第六章 生物反应器结构与设计计算
由生物细胞或生物体组成参与的生产过程可统称为生物反应过程，利用生物催化剂进行反应的生物反应器在生产过程中，具有重要 的作用，是实现生物技术产品产业化的关键设备，是连接原料和产物的桥梁。在生物反应过程中，若采用活细胞（包括微生物、动植物细胞）为生物催化剂，称为发酵过程或细胞培养过程。采用游离或固定化酶，则称为酶反应过程。按照生物反应过程所使用的生物催化剂不同，生物反应器可分为酶反应器和细胞生物反应器。根据反应器所需的能量的输入方式，微生物细胞反应器可以分为：通过机械搅拌输入能量的机械式、利用气体喷射动能的气生式和利用泵对液体的喷射作用而使液体循环的生物反应器等。
自上一世纪四十年代，青霉素大规模生产以来，出现了结构多异，性能和用途不同的多类生物反应器。为配合生物加工过程，工艺条件需要对生物反应器的结构进行设计和计算，以获得较高的产率和规模化生产。
一个良好的生物反应器应满足下列要求：1）结构严密，经得起蒸汽的反复灭菌，内壁光滑，耐腐蚀性能好，以利于灭菌彻底和减小金属离子对生物反应的影响；2）有良好的气-液-固接触和混合性能和高效的热量、质量、动量传递性能；3）在保持生物反应要求的前提下，降低能耗；4）有良好的热量交换性能，以维持生物反应最适温度；5）有可行的管路比例和仪表控制，适用于灭菌操作和自动化控制。
第一节 机械搅拌式生物反应器
机械搅拌式生物反应器是发酵工厂最常用的类型之一。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和醪液充分混合，促使氧在醪液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、发酵和代谢产物所需要的氧气。
一、机械搅拌式生物反应器的结构
机械搅拌通风发酵罐主要有罐体、搅拌器、挡板、轴封、空气分布器、传动装置、冷却管、消泡器、人孔、视镜等。下面做简要的介绍。
1．罐体
罐体由圆筒体和椭圆形或碟形封头焊接而成，材料以不锈钢为好。为满足工艺要求，罐体必须能承受一定压力和温度，通常要求耐受130℃和0.25MPa（绝压）。罐壁厚度取决于罐径、材料及耐受的压强。
2．搅拌器和挡板
为了强化轴向混合，可采用蜗轮式和推进式叶轮共用的搅拌系统。为了拆装方便，大型搅拌叶轮可做成两半型，用螺栓联成整体装配于搅拌轴上。
搅拌的主要作用是混合和传质，即使通入的空气分散气泡并与发酵液充分混合，使气泡破碎以增大气－液接触界面，以获得所需要的氧传递速率，并使生物细胞悬浮分散于发酵体系中，以维持适当的气－液－固（细胞）三相的混合与质量传递，同时强化传热过程。为实现这些目的，搅拌器的设计应使发酵液有足够的径向流动和适度的轴向运动。
搅拌器大多采用涡轮式。涡轮式搅拌器具有结构简单、传递能量高、溶氧速率高等优点，但存在的缺点是轴向混合差，搅拌强度随着与搅拌轴距增大而减弱，故当培养液较粘稠时，混合效果就下降。常用的涡轮式搅拌器的叶片有平叶式、弯叶式、箭叶式三种，叶片数一般为六个，也有四个或八个。如图6-1所示。
发酵罐内设挡板的作用是防止液面中央形成旋涡流动，增强湍动和溶氧传质。通常设4-6块挡板，其宽度为0.1-0.12D，达到全挡板条件。全挡板条件是达到消除液面旋涡的最低条件。在一定的转速下面增加罐内附件而轴功率保持不变。此条件与挡板数Z，与挡板宽度W与罐径D之比有关。
（6-1）
式中 ——挡板宽度，mm；
——罐内径，mm；
——挡板数，mm。
由于发酵罐中除了挡板外，还有冷却器，通气管，排料管等装置也起一定的挡板作用。当设置的换热装置为列管或排管时，并且在足够多的情况下，发酵罐内不另设挡板。
3．轴封
轴封的作用是防止染菌和泄漏。搅拌轴的密封为动密封，这是由于搅拌轴是转动的，而顶盖是固定静止的，两个构件之间具有相对用动，这时的密封要按照动密封原理来进行设计。对动密封的基本要求是密封要可靠并且机构要简单，使用寿命要长。
发酵罐中使用最普遍的动密封有两种：填料函密封和机械密封（或称端面密封）。
（1）填料函密封
填料箱本体固定在发酵罐顶盖的开口法兰上，将转轴通过填料函，然后放置有弹性的密封填料，然后放上填料压盖，拧紧压紧螺栓，填料受压后，产生弹性变形堵塞了填料和轴之间的间隙，转轴周围产生一定的径向压紧力，从而起到密封介质压力的作用。
填料函密封具有结构简单，填料拆装方便的特点。同时具有以下缺点：死角多，很难彻底灭菌，容易渗漏及染菌；轴的磨损较严重；增加由于摩擦所损耗的功率，产生大量的摩擦热；寿命较短，需经常更换填料。因其容易磨损和渗漏，故在发酵罐中已经很少使用。
（2）机械密封
机械密封的工作原理：它是靠弹性元件（弹簧、波纹管）及密封介质压力在两个精密的平面（动环和静环）间产生压紧力，相互贴紧，并作相对旋转运动而达到密封。主要作用是将较易泄漏的轴面密封，改变为较难渗漏的端面（径向）密封。
机械密封的基本结构由下列元件组成：摩擦付，即动环和静环；弹簧加荷装置；辅助密封圈（动环密封圈和静环密封圈）。
机械密封同填料函密封比较，具有很多优点：
① 泄漏量极少，其泄漏量约为填料函密封的1％。这是由于环密封圈与转轴以及静环密封圈与压盖没有相对运动，几乎不受磨损，而且端面材料是由具有高度平直、滑动性、耐磨性好的适当材料构成的，即使无润滑性流体进行润滑，密封端面的泄漏量也是极少的。
② 使用工作寿命长。机械密封的磨损部分只限于密封端面，由于选用适当的耐磨材料因此它的磨损量极小，一般条件下可工作半年至一年，质量好的机械密封寿命可达2～5年以上。
③ 较少需要调整。动环由于密封流体压力和弹簧力等推向静环方向，密封面自动保持紧密接触，因此较少需要调整。
④ 摩擦功率损耗小。由于密封端面的面积小、摩擦系数小，故摩擦阻力小，功率消耗小。其损耗功率仅为填料函密封的10～15％。
⑤ 轴与轴套不受磨损。
⑥ 结构紧凑，安装长度较短。由于不需要调整用的间隙，因而结构紧凑。
但存在着结构复杂，密封加工精度要求高，安装技术要求高，拆装不便，初次成本高等缺点。
3．机械消沫装置
发酵过程中由于发酵液中含有大量的蛋白质，故在强烈的通气搅拌下将产生大量的泡沫。严重的泡沫将导致发酵液的外溢和增加染菌机会，在通气发酵生产中有两种消泡方法。一是加入消沫剂的方法去除，二是使用机械消泡装置。在泡沫的机械强度较差和泡沫量较少时采用机械消沫装置有一定作用。其作用是将泡沫打碎。
消沫器可分为两大类：一类置于罐内，目的是防止泡沫外溢，它是在搅拌轴或罐顶另外引入的轴（指搅拌轴由罐底伸入时）上装上消沫桨；另一类置于罐外，目的是从排气中分离已溢出的泡沫使之破碎后将液体部分返回罐内。
4．通气装置
通气装置是指将无菌空气导入罐内的装置，最简单的通气装置，是一单孔管，单孔管的出口位于最下面的搅拌器的正下方，开口往下，以免培养液中固体物质在开口处堆积和罐底固形物质沉淀。管口与罐底的距离约为40。
第二种形式是开口朝下的多孔环形管。环的直径约为搅拌器直径的0.8倍。小孔直径，孔的总面积约等于通风管的截面积。在通气量较小的情况下，气泡的直径与空气喷口直径有关。喷口直径越小，气泡直径越小，氧的传质系数越大。但在发酵过程中通气量较大，气泡直径仅与通气量有关而与通气出口直径无关。又由于在强烈机械搅拌的条件下，多孔分布器对氧的传递效果并不比单孔管为好，相反的还会造成不必要的压力损失，且易使物料堵塞小孔，故已很少采用。
二、搅拌轴功率计算
发酵罐液体中溶氧以及气液固的混合强度与单位体积中输入的搅拌功率有很大的关系。在相同条件下，不通气与通气的情况下，轴功率也是不一样的。
1．不通气条件下的轴功率计算
在机械搅拌发酵罐中，搅拌器输出的轴功率与下列因素有关：发酵罐直径、搅拌器直径、液柱高度、搅拌器的转速、液体粘度、流体密度、重力加速度以及搅拌器形式和结构等。因为、均与之间有一定比例关系，于是：
、、、、
通过因次分析及实验证实，对牛顿型流体而言，可得到下列准数关联式：
（6-2）
式中 ——功率准数；
——搅拌情况下的雷诺准数；
——搅拌下的弗鲁特准数；
——搅拌器类型、发酵罐几何尺寸有关的常数，不同搅拌器的值见表6-1。
故，式（6-2）又可改写为
（6-3）
表6-1 不同搅拌器的K值
搅拌器形式
K值
滞留
湍流
六平叶涡轮搅拌器
71
6.3
六弯叶涡轮搅拌器
71
4.8
六箭叶涡轮搅拌器
70
4.0
六弯叶封闭式涡轮搅拌器
97.5
1.08
经实验证实，在全挡板条件下，液面未出现旋涡，此时指数y=0，故=1。所以，
在具有挡板且满足全挡板的情况下，，即搅拌准数是搅拌雷诺准数的函数。
在一系列的几何相似的试验设备中，用不同型式的搅拌器进行试验得出：
当、、、挡板数4的情况下，对涡轮式、螺旋桨式和平桨式三种桨型的功率准数与雷诺准数的关系，如图6-2a所示。从图中可以看出：
当时，液体处于层流状态，此时，
（6-4）
（6-5）
当时液体处于湍流状态，此时，
（6-6）
（6-7）
此时搅拌功率与流体粘度无关，并且此时不随的变化而变化，其为一常数。
当时，液体处于过度流状态，与均随变化。
在一般情况下，搅拌器大多在湍流状态下操作，故可用式（6-7）来计算搅拌器的轴功率。由于一般发酵罐中、，其搅拌功率可用下式校正：
（6-8）
为校正系数，它由下式来确定：
（6-9）
式中，带*号代表实际搅拌设备情况。
由于工业发酵罐的高径比一般为2-3，因此在同一轴上往往装有很多层搅拌器。对于多层搅拌器的轴功率可按下式估算：
（6-10）
式中 -------搅拌器层数。
在发酵生产中，液体深度较大，只用一只搅拌器，搅拌效果不佳。在相同的转速下，多只搅拌器比单只搅拌器输出更多的功率，其增加的程度除了搅拌器的个数外，还取决与搅拌向的距离。经过多次试验得出：
2．通气搅拌功率计算
当发酵罐通入压缩空气后，搅拌器的轴功率与不通气时相比，将会下降，减少程度与通气量存在着一定关系。可能的原因是：1）由于通气使得液体的密度降低；2）由于通气使得液体的翻动。也就是说，减少程度主要取决于搅拌器与周围液体的情况。为了估算通气条件下的搅拌功率，有人引入通气准数，它表示了发酵罐内空气的表现流速与搅拌叶端流速之比。可表示为：
（6-11）
式中 ——工况通气量，；
——搅拌器直径，；
——搅拌器转速，；
若以表示通气搅拌功率，为不通气搅拌功率，则
当时， （6-12）
当时， （6-13）
图6-2b表示了在各种搅拌情况下，通气与不通气功率之比与通气准数的关系。
当发酵液密度为800～1650kg/m3，粘度为9×10-4 ～0.1Pa·s时，可用Michel公式来估算涡轮搅拌器的通气搅拌功率：
（6-14）
当在1/3~2/3之间变化，值为0.101~0.157之间。
式中 ——搅拌转速，r/min；
——工况下通气量，m3/min。
Reuss用因次分析法提出下列关系式：
（6-15）
式中 ——Froude准数；
——Reynold准数；
——通气准数；
——反应器直径；
——搅拌桨直径。
Hughmark从248组实验数据中整理出下式：
（6-16）
式中 ——液相体积；
——搅拌桨叶宽；
上式计算于实验值误差为11%。
Brown提出更为简单的关联式：
（6-17）
式中 、——与气体流速和搅拌桨直径有关的参数。
若以对流动准数对应作图，上述三个关系式所表示的曲线同图6-3相一致。
3．非牛顿流体特性对搅拌功率计算的影响
常见的某些发酵醪具有明显的非牛顿流体特性。这一特性对发酵过程的影响极大，对搅拌功率的计算也带来麻烦。
牛顿型流体：粘度μ只是温度的函数，与流动状态无关，服从牛顿粘性定律。
非牛顿流体：粘度μ不仅是温度的函数，而且随流动状态而变化。
（1）非牛顿型发酵醪的流变等特性
牛顿型流体的流态式为直线，服从牛顿特性定律：
式中 ——剪应力；
——剪切率（速度梯度）
凡牛顿型性流体，服从 （6-18）
而对于非牛顿型流体： （6-19）
所有气体以及大多数低分子量的液体都属于牛顿型流体，如空气、水、有机溶剂及多数的水溶液，而胶体溶液、高分子溶液属于非牛顿型。
我们接触的非牛顿型流体基本上为稳定的非牛顿型流体，而此类流体可按剪应力与剪切率之间的关系，分为三类：
①拟塑性流体（分段型性流体）
其剪应力和剪切率的关系：
（6-20）
式中 ——均匀性系数，也称作稠度指数，与牛顿型流体的粘度具有相类似的概念，所以也可以称作液体的粘度指标；
——流动性指数，＜1。
大多数发酵液均属于此类。
特点是粘度系数随着越大，流体就越粘，值越小，流体的非牛顿特性越明显。
②彬汉塑性流体
特点是其剪应力与剪切率的关系是不通过原点的直线。
（6-21）
式中 ——屈服剪应力
μp——刚性系数
③涨塑性流体：
（6-22）
式中 流动性指数＞1，
k——均匀性指数
据有关资料报道，某些发酵液随着发酵时间的变化，其流变状态发生变化。如青霉素发酵液中，在整个发酵周期内都是呈现非牛顿型流体；链霉素发酵中，在24以前为彬汉塑性流体，在48及96时呈牛顿型流体，在120时呈拟塑性流体。
4．非牛顿型流体的搅拌功率计算
对于非牛顿型流体搅拌功率的计算与牛顿型流体搅拌功率的计算方法一样，可用的关系式进行计算。但这类流体的粘度是随搅拌速度而变化的，因而必须事先知道粘度与搅拌速度的关系，然后才能计算不同搅拌转速下的。但从大量的实验数据中，可以得出，牛顿型流体与非牛顿型流体的～曲线基本吻合，差别仅在＝10～300区间之内。在实际计算中，可以用上述讲的轴功率计算方法来计算非牛顿型流体的搅拌功率。
三、搅拌反应器中热量传递
在机械搅拌式反应器中，当搅拌十分充分时，发酵液所有成分的浓度和流体的温度在器内不随位置而变化。由于流体受流动条件的限制，搅拌反应器的温度在任何条件下都不可能为常数，温度不断随空间坐标、时间发生很大的变化。热传递在搅拌反应器内是一个非定态过程。由于过程复杂，研究中往往将过程简化成定态过程，无论传热条件如何，一段时间后，机械能必定通过反应器壁传递给环境的介质。
图6-3是以桨式搅拌器为例的一个搅拌模型。桨式搅拌器由两片对称的直叶构成，属于开式径向搅拌器。以下就用该模型进行理论分析。
1．理论分析
对带挡板的桨式搅拌器的反应器，静止流体和层流流体的温度场的热衡算微分方程为：
（6-23）
式中 ——能量累计项；
——流动引起的热能变化；
——分子热传导引起的热能变化；
——由机械能转化的热能；
——挡板数；
式中 ——径向和轴向速度和的散失热；
——切向速度散失热；
上两式中的无因次量为：
——Brinkman数；
——Frourier数；
——反应器直径；
——prandtl数；
——局部散失热；
——Reynols数；
——Reynols数；
——局部温度；
——局部径向速度；
——局部切向速度；
——局部轴向速度；
——相对径向速度；
——相对轴向速度；
——径向无因次坐标；
——轴向无因次坐标；
——导热系数；
——比热容，为热扩散系数，为时间，T为任意时间t的局部温度，为时间t为0时的温度，为反应器壁温度。
Brinkman数Br可看作摩擦热于时通过壁传导的热的温度。Br与时间无关，由壁与流体之间的热传导方向决定。
从（6-23）可以看出，对流传递只有通过流体的径向和轴向流动进行，切向流动对热传递没作用，虽然这部分运动消耗了主要的机械能。流体中的热传递只靠次生流。内摩擦生成的热，主要是切向流动造成的。
式（6-23）的初始条件为：
时， （6-24）
边界条件为：
1） 容器底部
2） 液体自由表面
3） 容器筒体表面
4） 容器轴
5） 搅拌器筒体表面
6） 搅拌轴圆柱体表面
7） 搅拌器底部面积
8） 搅拌器顶部面积
无因次旋转轴直径
无因此液位高
无因次搅拌器高
无因次搅拌器直径
上面的式子可对（6-23）进行数值解。从结果中得出局部温度时以下参数的函数。
2．热传递的经验方程
工程中热量传递计算的基础时假定过程为定态。此时热量为：
（6-25）
式中 ——传热系数，定义为
（6-26）
式中 和——器壁内表面和外表面上的传热系数；
——为器壁厚度；
——为器壁材料的导热系数；
平均面积Am为：
温度差取对数平均值：
式中 ——器内液体的平均温度，
——器外流体的平均温度。
根据（6-25）和（6-26）计算时，需知道和，要求得这两个系数，需联立管内和管外的热量衡算方程。
由于搅拌器和换热器类型对计算有很大的影响，因此可直接应用的方程很少。以下方程式可用于带挡板、不带挡板、涡流桨、锚式桨、螺旋桨和桨叶式搅拌器，以及纯牛顿型流体和纯非牛顿型流体。对非牛顿型流体的计算时，常将代替，并且常常在实验条件下进行测定。
式中 ——Nusselt数；
——Reynolds数；
——Prandtl数；
，——反应器内流体平均黏度和壁温下的动态黏度。
其他流体性质必须在平均流体温度下确定。
气升式生物反应器
气升式发酵罐是应用最为广泛的生物反应器。气升式反应器是在鼓泡塔反应器的基础上发展起来的，它是利用空气的喷射功能和流体重度差造成反应液循环流动，来实现液体的搅拌、混合和传递氧。即不用机械搅拌，完全依靠气体的带升使液体产生循环并发生湍动，从而达到气液混合和传递的目的。
一、气升式生物反应器（ALR）的结构
气升式反应器的结构较简单，不需搅拌，易于清洗，维修，不易染菌，能耗低，溶氧效率高。目前内循环气升式发酵罐已广泛应用于生物工程领域的好氧发酵方面，如动植物细胞的培养、单细胞蛋白的培养、某些微生物细胞的培养及污水处理等。由此生产的产品有单细胞蛋白、酒精、抗生素、生物表面活性剂等。我国利用生物反应器生产了大量生物制剂，多采用的是气升式细胞培养生物反应器。气升式细胞培养生物反应器是空气提升式生物反应器的简称。
气升式发酵罐按其所采取的液体循环方式的不同，可划分为内循环气升式发酵罐和外循环气升式发酵罐。前者使循环过程中的升管与降管均设置在同一发酵罐内部；而后者则令上升管与下降管分立布置。如图6-4所示。
气升式生物反应器主要采用内循环，但也有采用外循环式。
内循环式生物反应器内部有四个组成部分：
（1）升液压 在反应器中央，导流管内部。若空气是在导流管底部喷射，由于管内外流体静压差，使气液混合流体沿管内上升，在反应器上部分离部分气体后，又沿降压管下降，构成一循环流动。若空气在降液管底部喷射，则流体循环方向恰好相反。
（2）降液区 导流管与反应器壁之间的环隙，流体沿降液区上升或下降，视喷射空气的位置而定。
（3）底部 升液区与降液区下部相连区，对反应器特性影响不大。
（4）顶部 升液区与降液区上部相连区。可在顶端装置气液分离器，除去排出气体中夹带的液体。
此外，器内还装有环形管气体喷射器等。内循环气生式生物反应器的基本结构如图6-5所示。
空气自通气管(2)进入发酵罐(1)底部后，经导向筒导向，推动发酵液沿上升管上升，由于发酵罐上部升管的空间不足以为完全气液分离提供条件(停留时间短)，因此高流速的循环发酵液凭借自身的重度沿降管下降，当到达拉力筒(3)底部时，又受到来自罐底部压缩空气的推动，重新沿升管上升，开始下一个气液混合循环过程。在循环过程中，气液达到必要的混合、搅拌并取得充分溶氧。夹套冷却器的作用是在不同发酵阶段对发酵液的温度实施合乎工艺要求的调节与控制，多孔板使布气均匀一致。
目前，专家对气升式生物反应器的研究工作的较多，但主要是对高径比较高()的气升式生物反应器的研究。对于低高径比（）的气升式生物反应器的研究报道极少。国内，郑裕国等人在我国现有生物反应器的基础上，进行改造，研制了罐体高径比为2.9的外循环气升式生物反应器。其结构见图6-6。该反应器总容积为11.5升，上升管与下降管直径之比（）为6.6，罐体高径比()为2.9，用不锈钢制造，通风量可调节，温度可自动控制检测。
