相。
上述移动床易发生堵塞，固相的移动操作有一定的难度。因此，固相本身不移动，而移动切换液相（包括料液和洗脱液）的入口和出口位置，如同移动固相一样，产生与移动床相同的效果，这就是模拟移动床（Simulated moving bed）。
图10-29为移动床和模拟移动床吸附操作示意图，真正的移动床操作是料液从床层中部连续输入，固相自下向上移动。被吸附（或吸附作用较强）的溶质和不被吸附或吸附作用较弱的溶质从不同的排出口连续排出。溶质的排出口以上部分为吸附剂洗脱回收和吸附剂再生段。模拟移动床操作时，液相的入口和出口分别向下移动了一个床位，相当于液相的入、出口不变，而固相向上移动了一个床位的距离，形成液固逆流接触操作。由于固相本身不移动而通过切换液相的出、入口而产生移动床的分离效果，故称该操作法为模拟移动床。模拟移动床在化学工业的应用实例有混二甲苯的分离，在生物产物方面，有葡萄糖和果糖的连续分离，图10-30为该分离过程示意图。
李勃等采用模拟移动床色谱(SMBC)系统分离纯化紫杉醇。SMBC把模拟移动床和色谱技术结合起来，与蒸馏、萃取、重结晶等传统工艺相比，分离能力更强，尤其适用于沸点相近，分子量较大，难分离物系的分离。SMBC以色谱为操作单元，将多根色谱柱用多位阀和不锈钢管连接起来，每根色谱柱前后均设有入口和出口，通过多位阀沿着流动相流动方向依次定期地不断切换，改变样品入口及产品出口位置，从而模拟出固定相的逆流流动，实现两种组分的连续分离。SMBC的分离由吸附段与一精段完成。通常的SMBC除这两段外，还包括解析段与二精段，称为四带。 第三节 层析原理与设备 层析技术是利用混合物中各种组分的物理化学性质（分子的形状和大小、分子的极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个相是固定的，称为固定相；另一个相是流动的，称为流动相。当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的目的。 层析技术操作简便，设备要求简单，作为一种高效的分离技术，过去主要应用在实验室中，近年来规模逐渐放大并应用于工业生产。也可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。 随着DNA重组技术的发展，新的生物产品不断出现，这些产品的纯化，对层析技术提出了更高的要求，原有的用于分离无机离子和小分子量的有机物质的层析介质已不能满足人们的要求。而具有高亲水性、足够的多孔性以及足够的强度的介质在大生产中得到了应用。 此外，还应具有良好的稳定性和能引入各种功能基团如离子交换基、憎水烃基、特殊的生物配位体或抗体等以适应不同技术的要求。 层析技术按不同的方法可分为几种不同的类型。如按流动相的状态不同可分为液相色谱（liquid chromatography）和气相色谱（gas chromatography）等；按固定相的使用形式不同可分为柱层析、纸层析、薄层层析等；按分离机制不同可分为吸附层析、离子交换层析、分配层析、疏水作用层析、凝胶层析和亲和层析等。本节主要就凝胶层析和亲和层析的原理和设备进行叙述。 一、凝胶层析 凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是利用凝胶粒子（通常称为凝胶过滤介质）为固定相，是根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。凝胶层析又叫分子筛层析，是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合物溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。 凝胶过滤有设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点。所以，此法除了常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可用于测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面。 （一）基本原理 如图10-31所示，凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透。 图10-32为用凝胶过滤层析技术分离两种目标产物的示意图。将含有两种不同分子量的混合样品小心自柱顶端加入，接着连续以水或其他溶液进行洗脱，并用分部收集器收集洗脱液（图10-32a），测定每管物质浓度，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵坐标作图，即得洗脱曲线（图10-32b）。

任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0～100％之间，其被排阻的程度可以用分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小依赖于凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）。即
（10-48） 在限定的层析条件下，Vt 和Vo都为恒定值，而Ve值却是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子质量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续发生，其最终结果是分子质量大的物质先从柱中流出，分子质量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子质量不同的物质相互筛分开了。其筛分效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响是显而易见的，但更为直接的影响是Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，乃至等于1或等于零（即使样品中各组分的分子质量相差很大），则分离效果很差，或根本不能分开。 Kav值既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白质分子质量的重要依据。从公式（10-48）看出，只要测出床体积Vt和外水体积Vo以及洗脱体积Ve，即可计算出Kav。而凝胶床总体积Vt可用二种方法得到： （1）计算法，即根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式表示：
（10-49） 式中
——层析柱半径；
——凝胶床高度；
——圆周率。 在计算凝胶床总体积的过程中，必须注意一下两点：①如果内径不均匀，必须分段测量；②在层析过程中，操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。 （2）测量法，由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体积Vo、内水体积Vi和凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即：
（10-50） 因Vg相比Vt数值很小，可忽略不计，则
（10-51） 而式中的
和