二、气升式生物反应器的主要参数
1．流动与传递特性参数
（1）气含率
气含率是气升式发酵罐的一个重要参数。气含率太低，氧传递不够，反之，太高则反应器的利用率太低。
在含同轴导流筒的内循环气升式发酵罐中，气含率的定义为：
平均体积气含率： （6-27）
导管内（上升区域）的气含率： （6-28）
环隙内（下降区域）的气含率： （6-29）
局部气含率： （6-30）
（2）体积氧传递速率系数
体积传递系数的经验公式表示为：
（6-31）
式中 ——气体管流速（m/s）；
——经验常数。
Barker和Worgan推荐，对于低黏度的发酵液，和的关系为：
（6-32）
当时， （6-33）
对高黏度流体， （6-34）
式中 ——流变指数。
（3）循环周期与循环速度
循环周期指液体微元在反应器内循环一周所需要的平均时间，即平均循环时间。循环周期通常在2.5-4min之间。不同细胞的需氧量不同，所能耐受的循环周期也不同。循环周期可有下式计算。
（6-35）
式中 ——发酵液体积；
——发酵液体积循环流速。
通常液体在循环管内的流速可取1.2-1.4m/s。一般液体管流速与成正比，H为液面高度，H越大，压力差越大。对于低黏度液体，液体空管速度与气体空管速度的关系为：
（6-36）
适用范围为，，与发酵特性无关。黏度增大时，式（6-36）形式不变，系数减小。
（4）混合时间
在大设备中混合时间对反应器效率有很大影响。混合时间随气体在上升管中的空管流速的增加而减小，至0.03—0.04m/s后接近常数。由导流管上面环形涡流造成的混合过程对混合时间由很大影响，导流管离液面的距离对混合时间也有影响。
（5）停留时间
当气升式反应器连续操作式，物料在反应器内的停留时间是不同的。若以表示循环比，为通过上升管的总流量与系统进料流量的比例，则每一次循环后示踪量按的比例下降。N次循环后，示踪量下降[]倍，因此，出口后示踪的相对浓度必须乘上一项，为：
（6-37）
式中 ——相对停留时间时循环系统中的总浓度；
；
——平均停留时间；
，指n次循环；
——第n次循环时的相对浓度；
——时间t内的轴向扩散系数；
——平均循环时间；
——Bodenstein数；
——流体空管线速度；
——循环一周的距离；
——轴向扩散系数；
用代入式（6-37），得关于停留时间的分布：
（6）通气功率
气升式反应器的通气功率可用鼓泡通气功率的计算公式：
式中 ——液体密度；
——重力加速度；
——喷嘴距液面高度；
——通气量。
一般来说相同条件下，通气功率越大，供氧速率越大，供氧功率因数越小。
2．操作参数
（1）液面高度
气液分离器中液体的体积与总体积之比总对气含率、液体循环速度和气体再循环有显著影响，总越大，气含率降低，液体的循环速度增加，混合时间减少，功耗增加。当总增大到一定值时，气含率和液体循环速度不再变化，但能耗仍在上升，因此存在最佳值。可以看出，气液分离器中的总值，在设计和操作气升式反应器时要考虑。
（2）操作气速
表观气速影响气升式反应器的气含率、循环时间及液体体积传质系数，并且其影响还与反应器结构(如气体预分布器、内件设置等)和物料的特性有关。有研究表明在小固含率下，气速是影响的主要因素，而在大固含率下，主要受固含率影响。因此操作气速要从反应器结构、物料特性综合考虑，使其在功耗最小下得到最大的。
（3）溶液的性质
气升式反应器在生物技术领域的应用主要是发酵、废水处理和生物细胞培养等。由于粘性较高，为了提高传质速率，以往对发酵液和生物细胞培养液常采用机械搅拌罐。实际上，只要在介质中加入合适的聚合物，采用气升式反应器，不仅可以增强传质，提高产量，而且还可以降低能耗。
三、气升式反应器的流体动力学模型
根据动量平衡原理和漂流通量模型建立液体循环流动的模型方程，采用了一个总阻力损失系数表达方便的优点，又进一步建立了总阻力损失系数与各局部损失系数的关系，给出了各局部阻力系数的计算方法，对液体循环速度和气含率进行模型计算。
根据动量平衡原理，在稳定状态下，ALR内的上升管和下降管间的流体静压差是液体循环的推动力，该推动力与流体沿循环回路引起的总摩擦压降相平衡，即
（6-38）
式中 ——总摩擦损失系数，无因次；
——气体分散高度，；在工程上气体分散高度与反应器的静液高度 差别不大，可以用代替；
——粘度，；
——密度，；
——上升管气含率，无因次；
——下降管气含率，无因次。
由于下降管气含率很小可忽略，则上式为：
（6-39）
根据漂流通量模型，可以得到：
（6-40）
式中 ——表观气体流速，；
——上升管气液分离箱液体流速，；
——总流速，。
——分布参数，它反映了上升管内气含率、气泡大小和液体速度分布的不均匀性。均匀鼓泡流时Ｃ为1。
若已知和分布参数Ｃ，联立模型方程式（6-39）、（6-40）即可得到液体循环速度和上升管的气含率。式（6-38）中的总摩擦压降是流体在沿程流动的各局部压降之和：
（6-41）
式中 ——总压差，；
——上升管局部压差，；
——下降管局部压差，；
——气液分离箱局部压差，；
——底箱局部压差，。
若以下降管的液体速度为基准，则由上式可得总阻力损失系数与各局部阻力损失系数的关系为
（6-42）
式中 ——总阻力损失系数，无因次；
——下降管局部阻力损失系数，无因次；
——气液分离箱局部阻力损失系数，无因次；
——底箱局部阻力损失系数，无因次；
——上升管局部阻力损失系数，无因次；
——下降管的横截面积，；
——上升管的横截面积，。
由于气液分离箱、下降管和底箱中的气含率均很低，这些部分按单相流处理。上升管中气液两相流的阻力损失系数利用气含率适用范围较宽的关系式计算有：
（6-43）
式中 ——上升管高度，；
——上升管直径，。
下降管的阻力损失系数根据Blaius公式计算
（6-44）
式中 ——下降管高度，；
——上升管直径，。
四、气升式反应器的设计
1．液体喷射循环反应器基本设计参数
虽然气升式反应器有其自身的特殊性，是气液非均相体系，但是其最基本的原理和最重要的流体动力学参数及其相互关系是与纯水的液体喷射循环反应器相似的。可以将分布均匀的非均相体系看为均相，应用液体喷射循环反应器的结果。液体喷射式循环反应器的流体动力学式比较有代表性的，气升式反应器很容易模拟其结果，因此，从液体喷射循环反应器为例进行讨论。
基本设计参数：
反应器的高径比：；
反应器的体积：；
反应液质量：；
循环比：；
平均循环速度：；
循环空速：；
平均循环时间：；
平均停留时间：；
喷嘴出口液体流速：；
喷嘴雷诺数数：；
平均循环雷诺数数：；
雷诺数数之比：； （6-45）
以上各式中 ——液位高度；
——总流体的平均密度；
——总质量流率；
——循环质量流率；
——进出口质量流率；
——总体积流率；
，，——喷嘴处料液的体积流量，喷嘴管直径，料液密度；
——喷嘴处运动黏度；
——总流体的平均运动黏度；
——总流体的平均密度。
2．液体喷射循环反应器的循环阻力
平均循环速率越大，混合越强烈。通常是希望在给定入口喷射功率的条件下，达到尽可能快的循环速率。
循环的速率是阻力数相关。
（6-46）
式中 ——流体循环引起的阻力。
工程规模的反应器可用下列计算式计算阻力数
将上式中的代入（6-45）得
（6-47）
3．液体喷射循环反应器中驱动循环的功率和效率
喷嘴循环反应器的液体喷射功率由下式给定
定态下液体喷射功率必须大于循环功率。
产生循环的效率可用单位液体喷射功率所产生的循环功率表示
也可以根据式（6-47）表示为：
第三节 鼓泡塔生物反应器
常用的鼓泡塔反应器是气液两相反应器，是指气体鼓泡通过含有反应物或催化剂的液层以实现气液相反应过程的反应器。该反应器以气体为分散相、液体为连续相、涉及气液界面。通常液相中包含有固体悬浮颗粒，如固体培养基、微生物菌体等。反应器内流体的运动状况是随分散相气速的大小而改变的，一般分为两种：一种是均匀鼓泡流，此时气速较低，气泡大小均匀，浮升较有规则；当随着气速的增加，小气泡被大气泡兼并，同时也造成了液体的循环流动，我们把这一种称之为非均匀鼓泡流。为了有利于气体的分散和液体的循环运动，一般在塔内装多层水平筛板，其高径比大，液体深度大，我们把这种鼓泡式反应器称为高位筛板式反应器，见图6-7a。压缩空气由塔底导入，经过筛板逐渐上升，气泡在上升过程中带动发酵液同时上升，上升后的发酵液又通过筛板上带有液封作用的降液管下降而形成循环。在降液管下端的水平面与筛板之间的空间是气－液混合区。由于筛板对气泡的阻挡作用，使空气在塔内停留时间较长，同时在筛板上大气泡被重新分散，从而提高了氧的利用率。
除了气液两相外，还有气液固三相鼓泡塔生物反应器。张朝晖等采用三相鼓泡塔作为固定化培养产酶的生物反应器，用于间歇合成木素过氧化物酶系。气液固三相分别是空气、培养液和固定了菌丝的聚氨酯泡沫塑料块。反应器装置图见图6-7b所示，培养时空气由下而上鼓入，在反应器中沿着一侧的器壁上流，培养液和聚氨酯泡沫块在气流的带动下，作从下往上，再从另一侧顺流而下的循环流动，形成一个内循环气升式三相鼓泡塔反应器。由于聚氨酯泡沫的比重很小，润湿后其比重和水的比重相差不大，在鼓泡塔中能够获得很好的流化效果。
鼓泡反应器结构筒单，易于操作，操作成本低，混合和传质传热性能较好，因此广泛应用于生物工程行业中，例如乙醇发酵、单细胞蛋白发酵、废水处理、废气处理（例如用微生物处理气相中的苯）等。鼓泡反应器内无传动部件，容易密封，对保持无菌条件有利。
最简单的鼓泡式反应器内部是一空塔，塔的底部用筛板或气体分布器来分布气体。其工作原理是利用通入培养基中的气泡在上升时带动液体而产生混合，并将气泡中的氧供培养基中的菌体使用。
一、流体力学特征
一般可用压降、气含率、液体速度分布、分散和混合特征等来描述鼓泡反应器的多相流体特征。反应床内气体体积占总体积的百分比—气含率是鼓泡反应器的重要设计参数之一。气含率是与氧传递有关的参数，它与气泡直径一起决定气液界面的大小，气含率的径向分布还可用于计算液体流速分布。
分散和混合是生物过程中非常重要的参数。单靠通气常常不能使整个反应器内的物料完全均一，此时就需要通过混合来使菌体与氧和其他底物接触。
另外一些基本现象也可用来描述鼓泡反应器的特征，如气泡形成、围绕单个上升气泡的液体流动、气泡群中泡间的相互作用等。
1．气含率
工程上气含率通常用经验公式计算，公式形式较多，且都有一定的局限性，尤其反应过程伴有液体汽化发生时，其计算误差较大。
鼓泡反应器的气含率可用下式计算：
式中 ——气含率；
Ｖ——反应床体积；
、——气相、液相体积。
气含率可以借助γ线空隙率计测量反应床的空隙率(空隙率=气相占的截面积/总截面积)得到。但由于有些反应器反应床内气液混合相密度沿反应床高度方向不均匀，应用γ线空隙率计很难测定反应的平均含气率。
采用压差测量方法测量鼓泡反应器气含率，可以实现装置的在线测量，测量数据可靠，准确度取决于所用测量设备。根据需要，差压变送器与微机控制系统连接，很容易实现自动控制。
由于介质的密度具有叠加性质，可知气含率与密度的关系如下：
则气含率为：
（6-48）
式中 ——反应床内混合相密度；
、——气相、液相密度。
反应床压差ΔＰ与密度的关系为：
（6-49）
式中 Ｈ——反应床高度。
气含率与反应床压差的关系将式（6-49）与式（6-48）比较，整理得到气含率计算式：
（6-50）
由此可知，通过对反应床的压差测量，便可得到鼓泡反应器的气含率。
2．流体流动状态
鼓泡塔内的流体力学状况，－般是以空塔气速的大小作为划分依据的。对于低黏度的培养基，当≤5cm/s时，称为安静区。此时气泡直径相当均匀，气泡群中的气泡以相同的速度上升，不发生严重的聚并，相互间不易发生作用，这种流动状态称为拟均匀流动，工业上通常要求在这样的条件下操作。
当＞８cm/s，称为湍动区，流速增大至液泛点以上，大气泡生成，产生非均匀流动。对高黏度的培养基，气速低于５cm/s就有可能形成大气泡。大气泡的浮力大，它的上升引起液体在塔内循环，因此该状态也称为循环流状态。虽然大气泡的比例很小，但它的上升速度很快。因此在高气速区域，大部分气液传递是由大气泡来完成的，气泡群对传质的贡献相对很小，使得单位输入功率的氧传递效率严重下降。影响流体流动状态的因素，除气体流速外，还有分布器的设计参数，液体的物化性质和液体的速度等。同样悬浮颗粒的存在也影响流动状态。平均孔径小于的多孔喷嘴，对于不同的流体和反应器，当气速在至时，仍可保持均匀流动。
3. 压力降
如果忽略由于液体的惯性和壁摩擦引起的压力降，反应器的压力降主要由两项组成：气体分布器压力降和液体静压头
（6-51）
一般情况下，＞。通过沿塔的压力分布的在线测量可以确定气含率。在无因次轴向位置Ｚ处的压力为
（6-52）
式中 ——反应器顶部压力；
，——液位高度。
α为最大静压头与的比例：
（6-53）
4．能量消耗
鼓泡式反应器的功率消耗计算如下：
式中 ——液体密度；
——效率因子；
——气体体积流速；
——反应液柱高；
——塔底压力；
——塔顶压力；
——通过小孔的气体流速。
5．气泡上升速率和气泡直径
气泡上升速率和气泡大小是反映气泡在鼓泡床反应器内运动行为的重要参数，直接影响到相间质量传递、相界面积和各相的停留时间。其测量方法很多，如摄影或照片法、电导探头法、光纤探头法、化学法、PIV法等。气泡上升速率与气泡直径间存在着关联式，并可根据气泡上升速率求出气泡尺寸和气液接触面积。
根据气泡在床层内上升速率的差异可将其分为大小两种气泡，气泡尺寸不同，在上升过程中其运动特性也不相同。
随液体表面张力和粘度升高，气泡间的聚并加剧，气泡尺寸分布变窄，故小气泡速率升高，大气泡速率降低；且液体表面张力较低时，随表观气速升高，小气泡速率降低，大气泡速率升高；液体粘度较高时，随表观气速升高，小气泡速率变化很小，大气泡速率升高。
随系统压力升高，气泡聚并的推动力降低，聚并减弱，使小气泡速率降低，大气泡速率升高；在高压条件下，随表观气速升高，小气泡速率变化很小，大气泡速率升高。
二、传热和传质
1．流体的传递特性
对液相位完全混合状态的鼓泡塔，其体积传质系数KLa可用Akita和Yoshida的经验式计算
（6-54）
式中 ——塔径；
——发酵液的运动黏度；
——气液表面张力；
——液相扩散系数；
——液体密度；
——重力加速度；
——气含率。
该式用于大规模反应器，塔径可达５.５ｍ，对大直径的反应器塔径的影响被消除，当＞60cm时，上式用＝60cm计算。应用限制条件还有：低黏度流体（≤21m·Pa·s），静态分布器。用上式计算的值比较保守，通常会比实际值小。上式也可试用于大型鼓泡反应器的的计算，因此可用该式进行以为基准的鼓泡反应器的放大。
2．热量传递
鼓泡塔生物反应器内的传热通常采用两种方式，－种是夹套、蛇管或列管式冷却器，另一种是液体循环外冷却器。
鼓泡塔的传热过程有以下特点：
① 由于鼓泡引起的床层液体循环，使床层内气液的温度分布比较均匀。热交换装置的几何形状以及是否装置挡板均不影响传热，塔径大于0.1ｍ时塔径对传热也没有影响。
② 由于液体的湍动，壁膜给热系数显著增加。通常鼓泡塔的传热速率与机械搅拌反应器的相近。
③ 鼓泡位置对给热系数有影响。在相同的表观气速下，当鼓泡仅在近器壁处进行时，给热系数较大，鼓泡在全截面均匀进行时，给热系数次之，鼓泡仅在容器中部进行时给热系数最小。因此环形分布器对传热比较有利，中间单孔鼓泡的反应器对传热不利。
④ 表观气速对给热系数有影响。当＜５cm／s时，即均匀流动状态，给热系数随气速的增加而迅速增大，当６＜＜１０cm／s时，即非均匀流动状态，操作处于湍流区，给热系数随气速增加而缓慢上升。
两相或三相塔式反应器中壁传热系数Ａ可由下式计算，可应用于低密度或高密度介质：
（6-55）
式中 ——液体比热。需注意当有微生物黏着于热传递表面时，会降低热传递的速率，影响上式的可应用性；
——运动黏度。
在热量传递计算中，常用Nusselt准数：
（6-56）
式中 ——热传导系数，Ｗ/ｍ·Ｋ。
Nusselt准数是湍流热传递和纯热传导之比。类似用于传质的Sherwood准数。热传递系数用数群关联为
（6-57）
式中 ——非牛顿型流体的Prandtl准数。
对牛顿型流体上式简化为：
（6-58）
三、鼓泡塔反应器模型
鼓泡塔反应器可分为半间歇半连续操作和连续操作。当为半间歇半连续操作时，液相为间歇操作，而气相为连续操作。此时气相一般可按活塞流模型处理，而液相则为全混合流型。当鼓泡塔为完全连续操作时，气液可并流向上或者是气液相逆流。在连续操作时，若为均匀鼓泡区，气液相的流型均可近似做活塞流处理，当处于过渡流及非均匀鼓泡区时，气体及流体均产生退混，可按有反混的轴向扩散模型处理。该模型的质量恒算方程式为：
累积项=对流项+扩散项+传质项反应项
若以菌体浓度表示，则为：
（6-59）
式中 ——菌体浓度；
——流体线速度；
——液相扩散系数；
——体积传质系数；
——菌体的饱和浓度；
——菌体生长速度；
——时间；
——塔的轴向距离。
1．若菌体的生长为非限制型，即此时菌体的生长不受基质的限制，符合以下式子的生长动力学
的生长动力学。
假定在稳态下操作，且无界面传质，并有，则对式（6-59）进行无因次化处理，可得
（6-60）
边界条件为
式中 ——Peclet准数；
——Damkohler准数；
；
。
式（6-60）的解如下：
当时
（6-61）
式中 。
当时
（6-62）
当时，
（6-63）
式中
2．若菌体的生长为基质限制型，此时菌体得比生长速度与基质浓度有
。
当处于稳态，用一维扩散模型描述菌体和基质的质量平衡关系，分别有：
（6-64）
（6-65）
边界条件分别为
时
时
式中 ；
；
；
；
。
式（6-64）、（6-65）只能数值求解
当、时，借助计算机求得稳态下出口基质浓度与的关系，如图6-7c所示。
从图中可以看出，当时，在对应的准数下可得最小的值，即基质的转化率可达到最大。当准数进一步增大时，菌体浓度下降，基质浓度升高，基质转化率下降。
3．若氧的传递成为菌体的生长限制因素时，此时有
（6-66）
（6-67）
式中 ——氧在液相中浓度；
——氧的饱和常数；
——氧的菌体得率。
假定塔内气含率沿塔高变化不大，液相和气相轴向扩散系数均可示为常数，做稳态下液相和气相的氧平衡：
液相 （6-68）
气相 （6-69）
式中 ，——液相和气相轴向扩散系数；
、——氧在液相中的饱和浓度和溶解浓度；
——气体线速度；
——轴向距离；
——气体常数；
——体系温度；
——氧的质量（mol）；
、——液相和气相体积分率。
若将式（6-66）、（6-67）直接代入上述二式中求解，则由于式（6-68）和（6-69）均为非线性方程，只能数值求解。
当时，式（6-67）可化为
（6-70）
该式表示与为线性的一级反应关系。
若假定由于气相中氧的消耗很少，则反应器进出口氧含量变化不大，并且可视为常数，因此可略去方程（6-69），只剩下液相的质量平衡方程（6-71）。
（6-71）
边界条件为
当时，
当时，
式（6-71）为一线性微分方程，可以解得：
（6-72）
式中
，，，
根据Deckwer推荐的经验式，液相轴向彼克列准数可以用下式计算。
（6-73）
为弗鲁德准数（Froude），可以用下式表示。
式中 ——塔的直径，其它符号同式（6-68）和（6-69）。