可以通过实验测得：当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布时不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积Vo。即Ve＝Vo（Kav＝0）。然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve＝Vt＝Vo＋Vi（Kav＝1）。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则有一部分能进入凝胶网孔，故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之间（Kav在0～1之间）。 通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。其理由是：该物质分子质量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测在200nm或260nm时的洗脱体积Vo。但是，在测定激酶等蛋白质分子质量时，不宜采用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积Vi的物质，可选用硫酸铵或者其他与凝胶无吸附力的小分子物质。 （二）凝胶的分类与特性 1．凝胶的分类 凝胶的种类很多，按来源可分为人工合成凝胶和天然凝胶。其共同特点是内部具有微细的多孔网状结构，其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。一般，我们把它分为： （1）聚丙烯酰胺凝胶 它是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺（CH2＝CH－CONH2）与甲叉双丙烯酰胺（CH2＝CH－CONH－CH2－NHCO－CH＝CH2）共聚而成。商品名称为生物胶-P(Bio-GelP)。聚丙烯酰胺凝胶是完全惰性的，不会与一些杂蛋白发生非特殊性吸附。适合于各种蛋白质、核苷及核苷酸等的分离纯化。但也有缺点：遇强酸时酰胺键会水解，一般在pH2～11范围内使用。 （2）聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 其商品名为Suphacryl，是由甲叉双丙烯酰胺交联丙烯葡聚糖形成的球形凝胶颗粒，其特点是反压很低，机械性能好，分离速度快，分辨率高，理化稳定性好，在SDS、6mol/L盐酸胍及8mol/L尿素中均可使用。具体型号有S1000HR、S-200HR、S-300HR、S-400HR、S-500HR、S-1000SF等六种。可用于分离相对分子质量为1×103～1×108的蛋白质，也可用于分离多糖和核酸。 （3）聚乙烯醇凝胶 其商品名为Toyopearl，是以交联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质。是由美国R＆H公司与日本曹达公司的联合企业TosoHaas开发研制而成，适用于HPLC的介质Fractogel TSK是该系列的类似产品。 Toyopearl为多孔的三维网状结构，大分子链上含有丰富的羟基，它不但使骨架为高亲水性，还可利用羟基进行化学改性而得到含有多种功能基团的亲和吸附剂。该系列凝胶与生物大分子有较好的相容性，作为固定化生物催化剂载体也已得到广泛应用。 （4）琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂糖，可制成不带电荷的琼脂糖，用琼脂糖制成颗粒内径不等的多种型号层析用琼脂糖凝胶。商品名为Sepharose。Sepharose的孔径大，机械强度好，层析时流速较快，但只能分离相对分子量较大的分子。 今年来，Pharmacia公司推出商品名为Superose的琼脂糖凝胶，主要由含琼脂糖6％的Superose6和含琼脂糖12％的Superose12及其衍生物组成。Superose刚性特别好，理化稳定性高，在高粘度液体下能保持较好的流速，适合于糖类、核酸、病毒和包含体蛋白在促溶剂中的纯化。 （5）葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶由相对分子质量为4×104～2×105的葡聚糖交联聚合而成。由Pharmacia公司生产的商品名为Sephadex的葡聚糖凝胶，具有良好的化学稳定性等优点，为最常用的凝胶之一。Sephadex耐碱，在0.01mol/L盐酸中放置半年不受影响，故广泛用于各种物质的分离纯化。Sephadex有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等多种型号以及粗、中、细、超细等多种规格。G后面的数字表示胶粒孔径，数字越大，孔径就越大，越适合于大分子的分离。但颗粒的机械强度却随孔径的增大而降低，较高的操作压力会使G100、G150、G200等颗粒变形而使洗脱液的流速下降。故采用上述型号的Sephadex进行层析时，流速一般比较慢，时间也比较长。同型号的Sephadex，颗粒越细，在同样柱长的柱子中分辨力越好，但流速也越慢。 （6）Superdex Pharmacia公司提供的新型凝胶过滤介质，是将葡聚糖共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上制成的球形凝胶珠，流速快、反压低、非特异性吸附很低，因而样品回收率高，可以说是目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质。理化稳定性高，在0.1mol/LHCl及0.1mol/LnaOH中40℃保温400 h分辨率保持不变，在1％SDS、8mol/L尿素及6mol/L盐酸胍中均能保持良好的色谱性能，有多种型号可供选择，适合于生物大分子的精细纯化。 2．凝胶特性参数 表征凝胶特性的参数主要有下列几项： （1）排阻极限（exclusion limit）：凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶颗粒内部的最小分子的相对分子质量。不同的凝胶过滤介质品牌具有不同的排阻极限。例如，Sephadex G50的排阻极限是30KD，即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶颗粒中，其洗脱体积为Vo。 （2）分级范围（fractionation range）：即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50的分级范围为1.5～30KD。 （3）溶胀率：某些类型的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数称为溶胀率，即： 溶胀率＝100％×（溶胀处理平衡后重量－干燥重量）/干燥重量 Sephadex G50的溶胀率为500％±30％。Sephadex G系列中的凝胶型号与此溶胀率有关。 （4）凝胶粒径：凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米来表示。软凝胶粒径较大，一般为50～150μm（100～200目），硬凝胶粒径较小，一般为5～50μm。例如，Sepharose 和Sephadex 凝胶粒径分布为45～165μm，而Superose 和TSK Toyopearl HW系列可小到20～40μm，甚至6～10μm。 （5）床体积（bed volume）：即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G50的床体积为9～11cm3/g干胶。凝胶的床体积可用于估算装满一定体积的层析柱所需的干燥凝胶量。 （6）空隙体积（void volume）：指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即Vo值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000KD的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。 