第四节 膜生物反应器
膜生物反应器是一种可以同时进行两种操作程序的装置。即在生物反应器内既可控制微生物的培养，同时又可排除全部或部分培养液，用指定成分的新鲜培养基来代替它，为去除培养液，把它从细胞分离出来，通常是利用各种类型的聚合物膜，建立一个培养微生物过程，这个过程中液相是不间断的，固相是周期性的。
膜生物反应器是国际上20世纪末发展起来的高新技术，它将膜分离技术和生物技术有机地结合在一起，具有传统工艺不可比拟的优点，成为近些年来的研究热点，膜生物反应器具有以下几方面的优点：
① 增大反应速率。在生物学中有许多反应是产物抑制型，即随着反应的进行，产物浓度提高，反应速率下降。采用膜生物反应器可在反应过程中移去产物，使产物浓度保持恒定，反应速率因此会提高。
② 提高反应转化率。膜生物反应器通常在常温和常压下进行生化反应，可使产物或副产物从反应区连续地分离出来，打破反应的平衡，从而可大大地提高反应转化率，增加产率或处理能力，过程能耗低、效率高。
③ 简化生产步骤。膜生物反应器使反应和分离在同一个步骤里完成，简化了生产步骤，减少劳动量，提高了劳动效率。
④ 截留生物催化剂，使细胞或酶在高浓度下进行。
⑤ 减少了能耗，节约了成本。
一、膜生物反应器的分类
膜生物反应器从整体构造上来看，是由膜组件及生物反应器两部分组成，根据这两部分操作单元自身的多样性，膜生物反应器也必然有多种类型：
① 按膜组件部分从构型上可分管式、板框式、卷式及中空纤维式。
② 按膜材料可分为有机膜和无机膜两大类；根据膜孔径大小的不同可分为微滤膜和超滤膜。
③ 按膜过滤的压力驱动方式可分为加压型和吸引型两大类。
④ 按生物反应器部分可分好氧、厌氧两大类。
⑤ 按反应器内生物催化剂的状态，可分为游离态和固定化膜反应器。
⑥ 按底物和产物通过膜的传质推动力，可分为压差推动和浓差推动的膜反应器。
⑦ 按膜反应器的结构型式，可分为平板膜、螺旋卷绕膜、管状膜及中空纤维膜等膜反应器。
⑧ 按组合方式又可分为分置式和一体式。
⑨ 按反应器内流体与生物催化剂的接触形式，可将膜反应器分为直接接触式、扩散式和多相膜三类。
⑩ 膜组件在膜生物反应器中所起作用的不同，大致可将膜生物反应器分为分离膜生物反应器、无泡曝气膜生物反应器和萃取膜生物反应器三种。
目前常应用的膜生物反应器有分置式与一体式、分离膜生物反应器、无泡曝气膜生物反应器和萃取膜生物反应器，下面重点介绍这几种形式的膜反应器。
1．分置式与一体式膜反应器
分置式是指膜组件与生物反应器分开设置，超滤膜的压力驱动是靠加压泵；一体式是指膜组件安置在生物反应器内部，压力驱动靠水头压差，或用真空泵抽吸，可省掉循环用的泵及管路系统。
分置式与一体式的优缺点比较：分置式由于膜组件自成体系，有易于清洗，更换及增设等优点，但泵的高速旋转产生剪切力对某些微生物菌体会产生失活现象；一体式通常在生物处理槽内设置中空轴及圆板状膜，通过中空轴的旋转，使安装在轴上的膜也随之转动，利于防止膜污染，属错流型膜件。也有将中空纤维膜组件直接放入曝气池内，膜出水靠真空泵抽吸来实现，或利用液位差做出水动力。由于一体式不使用循环泵，可避免微生物菌体受剪力而失活。对于象槽内设转盘膜或中空旋转圆板膜这一类一体式，通常膜部分的拆装、清洗较困难，而中空纤维式膜由于体积小，组装灵活，可分组设置若干框架结构，便于从曝气池中取出，克服了不易拆装、清洗的缺点，但分置式的动力耗费很大。
2．分离膜生物反应器、无泡曝气膜生物反应器和萃取膜生物反应器
根据膜组件在膜生物反应器中所起作用的不同，大致可将膜生物反应器分为分离膜生物反应器、无泡曝气膜生物反应器和萃取膜生物反应器三种。它们的流程图见图6-9所示。分离膜生物反应器中的膜组件相当于传统生物处理系统中的二沉池，在此进行固液分离，截留的污泥回流至生物反应器，透过水外排；无泡曝气膜生物反应器采用透气性膜，对生物反应器进行无泡供氧；萃取膜生物反应器利用膜将有毒工业废水中的优先污染物萃取后对其进行单独的生化处理。从图可以看出，膜生物反应器主要是由膜组件、泵和生物反应器三部分组成。
这三种膜生物反应器主要应用于活性污泥与废水处理当中，此中生物反应器是污染物降解的主要场所。
二、膜材料和膜组件
膜可以看成一种材料，这种材料能让某种物质比其他物质更容易通过，膜的这种性质奠定了膜分离的基础。扩散定理、膜的渗析现象、渗透压原理、膜电势等一系列研究为膜的发展打下了坚实的理论基础。
1．膜材料
膜根据制膜材料的不同分有机膜和无机膜。目前世界膜及膜装置的市场总销售量已超过100亿美元。固体膜占99%以上，其中尤以有机高分子膜材料制备的膜为主。有机膜的特点是：高的分离效率，不发生相变，设备简单，易操作，能耗少；缺点是：易受污染、堵塞，操作温度低、使用寿命短。无机膜的销售额占市场的10～20%，并以每年35%的增长率发展。下面简单介绍一下两者的现状及未来的走势。
（1）有机膜
二百多年前，Ｎollet发现膜的渗透现象以来，膜分离技术已有巨大的成功。如30年代的微孔过滤、40年代的渗析、50年代的电渗析、60年代的反渗透、70年代的超滤、80年代的气体分离、90年代的渗透蒸发相继问世，膜分离技术日趋成熟，而贡献最大的则是高分子材料制成的有机膜。所有膜中有机膜占了80～90%，应用十分广泛，从环境、化工、生物到食品各行业都采用了有机膜分离技术。因此，有机膜现在的发展状况和未来的发展趋势都将是我们关注的焦点。
有机膜的材料有多种，大致可以分为以下几类：
① 纤维素衍生物类：再生纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素类、乙基纤维素类、其它纤维素类。
② 聚砜类：双酚型聚砜、聚芳醚矾、酚酞型聚醚砜、聚芳醚酮。
③ 酰胺类：脂肪族聚酰胺、芳香族聚酰胺、聚砜酰胺、反渗透用交联芳香含氮高分子。④ 聚酰亚胺类：脂肪族二酸聚酰亚胺、全芳香聚酰亚胺、含氟聚酰亚胺。
⑤ 聚酯类：涤纶、聚对苯二甲醇丁二醇酯、聚碳酸酯。
⑥ 聚烯烃类：聚乙烯、聚丙烯、聚4- 甲基戊烯
⑦ 乙烯类聚合物：聚丙烯腈、聚乙烯腈、聚氯乙烯。
⑧ 含硅聚合物：聚二甲基硅氧烷、聚三甲基硅丙炔。
⑨ 含氟聚合物：聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯。
⑩ 甲壳素类：脱乙酰壳聚醣、胺基葡聚醣、甲壳胺。
在有机膜的实际应用中，反渗透膜材料以醋酸纤维素类为主，芳香族聚酰胺类为次，其它还有聚苯并咪唑、磺化聚磺酸盐、聚乙烯腈等。超滤膜材料一般是醋酸纤维素、聚酰亚胺、聚丙烯腈、聚醋酸乙烯、两性离子交换膜和芳香族高聚物等。微滤膜材料则是由聚酯、聚碳酸、纤维素及聚四氟乙烯等一系列物质组成。
有机膜在以后的发展中仍将是用于各种膜分离过程的主要分离膜。有机膜目前的研究方向应该是加强超薄和活化。具体则是需继续进行各种分子结构、各种功能基团有机高分子膜材料的合成，根据不同的分离对象，引入不同的活化基团，对膜的表面进行改性，研究新的成膜工艺，进一步发展制备超薄、高度均匀的有机膜技术，最后则是发展高分子合金膜。
（2）无机膜
无机膜的研究始于20世纪40年代，但真正的商品化无机膜是从80年代法国ＳＦＥＣ改进了美国联合碳化物公司的技术而发展起来的。1981年，SFEC成功地将商品化的氧化锆投入了奶业、饮料业等行业中并将它推广。先后在食品、化工、环境、生物等领域广泛使用。无机膜具有耐高温、孔径大小易控制等优点，大大弥补了有机膜在这些方面的不足。在膜分离技术中，无机膜开始展露出它不可为有机膜替代的一面。
如今制备无机膜的材料也是多种多样，像金属膜，它是以金属粉末(如Pd或Pd 和Ag合金)为原料涂装成管式模件再通过烧结而成。玻璃膜则是某种由SiO2、B2O3、Na2O组成的均匀玻璃熔融物通过分相形成两相，然后在酸中浸制而成的。碳膜这种一般为非对称结构的无机膜则是通过lecarboneorraine工艺将非常精细的碳微粒产生分离层而形成或通过techsep工艺将石墨膏挤制成管式膜，然后再使精细微粒沉积在这种对称结构上而制得的。陶瓷膜有Al2O3、ZrO2膜，其以热稳定性最好著称。
虽然无机膜的发展速度和应用范围都没有有机膜来得快来得广，但近几年所受重视程度并不亚于有机膜。特别是在日本，其发展的速度是最快的。无机膜在生物、化工、核工业、冶金特别是在食品、饮料、医药及环保等行业中应用广泛，而且部分无机膜在日、美等欧美发达国家中已实现了商品化。
2．膜组件
应用于膜生物反应器的膜组件形式主要有管式、平板式、卷式、微管式以及中空纤维等膜组件形式，在分置式膜生物反应器工艺中，应用较多的是管式膜和平板式膜组件，而在一体式膜生物反应器中多采用中空纤维膜和平板式膜组件。膜组件的设计宗旨是考虑如何使膜抗堵塞，从而维持长久的寿命。现在，在日本采用最新的形式是以中空纤维膜制成膜块和膜堆，整齐排列浸没在污水中。膜和集水管相连，通过抽吸作用出水7:9。这种形式可以有效的防止膜内部的阻塞。各种形式的膜组件如图6-10所示。
表6-2 不同形式膜组件的性能比较
膜组作形式
膜填充面积，m2·m3
投资费用
操作费用
稳定运行
膜的清洗
管式
20~50
高
高
好
容易
平板式
400~600
高
低
较好
难
卷式
800~1000
很低
低
不好
难
微管式
600~1200
低
低
好
容易
中空纤维膜
8000~15000
低
低
不好
难
图6-10 各种形式的膜组件
三、膜生物反应器工艺设计的考虑因素
在膜生物反应器设计中，通常根据物料特性和工艺要求，确定反应器类型和结构，确定最佳工艺、操作条件和工艺控制方式，确定反应器大小和结构参数等。主要考虑的三方面是：生物因素、水力学因素和膜，同时考虑投资费用和操作费用，由于涉及面广，参数多，设计优化复杂，通常从经济角度进行全面的系统分析来优化。图6-11表示膜生物反应器的工艺流程。
1．生物因素的考虑
（1）膜生物反应器中底物(基质)的降解
在膜生物反应器中，主要是微生物生长和底物的消耗，忽略产物的抑制作用，通常以Monod方程表示底物的降解速率(-dCs/dt)：
-
式中 ——微生物最大生长速率；
Cs——底物浓度；
Cx——微生物浓度；
——总的微生物得率；
Ks——饱和常数。
可以看出在一定的条件下，、Cs和Cx越大，越小(取决于微生物的种类等)底物的降解越快，据此可减小反应器体积。
（2）膜生物反应器尺寸(V)
V可据污水处理量(Q)和试验的最佳HRT计算，V=Q×HRT通常据不同应用场合，V在数m3至数千m3之间。
2．膜有关的因素
（1）膜材料选择
常用的膜材料有聚砜(PSF)、磺化聚砜(S-PSF)，聚醚砜(PES)、聚丙烯腈(PAN)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和陶瓷等，这些材料都耐生物降解，优选亲水性好的膜材料以耐污染。
（2）膜的孔径
膜的孔径在0.01～0.1μm之间为好，优选孔径分布窄，单皮层非对称膜，以耐污染和易清洗；膜纯水渗透性约在4～40L/m2.kPa左右；据实际需求，运行中膜通量能保持在20～200L/m2.h。
（3）膜组件
膜组件可选用管式、板式、卷式和毛细管式，现多用毛细管式，对粘度大的进料可选用管式。
（4）膜性能
膜性能根据实际小试和扩式中相关膜的性能，选取膜和组件，并决定其数量和配置方式等。
（5）膜的清洗
膜的清洗对稳定膜的通量、保证使用寿命至关重要，通常据污染物的性质和膜的性质采用物理和化学方法进行清洗。对RMBR目前多采用反冲洗加定期化学清洗；对SMBR，在池中加入少量粉末活性炭等，在曝气的同时，可更新膜表层，是十分可取的。
3．水力学因素
（1）膜面流速与浓差极化和凝胶层形成
膜面流速取决于膜组器的形式和膜生物反应器的类型，对浸泡式膜生物反应器，取决于曝气强度等，对RMBR，为消除浓差极化和凝胶层形成，内压式中空纤维组件，膜面流速通常应在1.5m/s以上，这与进料的粘度和MLSS有关，对高粘度的进料应选择管式膜组件，膜面流速通常应在3m/s左右，对管式膜组件有人提出如下公式：
式中 ——膜面流速；
——膜通量；
——管径；
Y——产水粘度；
Ds——可溶有机物溶质扩散系数；
Cg、Ce、Cw——凝胶层、产水、回流浓缩污泥中有机物浓度；其中Cg的浓度很关键，在低于一定值后，在定流动条件下可不产生凝胶层。
为了保证膜面的流速，对RMBR通常进料都有一再循环回路，经一增压泵来实施。
（2）膜通量与有效压力
除膜本身外，膜通量与进料性质、流速和有效压力有关，通常表达式如下：
式中 △P——有效压力；
μ——物料粘度；
——膜的阻力；
——不可逆污染阻力；
——凝胶层阻力。
很显然，一切降低μ、、和的措施，都有力于提高膜通量。在一定范围内增加△P可提高膜通量，但一般情况下，操作压力在0.1～0.3MPa。也可以将MBR的其他相关工艺参数与Jv建立定量关系，如
式中 Q——进料量；
β——剩余污泥引出率；
——重力装置容积；
——膜分离装置效率；
δ——膜分离装置与同等能力的重力分离装置容积比。
四、膜生物反应器的应用
（1）截留细胞或酶
膜反应器的最重要优点是把细胞或酶保留在反应器中。反应器连续灌流，在常规连续反应器中的洗出现象不会发生。膜也可同时将产品和细胞或酶分离，简化下游分离步骤。虽然其他固定化技术也有这些特点，但是在膜包埋中，不使用化学试剂，条件不苛刻，膜包埋可能是最温和的方法。酶的膜包埋对其本征动力学没有很大影响，膜包埋很温和，对于易受伤害的哺乳动物细胞很适合，因为它们缺乏微生物的弹性细胞壁。而且，中空纤维具有很高的膜表面积，有利于贴壁依赖性细胞的附着生长。在膜反应器中，通过细胞截留可达到高的细胞密度。如果细胞易结团生长，如植物细胞，膜包埋特别有帮助。植物细胞产率与结团大小有关，在膜反应器中比在悬潺培养中更易于控制，结团造成其内部底物峡乏、中间代谢物或激素积累，细胞间的相互作用很复杂。
膜反应器也用于不同酶、辅因子或微生物的共包埋。例如，将辅因子（如NAD＋）与大分子相结合（如聚乙烯醇），用超滤膜保留在反应器中。多种酶的共包埋成功用于复杂的酶反应。
（2）选择性供应和除去不同化学物质
膜反应器最重要的特征之一是综合应用了分离过程广泛开发的技术。膜对不同物质的选择性透过性能，可用来去除抑制性代谢物和回收不稳定产物，防止降解。用酶反应器水解蔗糖，可分离单糖和二糖。在包埋酵母的膜反应器中，可用反渗透膜选择性除去抑制剂乙醇而保留葡萄糖。
通过选择合适的膜孔径可浓缩大分子产物。应用于动物细胞培养中，可富集产物，降低分离成本，间歇或在操作结束时从细胞区收集浓缩产物。膜反应器截留了产物，也浓缩了蛋白酶，应考虑蛋白水解的可能性。为了防止产物降解，要经常甚至连续除去产物。
（3）酶和细胞的保护
机械应力对菌丝体微生物、植物细胞、尤其是动物细胞（缺乏坚硬的细胞壁）的活性有很大的影响。碰撞和机械搅拌造成的剪切以及气泡破裂引起的细胞损伤都有不同的作用。酶和简单原核生物（除放线菌以外）对反应器中的剪切力不敏感，在搅拌罐中失活的原因是在气液界面蛋白质和其他生物大分子的变性，在有泡沫时尤其严重。在循环式反应器中，微生物可以达到高密度，但是用泵使细胞通过外循环会造成伤害。在膜反应器中，这些问题都可以消除，酶或细胞处于相对静止的环境，免受机械伤害，而且一般不与空气直接接触。在某些情况下，膜反应器可采用相对较粗的原料，因为胶粒、微粒和其他无用的成分不会进入酶和细胞区。在膜反应器中水解乳糖，可以使用未处理的乳清或脱脂牛奶。同样，在动物细胞培养基中不需要的蛋白质也不会进入细胞区的浓缩产品中。膜反应器也可能提供一定程度的保护，抗细菌、支原体甚至病毒的污染。
（4）迅速更换培养基
在许多生物转化过程中，要改换一次或多次培养基。生物转化和静息细胞体系，这些过程要求在无细胞生长下完成。对于微生物转化，通常的方法是先发酵，再离心或过滤，除去生长培养基，随后洗涤细胞，再悬浮在含有被转化化合物的缓冲液中。相似地，植物细胞在生长和产物合成阶段，常需要不同培养基，而且收集产物时，需要含有透化剂（如二甲基亚矾）的溶液或改变pH值和离子强度。这种过程难于在常规装置中放大，但是，在灌注膜反应器中，液体停留时间短，培养基能快速更换，较适于这些场合。
（5）污水处理与回用
膜生物反应器可用于污水处理与回用，诸如生活污水、粪便污水、一般的工业废水以及难降解的有机工业废水等都得到了有效性的公认。经膜生物反应器处理后，出水水质良好，出水悬浮物和浊度接近于零，可直接回用，实现了污水资源化。由于膜的高效截流作用，使微生物完全截留在反应器内，实现反应器水力停留时间和污泥龄的完全分离，运行控制灵活稳定。延长大分子有机物在反应器内的停留时间，使之得到最大限度的降解。利于硝化细菌的截留和繁殖，系统硝化效率高。通过运行方式的改变亦可有脱氮和除磷功能，氨氮去除率远高于传统工艺。因为泥龄长，大大提高了难降解有机物的降解效率，反应器在高容积负荷、低污泥负荷、长泥龄下运行，基本实现无剩余污泥排放。用膜生物反应器处理污水还具有运行费用低，由于系统采用PLC控制，可实现全程自动化控制。膜生物反应器设备布置可集中可分散，具有灵活性，可实现污水就地处理，进而节约大量的给排水管网及泵站的费用，并减少占地费用。同时膜生物反应器噪声小，对设备间外不会有明显影响。
五、膜生物反应器的研究进展与研究方向
（1）膜生物反应器在我国的研究概况
我国对膜生物反应器的研究仅有10年，但发展十分迅速。1991年10月，岑运华介绍了膜生物反应器在日本的研究状况。1993年前后，许多高校与研究所加入了膜生物反应器的开发研究工作。近两年来，膜生物反应器在国内已进入了实用化阶段。日本、德国、英国以及法国等国家的生活污水的处理与回用中膜生物反应器工艺的应用规模正不断扩大。目前，我国在这方面的研究已取得了很大的成效，清华大学、同济大学、天津大学等高校和中科院等科研机构都在从事膜生物反应器工艺的理论与科学研究工作。膜生物反应器系统的处理对象从生活污水扩展到高浓度有机废水和难降解工业废水，如制药废水、化工废水、食品废水、屠宰废水、烟草废水、豆制品废水、粪便污水、黄泔污水等。从目前的趋势看，污水回用将是膜生物反应器在我国推广应用的主要方向。
（2）存在的问题
MBR工艺有传统工艺所无法比拟的优点，但也存在较难克服的问题。首先如何防止膜污染，是国内外研究者面临的主要问题。诸多研究表明，生物细胞的胞外聚合物是膜污染的重要因素，因为它在污泥混合液中的累积可引起混合液粘度的增加以及膜过滤阻力的增加。膜污染现象非常复杂，它取决于浓度、温度、pH值、离子强度、氢健、偶极间作用力等物理和化学参数。其实，膜污染在膜生物反应器工艺中是非常复杂、难控制的，它是膜生物反应器工艺实用化的主要问题。
能耗是制约膜生物反应器推广的又一重大问题，因为膜生物反应器工艺的发展不仅取决于工艺本身，还取决于其经济可行性。分置式好氧膜生物反应器的典型能耗为6kWh/m3～8kWh/m3。此外，低成本的膜材料的开发、膜材料的改性、膜寿命的延长等问题都是膜生物反应器工艺应用于污水处理与回用所亟待解决的问题。
（3）今后的研究热点
今后国内对膜生物反应器的研究大致可分为以下几个方面:
① 探索不同生物处理工艺与膜分离单元的组合形式，生物反应处理工艺从活性污泥法扩展到接触氧化法、生物膜法、活性污泥与生物膜相结合的复合式工艺、两相厌氧工艺等；
② 影响处理效果与膜污染的因素、机理及数学模型的研究，探求合适的操作条件与工艺参数，尽可能减轻膜污染，提高膜组件的处理能力和运行稳定性；
③ 扩大膜生物反应器的应用范围，膜生物反应器的研究对象从生活污水扩展到高浓度有机废水(食品废水、啤酒废水)与难降解工业废水(石化废水、印染废水等)，但以生活污水的处理为主；
④ 开发研制性能优越的新型分离膜，尤其是耐污染膜的开发研制，新型膜组件的开发研制，膜组件清洗手段和频率的试验和探讨；
⑤ 膜生物反应器工艺流程形式及运行条件的优化；
⑥ 目前国内外膜生物反应器的工艺设计尚末见有较成熟、系统的方法，建立一套合理的设计方法和标准也是急需解决的问题之一。
第五节 酶生物反应器
酶是生物体为其自身代谢活动而产生的生物催化剂。以酶为催化剂进行生物反应所需要的设备称为酶反应器。它是当今酶工程研究的重要内容，通过对酶反应器动力学和热力学模型的研究，可以为酶反应器的设计、选择以及应用提供重要的理论依据。
一、酶生物反应器的分类
根据酶催化剂类别的不同，酶反应器可分为游离酶反应器和固定化酶反应器。固定化酶反应器又可分为固定化单一酶、复合酶、细胞器和细胞等型式的反应器。
酶催化生物反应器是根据其型式与操作方式进行分类，如表6-3所示。从几何形状或结
表6-3 酶反应器的型式
型式名称
操作方式
说明
单项系统酶反应器
搅拌罐
分批、流加
靠机械搅拌混合
超滤膜反应器
分批、流加或连续
适用于高分子底物
多项系统酶反应器
搅拌罐
分批、流加或连续
靠机械搅拌混合
固定床或填充床
连续
适用于固定化酶或微生物的反应器
流化床
分批、连续
靠溶液的流动而混合
膜式反应器
悬浊气泡塔
连续
分批、连续
膜状或片状的固定化酶适于气体为底物
构来划分，酶反应器大致可分为罐型、管型和膜型３类。每一类又有多种类型，并且有些反应器可互相组合成具有不同性能的酶反应器系统。罐型反应器内一般装配有搅拌装置，故称其为“机械搅拌式生物反应器”，适用于上述各种操作。管型反应器和膜型反应器一般用于连续操作，对相对直径较大、纵向较短的管型反应器也称为塔式反应器。目前，发酵工业上广泛使用的糖化罐、液化罐等都是典型的酶反应器。
酶反应器成功进行连续操作的首要要求是将酶限制在一定区域内来同底物反应。采用连续式操作的反应器，由于反应器内流体的流动状态会影响到底物的转化率（conversion），所以把握好反应液的流动状态与流体的混合程度是很重要的。根据流体流动的特性，连续式操作的酶反应器可以按照表6-4进行分类。活塞式流动是指反应液在反应器内径向呈严格均一的速度分布，流动如同活塞运动，反应速度仅随空间位置不同而变化。全混式流动是指反应器内混合足够强烈，因而反应器内浓度分布均匀，且不随时间变化。当然，这也是一种理想化的假定，它是与活塞式流动相对应的另一个极端的理想流型。实际酶反应器中是不存在上述理想化的流动形式的，这是因为流动状态和温度、浓度等参数是随空间位置或时间而变化的。
表6-4 连续式反应器的流动状态
流动状态
反应器
实用反应器
理想型
活塞式
(plug flow）
连续操作活塞式反应器
（continuous plug flow reactor， CPFR）
填充床、膜反应器
全混式
(backmix）
连续操作搅拌式反应器
（continuous-flow stirred tank reactor，CSTR）
搅拌罐
非理想型
具有返混的管型反应器
采用连续操作搅拌式反应器（CSTR）进行酶促反应与采用连续操作活塞式反应器CPFR的相比，尽管从结构和流动状态上有明显的不同，但若经过时间和滞留时间都着眼于同一流体要素的话，两种反应器有着相似的特征。也就是说，在CPFR反应器中，特定位置的状态取决于流体通过此位置时在反应器内存在的时间，所以，从这一点来讲，这两种反应器是类似的。
（一）膜式酶反应器
膜式酶反应器通过膜的选择性透过作用在有外推动力的情况下实现目标成分从反应混合物中的分离。膜也能被用作固定化酶的载体，即在进行催化反应的同时，实现产品的分离浓缩，催化剂的回收再利用。近年来，在两相或多相生物催化反应体系中利用膜实现不同相间的隔离，提供相界面的反应接触区和界面催化酶。
酶通常以可溶的或以不溶状态处在膜的表面或微孔中。酶若以游离态存在，可以通过分子筛、静电斥力等以化学和物理作用将酶固定于中间支持体(憜性氮，凝胶，脂质体)，从而将酶限制在膜某一侧的空间范围。采用化学结合法，物理吸附或静电吸附能将酶直接固定在膜上。在多相反应体系中，酶通常固定在膜亲水的一侧或膜内；但是对某些酶如酯酶，酶则固定在膜朝向疏水的一侧。
1．超过滤式膜式酶反应器
这类反应器的酶可以以固定化或以游离态存在。底物一进入膜的一侧，就能与可溶性的酶接触进行反应。图6-12是典型的三种超过滤式膜式酶反应器形式（S1产物，P底物，圆点是酶）。
2．扩散型膜式酶反应器
这类反应器底物分子需经过被动扩散通过膜微孔后到达酶反应区，酶以固定化或游离态存在。这类反应器要求反应底物是小分子量的，催化反应得到的产物又扩散回到未反应的底
物中不断循环。此类反应器常使用中空纤维膜，酶一般位于纤维的外层。此类反应器可分为图6-13几种形式（S1产物，P底物，圆点是酶）。
3．接触式多相膜式酶反应器
这是指能促使底物和酶在膜上进行相界面接触的一类反应器，如图3（S产物，P底物，圆点是酶）。
4．动态膜分离式酶反应器
动态膜分离式酶反应器(Enzyme Reactor with Dynamic Membrane-Separation，简称为DMER)是超滤膜式反应器的一种，酶以游离态直接与原料液混合，能方便的使酶反应连续进行，酶得到反复的高效利用，产率提高而操作成本下降，实为酶的固定化的一种。与填充床、流化床式反应器相比，膜的选择性透过作用可使产物透过膜，而基质被截留在膜的另一侧，从而使反应平衡向生成产物的方向移动。而对有产物抑制的酶反应，产物透过膜孔不断分离解除了抑制，使反应向正方向进行，提高转化率。
（1）DMER酶反应器结构
DMER酶反应器结构简图如图6-15所示。
DMER酶反割分子量可根据反应物和产物分子量来定，随着反应的进行，产物随时滤出，有效地消除反应器由单级或多级串联的膜滤室组成，滤室中装有旋转叶轮，在滤板两侧固定有滤膜，其起了产物抑制现象。滤室又是反应室，反应料液轴向进入反应室，由旋转叶轮带动呈周向运动，形成十字流过滤(又称横流过滤)；同时由于旋叶上的刮刀与膜之间间隙很小，从而强化了反应室内的湍流和膜面剪切效应，有效地削弱了膜表面浓差极化现象，提高了膜滤速率。当DMER中只安装一块滤板，则构成了单级的DMER酶反应器。增加滤板数量即增加过滤级数，则构成由多个滤室组成的多级DMER酶反应器。
（2）DMER酶反应器特点
① DMER酶反应器是一种新型高效多功能酶解反应器，实现了反应与分离一体化，使用功能强。它成功地用于生物酶法降解菊粉生产果糖工艺，也可以相应推广应用到其他酶水解过程。
②单级DMER酶反应器属CSTR型反应器。
③多级ＤＭＥＲ的流体特征不同于CSTR型和PFR型反应器。其中的酶解产物在每一个室内及时分离移出，有助于提高酶反应的转化率。通过对反应器停留时间分布统计特征值的比较可以看出，DMER反应器在流体流动性能上优于CSTR型反应器。
二、酶反应器设计和操作的参数
决定酶反应器设计和操作性能的参数有停留时间τ、转化率χ、反应器的产率Pτ、酶的用量、反应器温度、pH和底物浓度等。当副反应不可忽视时，选择性［S］P也是很重要的参数。
(1)停留时间τ
停留时间τ是指反应物料进入反应器时算起，至离开反应器时为止所经历的时间。分批式搅拌罐（batch stirred tank reactor，BSTR）中，所有物料的停留时间是相同的，且等于反应时间；CPFR中两者也是一致的。对于CSTR，常使用“平均停留时间”来表达。如果反应器的容积为V，物料流入反应器中的体积流量为Ｆ，平均停留时间τ的定义式为
（6-74）
式中 τ—空时（空间时间），其倒数1/τ称为空速（空间速度space velocity）。
(2)转化率χ
转化率χ，也称转化分数（conversion，fractional conversion）是表明供给反应的底物发生转变的分量。分批式操作中，底物的初始浓度为[S]0，反应时间t时的底物浓度为[S]t，此时，底物Ｓ的转化率为：
（6-75）
连续式操作中，流入反应器内的底物浓度为[S]in出，流出液中底物的浓度为[S]out，此时转化率为
（6-76）
(3)生产能力Pr
反应器生产能力Pr（productivity）的定义是单位时间、单位反应器体积内生产的产物量。分批式操作中，
（6-77）
式中 Pt——t单位反应液体积中产物的生成量。
连续式操作中，
（6-78）
式中 Pout——单位体积流出液中的产物量。
（4）选择性[S]p
选择性[S]p（selectivity）是在有副反应发生的复合反应中，能够转变为目的产物的底物变化总量中，实际上转变为目的产物的比率。由底物Ｓ生成目的产物Ｐ的选择性[S]p为：
（6-79）
[S]p表明了整个反应的平均选择性。（6-79）式中asp是指从１mol底物Ｓ中所得到产物Ｐ的摩尔数，是由反应的量论关系而决定的。由于在反应的各阶段或反应器内不同位置的选择性并非一致，因此，瞬时（或局部）选择性为
（6-80）
式中 rp－主反应速率；
rs－副反应速率。
三、酶反应器的选择
游离酶反应器的选择，完全可以按照－般生物反应器的选择要求来进行。对固定化酶反应器的选择，除根据使用的目的、反应形式、底物浓度、反应速率、物质传递速率和反应器制造和运转的成本及难易等因素进行选择外，还应考虑固定化酶的形状（颗粒、纤维、膜等）、大小、机械强度、密度和再生或更新的难易；操作上的要求，如pH的控制、供氧和防止杂菌污染等，反应动力学形式和物质传递特性、内外扩散的影响，底物的性质，催化剂（固定化酶）的表面／反应器体积的比值等。
固定化酶的形式有颗粒状（particle pellet）、膜状（membrane，film，plate）、管状（tubing）和纤维状等几种类型。其中以颗粒状为主，这是由于其比表面积大。由催化剂的形状，可以决定反应器的大致型式，例如，小颗粒的固定化酶，可选用流化床反应器，以增大有效催化表面积。一般总是期望固定化酶的机械强度大些，但是，有些固定化酶颗粒（如用凝胶包埋法或胶囊法制备的固定化酶）的机械强度仍较差，在搅拌罐中，由于搅拌翼的剪切作用，这种固定化酶易遭破坏。对凝胶包埋法的固定化酶颗粒，当采用固定床反应器时，随床身增高，由于凝胶颗粒自身的质量，会使凝胶发生压缩（compaction）和变形，压强增大，为防止这种现象，有必要在床内安装筛板，将凝胶适当间隔开。
由于酶失活是不可避免的，所以要保持恒定的酶活力，就必须进行催化剂的再生、新催化剂的补充或更换，这就要求反应器应具备相应的结构。
底物的性质是选择反应器的另一重要因素。－般来讲，细粒状和胶状底物有可能阻塞填充柱或发生分层，这时可使用循环式反应器或流化床反应器。
另外，在考虑反应器的价格时，不要忽略固定化酶本身的价格。
四、理想的酶生物反应器
1．CPFR型酶反应器
在生产上应用的连续流动的管式反应器中，沿着与物料流动方向相垂直的截面上，速度分布总是不均匀。流速较小的层流流动时，呈现抛物线状的分布，流速较大的湍流流动时，虽然速度分布较为均匀，但在边界层中速度仍然因壁面的阻滞而减慢，造成速度分布的不均匀。此外，管内湍流流动时，径向和轴向都有一定程度的混合，这种速度分布的不均匀性和径、轴向的混合给酶反应器的设计带来困难。为此，人们设想了这种理想流动的反应器——CPFR，其也称为活塞流式反应器或平推流式反应器。
CPFR具备以下特点：在正常的连续稳态操作情况下，在反应器的各个截面上，物料浓度不随时间而变化；反应器内轴向各处的浓度彼此不相等，反应速率随空间位置而变化；由于径向有严格均匀的速度分布，即径向不存在浓度分布，故反应速率随空间位置的变化只限于轴向。
基于以上特点，对CPFR进行物料衡算，沿反应器轴向任意切出长度为dl的一个微元管段作为反应器微元，该微元的体积记为ｄV＝Adl，如图6-16所示，在该微元内的反应速率不随时间而变。稳定状态下，以一级反应为例，取底物S作为起始组分进行物料衡算（单位时间内），得
流入量＝流出量＋反应量＋积累量
其中流入量F[S]，流出量 (F+dF)（[S]＋d[S]），反应量－rsdV，积累量 0。
由于dF＝0，F0＝F＝Ff，所以
－Fd[S]＝－rsdV＝k[S]dV＝k[S]dl （6-81）
以边界条件l＝0，[S]＝[S]0进行积分，得
（6-82）
式中 ——底物浓度，mol/m3；
——以体积计的物料进料流率，m3/s；
——反应器横截面积，m2；
——反应器长度，m；
——停留时间，s；
——一级反应速率常数。
所以，反应器的停留时间为：
（6-83）
对于其他各级反应可得到一般的关系式：
（6-84）
把酶促反应的典型动力学方程——米氏方程代如上式，得操作方程为：
（6-85）
也可整理为：
（6-86）
式中 χout——流出液中底物的转化率。
2．CSTR型酶反应器
稳定状态下，CSTR型反应器内各处的浓度和温度均不随空间位置和时间而变化，因而反应器内各处的反应速率相等，所以可对整个反应器（图6-17）进行物料衡算，一级反应条件下，对组分S（单位时间内）有
流入量＝ 流出量＋ 反应量＋ 积累量
其中流入量F[S]0，流出量 F[S]t ，反应量(-rs)V，积累量 0。
F([S]0－[S]t)＝(-rs)V （6-87）
（6-88）
上式变为一般化的关系式为：
（6-89）
将米氏方程代入上式，得操作方程，即
（6-90）
也可写为 （6-91）
第六节 固定化生物反应器
固定床和流化床反应器主要用于固定化酶反应、固定化细胞反应和固态发酵。
固定化的主要优点是可以重复利用生物催化剂，便于将生物催化剂与反应产物分离。
一、固定床生物反应器
固定床生物反应器是由连续流动的液体底物和静止不动的固定化生物催化剂所组成。另外，也可由连续不动的气体和静止不动的固体底物和微生物组成。
对于在连续流动的液体底物和静止不动的固定化生物催化剂所组成的固定床生物反应器中，存在生物催化剂活性位点上的反应，另外还存在反应物从主流体向固定化颗粒表面的传递，以及在固定化颗粒内微孔中的扩散，颗粒内表面活性位点上生成的产物经微孔和液固结界面的滞流膜向主流体传递的过程。
1．固定床层的压力降
固定床层的压力降可由下式求得：
………………….. （6-92）
式中 ——固定床层高度；
——流体空塔线速度；
、——连续相的密度、体积百分率；
——修正的雷诺数；
（）——修正的摩擦系数。
当时，流体在固定床中呈层流流动，比1.75大的多时，1.75可略去。
当时，流体在床层中呈湍流，比1.75小的多，修正的摩擦系数等于1.75。
2．床内热传递
假定固态发酵的固定床反应器是圆柱体的，底部通入湿润空气，在时间为零时，接种后的湿润淀粉底物置于反应器内，在整个过程中，反应器床层保持静止。当反应器直径很大时，径向热传递可以忽略，只考虑轴向热传递。
生长动力学的经验公式：
……………………………… （6-93）
式中 ——可能的最大菌体浓度；
——比生长速率，可表示为温度的函数；
当时，；
当时， ；
当，。
式中 ——最佳生长温度的比生长速率；
——微生物能够生长的最高温度；
——描述比生长速率对温度增加的敏感性的参数。
当反应器直径相对于床层高度很大时，壁的热传导可以忽略，床层的能量平衡中包括对流和蒸发时移出的热量，轴向的热传导，和微生物的生长产生的热。
（6-94）
式中 各项的因次为（）；
——湿润空气的热容，J/kg·℃；
——床层热容，J/kg·℃；
——空气中水热容随温度变化的速率，kg水/kg空气·℃；
——潮湿空气的密度，kg/m3；
——床层的密度，kg/m3；
——底物的密度，kg/m3；
——水的蒸发焓，J/kg；
——湿润空气的表观线速度，m/s；
——床层的导热系数，W/（m·℃）；
——空隙率；
T——床层温度，℃；
t——时间，s；
z——轴向位置，m；
——菌浓度，kg干菌/kg初始湿底物；
Y——代谢热生成系数，J/kg干菌。
假设微生物和底物的热性质是相同的，而且，这些热性质不随空隙率和时间的变化。
式中 ——底物热容，J/kg·℃；
——湿润空气的导热系数，W/（m·℃）；
——底物的导热系数，W/（m·℃）。
边界条件和初始条件为：
式中 ——床层底部空气入口温度；
——发酵开始时的温度；
——发酵开始时的接种浓度；
——床层高度。
修正的Damkohlter准数表征在热产生的高峰期热生成和移出的比例。假设在对数生长期，维持代谢的影响可忽略。最大的热生成速率将在菌浓达到最大浓度的一半时，则将代入式（6-94），得到生成热为：
（6-95）
修正的Damkohlter准数的分母为进口和出口空气之间轴向对流和蒸发的热移出总量：
则修正的Damkohlter准数：
（6-96）
一般固定床反应器中温度最高的部位在顶部，床层的温度随层高度增加而剧烈上升，随空气线速度的增加而下降.在发酵过程中温度升高到一定值时，回引起孢子的产生，影响产物的形成。这说的温度为临界温度，使发酵过程达到临界温度的床层高度为临界床层高度。临界床层高度随空气的线速度上升而升高。
在设计时，一般要求发酵产生的热与移出的热相平衡，就是，等于1。可以由（6-96）得出用来预计床层得最大温度：
反之，如果由临界温度决定，则式（6-95）可以用于确定临界床层高度：
式中湿润空气的各项性质，，和可以从物化手册中得到。与底物相关得参数和以及生长动力学参数和由实验得出。代谢热生成系数也是可以查得的。
使生物固定床反应器维持在所需温度的表观速度可以由下式计算：
式中 ——生物反应器内热生成的总速率；
——反应器壁的热传导系数；
——进行热传导的面积；
、——空气出、进口的湿度；
1004——的积。
二、流化床生物反应器
（一）流化床的基本参数
1．起始流化床速度
当流体流过颗粒床层的阻力等于床层颗粒重量时，床层中的颗粒开始流动起来，此时流体的流速称为起始流速，记作。它仅于流体和颗粒的物性有关。具有代表性的计算公式有：
对于的小颗粒
对于的大颗粒
式中 ——颗粒的平均粒径；
——颗粒和气体的密度；
——气体的黏度。
2．颗粒的带出速度
如果床内流体的速度等于颗粒在流体中的自由沉降速度时，颗粒开始从床内带出，此时流体的速度称为颗粒的带出速度，记。其相应的计算公式如下：
当时，
当时
当时
3．操作速度和流化数
操作速度即表示流化床在正常操作时流体的速度，一般而流化数表示操作速度和起始流化速度之比，即，对于一般的流化床，，但对于有些流化床可以达到几十甚至几百。流化床操作速度的大小选择原则是：当过程为效应不大，反应速度慢，催化剂粒度小，筛分宽，床内无内部构件和要求催化剂带出量少的情况，宜采用较低的气速，反之，则宜用较高气速。
4．床层的膨胀比
床层的膨胀比为床层正常流化时床层高度与床层处于起始流化态时的床层高度之比。即
式中 ——表示床层的空隙率，密度，
下标——表示起始流化，正常流化状态。
对床内装有垂直管束的床层
对床内装有导向挡板和挡网的床层、
对于粗颗粒床
而对于细颗粒床
（二）流化床生物反应器操作的影响因素
1．流体力学应力
固定化生物催化剂承受流体力学应力的能力(主要是剪切力)，是设计生物反应器时要考虑的一个重要物理学因素。这一承受能力常常决定了微生物培养过程和生产过程中所能采用的操作条件。
2．生物反应动力学的影响