对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般都会给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。 （四）凝胶层析操作 1．装柱 层析柱必须粗细均匀，一般柱内径为1～4 cm，柱长10～150 cm。 有些凝胶是干燥颗粒，使用前须吸胀，有些是悬浮颗粒，可直接用来装柱。 装柱时柱底先放置一层玻璃纤维或棉花等，在柱内先充满洗脱剂(一般用水或缓冲液作洗脱剂)，然后在搅拌下缓缓而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，使之自然沉降，直至达到所需的高度为止。要注意不能有气泡或裂纹存在。 凝胶沉集后，将多余的溶剂放出，使液面刚好与凝胶表面一致。然后在凝胶表面放一片滤纸或薄尼龙布，以防使用时凝胶被冲起。再通过2～3倍凝胶床体积的溶剂使柱稳定。 新装好的柱要检查其是否均匀，可用肉眼对光检查，也可用大分子的有色物质，如：铁蛋白、印度黑墨水、蓝色葡聚糖-2000等的溶液过柱，看色带是否均匀、平整地下移。 要注意在柱装好后，任何时间都不能使液面低于凝胶表面，否则会影响分离效果。 2．加样 加样是凝胶层析中一个重要步骤。要使样品均匀地进入凝胶床，要在溶剂表面恰好与凝胶表面相平时加进样品。当样品进入凝胶床，样品液面到达凝胶床表面时，加入洗脱液。
样品溶液的浓度大些为好，但粘度不能过大，以免影响分离效果。而加样的体积则与被分离物在层析柱的分配系数Kav或洗脱体积Ve有关。假设A、B两个被分离物在层析柱中的洗脱体积分别为VeA、VeB，分配系数分别为Kav′、Kav〃。A、B两物洗脱体积之差称为分离体积，以Vs表示。则
（10-52） 理论上当样品体积Vp正好与Vs相等时，A、B两种物质刚好分开。但从图10-33看，由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大。图中两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部分分开。因此，当Vp等于或大于Vs时，A、B两种物质就不能完全分开（见图10-33）；而当Vp小于Vs时，A、B两种物质就能分开。 根据：
（10-53） 则
（10-54） 这也就是说分离效果是与加样体积、被分离样品在层析柱中的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床的体积有关。所以，为了提高分离效果，在一定范围内，加样体积越小越好。例如在蛋白质溶液中脱盐时，因加样过大会产生分离不完全的现象。而加样量减少时，则产生良好的分离效果。 3．洗脱 凝胶层析用的所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则。 并且洗脱用的液体应和凝胶溶胀时以及凝胶柱平衡时所用的液体完全相同，否则会引起凝胶体积的变化而影响分离效果。 洗脱时的流速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就很难测出。控制流速的最好装置是恒流泵，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。 一般来说，洗脱流速慢，分离效果就好，但是如果太慢也会因扩散加剧而影响分离效果。 加样后，经洗脱、收集的每管洗脱液，可选用适当的方法进行定性和定量测定。 （五）凝胶柱的再生和保存 1．再生 仅使用过一次的凝胶柱，通常进行重新平衡后即可使用；但如果使用次数过多后，由于凝胶床体积变小、流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，如欲重复使用，就须进行再生处理，其方法是：先用水进行逆向冲洗，再用缓冲液进行平衡。平衡完毕后，即可重复使用；另一种方法是：把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行处理，处理后重新装柱即可再次使用。 2．保存 使用过的凝胶柱，若要短时间保存，则需进行反复洗涤除去蛋白质等杂质，并加入适当的防霉剂，如醋酸汞、三氯乙醇等；若要长时间保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。其方法：将凝胶用低浓度的酸或碱溶液经短时间浸泡后，再用水反复洗涤除去杂质、过滤抽干，浸泡在50％乙醇溶液中进行脱水。然后，再过滤抽干，并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液中。如此依次提高乙醇浓度进行反复处理，待乙醇浓度增加至95％时，将凝胶抽干，置于60℃烘箱内烘干，可装瓶保存。在此过程中，溶胀的凝胶不能直接用高温烘烤 ，否则会粘结成块。交联度越小的葡聚糖凝胶，越难以脱水。一般可用将其较长时间浸泡在60％～70％乙醇溶液中的方法来达到这一目的。 （六）凝胶层析设备 凝胶层析设备种类比较多，不同种类的层析设备分离原理大致一样，可用于不同生物物质的分离分析。这里介绍以下几种： 1．柱层析装置 一般的柱层析装置就可以用于凝胶层析，如图10-34所示。
主要由进样系统（一般为恒压泵）、层析柱、收集器和检测系统组成。选定的凝胶作为固定相装入层析柱，样品溶液由进样系统进入层析柱，根据分子大小的不同由大到小依次流出凝胶柱。然后依次分布收集洗脱液，即得到样品混合物中每单一组份的化合物。凝胶柱可用于生物大分子的纯化、分子量的测定等。
比较正规的层析柱如图10-35，柱的两端均密闭，为了使用方便起见，柱两端的形式是一样的。滤板用400目的尼龙布或聚四氟乙烯布，样品和洗脱液均用微量泵传送，达样可使底部的死体积减少到最小值。除一般的下层层析外，也可用于上向或循环层析。其中2、3柱还具有双层管，管间可通温水保温，进出口处可用尼龙管伸入柱内，连接一个附有滤板的漏斗状托盘，以减少底部死体积，托盘周围用橡皮圈与柱壁密封。图10-36为一种反转式层析柱。两根支柱支撑在两法兰之间，在支柱的中部装有转轴，支撑在支架轴承中，这样，分离柱就可以上下反转，工作时可用定位螺固定。这种结构可避免柱中凝胶压紧。
2．薄层凝胶层析装置 凝胶排阻层析既可以采用柱层析的装置，也可用薄层层析的装置。这种操作方式叫做薄层凝胶排阻层析（thin layer gel exclusion chromatography）。其操作过程和薄层层析相似。凝胶膨化后铺在薄层层析的玻璃板上，厚约1～2mm。薄板上的凝胶自始至终不能变干，层析常用下行方式。当薄板与平面成10～20°角时，流速控制在6cm/h为宜。整个装置如图10-37所示。
薄层凝胶排阻层析与前面所讨论的薄层层析相比，虽有相似之处，但也有显著的不同，主要有如下几个方面： 薄层由凝胶构成，即由凝胶构成固定相，并且不加粘合剂； 自始至终不能让凝胶干燥； 必须平衡12小时以上，以便使固定相和流动相之间的体积比标准化。 这一类装置可用于亲水性样品物质的分离分析，如蛋白质、多肽和核酸等。 3．AM90-1型凝胶层析仪 该系统系全自动凝胶层析仪，由蠕动泵、不中断进样阀、层析柱、紫外检测仪、自动电脑积分记录仪组成，并能与收集器配合，进行定峰定时、定滴收集。主要用于：（1）各类生物大分子的分离；（2）生物大分子的分子量测定及其定性；（3）已知生物大分子的定量分析； （4）氨基酸、无机盐的分离分析。 该凝胶层析仪的检测波长为254nm和280nm，洗脱速度适用范围为1～600ml/h，吸收峰分辨率为0.5～5.5％，适用于连续操作。此外，该层析仪还可用于亲和层析和离子交换层析。如图10-38所示。 图10-39为该装置的凝胶层析原理的示意图，样品由进样阀进入层析柱，小分子物质能进入凝胶颗粒的内部，而大分子物质却被排阻在外部，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。柱后面连有的检测仪能检测出目标产物的出峰时间，并由电脑记录，从而可实现目标产物的定时收集。