（1）Monod型动力学的影响：在基质不抑制反应和反应动力学遵从Monod型关系式的条件下，生物反应器最好在高基质浓度下操作。在连续操作时，可使液流呈推流式，以实现高基质浓度的条件。气液固流化床应选择较大的高/径比，以近似实现推流型。
（2）基质抑制动力学：当反应中发生基质抑制时，可采用带机械搅拌的流化床。低高/径比的三相流化床也可获得良好的液相混合程度。此外，也可在反应器中放置一根导流筒以实现良好的液相混合。
（3）产物抑制动力学：对于产物抑制动力学的反应系统，采用推流式反应器比完全混合式反应器更有利于实现基质的高转化率。但最有效方法就是及时移走任何抑制组分，这可采用固体颗粒吸附或中空纤维膜分离方法来实现。
3．氧传递
有效的氧传递对于生物量负荷大的体系尤为关键。三相流化床中的氧传递与许多操作参数有关。如不使用纯氧，可以采用提高空气流速，提高传质系数或增大相界面积的方法来改善氧的传递。
4．固定化生物颗粒的稳定性和强度
固定化的耐久性和稳定性，是三相流化床生物反应器能否成功操作的重要因素之一。除了固定化微生物颗粒的物理性质外，颗粒的完整性主要受颗粒间的碰撞、摩擦以及气流发生的液体湍动剪切力的影响，颗粒不完整将会导致过程操作的失败。
5．固定化生物颗粒的大小
Dstergaard和Os-tergaard在丹麦做了在三相生物流化床反应器中的研究。通过1、3、6，3种不同粒径的气体停留时间和气泡大小的实验。发现在颗粒直径为6的反应器中气液传递较好。由于气体滞留和气泡破裂等问题，把颗粒大小作为一个设计参数进行了研究。
6．固定化生物颗粒密度的影响
颗粒密度是影响动力消耗和传质系数的一个重要参数。Riba通过研究表明：传质系数取决于颗粒和介质的密度差。可用来表达这种差值(为颗粒密度、为液体密度)。通过大量实验，这个系统确定为0.37。因此，选择密度大的载体，对液固相传质有好处。
（二）流化床反应器的设计
1．床层壳体的设计
（1）床径的确定
当生产能力（单位时间内反应气体积流量），给定后，根据过程特点选定流化数（或）。则床层的壳体直径由下式给出
式中 ——操作速度。
计算所得的再根据设备的公称直径标准加以圆整。
（2）床层流化高度的确定
正常流化床的床高
式中 ——床层于起始流化床状态时的床层高度；
R——床层的膨胀比。
对床层装有垂直管束的床层
对床层装有导向板和板网的床层
对粗颗粒床（颗粒直径大于100um），
而对于细颗粒床（颗粒直径小于100um），
（3）扩大段直径的确定
如颗粒回收需要在床层上部加扩大段作为为自由沉降段，则其直径D由最大颗粒的带出速度Ut确定，得：
如无扩大段，则可由床层直接按上式计算出可能被气流带出床层得最大颗粒径，如能满足过程要求或旋风分离器能承受，不加扩大段也可。
（4）分离高度的确定
计算流化床自由空间的分离高度的计算式虽然较多，但相互误差较大，一般可用图6-18求得。该图虽由流化床催化裂化颗粒检测得到，但对其他体系也可借用。
2．内部装置的设计
（1）内部构件的选择与设计
流化床内部构件的形式结构较多，但除垂直管束外，其他挡板类内部构件的开孔，板间距等结构参数无统一的公认的设计方法，全凭经验选择和设计。对垂直管数一般用当量直径相同或相似设计为多，故有时为了保证当量直径相似，所需的管数比用计算传热面所得的管数多得多。
式中 、——管数、管外径。
（2）气体分布器的设计
流化床气体分布器是流化床的主要构件之一。对气体分布器的设计主要是结构型式的选择，开孔率（分布器孔的总面积/床层截留面积）其压降的确定。
由流体力学可知，气体分布器压降与分布器的阻力系数、通过孔的气速和开孔率有下述关系：
（6-97）
或
式中
气体分布器为了实现稳定操作，其开孔率必须小于由下式求得的开孔率，
式中
——孔径；
——板的厚度。
再由图6-19求得分布器的阻力系数（或）。求得和后，再将、值代入式（6-97）求得。一般分布板的压降与床层压降的比值应在0.15-1.0范围内，取何值好，视过程而定。
3．流化床中的传热
流化床与外界进行交换，主要是床层与其壁面和床层与浸没于床内的管束中进行的，它们之间的给热系数的计算式分别如下。
床层与壁面间的给热系数为：
床层与垂直管束间的传热系数为：
式中 的单位为；
——管子距中心位置的校正系数。
床层与水平管束间的给热系数：
当
当
式中 ——水平管的外径。
求得后，就可根据热传递理论求出总括传热系数K。
第七节 固态发酵生物反应器
现代发酵工业是当代生物技术产业中以工业化方式生产的主体部分，其发酵技术水平是一个国家生物技术产业发展水平的重要标志之一。众所周知，微生物发酵方法有两类：液体深层发酵与固态发酵。固态发酵是最古老的生物技术之一，只因固态发酵技术至今未达到纯种培养与大规模产业化要求，而一直被隔离在现代发酵工业的大门之外，作为传统与落后的代表而被忽视。但许多现代生物制品固态发酵的产率比液体深层发酵高得多，这是因为，液体深层发酵产生的大量发酵废水、通气与机械搅拌的高动力能耗，成为液体深层发酵进一步发展的障碍，迫使其向高浓度、高粘度方向发展，然而高浓度、高粘度的极限就是固态发酵。再从生态学与仿生学角度看，经过千百万年生物进化洗礼的自然界生物体，无论是最低等的单细胞生物，还是高等动植物及其单个活体细胞，都不是选择在流体流动环境下生活。可见，现代发酵工业中液体深层发酵技术一统天下的局面是不完整的。这种不完整性不仅表现在应用范围所受限制上，更重要的还在固态发酵反应器的设计原理与理论基础尚应加强。
一、固态发酵基础理论
（一）固态发酵的特点
固态发酵（solid state fermentation）又称固体发酵，是指微生物在湿的固体培养基上生长、繁殖、代谢的发酵过程。固态的湿培养基一般含水量在50%左右，但也有的固态发酵的培养基含水量为30%或70%等。此培养基通常是“手捏成团，落地成散”，所以此发酵也可称为半固体发酵。培养基呈液态的微生物发酵过程称为液态发酵。我国农村的堆肥、青饲料发酵和酒曲生产，就是固态发酵。固体发酵主要适合于霉菌，这是由于霉菌细胞内的渗透压比较高，不会因固体基质的高渗透压而致死。
固态发酵的特征，体现在它与液态发酵相比的相对优、缺点方面，见表6-5所示。
表6-5 固态发酵与液态发酵相比的主要优、缺点
优点
缺点
1.培养基含水量少，废水、废渣少，环境污染少，容易处理；
1.菌种限于耐低水活性（aw）的微生物，菌种选择性少
2.消耗低，供能设备简易；
2.发酵速度慢，周期较长
3.培养基原料多为天然基质或废渣，广泛易得，价格低廉
3.天然原料成分复杂，有时变化，影响发酵产物的质和量
4.设备和技术较简易，后处理方便。
4.工艺参数难检测和控制
5.产物浓度较高，后处理方便
5.产品少，工艺操作消耗劳力多，强度大
固态发酵的成本低，排放废水少，至今仍在生物杀虫剂、纤维素酶、饲料、单细胞蛋白、曲种以及调料品中广泛应用。固态发酵的缺点是：受菌种的限制，有些菌种不适宜在固相中培养；受传质和传热的限制；模拟和控制较困难。固态发酵与深层液体发酵有很大的区别，前者的底物是固态的，几乎不溶于水，而后者的大部分底物溶解于水。在固态发酵中，细菌或酵母附着于固体培养基颗粒的表面生长，而丝状菌可以穿透固体颗粒基质，进入颗粒深层生长。在固态培养中，微生物是在接近于自然条件的状况下生长的，有可能产生一些通常在液体培养中不产生的酶和其它代谢物，例如霉菌毒素等，应当引起重视。微生物生长和代谢所需的氧大部分来自气相，也有部分存在于与固体基质混合在一起的水中。所以固态发酵常涉及气、固、液三相，使情况变得非常复杂。固态发酵的气体传递速率比液体发酵高得多，因为固态发酵中固体颗粒提供的液体表面积比深层发酵中气泡提供的界面大得多。由于固态发酵是非均相反应，测定和控制都非常困难，可用于工程设计的参数较少，因此过去大部分发酵过程都依赖经验。随着科学技术的发展和计算机的应用，近来关于固态发酵过程的传质、传热、数学模型的放大方面的研究有显著进展。
根据固态发酵微生物的特点分为好氧发酵、兼性好氧与厌氧固态发酵。厌氧菌固态发酵生产较简易，一般采用窖池堆积，压紧密封进行。好氧菌的固态发酵生产可以将接种后的培养基摊开铺在容器表面，静置发酵，也可通气或翻动，使能迅速获得氧和散去发酵产生的热。因通气、翻动、设备条件、发酵菌种和产物等的不同，固态发酵的反应器和培养室也是多种多样。
（二）固态发酵的传质
固态发酵的特征为底物本身为发酵的碳源或能源，发酵在无自由水或接近无自由水的情况下进行，用天然物质作为主要底物，或用惰性物质作为支撑物。
固态发酵中底物的特征扮演着重要的角色。固态发酵的培养基可以是固体、液体和气体。对固体培养基，微生物必须黏附于培养基上进行交换，吸取营养成分，排出代谢产物，微生物所需的水分通常高于固态底物所含的水分，因此需要用湿润的空气来补充，有时也用喷淋湿润的方法补充水分。当培养基为液态时，培养基必须在微生物颗粒表面形成液膜，并时时被更新。有时培养基必须或完全应用气态底物，例如有机废气的处理。
在固态发酵中，有效的供氧和即时排出挥发性产品的过程是不复杂的。但是颗粒的结构和微生物特性必须了解清楚，以确定内部质量传递是否发生在发酵过程中起着重要的作用，颗粒内是否缺氧。通常用前期底物的条件来描述底物孔隙率和颗粒内的湿润程度，以决定发酵处于好氧还是厌氧状态。但是有时微生物和底物表面之间的相互作用也会引起不可预料的微观限制条件，影响固态发酵过程的重复性。
在固态发酵中，缺乏可流动的水，液相没有宏观混合，因此通气是氧传递的主要途径。减少颗粒直径，可以增加氧传递的界面积，也是增强传递的手段之一。湿润程度对氧传递也有影响，湿度太大会影响气体的通透性。氧必须从主流气体穿越液膜到达附着在固体基质上的菌体表面，然后扩散进入固体底物颗粒内的微孔，被微孔内壁上的微生物利用。颗粒内的传质还包括营养物和酶在底物内的传递。在这过程中主要应考虑氧的扩散和微生物分泌酶对固体基质的降解。
在生长时期，由于微生物的大量摄取，氧被消耗，固体床较深时中间氧浓度有可能零，成为厌氧区。氧浓度变为零处的床层深度称为临界床厚度，事先求出或测出临界厚度对反应器的设计很有用处，可使反应器效率提高。
（三）固态发酵中的传热
微生物发酵为放热反应，在固态发酵中所涉及的热量是相当可观的，直接与代谢的活力成正比。由于固体基质的导热性差，过程中又缺乏有效的混合，因此填充床的散热困难，温度变化陡峭，甚至在很浅的基质层处也会发现显著的温度差别。高温影响微生物的发芽、生长和产物生成，而温度太低，又会造成代谢活性不足。因此温度控制是非常重要的。与液体发酵相比，散热性能差是填充床发酵最主要的缺点之一。在固态发酵反应器中，温度主要靠小心地调节通气速率来控制。
（四）固态发酵的数学模型
数学模型是优化生物进程的必要工具。数学模型不仅能指导生物反应器的设计和操作而且能够对在发酵体系里发生的各种现象如何结合起来控制整个过程的执行提供见解。然而在过去的大约十几年里，人们才开始致力于发展固态发酵过程的数学模型。人们提出的关于固态发酵领域的数学模型可以分为下列两种：宏观模型和微观模型。宏观模型涉及的是生物反应器的操作，它描述穿过基质床的传质传热过程。正因为如此，宏观模型也可以被称为固态发酵生物反应器模型。微观模型涉及的是在颗粒表面和内部发生的各种现象，并不把生物反应器的操作作为一个整体来描述。显然，由于它们的重点不同，这两种数学模型对于生物反应器都非常重要。固态发酵生物反应器的数学模型的目的是描述不同的操作变量如何影响反应器的性能。生物反应器的模型可认为由两个亚模型组成：动力学亚模型和平衡（传递）亚模型（FIG1）。平衡（传递）亚模型描述在生物反应器不同相里或不同相之间的传质传热，而动力学模型描述的是微生物的生长速率怎样依赖于关键的环境参数。
固态发酵反应过程包括氧和二氧化碳通过液膜的传递，在多孔营养基质中的传递，微生物在多孔基质上的生长，在过程中氧被消耗，二氧化碳和热量产生。氧从外部扩散进入颗粒中心，二氧化碳从颗粒内部向表面扩散、通过膜进入气流主体。因此在颗粒内和液膜层中是存在浓度和温度梯度的。描述固态发酵的数学模型应该反映发酵的时间进程，温度和浓度的梯度，是关于温度、浓度和时间的偏微分方程组。此偏微分方程组通常需要简化才有解析解。当通气量较大，外扩散阻力和传热阻力可以忽略时，模型中就只有气相在固相中的传递和生物反应，问题可以简单许多。
此外，微生物生长是微生物和其生长环境条件的总效应。因此还应当考虑到热量守恒的热力学定律。环境条件包括温度、pH值、渗透压、底物浓度、产物溶氧水平等影响生长和产物生成的因素。在液体培养中环境控制较简单，在固态培养中由于传递和混合差的原因控制非常困难。
二、固态发酵的生物反应器
用于固态发酵的反应器可归类为六种形式：填充床反应器，流化床反应器，转鼓式反应器，浅盘式反应器、搅拌反应器和压力脉动固态发酵生物反应器。
（一）浅盘式生物反应器（tray fermentor)
浅盘式生物反应器是比较常用的一种固态发酵设备，这种反应器构造简单，由一个密室和许多可移动的托盘组成，托盘可以是木料、金属(铝或铁)、塑料等制成，底部打孔，以保证生产时底部通风良好。培养基经灭菌、冷却、接种后装入托盘，托盘放在密室的架子上。一般地托盘在架上层层放置，两托盘间有适当空间，保证通风。发酵过程在可控制湿度的密室中进行，培养温度由循环的冷(热)空气来调节。
浅盘式生物反应器是一种没有强制通风的固态发酵生物反应器，特别适合酒曲的加工。装有的固体培养基最大厚度一般为15cm，放在自动调温的房间。它们排成一排，一个间邻一个，之间有一个很小的间隙。这种技术用于规模化生产比较容易，只要增加盘子的数目就可以了。尽管这种技术已经广泛用于工业上（主要是亚洲国家），但是它需要很大的面积（培养室）而且消耗很多人力。浅盘生物反应器的结构示意图如图6-20所示。
1．浅盘式生物反应器的氧平衡
Smits等人描述基质床的氧平衡关系为：
（6-8-1）（6-98）
式中 ——时间；
——每单位体积床层的氧浓度；
——垂直坐标；
——扩散率，
——微生物吸收氧的速率。
Rajagopalan and Modak提出的模型认为在床层内的颗粒覆盖有一层生物膜，在这种情况下，在床层盘里氧传递的方程式为：
（6-99）
式中 ——盘内氧气的浓度；
——床层空隙率；
——空气/生物膜界面的氧气质量传递系数；
——每单位体积生物反应器空气/生物膜界面的面积；
——亨利系数；
——生物膜氧浓度。
另外，还需要另一个方程式描述生物量吸收的氧气量。用一个拟平衡状态的近似值描述生物膜的氧传递速率：
(6-100)
在这个方程式里（膜的氧浓度）假设是可以调节的，因此氧传递的速率和氧吸收的速率相等。
此外，在这个模型里还描述当气体流过床层表面时气体浓度的变化：
（6-101）
式中 ——顶部空间O2浓度；
——顶部空间水平坐标；
——床层高度；
——顶部空间的高度。
方程式右边第一个术语描述了顶部空间的氧气穿过床层的对流，第二个术语描述了顶部空间氧气到床层的传递。
2．浅盘式生物反应器的水平衡
到目前为止，只有Smits 等人的模型描述了浅盘基质床水的平衡，可用以下方程式表示：
（6-102）
式中 ——液态水的浓度/单位体积床层；
——水蒸气浓度/单位体积床层；
——床层水蒸气有效扩散系数；
——水的新陈代谢速率。
3．浅盘式生物反应器的能量平衡
Rajagopalan 和Modak模型的能量平衡考虑了传导和新陈代谢产生的热：
（6-103）
式中 ——床层的厚度；
——床层的热能；
——床层温度；
——床层的热导率；
——微生物新陈代谢生成热的速率。
Smits等人的模型还描述了蒸发带走的热：
（6-104）
式中 ——床层的热焓；
——水汽化时的热焓。
方程式右边第二个术语表示了床层内的传导，第三个术语表示了由于水蒸发和扩散带走的热量。
生物膜氧浓度的限制是不可避免的，甚至是在生物膜表面氧浓度很高的状态下。当然，这种限制在所有的固态发酵过程中，不管是什么类型的生物反应器都是不可避免的。浅盘反应器传质和传热对扩散和传导的限制限定了其影响浅盘床层环境的能力。因此，以后的数学模型可能仅用于单个浅盘反应器的操作和设计。而且为了更好的了解浅盘反应器，会更加重视床层自然对流的情况。自然对流可能会由于温度梯度的升高而出现。
（二）填充床生物反应器（packed bed bioreactor，PBB）
填充床生物反应器是静置式反应器之一，比浅盘发酵器优越性在于采用动力通风，可更好地控制反应床中的环境条件，它能调节温度及空气风速，反应床边缘对流热量的去除效果比浅盘发酵好，由于存在径向温度梯度使反应床的高度受到限制；填充床由于具有静态的基质床适合于对于混合是有害的固态发酵过程，例如真菌孢子。填充床生物反应器比浅盘式更易控制发酵参数。在大的浅盘反应器会出现中心缺氧和温度过高的问题，而在填充床反应器可通过通气部分解决这些问题，但在空气出口仍会出现温度过高的问题。Saucedo-Castanda等对填充床反应器不断改进研究，利用填充床内附上内表面冷却系统，减少了轴向温度梯度的形成，Roussos等在较宽大的填充床反应器中插入垂直热交换板促进水平热传递，同时又克服了反应床高度限制的弊端，由于反应器中冷却水温()热转移平板半间距(Ｌ)及空气表面流速()因素关系较复杂，从而更加突出了建立数学模型的重要性；Mitchell等利用数学建模方法对填充床反应器进行设计和优化操作，并对模型的参数进行了实验测定，同时对影响反应器设计的底物传导率及冷却板对流冷却的热传导系数等参数值对模型的敏感性进行了实验研究。填充床反应器示意图如图6-21所示。
普通使用的通风室式、池式、箱式固态发酵设备即是填充床生物反应器的一种主要结构，其结构示意图如图所示。通风室式、池式、箱式固态发酵设备是随着厚层通风培养的发酵工艺而发展起来的一种固态发酵反应器，它与浅盘培养不同的是固态培养基厚度为30cm左右，培养过程利用通风机供给空气及调节温度，促使微生物迅速生长繁殖。通风培养室为一个长10—12m，宽8m，高3m的房间，其墙壁可为砖木结构、砖结构和钢筋水泥结构。门窗是换气或调节温、湿度的重要设施。利用安装在室内的蒸汽管或蒸汽散热片进行保温；利用自然通风和排风扇进行降温；利用水泥砖或钢板制成的空调箱进行保湿，同时有保温和降温功能。其结构简图如图6-22所示
通风培养池或箱最普通，应用广泛，可用木材、钢板、水泥板、钢筋混凝土或砖石类材料制成。培养池或箱可砌成半地下式或地面式，一般长度8—10m，宽度1.5—2.5m，高0.5m左右。培养池或箱底部有风道。通风道的两旁有10cm左右的边，以便安装用竹帘或有孔塑料板、不锈钢等制成的假底，假底上堆放固态培养基。该类反应设备的缺点是：（1）进出料主要靠手工操作，工作效率低，劳动条件差；（2）湿热空气使生产车间长期处于暖湿环境，对生产卫生及发酵工艺的控制有不利影响。
填充床生物反应器微生物的生长动力学可用经验式表示为
（6-105）
式中 ——生物量浓度（kg生物量/kg干物质）；
——最大的生物量浓度；
——比生长速率，可表达成温度的函数：
当 （6-106a）
当 (6-106b)
当 (6-106c)
式中 ——最佳生长温度下的比生长速率；
——微生物能够生长的最高温度；
——描述比生长速率对温度增加的敏感性的参数。
由于实际过程中的温度不会明显低于，因此可用式（6-106a）简化。
当反应器直径相对于床层高度很大时，由于热量向壁的传递可以认为是可以忽略的，因而仅考虑轴向传热。在柱内总的热量平衡包括：对流和蒸发的移出的热量，轴方向的传导和微生物生长产生的热量。
（6-107）
式中 各项的因次为，W/m3；
——湿润空气热容，J/kg·℃；
——床层热容，J/kg·℃；
——空气中水热容随温度变化的速率，kg水/(kg空气·℃)；
——潮湿空气的密度，kg/m3；
——床层密度，kg/m3；
——底物密度，kg/m3；
——水的蒸发焓，J/kg；
——湿润空气的表观线速度，m/s；
——床层的导热系数，W/（m·℃）；
——空隙率；
——床层温度，℃；
——时间，s；
——轴向位置，m；
——菌浓度，kg干菌/kg初始湿底物；
——代谢生成系数，J/kg干菌。
假定，在用水蒸气饱和空气的条件下，床层中任意位置上空气和湿润固体保持平衡。由于水的蒸发使空气中的水分达到饱和，使空气的显热增高，所以增加。方程最后一项假定代谢生成的热直接正比于菌体的生成，而且维持代谢和菌生长对颗粒尺寸和压力降的影响可以忽略。床层的密度、导热系数和热容为床层中空气和底物性质的平均值。
床层的密度、热传导、热能的数值可以作为衡量床层内空气和基质平均值计算的工具。密度和热传导以体积计算，而热能以质量计算：
（6-108a）
(6-108b)
(6-108c)
式中 ——底物热容（J/kg·℃）；
——湿润空气的导热系数（W/（m·℃））；
——底物的导热系数（W/（m·℃））。
在这些方程中还隐藏着一个假设，微生物和底物的热性质是相同的，而且这些热性质不随空隙率和时间变化。
边界和初始条件为
在处， (6-109a)
在处， (6-109b)
在时，在范围内， (6-109c)
在时，在范围内， (6-109d)
式中 ——床层底部空气入口温度；
——发酵开始时的温度；
——发酵开始时的接种浓度；
H——床层高度，假设在发酵开始时整个床层的温度和浓度是均匀的。
修正的Damkohler准数表征在热生成的高峰期热生成和移出的比例。假定指数生长期，维持代谢的影响可以忽略，最大的热生成速率将在菌体浓度达到最大菌浓度的一半时发生。将 代入式（6-107）中的热生成项，得生成热：
(6-110)
修正的Damkohler准数的分母为空气进口和出口之间轴向对流和蒸发的热移出总量，假定空气始终被水饱和，
(6-111)
和的单位为（Jm-3s-1）。
(6-112)
最大的热产生时期不一定要根据菌浓度来判断，也可以根据在最佳温度下培养时的最大摄氧率来判断。
通常填充床反应器中温度最高的部位在顶部，床层的温度随床层高度增加而急剧上升，随空气线速度的增加而下降。在发酵过程达到临界温度的床层高度为临界床层高度。临界床层高度随空气的线速度上升而上升。临界床层高度是设计的关键参数。
设计要求发酵产生的热与移出的热平衡，也就是应当等于1，因此式(6-112)可以用来预计床层的最大温度
（6-113）
反之，如果由临界温度决定，则式(6-110)可用于确定临界床层高度
（6-114）
式中湿润空气的各项性质，， 和可从物化手册获取。与底物相关的参数和以及生长动力学参数和由实验确定。代谢热生成系数Y可以在相关的文献中查取。
使生物填充床反应器维持在所需温度的表观速度可由下式计算
（6-115）
式中 ——生物反应器内热生成的总速率；
——反应器壁的热传导系数；
——进行热传导的面积；
，——空气在出、进口的湿度；
值1004——和的积。
上式假定空气在进出口都被水饱和。此式可用于通气的任意固态发酵反应器。
近年来，对用于固态发酵的固体床反应器的设计、操作和放大方面的研究有显著进展。理论研究的结果表明，在这类过程的放大中，数学模型是有用的工具。
（三）流化床生物反应器
通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应的装置称为流化床反应器。流化床中固体颗粒与流体的混合较充分，传热传质性能好，床层压力降小，但是固体颗粒的磨损较大。流化床可用于絮凝微生物、固定化酶、固定化细胞反应过程以及固体基质的发酵。例如固体基质制曲过程（气固流化床），乙醇生产，废水的硝化和反硝化，用絮凝性酵母酿造啤酒（液固流化床），以及用固定化α-胰凝乳蛋白酶分离D-，L-苯丙氨酸。图6-23为流化床生物反应器简图。
流化床生物反应器示意图如图6-23所示。液体从设备底部的一个穿孔的分布器流入，其流速足以使固体颗粒流态化。流出物从设备的顶部连续地流出。空气（好氧）和氮气（厌氧）可以直接从反应器的底部或者通风槽引入。流化床生物反应器不存在床层堵塞、高的压力降、混合不充分等问题。在反应器里，固体颗粒可以和气相充分接触。
为简化液-固流化床反应器的模型，假定：（1）生物催化剂颗粒大小均匀；（2）流体密度与底物浓度有关；（3）液相以平推流向上流动；（4）底物消耗速度与底物浓度无关，而与生物催化剂浓度成一级关系；（5）以最大沉降速率计算的催化剂颗粒雷诺数很小，附合斯托克斯定律；（6）反应在恒温下进行。底物转化方程为：
(6-116)
即
(6-117)
式中 ——液体空塔线速度，是与轴向位置有关的变量；
——反应器上轴向距离；
——底物消耗速率与生物催化剂浓度一次有关的速率常数；
——生物催化剂密度；
——底物浓度。
对斯托克斯流动，在流化床中悬浮生物催化剂与液体流速的关系为：
(6-118)
式中 ——微生物干密度；
——斯托克斯流动中球形颗粒的最大沉降速率。
可见流化床与其他形式反应器中所强调的不同，其各位置上生物催化剂的浓度完全取决于流体力学参数，而非生化反应代谢特征。将(6-118)代入(6-117)，方程就只剩下和两个因变量，它们都是流化床中位置的函数。
根据总的质量守恒，总质量通量不随位置变化
(6-119)
式中 ——底物浓度的函数，将式(6-119)展开
（6-120）
式(6-117)和式(6-120)是未知变量和的联立代数方程，初始条件为：
； (6-121)
式中 ——塔底截面积；
——流量。
假定流体密度变化对无影响，则与位置无关，式(6-121)可直接积分得：
(6-122)
式中 ——塔高；
——出口底物浓度；
——生物催化剂的初始密度。
从式(6-122)可见，出口底物浓度与平均停留时间呈线性关系。对于耗氧要求高的反应，要通入大量气体。从气泡想液相的传质步骤限制总的生长速度。对高塔，气体可视为平推流，液体存在返混。为达到足够的氧传递量，用下式求塔高
（6-123）
式中 ——气泡上升速度；
——气含率；
——氧的亨利系数。
（四）转鼓式生物反应器(rotary bioreactor RDB)
转鼓式固态发酵生物反应器通常为卧式、或略微倾斜，鼓内有带挡板的也有不带挡板的，有通气的，也有不通气的，有连续旋转的，也有间歇旋转的。转鼓的转速通常很低，否则剪切力会使菌体受损。采用转鼓式反应器与填充床相比其优点在于可以防止菌丝体与反应器黏连，转鼓旋转使筒内的基质达到一定的混合程度，菌体所处的环境比较均一，改善传质和传热状况。转鼓反应器是一个包括基质床层、气相流动空间和转鼓壁等组成的多相反应系统。与传统固体发酵生物反应器不同的是：基质床层不是铺成平面，而是由处于滚动状态的固体培养基颗粒构成，占反应器总体积的10%至40%。菌体生长在固体颗粒表面，转鼓以较低的转速转动（通常为2r/min至3r/min），就如同设置了搅拌轴那样加速传质和传热过程。正是这种巧妙的构思使得转鼓式生物反应器以“动”区别于传统固体发酵生物反应器的“静”。
转鼓式发酵器示意图6-24如下：
这类反应器适合固态发酵的特点，研究也较多，它可满足充足的通风和温度控制，Hardin等根据微生物生长产热量最高峰时的热量产生与去除效果的比率，利用无因次设计因数(DDF)来研究设计转鼓式发酵器，它能够预测所给条件下反应床中能达到的最大温度值，得出发酵期间最大耐受温度，并结合操作变数作出相应的控制措施，该方法提出了利用几何相似性原则进行反应器设计放大时考虑的三个策略:（1）维持通过转鼓式发酵器的空气表面流速恒定；（2）维持反应器单位体积内空气体积比率恒定；（3）反应器放大时调节空气气流速度以维持发酵期间反应床中到达的最高温度恒定；另外，运用DDF方法进行反应器放大设计也可适用于其它固态发酵生物反应器如浅盘式发酵器、流动床反应器及填充床反应器等，或通过构建系统热量去除方法适用于其它特殊类型的生物反应器放大设计。HAN等设计的该反应器配有搅拌轴，料气进出口及接种口等，培养基灭菌、接种、通气培养和干燥可在发酵器内进行，可有效防止杂菌污染，恒温水浴控制温度，恒温冷水喷雾冷却旋转鼓，发酵时温度波动小，机械化程度高，通过实验比较了静置式与搅拌式对大豆根霉发酵效果的影响，结果表明该发酵反应器操作隔离性能好，通过传感器对操作参数进行检测和控制，滚轴旋转速度在1 5～4 0r/min，空气进入管中空气流速为2 0Ｌ/ｍin-1，但反应器体积放大有一定的局限性，因影响到反应器的热量扩散和培养基的灭菌效果，同时，前期过多拌料等因素对一些菌属的生长有较大的影响；HAN等利用转鼓式发酵器根霉发酵大豆生产新型的固态发酵产品，可作为粉状食品的配料。至目前为止，利用转鼓式发酵器应用于发酵生产有酒精、酶、制曲、植物细胞培养、根霉发酵大豆及丹贝生产等。
为满足固体发酵的要求，浙江工业大学90年代开发的全密闭转鼓固体发酵生物反应器由以下几个部分所组成。
（1）罐体： 罐体是由圆柱形中部和圆锥形封头组成，并由钢板组焊成，罐体壁按压力容器设计计算。
(2)加料口：为加料方便，采用人工加料方法，加料口开在锥形封头锥顶处，采用快开式入孔结构。
(3)出料口：发酵结束后，物料从出料口出料。出料口开在锥形封头锥顶处，采用快开式入孔结构，罐体边旋转边出料，将发酵料卸到螺旋式输送机上，送到干燥机上干燥或送到浸泡槽进行浸泡，提取精制酶。
（4）通风装置：空气通入装置的作用吹入无菌空气，供微生物生长、代谢之呼吸，主要使空气均匀分布。无菌空气由无菌空气过滤系统制备，从反应器的空心轴吹入反应器内，再由搅拌轴上的支管小孔喷出，供给固体物料，使微生物生长、繁殖、代谢，同时可降低料温。
（5）加热装置：加热方式采用夹套间接加热和物料、蒸汽直接接触式加热两种方式。夹套间接加热是将蒸汽通入夹套内，通过器壁传热，直接加热是采用蒸汽通过空气管进入物料，使物料湿润并加热，加热时间和温度按工艺条件决定。
（6）冷却装置：冷却装置采用夹套冷却方式，物料经灭菌之后，在夹套内通入冷冻水使物料温度冷却到接种温度。
（7）翻料装置：按固态发酵的特点，为加强传质和传热效果，在发酵过程中，需要翻拌，以防止物料结块，为此，本设计采用锥体旋转，内装固定式搅拌器进行翻拌，当罐体转动时，物料被锥体带上然后抛下，被搅拌器打碎。由于搅拌器与罐体有相对运动，达到翻拌的目的，为使得物料被带上，在罐体内壁安装有当板。
（8）传动装置：一台机器设备的传动可以采用送轮传动、皮带传动和摩擦轮传动等。本设计采用送轮传动
全密闭式固态发酵生物反应器技术特性见表6-5。
表6-5 全密闭式固态发酵生物反应器技术特性
型号
SHG3－00
SHG5－00
工作容积
2.1m3（约含干料1吨）
3m3（约含干料1.6吨）
全转速
3.0m3
5.0m3
转速
2转/分
2转/分
罐体直径
1700mm（最宽4420mm）
2000mm（最宽4970mm）
电机功率
10kW
13.0kW
使用压力
2.5kgf/cm2
2.5kgf/cm2
设计压力
3.0kgf/cm2
3.0kgf/cm2
水压试验
3.5kgf/cm2
3.5kgf/cm2
设计温度
150℃
150℃
外型尺寸
4.5×2×3.5（m）
5×2.2×3.5（m）
此固态发酵生物反应器集蒸煮、灭菌、降温、接种、发酵五大功能于一体；罐体旋转、罐内搅拌，工作状态处于密封环境中，能严格避免杂菌污染，在整个固态发酵中，根据发酵工艺的要求，调节罐内温度，湿度，通入无菌空气，调节罐内氧气，可达到较佳的传质传热效果。
以5.0m3全密闭固态发酵生物反应器为例，阐述其工作原理。在5.0m3全密闭固态发酵生物反应器中，装料1.6吨（主要含量是麸皮），按工艺要求加一定量的水，夹紧加料口，转动生物反应器，通入加热蒸汽，加热至121℃灭菌一定时间（按工艺要求），停止加热、冷却，通入无菌空气，打开排气阀，保持一定压力，冷却到接种温度，接入固体种或液体种，开始发酵。按发酵品种的不同，可选择① 连续通风、连续转动；② 连续通风、间歇转动；③间歇通风、间歇转动等不同的发酵模式。发酵结束后，打开卸料口出料。
Stuart 转鼓式发酵器模型包括三个子系统：基质床、顶部空间的气体和生物反应器壁。每个子系统的能量平衡如下图6-25所示。
1．基质床的能量平衡：
式中 ——基质床的温度；
——基质干重；
——干燥固体的热能；
——床层水的含量；
——液态水的热能；
——热传递系数；
——壁温；
——生物反应器壁和外部空气的接触面积；
——热传递系数；
——器壁和顶部空间空气的接触面积；
——顶部空间空气的温度；
——质量传递系数；
——平衡水蒸气浓度；
——顶部空间的水蒸气浓度；
——水蒸气的热能；
——水蒸发时的热焓。
2．生物反应器顶部空间的能量平衡：
式中 ——顶部高燥空气的质量；
——顶部空间的湿度；
、、——进口空气的温度、流率、湿度；
——干燥空气的热能；
——出口空气的流速。
3．生物反应器壁的能量平衡：
式中 ——生物反应器壁身金属的体积；
——生物反应器壁身金属的密度；
——生物反应器壁身金属的热能；
——热传递系数；
——生物反应器壁和外部空气的接触面积；
——外部空气的温度。
4．基质床水的质量平衡：
(6-124)
式中 ——水新陈代谢的速率。
方程式右边第一个术语描述的是基质床由于蒸发而损失的水，第二个术语描述的是生长产生的代谢水。
5．顶部空间水的质量平衡：
(6-125)
方程式右边三个术语分别表示了进口空气所带进的水量，出口空气所带出的水量，基质床蒸发到顶部空间的水蒸气量。
（五）搅拌生物反应器
固态搅拌反应器有卧式的也有箱式的，卧式搅拌反应器采用水平单轴，多个搅拌桨叶平均分布于轴上，叶面与轴平行，相邻两叶相隔180度。箱式搅拌反应器有采用垂直多轴的。为减少剪切力的影响，通常采用间歇搅拌的方式，而且搅拌转速较低。这类反应器已在工业上用来生产单细胞蛋白、酶和生物杀虫剂。搅拌反应器的最高温度比填充床的低。
一个连续混合的水平搅拌反应器由Wageningen大学研制成功。如图6-26所示。这种无菌的发酵器可用以用于不同的生产目的，并且可以同时控制温度和湿度。尽管，这种装置热传递到生物反应器壁的效率得到了改善，但是把它用于大规模的生产效率很低，这是因为热只能通过器壁移出使得当规模扩大时效率更低。
对于不需要灭菌的操作，生物反应器设计和应用已经取得了很大的进展。日本的Fujiwara公司销售的制造酒曲的旋转型为这种设计的一个代表。（图6-26）已经处理过的培养基堆积在一个旋转的圆盘。圆盘的直径决定所需的工作体积，但通常一层的最大厚度为50cm。这种不需要灭菌的反应器用一台控制着所有的参数（入口空气的温度、空气流速和搅拌周期）微型计算机来运作。这种设备主要的缺点是在把培养基填充到反应器前需要在其它设备制备和接种培养基。不过这种类型的反应器在亚洲国家得到了广泛的应用。
法国第戎的一个研究组发明了一种不需要灭菌的设备，它基于下原则建造（图6-28）。基质的温度Tm和湿度WAm由温度、相对湿度和进口空气的流速的调节控制。它同样需要定期地喷淋水（E）和搅动（A）。喷淋的水量由培养基的总质量（Mg）以及由因为呼吸（CO2）而损失的质量来计算。这种反应器已经成功地用于包括工业副产品的蛋白质富集、酶的生产和生物杀虫剂等方面。
Tin、HRin、Din分别表示空气进口温度、相对湿度和流速； Tout、HRout、Dout分别表示空气出口的温度、相对湿度和流速；tWAm为固体培养基的水含量；Tm为固体培养基的温度；Mg为固体培养基的总质量；A表示搅拌；E表示喷淋水。
现在这个反应器已经连续地得到了改善。与第一台反应器相比，主要的变化在于设备本身的一些附件（接种和喷淋水用的泵）、空气条件和在加工过程控制参数调节的软件（图6-29）。特别地，已经建立了一个数学模型，通过考虑由于通风带来的干物质的损失和蒸发，维持加工过程中基质的湿度。
用同样的设计，两台更大的反应器（每一台总尺寸为17.6m×3.6m×2.0m）和一台最大生产量为50吨（20%干物质）的设备已经制造出来，这证实了这种发酵罐可以用于工业规模化的生产。
另外处理能力为50升的反应器由Durand等人申请了专利。这种反应器有一个行星混合装置，在不同操作步骤中完全由微型计算机控制：空生物反应器的灭菌、基质的灭菌、发酵过程中的控制以及数据的获得。这种反应器已经被用于gibberellic(赤霉酸)的SSF的反馈生产（Bandelier等人，1997）以及用于分生孢子的生产（培养15天后）。到目前为止，工业上没有这种装置的规模化应用。
随着固态发酵过程动力学数学模型的不断研究和发展，不断揭示固态发酵过程的变化规律，加上系统控制技术的完善，固态发酵反应器的设计会更加科学合理，使固态发酵系统工艺参数控制达到最优化。在酿造企业中不断采用先进的固态发酵技术及高效生产设备可使传统固态发酵产品的更新换代得到更快发展，并实现酿造企业节能、高效、提高企业综合效益的目标。
（六）压力脉动固态发酵生物反应器
由中国科学院过程工程研究所研制出的压力脉动固态发酵新技术在严格意义上达到了纯种培养与大规模产业化要求。1999年12月通过了中国科学院组织的专家鉴定，由李季伦和沈寅初院士等组成的专家组鉴定意见认为：(1)压力脉动固态发酵新技术及其设备是固体发酵技术的一个新发展；(2)该项技术具有较普遍的应用价值，其中压力脉动固态发酵新技术及其发酵设备的成果处于国际领先水平。目前，压力脉动固态发酵反应器已成功地从实验室的2L、50Ｌ、800Ｌ放大到25ｍ3、50ｍ3、70ｍ3的工业级生产规模。并对装料方式等进行了改进。应用范围涉及到抗生素、酶制剂、有机酸、食品添加剂、生物农药和生物肥料等。
压力脉动固态发酵反应器的研制，是从理论突破开始的，以前还局限在按传统化工“三传一反”理论研究各种类型的密闭机械翻动固态发酵反应器，均因达不到严格纯种培养要求而放弃。对非生物反应过程适用的化工“三传一反”理论不适用于生物反应过程。因此，提出了“四传一反”新机理及新方法，推演出生物反应器设计新原理：外界周期刺激强化生物反应及细胞内外传递速率。对于压力脉动固态发酵反应器设计思路主要是以流体静力学理论为基础(固相培养基静态)，以法向作用力为动力源(气相动态周期作用力)，强调生物反应器是一个非线性活细胞代谢与周围环境进行质量、热量、能量、信息交换的生态系统，是由生命系统和环境系统组成的特定空间，而不是单一的装置。
由图6-30所示，压力脉动发酵系统由两部分组成。第一部分为空气调节系统，主要通过换热器及水雾化处理装置对压缩空气的温度和湿度进行调节，再通过流量计和膜过滤器对压缩空气进行计量和除菌，使进入压力脉动发酵罐的空气达到相对无菌；第二部分为发酵罐系统，它是由夹套、隔板、压力表以及压力延时释放控制系统、温度控制等组成的，同时设有蒸汽通道，以便进行实罐灭菌，减少原料杂菌污染。
具体的主要操作是用无菌空气对密闭低压容器的气相压力施以周期性脉动。罐压的变化曲线如图6-31所示。罐体气相压力通过无菌空气的充压与泄压。峰压值一般为150350kPa，谷压一般为1030kPa。峰压时间与谷压时间由人为设定控制，并随发酵时间而变化，一般在对数增长期变化频率高， 延迟期与稳定期频率小。周期一般为15150min随需要而定。