图 10-38 AM90-1型凝胶层析仪
4. 封闭连续柱层析装置 柱层析是复杂组分分离提纯的非常有效的手段。使用通常的柱层析装置，溶剂挥发扩散、环境污染。而封闭连续柱层析装置洗脱液处于基本封闭的循环利用状态，易于实现自动控制。此外，还将洗脱和产品浓缩结晶两道工序结合起来，缩短了生产周期，洗脱液的用量可显著减少。该装置示意图如图10-40所示，主要有集热式磁力搅拌器、层析柱、回流冷凝管和真空负压装置组成。集热式磁力搅拌器由DF—101B集热式恒温磁力搅拌器改装而成，内装液体石蜡，工作温度用电接点温度计自动控制。层析柱由层析主体柱，洗脱液蒸汽通道管，洗脱液流出控制管组成，工作时，以干法或湿法装柱，硅胶层上部装有适量拌有待分离样品的硅胶，最上面铺一层脱脂棉，并注意略低于蒸汽通道出口。流出控制管有3个作用，第一，　通过旋转活塞5和6以控制溶液速度从而控制层析速度；第二，通过取样孔7取样检测，　实现对分离效果的监控；第三，必要时可用一个能与活塞4的母磨口磨合的分液漏斗在不改变体系负压的情况下补充洗脱液。洗脱液蒸汽在回流冷凝管里冷凝回流，由一上端接一与之磨合的弯头经耐负压橡皮管与射流真空泵相连。冷凝回流效果关系重大，因此不能使用温度较高的水泵循环水，在良好的冷凝条件下，蒸汽泄漏极少，分别一次加液就能完成杂质淋洗或产品洗脱的任务。真空负压装置由射流泵，水泵及循环水箱组合而成。水泵抽取循环水箱中的水加压注入射流泵，使柱系统形成负压，射流泵流出的水复流入循环水箱。通过控制水流速度来控制系统真空度，进而使洗脱液在规定的温度下沸腾。
与普通柱层析比较，封闭连续柱层析有其自己的特点和优势：能阻止或缓解不稳定的物质的分解或变性；有利于稳定层析条件，提高柱子的分离效能；减轻了产品浓缩结晶和溶剂蒸馏回收的工作量，缩短了产品制备周期；封闭连续柱层析是在封闭状态下工作，溶媒泄漏很少，污染危害大大减轻。 较大规模的凝胶层析装置如图10-41所示。
（七）应用 1．脱盐 生物高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。收集液的蛋白质含量可用280nm的紫外光吸收法检测，也可用考马式亮蓝染色法测定。 2．分离提纯 凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原质（pyrogen）有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的热原质以制备注射用水。 此外，凝胶层析还可用于医药产业中低分子生物制剂中抗原性杂质的去除。例如，青霉素的致敏作用一般认为是产品中存在的一些高分子杂质所致，如青霉素聚合物和青霉素降解产物青霉烯酸与蛋白质相结合形成的青霉噻唑蛋白，它们都是具有强烈致敏性的全抗原。利用Sephadex G25凝胶柱处理青霉素溶液可去除这类高分子杂质。 3．测定高分子物质的分子量 用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。不过，凝胶层析法仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。 4．高分子溶液的浓缩 通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。 二、亲和层析过程与设备 （一）概述 在纯化蛋白质和核酸等大分子物质时，一般是依据各种大分子物质之间理化特性的差异性来达到分离纯化的目的。由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度较高的物质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终的收率却很低。随着生化技术的发展，人们找到了一种有效的分离方法，即利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术，这种方法我们称之为亲和层析法（affinity chromatography）。虽然在20世纪60年代以前就有人应用此法，但是由于固相载体的缺乏，使之发展缓慢。1967年Axen等发表了用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成功地制备了固定化酶。不久，这一固定化方法便在亲和层析中得到采用，从而解决了固相载体的制备问题，这就使酶类等大分子物质的纯化过程变得比较简单、迅速和高效。这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐步得到了广泛的应用。 （二）基本原理 亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力，如图10-42所示。
正如在酶与底物的反应中，特异性的底物S与一定的酶结合，产生复合物E-S一样。在亲和层析中是特异性的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体呈固相存在；而后者进行反应时，底物大部分呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L以共价键的方式固化到含有活化基团基质M上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把固相载体装入小层析柱后，让欲分离的样品液通过该柱。这时，样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰；然后，恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第二个层析峰。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分开。使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。 以上介绍的亲和层析法也称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力；而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料、以及氨基酸等），它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。因为将琼脂糖基质装入上述的层析柱中，不论加入何种样品液，由于柱体积小、上样量大、洗脱流速快等原因，所以在层析过程中都只能得到一个层析峰。此外，本法被广泛用于分离纯化蛋白质、核酸和激素等物质。该法的缺点是，要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体之后方可进行。 （三）亲和吸附介质的制备 亲和吸附作用在特定配基的存在下实现，因此，除少数特殊情况外，均需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。这里所说的少数特殊情况是指外源凝集素的亲和纯化。如上节所述，植物凝集素与糖具有亲和结合作用，因此，天然琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶可直接用做外源凝集素的亲和吸附介质。例如，Sephadex凝胶是葡聚糖通过α-1.6结合与交联制备的葡聚糖凝胶，可亲和吸附伴刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）；Sepharose凝胶中含有半乳糖，在Ca2+离子存在下可亲和吸附蛇毒凝集素。在利用亲和层析技术纯化目标产物时，商品化的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的需要，有必要自制亲和吸附介质。因此，本小节从讨论亲和配基的性质入手，进而介绍亲和配基的固定化方法。 1．亲和配基 （1）酶的抑制剂 一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白（ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约为4×104L/mol（25℃）。 （2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。但是单抗或者利用动物免疫实验从动物腹水中获得，或者通过动物细胞培养获得，是一种昂贵的生物活性物质，很难大规模使用。不过，对于产量较小的基因工程药物如组织纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA）、干扰素（interferon）等的分离纯化，单抗免疫亲和层析法的确是非常有效的纯化手段。利用多克隆抗体为配基时，只要选择适当的洗脱条件，也可进行目标产物的高度纯化。 （3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblin G，IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）。每个A蛋白分子上含有5个Fc片断结合部位。除IgG外，A蛋白与人IgM和人IgA也具有亲和结合作用，但结合力较弱。 A蛋白不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。此外，A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。 （4）凝集素 凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不用的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，con A)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的亲和结合作用较强。 Con A可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子以及全细胞、细胞膜片断和细胞表面受体蛋白的亲和配基。pH＜5.6时con A为二聚体，分子量为52KD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102KD，每个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。因此，在利用con A为配基的亲和层析操作中，操作条件（pH，溶液组成）应当适宜，不能使con A的亚基发生解离。 （5）辅酶和磷酸酰苷 各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadenine dinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NAD phosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。 （6）过渡金属离子 Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electron donor atom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2。 过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）或三羧甲基乙二胺[tris(carboxymethyl)-ethylene diamine，TEP]形成鳌合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。这种利用金属离子为配基的亲和层析一般称为金属螯合层析（Metalchelate chromatography）或固定化金属离子亲和层析（Immobilized metal affinity chromatography，IMAC）。廖晓全等用金属铜螯合的亲和层析技术分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶（hnMn-SOD），取得了比较满意的效果。史彤等用金属鳌合层析技术对重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位纯化，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为单一条带。 如图10-43为利用IDA鳌合Cu2+及其与蛋白质相互作用的示意图。IDA鳌合的Cu2+在加入蛋白质之前与溶剂分子（如水、咪唑）配位，加入蛋白质后，蛋白质置换溶剂分子，与金属离子形成配位键而被吸附。吸附蛋白质的洗脱可利用酸或Zn2+溶液（H+或Zn2+和固定化金属离子竞争，与蛋白质发生结合作用），或咪唑溶液（咪唑与固定化金属离子结合，置换蛋白质），也可用鳌合剂（如EDTA）将金属离子和蛋白质一起洗脱下来。由于大多数蛋白质都含有His等残基，故IMAC用途广泛，可根据蛋白质之间His等残基的含量和分布的差别引起的结合作用的强弱不同进行蛋白质的层析分离。
（7）组氨酸 在各种氨基酸中，组氨酸（如图10-44）的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。
（8）肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5～30KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低 2．亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面（孔内）即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体（carrier，support）。因此，亲和吸附介质又称为亲和载体（affinity carrier，affinity support）。作为载体的固体粒子应该满足以下要求： 有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。 亲和吸附载体已有商品出售，如著名的Pharmacia公司等能生产商品化的亲和吸附载体及其对应的目标产物，还有许多商品化的活化载体，供各种配基的固定化。 但是商品化的亲和吸附介质种类有限，在实际应用中，特别是在科研工作中往往需要在实验室内利用凝胶过滤介质合成所需的亲和吸附介质。合成的方法很多，可根据凝胶和配基的反应活性基团的不同加以适当选择。几种常用的方法如下： （1）溴化腈活化法 用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载体的活化在碱性（pH＞10）条件下数分钟即可完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件下进行，一般使用碳酸盐缓冲液。反应机理为：