“压力脉动”对固体培养基是静态，但对气相则是动态。其作用有：(1)因气体分子“无孔不入”，压力脉动很容易在单颗粒水平上变分子扩散为对流扩散，以达到菌体周围小尺度上的温度、湿度的控制与均匀性，加强供氧与排出CO2的速度；(2)在泄压操作中，因突然快速排气，颗粒间的气相因减压膨胀，对固体颗粒起松动作用，为菌丝体的大量繁殖扩充了空间，所以发酵料层内外菌丝体都十分丰满。
压力脉动固态发酵反应器是现代生物发酵技术体系的核心部分，是固态发酵实现纯种培养与大规模产业化这一世界技术难题的突破口。固态发酵新技术与液体深层发酵技术一样，是一种普适性的微生物生产应用技术，不限于某一种产品。随着该技术体系的不断改进与完善，以技术开发带动产品开发，扩大应用范围。根据已有的试验与生产实践结果，无论是细菌，还是霉菌、放线菌，均可采用此现代固态发酵技术实现纯种大规模培养，尤其是对后者效果更佳。因此现代固态发酵技术有着无限广阔的应用与发展前景。
三、固态发酵生物反应器的设计和应用
（一）生物反应器的设计
生物反应器是发酵过程的中心，在反应器里生物原材料在合适的条件下转变为需要的产品。产品的产量和形成速率的最大化是优化生产过程的关键部分。固体发酵生物反应器的理想特征如下所述：
（1）用于建造生物反应器的材料必须坚固、耐腐蚀以及必须对发酵过程的微生物无毒。此外须有一个可以承受的合理的价格。
（2）防止发酵过程污染物的进入同时控制发酵过程的有机体释放到环境。前者特别难以控制，这是因为固体的处理不能象深层液体发酵的液体那样用泵输送，因此产生污染物自由封闭体系。而后者同样是一个非常重要的必备条件，因为大多数的固态发酵过程含有真菌孢子，它可能是致病的，会对周围的环境产生危害。要达到这种要求，可以通过在空气出口安装过滤器，周详的密封设计以及对进口空气进行过滤。但同时，这也增加了设备的费用。
（3）有效的通风调节、混合和热的移除来控制温度、水活度、气体的氧浓度等操作参数。通常，固体培养基的发酵会遭受无效的热移除或者培养基床水蒸发的损失等问题，影响所需产品的产量和质量。
（4）维持基质床层内部的均匀性——这通常由有效的混合获得。它同样对使热量梯度的最小化非常关键，是固态发酵过程非常重要的一个因素。
（5）总的固态发酵过程包括培养基的制备、培养基的灭菌、产品回收之前生物量的灭菌、接种体的准备、生物反应器的安装和拆卸。一个生物反应器的设计应该使以上的操作非常方便，令人满意。
（二）固态发酵的应用
固态发酵因后处理简单、环境污染小、成本低、受到科学家的重视，近年来的发展很快，其应用领域正在不断拓宽，具有良好的发展前景。
1．固态发酵在资源环境的应用
固态发酵领域的研究及其在资源环境中的应用取得了很大的进展，主要表现在生物燃料、生物农药、生物转化、生物解毒及生物修复等方面的应用。
（1）生物燃料(biofuel)
用工农业残渣进行固态发酵，生产生物燃料，主要为乙醇(酒精)。乙醇是产量最大的发酵工业产品，是清洁燃料工业的代表，主要原料为各种可再生性糖类物质(如天然纤维素)。我们知道当前地球上“温室效应”增强的罪魁祸首是CO2。所以，如果能找到一种不增加大气中CO2含量的燃料来代替化石燃料，那么就可以有效地控制“温室效应”。目前能满足这种需要的就是燃料乙醇。乙醇是可再生性能源。利用固态发酵技术有许多优点，如：可消除糖的萃取过程，节省成本；由于发酵过程减少用水量，而降低发酵罐体积，无废水；降低能耗等。这是一个有潜力的生产乙醇路线，国外对其研究相当多，大多利用酵母菌发酵，但也有研究用代谢葡萄糖的细菌菌株(如Zymomonas mobilis)。纤维素原料是地球上最丰富的，并且是每年可再生的有机物质。充分利用生物技术把再生资源转化为有高价值物质，完全可以减轻人类面临的能源、环境危机。
（2）生物农药(biopesticide)
我们经常想找到一种既不污染环境，又可杀死害虫的办法。最近，大量的文献表明，人们越来越重视利用昆虫病原体真菌及寄生真菌来控制害虫的方法。Deshpanade综述利用固态发酵生产真菌杀虫剂的方法，与液态发酵相比，不仅生产成本大大降低，而且药物对害虫的毒力也提高了。筛选具有杀虫能力的真菌是开发可感染繁殖体(像分生孢子、牙粉孢子、衣原体孢子、卵孢子、受精卵孢子等)的第一步，对真菌与害虫作用机理理解是生产有效生物农药的主要研究领域。
（3）生物转化(biotransformation)
固态发酵其中一个重要应用领域就是利用微生物转化农作物及其废渣，以提高它们的营养价值，减小对环境的污染。生物转化利用的菌株一般为白腐菌。木薯是非洲、亚洲及南美洲地区人民最重要的食物之一。但它的蛋白质、维生素、矿物质含量低，也缺乏含硫氨基酸。已有几种固态发酵方法可以改善其营养价值。此外，木质纤维素作物的剩余物是动物饲料具有潜力的源泉，主要由纤维素、半纤维素及部分木质素组成，其蛋白含量低、难消化、味道差等特点限制它们作为理想饲料的应用。提高它们的利用价值就必须改变其营养含量，可用物理、化学或生物方法等。但物理、化学方法能耗高、比较昂贵，所以人们更倾向于生物方法，在这一方面固态发酵特别有潜力。现在已成功地利用白腐菌把木质纤维素转化为蛋白含量较高的饲料，利用菌株Ｐ.ostreatus及L.edodes对咖啡渣进行固态发酵，已生产出蘑菇。
还有一些植物残渣也可用来生产高蛋白物质或单细胞蛋白，如:柑橘皮、黑麦、芒果与海枣工业废渣、甜菜根、麦草或苹果渣。上述发酵成品提高了蛋白质含量，更利于动物消化。
（4）生物解毒(biological detoxification)
某些工农业残渣含有对人体有副作用或可造成营养不良的化合物，如咖啡因、氰化氢、聚苯化合物、鞣酸等，对这些残渣有效利用十分困难。由于它们可导致严重环境问题，所以对它们的处理对加工业来说是十分头疼的事。最近，固态发酵已成为对像木薯皮、油菜籽粉、咖啡皮、咖啡浆等残渣有效的解毒方法，已有一些成功的例子。
（5）生物修复(bioremediation)
生物修复(Bioremediation)是利用微生物及其代谢过程(其产物消除或在体内富集有毒物质)来修复被人类长期生活和生产所污染和破坏的局部环境，使之重现生机的过程。由于目前环境污染日益严重，国外学者对生物修复研究相当投入。固态发酵生物技术是有毒化合物生物降解与环境生物修复的有益工具。
2．生产有价值的物质
固态发酵可用来生产许多有价值的物质，例如谷物或者谷物残余物营养的富集，发酵食品、酶、色素、抗生素、生物杀虫剂、有机酸和风味化合物的生产。至今工业用酶大多数采用深层发酵的方法，成本很高，使酶的应用受到限制，固体发酵生产酶是降低成本的好方法。例如纤维素酶的液体深层发酵，每升发酵液可得10g粗酶，成本约为$20/kg，固态发酵的水平为10mg/g基炙，成本只有$0.2/kg。固态发酵在各方面的应用如表6-6。
表6-6 固态发酵的应用领域
生产生物活性化合物
生产酶
生产有机酸
生产其他化合物
黄曲霉素
纤维素酶
柠檬酸
L-谷氨酸
曲霉素
漆酶
反丁烯二酸
色素
细菌内毒素
聚半乳糖酶
乳酸
胡萝卜素
赤霉素
木聚糖酶
五倍子酸
黄原胶
玉米素
乙酰乙酸酯酶
琥珀酰甘露糖
麦角素
木糖酶
乙醇
头孢菌素
儿茶酚氧化酶
芳香化合物
头孢菌素C
脂肪酶
维生素B12、B6
四环素
谷氨酸酶
核黄素、硫胺素、烟碱
放线紫红
植酸酶
亚油酸
环孢菌素A
单宁酶
生物表面活性剂
真菌酚
β-葡萄糖苷酶
Li-和Mn-过氧化酶
生物杀虫剂、除草剂
第八节 动物细胞培养生物反应器
随着基因工程的发展，通过动物细胞的培养所生产出多种疗效高的药物、灵敏的诊断试剂及生物技术制品，目前在这一方向上正发展成为一支高新技术产业。由于动物细胞与微生物细胞有很大的差异，对体外培养有严格的要求，如动物细胞对剪切非常敏感，反应器的设计不能像微生物细胞那样高的剪切力，因此，传统的微生物细胞反应器应该经过改造才能适用动物生物反应器，根据动物细胞的特点，开发新型的生物反应器显得十分重要和迫切。
一、动物细胞培养过程
（一）动物细胞培养概论
动物细胞培养（cell culture）是从动物体内取出细胞并分散成单个细胞，模拟体内的生长环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使细胞在体外继续生存、生长、增殖并维持结构和功能的一门技术。体外培养可分为原代培养（primary culture，亦称初代培养）和传代培养（subculture，亦称继代培养）。原代培养是指从机体内取出的细胞进行初次培养的过程。培养的细胞大约增殖10代左右称为原代细胞（primary cell）；从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。
动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家哈里森Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，并观察到细胞突起的生长过程，创立了体外组织培养法。1923年，法国学者卡勒尔设计的卡氏培养瓶用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，也使得多种动物组织培养获得成功。20世纪80年代以来，随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展，人们已经能够把特定的外源基因通过PCR扩增，并转染到动物细胞内，得到高质量的表达，由此可生产各种特殊的生物制品。德国生物技术公司Hauser用一个含人的IFN-β基因的科斯质粒pCOSIFN-βNDA（36000碱基对）与质粒pHC792COS/tk+DNA（含有单疱疹病毒的tK基因）通过磷酸钙沉淀技术，共转移进入小鼠LK-细胞，从而得到含干扰素基因的能分泌干扰素的细胞克隆。近年来发展起来的淋巴细胞杂交瘤技术，能大量繁殖并生产单克隆抗体，品种不下万种，其中数百种已在医学和生物学的各个领域得到了广泛的应用，使动物细胞培养进入了一个新的领域。到了90年代初期，世界单克隆抗体的销售已超过30亿美元，取得了明显的社会效益和经济效益。利用人工培养的动物细胞，可以分离和鉴定病毒，进行遗传工程、代谢及其调节方面的研究，并能根据其表达产物方面的优点（如转录后修饰和产物胞外分泌等），生产出许多与人类健康和生存密切相关的生物技术产品。因此，动物细胞培养工程正在逐步形成一支独特的高新技术产业，并显示出巨大的工业发展前景。
动物细胞的体外培养有三种类型，一类是悬浮培养，指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞，此类细胞体外生长不需贴壁，可采用微生物的方法在培养基中悬浮培养。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和许多重组细胞都属于此类细胞。由于是悬浮生长，细胞密度一般都较高，易于大规模生产，便于过程的控制。另一类是贴壁培养，指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养，主要适用于贴壁依赖型细胞（亦称贴附型细胞），大多数动物细胞都属于这一类型。这类细胞生长需要附着于某些带适量正电荷的固体和半固体表面，细胞贴附生长后，不再是原有的形态，形态上一般单一化，主要有成纤维细胞型、上皮型、游走型和多形型等。再有一类是固定化培养，这类培养既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有所不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。
（二）动物细胞体外培养的特点
动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞相比，其进化程度更高，结构和成分更复杂，功能也更全面。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物细胞相同，但动物细胞对营养的要求更为苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖等基本营养元素外，还需要血清。动物细胞对于培养环境的适应性更差，对环境更加敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，需要严格控制。另外，动物细胞相对于微生物来说，生长比较缓慢，因而培养时间较长。在细胞培养中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感，所以还需要防治污染问题，微生物、细胞残余物以及非营养的化学物质都有可能导致动物细胞培养物的污染。这些都给动物细胞的培养带来了一定的难度。
（三）动物细胞培养条件
1．无污染环境
细胞一旦离开机体，对环境无毒、无菌的要求也更高。因为动物体内存在着强大的免疫系统和肝脏等解毒器官，对侵入体内的少量的有毒物质，可进行抵抗和消毒，使细胞不受危害。当细胞被置于体外培养时，由于失去了抵抗能力，一旦污染便很容易导致细胞死亡。因此，在动物细胞进行体外培养时，保持无污染的环境是维持细胞生存的基本条件。
2．温度
温度是细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度是不尽相同的，例如人和哺乳动物的体内的温度为35-37℃，昆虫细胞的最适温度是25-28℃，培养细胞的最合适的温度也在这个范围，偏离这一温度范围，细胞的正常生长和代谢将会受到影响，甚至导致细胞死亡。一般来说，培养细胞对低温的耐受能力比高温强。温度不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；若高于40℃，细胞受到严重损伤，几小时内细胞便会死亡。细胞代谢随温度的降低而减缓，温度不低于0℃时，能抑制细胞代谢，但细胞仍能生存和生长，但速度缓慢。
3．pH值
大多数动物细胞培养的最适pH一般为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将产生有害影响，严重时可导致细胞退变或死亡。不同的细胞对pH的要求也不完全相同，一般原代培养细胞对pH的耐受力更差一点。总的说来，细胞的耐酸性比耐碱性强一些。因此培养过程一定要控制pH，为维持培养液的pH恒定，最常用的是加入磷酸缓冲剂的方法。
4．溶氧及气体环境
细胞的生长代谢离不开气体，所需气体主要是O2和CO2，氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长和繁殖。CO2是细胞代谢产物，它能调节培养环境的pH。当细胞代谢旺盛时，不断释放CO2，培养液变酸；反之，当CO2外溢时，会使pH升高。
5．营养物质
动物细胞体外培养所需的营养物质与体内培养的基本相同，对营养的要求较高，需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子。大多数培养细胞对渗透压都有一定的耐受性，对大多数细胞来说，渗透压在260-320mOsm/kg(每kg细胞耐受的溶质浓度为260-320mmol/L)范围都适宜。在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种营养，只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常生存、生长。
（四）动物细胞培养基
动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。动物细胞的培养基一般可分为天然培养基、合成培养基、无血清培养基几种，此外，动物细胞培养还需要一些常用的溶液。
1．天然培养基
即直接取自动物体液或从组织中提取的成分做培养基，主要有血浆、血清、胚胎浸出液、鼠尾胶原等。天然培养基使用最早，营养成分最高，也最为有效，但成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因此使用受到限制。
动物血清是天然培养基中最常用的，血清含有许多维持细胞生长繁殖和保持生物学特性不可缺少的营养物质，包括蛋白质和核酸等。另外，血清能中和培养基中的有毒物质的毒性，使细胞免受伤害。常用的动物血清主要有胎牛血清、犊牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等。其中胎牛血清质量最好，但来源少，价格较高，最常用的是小牛血清。血清中主要含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、金属离子、促贴附物质等。
2．合成培养基
合成培养基是参照天然培养基的成分，根据细胞生存所需物质的种类和数量，用化学物质人工模拟合成的。合成培养基成分已知，便于实验条件的控制。但由于天然培养基的有些成分尚未知，加上有些成分尚无法用已知的化学成分代替，因此，要想细胞更好的生长和繁殖，还需加入一定量的天然培养基，一般是加入小牛血清。
3．无血清培养基
无血清培养基不加动物血清，在已知细胞所需营养物质和贴壁因子的基础上，在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，保证细胞的良好生长。动物血清成分复杂，对细胞培养易造成污染和毒性作用，不利于产品的纯化和检测，再加上来源有限、成本高等限制了它的大规模使用。无血清培养基的优势在于避免了血清的这些缺点。在生产单克隆抗体、细胞生长因子和疫苗等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。在细胞早期培养阶段，细胞对于无血清培养基的适应性往往是克隆特异性的，每个新的克隆常需要重新配制培养基和适应过程。最近研究表明，先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养，然后转染这些细胞得到的重组克隆在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力，其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。
4．无蛋白培养基
无血清培养基中添加的蛋白成分价格昂贵，且有的成分(如牛血清蛋白)含有很多种杂质，因此，在无血清培养成功以后，科学家们又开始研究从培养基中减去这些成分。在对细胞的营养需求有比较深入认识的基础上，化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和杂交瘤细胞的培养。
5．细胞培养常用液
（1）消化液
主要用于细胞培养前的组织块解离和细胞的分散以及传代培养时细胞脱离贴壁表面并分散细胞。常用的消化液有胰蛋白酶溶液和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）溶液。