CNBr为剧毒药品，上述操作需在通风橱中进行。CNBr活化法适用于RNH2型配基的修饰，如蛋白质类配基。 （2）环氧基活化法 可用于多糖凝胶和表面为氨基的载体的活化，固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基。常用的活化试剂为1，4丁二醇-二缩水甘油醚（简称BGE）和环氧氯丙烷。活化过程需在强碱条件下进行，以活化羟基为例，反应机理为：
引入活性基团环氧基后，可采用下述直接法或间接法固定配基。 （A）直接固定化法 在碱性条件下环氧基直接与配基（R-OH，R-NH2，R-SH）反应：
此反应速度很慢，所需固定化时间较长（24h以上）。利用改良的间接法可提高反应速度和配基固定化率。 （B）间接固定化法 配基的间接固定化法很多，下面用反应式介绍几种常用的间接固定化法。 氧化法
其中NaBH4和NaCNBH3为还原剂，还原甲酰基与氨基反应形成的不稳定Schiff碱（Schiff base），即将－CH=NR转化为－CH2NHR。 （b）碳二亚胺法
常用的水溶性碳二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺，简称EDC。 （c）戊二醛活化法 上述（b）中用浓氨水处理后得到的氨基化载体用戊二醛甲酰化后固定配基：
因为NaBH4不仅还原Schiff碱，而且还原甲酰基，故第一步反应不能用NaBH4，而需用NaCNBH3，后者只能还原Schiff碱。 （3）硅胶的活化 活化硅胶常采用硅烷化试剂，如γ-氨丙基三甲（乙）氧基硅烷和环氧丙基三甲（乙）氧基硅烷等，反应式分别为：
引入活性氨基或环氧基后，可利用上述相应方法固定配基。但需注意的是，硅胶在碱性溶液中易溶解，所以固定化反应不能在碱性条件下进行。在酸溶液中环氧基可发生二醇化反应：
邬建敏等将硅胶浸渍壳聚糖后，通过环氧氯丙烷交联使其均匀地包在硅胶表面，该法改善了壳聚糖基质的酸溶性、质软、难成均匀球状的缺点。另外，由于壳聚糖上存在氨基，因此能方便地用双官能团试剂戊二醛将蛋白分子与壳聚糖偶联。将卵清蛋白用戊二醛偶联于上述基质，装柱后，亲和纯化小鼠抗卵清蛋白抗体，结合酶联免疫分析(ELISA)法检测冼脱液中的抗体含量，结果显示亲和层析效果良好。 利用上述各种活化的固定化法得到的配基固定化密度与载体的性质、活化/固定化法以及配基的性质有关，并且受反应条件（温度、pH等）的影响。因此，对于特定配基，需选择适当的载体在适宜的条件下进行活化与固定化反应，以期达到较高的固定化密度，提高亲和层析操作中目标产物的吸附容量和回收浓度。但当配基固定化密度过高时，会产生空间位阻作用（steric hindrance），影响配基与目标产物之间的亲和吸附，配基的有效利用率降低。因此，配基固定化密度也不宜过高，通常存在最佳密度值范围。 3．间隔臂 当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用，如图10-45a所示。这时需要在配基与载体之间连接一个“间隔臂”（spacer），以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合，如图10-45b所示。在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的双环氧化合物起间隔臂的作用。事实上，除CNBr活化法外，其他活化法都引入了不同的活性基团，这些活性基团如果有适当的长度，都可起到间隔臂的作用。利用CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先引入ω-氨基己酸或1，6-二氨基己烷后再用相应的方法固定配基。
引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又会减弱。Lowe等人的研究表明，间隔臂的长度对固定化核苷酸与脱氢酶和激酶的亲和力影响很大。当间隔臂含有6～8个亚甲基（－CH2－）时亲和力最大，亚甲基数超过8（长度＞1.0nm）时，亲和力下降。这可能是由于间隔臂过长容易弯曲，使配基与载体之间的距离缩短，或者不能有效地与酶的亲和结合部位接触，从而减弱了与酶的亲和作用。 （四）亲和层析过程及其分析计算 1．分离过程 如图10-47所示，亲和层析操作多采用断通式前端分析法，当目标产物在层析柱出口发生穿透后（或接近穿透前）停止进料，逐次转入清洗、洗脱和亲和吸附介质的再生过程。吸附操作中首先要保证亲和吸附介质对目标产物有较高的亲和吸附作用和吸附容量，同时，杂质的非特异性吸附要控制在最低水平。配基与目标产物在特定物理环境下表现较高的亲和结合作用，不同亲和体系所要求的物理环境不同，但pH多为7～8。目标产物在亲和吸附介质上的吸附平衡关系多用Freundlich或Langmuir型等温式表达。

图10-46为应用Vicam's 柱免疫亲和层析技术分离谷物中的毒枝菌素示意图。柱内的珠子用化学方法装上毒枝菌素的特异性抗体（1）；谷物样品用甲醛水溶液抽提，抽提液流入亲和柱后，毒枝菌素吸附在抗体珠上（2）；抽提液中的另外物质不被吸附而被清洗下来，然后用甲醛把毒枝菌素洗脱下来（3）。为了表示并测定洗脱液中的毒枝菌素水平，可用荧光计测定毒枝菌素的浓度。 表10-5为部分Freundlich型亲和吸附等温式的实例，其中cm的指数值越小，表示亲和结合力越强。当指数值小于0.1时，吸附平衡式关系可用矩形等温式近似。 表10-5 亲和吸附平衡关系实列 亲和吸附介质 吸附溶质 缓冲液 温度 平衡关系  Sepharose 6B-Benzamidine 胰蛋白酶 50mnol/lTris-HCl+0.5mol/lNaCl (pH7.8) 10℃ 
8.0
 Sepharose 6B-Trypsin Benzamidine 同 上 10℃ 
0.16
 Sepharose 4B-STI 胰蛋白酶 同 上 10℃ 
2.3
 Sepharose 4B-PAPTG β-半乳糖苷酶 50mnol/lTris-HCl+0.5mol/lNaCl (pH7.5) 10℃ 
10.6
 Sepharose 4B-anti-BSA 牛血清白蛋白 20mmol/l PBS+0.15mol/lNaCl 25℃ 
0.67
 注： PBS-phosphate buffer saline; PAPTG-p-aminophenyl-β-D-thiogalactopyranoside; Anti-BSA-抗牛血清白蛋白抗体； STI-soybean trypsin inhibitor； ρb——亲和吸附介质的床层填充密度（kg介质/L床体积）；
——单位质量填充吸附介质上溶液的平均吸附量（kg/kg介质）； cm×——流动相（游离）溶质的平衡浓度。 因为生物料液中目标产物浓度很低，而杂质大量存在，吸附过程中即使有少量杂质的非特异性吸附发生也会大大降低纯化效果。一般来说，杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化法以及流动相的离子强度、pH和温度等因素有关。例如，当配基或目标产物带有电荷，或者用CNBr活化法修饰配基的同时引入带电基团时，在较低离子强度下，亲和吸附介质（包括已被吸附的目标产物）对杂质的静电作用较强，非特异性吸附量较大。另外，在离子强度较高的情况下，由于间隔臂上碳氢链的疏水性相互作用较强，也可能使非特异性吸附量增大。因此，为减小吸附操作中的非特异性吸附量，所用缓冲液的离子强度要适当，一般为0.1～0.5mol/L，缓冲液的pH值应使配基和目标产物与杂质的静电作用较小。此外，要使用高纯度的配基制备亲和吸附介质，提高亲和吸附介质自身的质量。有时为减小杂质以及目标产物的非特异性吸附，可在料液(以及后续的清洗液)中加入0.01％～0.5％的表面活性剂（如Tween80，TritonX-100等）。特别是对于疏水性较高的蛋白质（如组织纤溶酶原激活剂），加入表面活性剂是提高目标产物纯度和回收率的有效手段。 料液流速是影响层析柱和分离速度的重要因素。提高流速虽可提高分离速度，但柱效降低，穿透曲线平缓，亲和层析柱的有效利用率降低。因此，吸附操作要在适当的流速下进行，既要保证高速度，又要保证高效率。此外，琼脂糖凝胶等低强度载体容易受压变形，存在最大允许线速度。如图10-48所示，在一定操作压力以上，继续增大压力流速反而降低，并且最大允许线速度随柱径和柱高增大而降低。其他层析过程同样存在类似现象，在放大设计中须特别注意这一问题。 清洗操作的目的是洗去吸附介质内部及柱空隙中存在的杂质，一般使用与吸附操作相同的缓冲液，必要时加入表面活性剂，保证目标产物的吸附和杂质的除去。由于亲和吸附是可逆的，清洗过度会使目标产物的损失增多，特别使对于亲和结合力较弱的亲和体系，而清洗不充分则使洗脱回收的目标产物纯度降低。因此，应利用合适的方法，确定适宜的洗脱操作时间。 目标产物的洗脱方法有两种，即特异性洗脱法和非特异性洗脱法。特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基
或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。例如：赖氨酸和精氨酸均为t-PA的抑制剂，利用固定化赖氨酸为配基亲和分离t-PA时，可用精氨酸溶液进行洗脱；利用con A为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严重的体系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。如图10-49所示，利用BSA-Sepharose 4B亲和层析柱分离抗BSA血清中不同抗体组分的层析结果，通过逐次降低洗脱液的pH值，得到三个抗体组分洗脱峰。利用组分1、组分3和全血清（含三个组分）修饰Sepharose 4B，制备了三种抗体吸附剂。
三种吸附剂亲和吸附BSA的平衡容量与pH值之间的关系如图10-50所示。虽然三种抗体吸附剂BSA的行为不完全相同，但均在酸性和碱性pH范围内吸附容量降低，表明利用酸性或碱性溶液是洗脱抗原或抗体的有效手段。

如图10-51所示表示离子强度和离子种类对吸附容量的影响，可以看出，利用高浓度SCN－离子也可降低抗原和抗体的结合作用。其他亲和体系，如酶-抑制剂，抗体-A蛋白等均具有类似的性质。利用这些亲和体系的亲和层析洗脱操作多利用pH2～3或pH10～12的缓冲液。色素亲和层析则利用高浓度盐溶液洗脱，促溶剂（chaotropic ion，如SCN－等）也是常用的洗脱剂组分。当亲和结合力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产物时，可利用脲或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物发生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不可逆变性，需要慎重使用。 2．分析计算 要分析测定分离过程中目标产物和杂质浓度的变化，建立分离系统的数学模型，进行分离过程的优化分析和放大设计是十分必要的。 从实质上来讲，亲和层析的吸附过程与一般的吸附操作是一样的，所以可用固定床吸附过程理论来分析亲和层析的分离过程曲线。这里介绍一种基于线性推动力速率方程和恒定图式假设推算总传质系数，来分析穿透曲线的方法。 利用轴向扩散模型描述亲和层析操作过程，有：
（10-55） 式中
——固定相中溶质的平均浓度； Dz——轴向扩散系数。 由于在亲和吸附操作过程中，亲和吸附介质细孔内溶质量可以忽略不计，则上式右边第三项可表示为：
（10-56） 式中
——亲和吸附介质的床层填充密度（kg介质/dm3床体积）；
——单位重量吸附介质上目标溶质的平均吸附量（kg/kg介质）。 如果亲和吸附平衡关系符合Freundlich等温式，则：
（10-57） 上式为优惠吸附等温式，假定恒定图式假设成立，则：
（10-58） 式中
，c0——进口处的q和cm值，
和c0之间呈相平衡关系。利用简化的线性推动力速率方程表示液固相界面的传质速率，则：
（10-59） 式中 Kfa——总体积传质系数。 设目标溶质的穿透时间为tB，此时出口溶质浓度为cB；操作时间为tE时出口溶质浓度为cE=c0－cB，将式（10-58）代入式（10-59），并在cm=cB，t=tB和cm=cE，t=tE范围内对式（10-59）积分，得到：

（10-60） 将式（10-—36）和式（10-—37）代入式（10-—39）后积分，得到下式：
（10-61） 式中 XB=cB/c0，XE=cE-c0。 因为在吸附操作过程中Kfa值并非常数，而使浓度cm（t，z）的函数，故在式（10-60）和式（10-61）的积分式中假定为常数，用tB和tE区间内的平均值
表示。通过实测穿透曲线，利用式（10-61）可计算
值。另外，分别利用独立方法可测定其他参数（ρb、ε和Dz）的数值。 轴向扩散系数Dz可用盐（如KCl）溶液的脉冲响应（impulse response）实验测定，而吸附等温式可通过亲和吸附平衡实验测定。当Dz，ρb，ε和
已知后，利用式（10-55）、（10-56）、（10-59）和吸附等温式以及适当的边界条件可分别测定穿透曲线和清洗曲线，确定所需的进料和清洗时间。 洗脱操作中，确定洗脱条件下的吸附平衡关系后，同样可利用式（10-55）、（10-59）和实测的各参数值计算洗脱曲线和所需洗脱时间。如果利用目标溶质的小分子亲和配基溶液为洗脱剂进行特异性洗脱，则要考虑目标溶质与固定化配基和洗脱剂之间的分配平衡，确定洗脱过程中溶质在亲和吸附介质上的吸附平衡关系。如果利用非特异性洗脱方式，可近似认为洗脱液进入亲和吸附介质后目标溶质发生脱附，吸附平衡关系可用Henry型线性吸附等温式表示。 利用特异性亲和吸附介质进行亲和层析操作时，可能有两种以上的溶质发生亲和吸附。此时，可根据各溶质之间亲和吸附的强弱差别（即吸附等温式的差别）进行特异性或非特异性梯度洗脱，分析方法与离子交换层析相类似。 （五）亲和层析设备 1．亲和层析柱 一般的层析柱亦能用于亲和层析，如图10-52所示，一套亲和柱层析系统主要包括：（1）原料及溶液系统；（2）输液泵（pump）：可提供一定流速的稳定液流；（3）柱（column）：一定的层析方法 (如亲和层析)需装填的固定相介质；（4）监测器（detector）：动态监测柱末端流动相内已分离的各组分分布情况；（5）记录仪（recorder）：如实描述检测器发出的信号；（6）分部收集器（fraction collector）：分段收集层析流分。 原料经由泵供给的流动相推动与柱内装填的固定相介质相互作用，分离后的各组分由检测器检测信号输出到记录仪上，流过检测器的各组分再由分部收集器收集而获得目的组分。 现在最新的层析柱在外形上和原来差不多，但已在材料上有了很大发展，如用尼龙或聚甲醛等材料制成的亲和层析柱。该柱具有设计先进，洗脱方便等特点。而且洗脱死体积小，具有良好的耐化学腐蚀性。是医学制药、生物化学、化学分析等实验室必备的最佳亲和层析设备。
2．大型化亲和层析装置 随着现代生物技术的飞速发展，迫切需要能够与大规模制备生物制品相适应的设备出现，层析设备也从开始一个单一、小型的层析柱向自动化，大型化层析装置发展。如图10-53改变层析柱的载体，就能用于亲和层析。
样品经泵打入层析柱，缓冲液用于洗脱，由柱底流出的液体按一定的计量方式分部收集，通过测定相关的物理性质分析，来确定目的产物。此装置可用于蛋白质（特别是酶）的分离，也能用于酶抑制剂、抗体等分离纯化。 （六）应用举例 1．2-胰凝乳蛋白酶的提纯 （1）亲和吸附剂（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）的制备? 取一定体积的Sepharose4B加100mgCNBr。搅拌混合物，滴加2-8mol/L NaOH，使溶液pH维持在11.0。20℃左右，8-12分钟完成反应。在布氏漏斗中抽滤活化的琼脂糖，然后用20倍体积冷的0.1mol/L NaHCO3（pH9.0）溶液洗涤。将上述活化的Sepharose4B与等体积0.1mol/L NaHCO3（pH9.0并在冰箱中预冷）溶液混合，接着迅速加入α-胰蛋白酶抑制剂（Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制剂的最大用量为每毫升Sepharose 4B 65μmol/L。4℃缓慢搅拌约24小时，而后再用水和缓冲液反复地洗至没有游离的抑制剂为止。制得的亲和吸附剂在50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中保存备用。 （2）分离 亲和吸附剂装柱后用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡（室温）。样品溶于同样缓冲液中并上柱，再应用同样缓冲液淋洗柱子。流速为30-60ml/小时，直至280nm无光吸收时停止洗涤，然后改用0.2mol/L醋酸缓冲液（pH3.0）洗脱。 2．单克隆抗体(McAb)亲和层析柱纯化重组人α2a干扰素(rHuIFN-α2a) 重组人α干扰素作为一种具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长及免疫调节作用的细胞因子新型药物，已在国内外广泛投入临床应用，并取得了显著的疗效。国际上对用于临床的重组干扰素的纯度要求很高，美国NIH规定必须在90％以上，因此生产者普遍采用亲和层析纯化法。朱勇等研制了rHuIFN-α2a的McAb 3F1，与CNBr活化的Sepharose 4B交联制成亲和层析柱，经1年60余次较大规模试用表明具有较理想的亲和层析纯化rHuIFN-α2a的性能，达到了国内外同类McAb的水平。由于McAb 3F1也能和rHuIFN-α2b结合，故极有可能亦适用于rHuIFN-α2b的亲和层析纯化。操作步骤分两步： （1）rHuIFN-α2a的粗提：用盐酸胍裂解表达rHuIFN-α2a的工程菌，过DEAE凝胶柱粗提，收集活性峰。 （2）亲和层析：rHuIFN-α2a粗提物用pH7.2，0.15mol/L PBS透析过夜，上样于经pH7.2，0.15mol/L PBS平衡的亲和层析柱，流速0.5ml/分，然后用大量PBS流洗至流出液OD280≤0.02，再用pH2.4，0.1mol/L甘氨酸-HC1洗脱，洗脱液立即转至pH7.2，0.15mol/LPBS中透析过夜，测定蛋白浓度、纯度和活性。 根据实验结果，利用单克隆抗体(McAb)亲和层析柱纯化重组人α2a干扰素(rHuIFN-α2a)取得了良好的效果： ①McAb的特性：IgG1，间接ELISA效价10-7，对rHuIFN-α2a具中和活性； ②洗脱的rHuIFN-α2a纯度：>90％； ③洗脱的rHuIFN-α2a比活性：≥1×109IU/mg； ④rHuIFN-α2a的回收率：≥95％； ⑤亲和柱的稳定性：4℃操作和保存情况下，使用60余次1年时间性能无明显下降； ⑥与国外McAb比较：各项指标绝不亚于英国Celltech公司生产的McAb NK2。 3．基因重组融合蛋白的纯化 随着基因重组技术的发展，人工克隆目标产物的基因，使其在大肠杆菌、酵母或动物培养细胞中得以表达，从而通过大规模菌体发酵或细胞培养大量生产特定目标产物已经相当普遍，绝大多数现代生物技术医药产品如干扰素、白细胞介素（interleukin，IL）、集落刺激因子（colony-stimulating factor）、胰岛素（insulin）、t-PA、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）等都是基因重组技术的产物。同时，从目标产物分离纯化的角度，将具有特殊分子识别作用（亲和结合作用）的基因（如氨基酸、肽链、蛋白质等）的基因与目标产物的基因克隆相连接，制备融合基因，则此融合基因的表达产物就是连接有特定分子识别基团的目标蛋白质――基因重组融合蛋白质（recombinant fusion protein），简称融合蛋白。与目标蛋白相融合的分子基团称为融合蛋白的亲和标识物（affinity tag）。这样利用亲和标识物的特异性亲和吸附介质就可简单地亲和纯化目标产物。 便于目标产物分离纯化的融合蛋白质已有许多种。其中最具有代表性的是Uhlen等开展的利用A蛋白或其IgG结合部位为亲和标识物的各种融合蛋白。如图10-54所示，Uhlen等利用1000L发酵罐培养基因重组大肠杆菌，生产IGF-I与A蛋白的IgG结合部位（Z）的融合蛋白ZZ-IGF-I，经离心和过滤除菌体，将培养上清液通入IgG-Sepharose FF亲和层析柱，洗脱得到纯化的融合蛋白ZZ-IGF-Ia；融合蛋白冻干后b，加入到2mol/dm3的羟胺溶液中化学裂解（cleavage）融合部位c；经过凝胶过滤层析柱脱盐后d，再用IgG亲和层析柱吸附除去裂解的IgG结合部位（ZZ）和未ZZ-IGF-I，可得到IGF-I纯品e。 图10-54基因融合蛋白IGF-I的纯化过程。
除ZZ外，其他融合蛋白的亲和识别物有聚组氨酸（亲和配基为 SH基，Ni-IDA，聚苯丙氨酸（配基为苯基），精氨酸（配基为脱羟基胰蛋白酶），八肽（配基为Ca2+需求性抗体）等。 利用融合蛋白生产目标产物的纯化工艺简便，应用前景广泛，但仍存在一些问题：（1）亲和识别物除小数用化学水解法外，多数用蛋白酶水解法裂解去。酶裂解法虽然选择性较高，但需在较高温度下进行，容易引起目标蛋白的非特异性水解；（2）裂解后需附加层析分离步骤除去蛋白酶，使纯化工艺复杂化；（3）考虑蛋白酶需在裂解完成后除去，为方便纯化操作，一般蛋白酶的用量较小，易使裂解不完全；（4）由于大分子蛋白酶不能有效地与融合部位接触，许多融合蛋白很难在所希望的融合部位裂解。为此，Walker等开发了利用融合蛋白酶裂解目标融合蛋白的方法，解决了裂解用酶的分离问题。利用分子量小（20kD）、低温下活性高、水解特异性极高的蛋白酶3C与不同的亲和标识物融合，得到各种识别物的融合蛋白酶3C（记作Tag-3C），Tag-3C可有效地裂解其它融合蛋白的融合部位。因为Tag-3C融合有亲和标识物，所以容易用相应的亲和吸附介质吸附和回收。如图10-55所示，Tag-3C的三种不同利用方式。如果Tag-3C与目标融合蛋白含有相同的亲和标识物（如图49中的GST-3C），则GST-3C和目标融合蛋白均被吸附在亲和吸附介质（人谷胱甘肽-Sepharose）上。在亲和介质上GST-3C裂解融合蛋白，使目标蛋白脱离亲和柱得到回收，而裂解下来的亲和标识物（GST）和GST-3C仍牢固的吸附在亲和柱上。利用这种方法，仅进一步亲和层析操作就可同时完成融合蛋白的纯化和裂解，得到纯化的目标产品。如果融合蛋白的裂解不能在层析柱中进行，则可利用常规方法首先亲和纯化融合蛋白，然后向融合蛋白溶液中加入Tag-3C（如图10-55中的His-3C），裂解融合蛋白（His-PKCI）后，用IMAC吸附裂解下来的亲和标识物His和His-3C，纯化目标蛋白PKCI（如图10-55）。对于绝大多数融合蛋白酶与目标融合蛋白的亲和标识物不同的情况，可利用不同的亲和层析柱分别除去目标融合蛋白的标识物和融合蛋白酶。如图10-55所示，GST-3C可裂解融合蛋白His-PKCI(六个组氨酸的肽链融合在PKCI的N末端)，第一个Ni2+鳌合柱吸附裂解下来的组氨酸肽链，而第二个谷胱甘肽-Sepharose柱吸附GST-3C，最终得到纯化的目标产物PKCI。 在众多亲和标识物中，以聚组氨酸肽链最受产业界注目，因为这种融合蛋白可利用吸附容量高、价格便宜的IMAC纯化。