① 胰蛋白酶溶液：呈黄色粉末状，易潮解，应冷藏干燥保存。胰蛋白酶来源于牛、猪等动物的胰脏，能使细胞间的蛋白质水解，使细胞分散。不同的细胞对胰蛋白酶的浓度、温度、作用时间的要求不一样。在pH8.0，37℃时胰蛋白酶的效果最好。常用的溶液的浓度是0.25%和0.125%两种。Ca2+，Mg2+的存在和血清、蛋白质的存在会降低胰蛋白酶的活力。所以用无Ca2+，Mg2+的溶液配制，消化结束时，用血清来阻制酶作用。
② EDTA溶液：又称Versen，是一种化学螯合剂，对细胞有一定的解离作用。它毒性小，易配制，使用方便。常用的浓度是0.02%。如将EDTA和胰蛋白酶溶液按一定的比例混合使用，效果更好。
此外，胶原蛋白酶溶液、链酶蛋白酶溶液等也可用于消化细胞，但价格昂贵，保存困难，因而使用较少。
（2）pH调整液
各种细胞对培养基的酸碱要求是十分严格的，因此，培养前一定要用pH调整液将培养基的pH调整到合适的范围。pH调整液应单独配制，单独灭菌，使用前加入灭菌的培养基。常用的pH调整液有Na2CO3溶液（7.4%、5.6%、3.7%）、10%醋酸溶液和HEPES液（20mmol/L，一种氢离子缓冲剂）。
（3）抗生素液
细胞培养的过程中，需向培养液中加入适量的抗生素液，以防止微生物的污染，而不影响细胞的生长。常用的抗生素有：
①青、链霉素（双抗）液：取青霉素G100万单位、链霉素100万单位溶于50mL 灭菌的Hanks或三蒸水中作为母液。使用时在100mL培养基中加入0.5mL母液，则最终浓度为每毫升含100单位青霉素、100μg链霉素。
②卡那霉素液：取5万微克卡那霉素溶于50mLHanks液中，即成10，000μg/mL的母液。使用时在100mL培养基中加入0.5mL母液，则最终浓度为50μg/mL。
③制霉菌素液：因其不溶于水，将其制成5，000μg/mL的悬液，使用时在100mL培养基中加入0.5mL悬液，则最终浓度为25u/mL。
（五）动物细胞常用的培养方法
1．贴壁培养技术
大多数细胞在离体培养的条件下，都要附着在固体表面上才能生长。原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展成各种形态，一般在数天后就铺满生长表面，形成致密的细胞单层（monolayer cell）。当细胞生长到表面相互接触时，就停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制（contact inhibition）。所以如需继续培养，需将单层细胞再分散，稀释后再重新接种，进行传代培养。贴壁培养的表面要求有带有适量的正电荷和高度的表面活性，主要材料有明矾——硅硼酸玻璃、聚苯乙烯、不锈钢等。贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。
贴壁培养的一般步骤是，先将组织块消化，使之分散成细胞团或单个细胞状态，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜营养液的培养系统中。然后放入CO2培养箱培养。
2．悬浮培养技术
少数非贴壁生长型细胞，如杂交瘤细胞，能在培养器中自由悬浮生长。将采集到的活体组织分散、过滤、离心、纯化、漂洗后接种到适宜的培养液中，置于特定的培养条件下培养。传代时不需再分散，只需按比例稀释即可继续培养。对于小规模多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养可采用类似发酵罐的生物反应器。悬浮培养设备要求简单、细胞增殖快，可借鉴微生物发酵的成功经验。但是，只有极少数的细胞适合这种悬浮培养。
（六）动物细胞大规模培养技术
动物细胞大规模培养技术始于20世纪60年代初Capstick及其同事为生产FDM 疫苗而对BHK细胞的研究。它是在传统的培养技术的基础上，融合固定化细胞、流式细胞技术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流和温和搅拌技术等发展起来的。
1．中空纤维细胞培养法
1972年，里查德·克瑞克（Richard Kncazek）等模拟体内微环境，设计了中空纤维细胞反应器。中空纤维是由聚枫或丙烯的聚合物组成的半透膜，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞能在表面生长。细胞能在中空纤维上不断从流动的培养液中获得营养物质，细胞代谢产物和培养物又可随培养液的流走而运走。与前面介绍的细胞生长在二维空间的培养技术不同，中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态。培养系统的核心部分由3至6层这样的中空纤维组成，细胞接种于中空纤维的外腔。细胞向三维空间繁殖，形成类似组织的多层细胞群体，细胞密度可达109个/ml。培养一段时间后，可逐渐用无血清培养基代替天然培养基。此时细胞不在增殖，但可继续分泌产物，分泌物的纯度可达60%-90%。这种培养系统具有所占空间小，产物的分离纯化比较方便，细胞保持高度活性等优点，适合多种细胞的培养。
2．微载体培养技术
大多数动物细胞，都具有贴壁生长的特性，而传统的适于贴壁生长的细胞培养系统，由于表面积的限制，很难达到大规模生产的目的。最初采用的滚瓶系统，虽然能增加细胞生长的贴壁面积，但所占的空间大，劳动强度大、细胞产率低、不易监控等缺点限制了他的进一步发展。1967年，凡?维茨儿（Van Wezel）开发了微载体培养系统(Microcarrier，MC)培养贴壁细胞。经过几十年的研究，微载体培养已广泛地应用于动物细胞的培养，其中尤以Pharmacia生物技术公司生产的微载体(Cytodex、Cytopore、Cytoline等)使用范围最广。微载体培养是细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长，通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。这种培养较传统的单层细胞培养，面积大大增加。如将这种微载体在流化床式、固定床式反应器中进行培养，则可获得比原来多20～50倍的高密度细胞。另外，这种培养的劳动强度减少，1升微载体培养生产的细胞相当于50个转瓶(490cm2/瓶)所生产的细胞，省却了玻璃容器等的清洗和准备工作。而且细胞与培养液的分离简单，一旦搅拌停止，3分钟后细胞即能依靠其重力而沉淀，只要去除上清液，而无须进行离心操作。减少了繁复的操作步骤，降低了污染率。目前，狂犬病毒精制灭活疫苗就是采用Cytodex培养Vero细胞而进行大规模生产的。
常用的微珠载体是DEAE-交联葡聚糖微粒。近年来，国外新开发的MC主要有液体微载体、大孔纤维素微载体、PHEMA微载体、聚苯乙烯孔微载体、聚氨酯泡沫微载体、磁性微载体。其中磁性微载体是由铁、钴或镍的磁性氧化物与经戊二醛处理的明胶混合、研磨，并用水解蛋白酶处理后制成，对疫苗、干扰素、生长素的生产均具有应用潜力，且产品质量较高。
但是，实心微载体的比表面积还是太小，于是人们设计了用微载体内部固定细胞。如海藻酸钠系统、琼脂糖系统、琼脂糖——海藻酸钠系统等。这类技术能维持很高的细胞密度，但很难达到2L以上的规模。1985年，Verax公司开创了大孔微载体培养技术，接着有了Percell系统和Siran系统。1986年，Nssina报道了明胶大孔微载体的制备及其在细胞培养中的应用。大孔微载体除了有利于细胞高密度大规模培养外，在外源蛋白的长期高效表达方面也明显的优势。
大多孔微载体以纤维素为基质，内部有许多网状的相互连通的小孔通向载体表面，细胞在接种后，易于进入微载体内部生长分裂，以避免剪切力或气泡的影响，即使大部分细胞免受机械损伤，又为细胞提供了充分的生长空间。Onderwater等报道，使用大多孔微载体培养能表达人类细胞色素Ｐ450同功酶的Ｖ79细胞，细胞量从接种时的2×105/ml，增加到六天后的1×107/ml。Zhaolie C等用多孔微载体Cytopore培养重组CHO细胞系4B3，最高细胞密度达到8.83×106/ml[11]。胡显文等将Cytopore多孔微载体用于中试规模的反应器，也收到了很好的效果。另外，由聚乙烯和二氧化硅制成的微载体Cytoline，则适用于贴壁依赖性及非贴壁依赖性细胞的流化床或灌注培养。
3．微囊化培养技术
微囊是一种由半透膜制成的多孔微球体，酶及大分子不能从微囊中溢出，而小分子物质可以通过。微囊化技术是用固定化技术将细胞包裹在微囊里，在培养液中悬浮培养。细胞微囊化后，由于生长在各自的微小环境里，减少了培养时搅拌对细胞的剪切力，细胞生长良好，培养液易于迅速改变，且无分离细胞与培养液的困难。在培养过程中，微囊化也能提供很高的细胞密度，产物浓度和细胞纯度都有所增加。微囊化培养技术为单克隆抗体、干扰素、乙肝表面抗原等大规模生产提供了广泛的应用前景。
1987年，利姆（Lim）和萨姆（Sum）制成了细胞能在其生长繁殖的微囊。制备微囊化细胞所用的材料主要是海藻酸和多聚赖氨酸。将动物细胞和海藻酸溶液混合悬浮，经微囊发生器制成微球滴入氯化钙溶液中，制成凝胶球。然后用聚赖氨酸处理，使胶球表面包裹一层膜。最后用柠檬酸溶液处理，使细胞得以悬浮在微囊中。得到的动物细胞微囊就可悬浮与培养基中培养。据报道，微囊中单抗浓度很高，可达2.5g/L，且无其它杂蛋白，容易获得高纯度单抗。目前，微囊工艺已用于生产以克计的单克隆抗体。高表达有工业价值蛋白质的重组细胞近年来亦更多地用微囊化培养。
二、动物细胞培养生物反应器
生物反应器是生化工艺过程中唯一一个把原料转化为产物的地方。在细胞培养过程中，细胞培养生物反应器是整个过程的关键设备，它要为细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞培养的质量和产量。因此，生物反应器的选择对整个生物反应过程至关重要。动物细胞的大规模培养需要特殊的反应器，与微生物和植物细胞不同，动物细胞外层没有细胞壁，质膜脆性大，对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求。因此，传统的微生物发酵用的反应器不能用于动物细胞的大规模培养，而具备低的剪切效应、较好的传递效果和力学性质是这类反应器设计或改进所必须遵循的原则。70年代以来，细胞培养用生物反应器用很大的发展，种类越来越多，规模越来越大，但是反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主。在国外，Celltech公司建立了10000L规模的生物反应器，培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体；Sumitomo公司建立了8000L搅拌反应器生产病毒疫苗、干扰素和其它生物制品，我国在“七五”期间已经开始这方面的研究，已成功地研制了CellCul－20Ａ等细胞培养用生物反应器。
除了以人工诱变为目的的培养外，用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。由于动物细胞生长的特殊性，需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。动物细胞培养用生物反应器大致有：气升式生物反应器，中空纤维管生物反应器，流化床生物反应器，搅拌罐生物反应器，堆积床生物反应器，一次性生物反应器，膜生物反应器等。
（一）气升式生物反应器（airlift bioreactor）
气升式生物反应器是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，其特点是结构简单，操作方便。目前，我国利用生物反应器生产了大量生物制剂，多采用的是气升式细胞培养生物反应器。气升式细胞培养生物反应器的原理及结构见本书第五章第二节。
戴晓萍等人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终密度可达1.13×106个/mL。香港大学的Wen等人报道了一个新型的灌流装置，由气升式反应器和澄清器组成，用于高密度培养动物细胞。在灌流循环中，细胞经过两级沉降回到反应器，平均培养密度达到1.31×107个/mL。
（二）中空纤维管生物反应器(hollow-fiber bioreactor)
中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维管束组成的，纤维束由外壳包裹，因此可分为壳体空间及管体空间两部分，每部分各有其进出口。一般地说，细胞生长在壳体部分，新鲜培养液从壳体部分导人，气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。反应器结构如图6-32、6-33所示。壳体部分的细胞如是附壁性的，则附着在纤维外侧，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲出；若是非附壁性的，应采用微滤材料将其截留在壳体内而让废培养液排出。中空纤维管细胞培养装置的产率与细胞分泌速度有关外，还与细胞培养装置的设计有关。它由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度最高可达109 cells/mL数量级。主要用于杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
柱状中空纤维反应器是最目前最常用的中空纤维反应器类型，是理查德·克瑞克（Ｋnazek）20世纪70年代初设计的。以Ｅndotronics公司生产的最著名的AcusystPM大规模生产系统为例，这种反应器的套管是一圆柱体，包含了两条独立的流动通道，每条通道连接有６个中型的中空纤维反应器。整个反应器系统采用计算机监控各种生长参数，诸如营养盐供应、废物排出、pＨ、DO、Ｔ等。
因柱状中空纤维反应器中营养供应和代谢产物会存在浓度梯度，所以细胞分布受到影响而不均匀，限制了培养系统的进一步放大。由此，人们开发出板框式中空纤维反应器。该反应器的中心是一束中空纤维浅床，置于两个不锈钢微孔滤板之间，营养液通过滤板垂直流向纤维床乎面。虽然一定程度上克服了柱状中空纤维反应器的不足，但是因为中空纤维浅床厚度有限，因而培养系统也不可能太大。
John等报道了一个用于大规模培养动物细胞的径向流中空纤维反应器。该反应器内有一个垂直的中央分配管，外面由中空纤维管与分配管呈平行组成一个环状床层。培养液由中央分配管径向流过中空纤维床，细胞在中空纤维外壁贴附并生长。空气和CO2的混合气体在中空纤维间与培养液成错流流过床层，向细胞提供氧分并维持一定的PH值环境，细胞的代射物随气流带出。在这个反应器中细胞生长的表面密度可达7.3×106个/cm2。
Guinn发明了一个可用于动物细胞培养的生物反应装置，由中空纤维反应器和灌流系统组成。液体通过泵在反应系统内循环，灌流系统补充或置换培养介质及移出代谢物。细胞在中空纤维膜的一侧生长，培养介质在膜的另一侧通过扩散向细胞传递营养。该反应器能为细胞提供一个温和的生长环境。用泵控制培养介质在反应器内循环。培养液在中空纤维腔内流动并通过中空纤维膜向另一侧供应细胞生长所需的养分。该反应器可控制溶氧、介质组成、温度和PH值，适合于细胞的高密度悬浮培养，尤其适合于动物细胞培养反应器，由氧渗透膜管和中空纤维束构成内外空间，供细胞生长和向细胞提供营养。细胞培养密度几乎能达到2×108个/ml。该反应器可用于为大规模中空纤维培养系统预测不同介质、培养条件及其他因素对细胞生长可能产生的。中空纤维管反应器总的发展趋势是让细胞在管束外空间中生长，用这种方式，能获的更高密度的细胞。
（三）流化床生物反应器(fluidizbed bioreactor)
流化床生物反应器的基本原理是培养液通过反应器垂直向上循环流动，不断提供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在呈流态化的微粒中生长。同时，不断加入新鲜培养液。这种反应器的传质性能好，并在循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供给高密度细胞所需要的氧，同时排出代谢产物；反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不损坏脆弱的细胞。流化床生物反应器满足了高密度细胞培养，使高产量细胞长时间停留在反应器中，优化了细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求。流化床反应器可用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞的培养。另外，流化床反应器放大也比较容易，放大效应小，已成功地从0.5L放大至10L，用于培养同种细胞生产单克隆抗体，体积生产率基本一致。
（四）搅拌罐生物反应器(stirtank bioreactor)
搅拌罐生物反应器基本结构为：一个旋转过滤器、一台用于控制温度、pH值、搅拌速度和溶氧(DO)的数字控制装置(DCU)和起通气作用的底部环形喷气结构。基本原理是新鲜培养基分散进入旋转滤器的外部区域，从旋转滤器的中间获得无微载体的收集液。旋转滤器一般由不锈钢丝网构成，有良好的生物相溶性，易于清洗和消毒，可重复和长期使用。在搅拌式生物反应器中同样可以培养悬浮生长的细胞，又能培养贴壁生长的细胞。它主要的优点是能满足高密度细胞培养的要求。CelliGen笼式通气搅拌罐和20L双层笼式通气搅拌罐（CellCul-20）已经大规模培养多种细胞。1999年，美国人Zhaolie-c在搅拌式生物反应器中利用重组CHO细胞4B3生产了纤维蛋白溶酶原激活.
（五）堆积床生物反应器(packedbed bioreactor)
CelligenPlus堆积床生物反应器的工作原理为：当推进器(impeller)旋转时，培养基通过推进器的中心空管螺旋式地从罐体底部往上流，然后从3个出口中流出，通过堆积床向下流动至罐体底部，再通过推进器的中心管往上流。细胞附着在堆积床的聚酯片上，气体从喷射器喷出进入培养基中。通过调节气体混合物的组成成分，完成对pH和DO的控制，加入氧气或氮气以满足培养过程中氧气的吸收；当pH太高时加入CO2；空气作为一种填充气体，保持气体进入罐体时流速的稳定。培养基通过蠕动泵从培养基储存瓶(mediareservoir)中进入反应器，收集液通过蠕动泵从反应器中流出进入收集瓶。堆积床有以下特点：贴壁依赖性和悬浮细胞可成功地在堆积床内附着；细胞不接触气液界面，低漩流和低剪切力，细胞受到的伤害很小；反应器能以分批式或连续/灌流方式运转，并可维持长时间;聚酯片提供高的表面积/体积比率，维持高细胞密度。
国内有人采用美国NEW BRUNS WICK SCIENTIFIC公司生产的ＣelliＧen Ｐlus堆积床生物反应器，用无血清培养基培养分泌rhEPO的工程细胞株ＸＰ9501，用于大规模生产重组人促红细胞生成素。
（六）一次性生物反器(disposable bioreactor)
这种生物反应器由预先消毒的、FDA认可的、对生物无害的聚乙烯塑料箱组成，箱中部分填充培养基并接种细胞。箱中其余部分是空的，培养过程中空气连续通过这里，空气通过完整的过滤器进入箱体。前后摇动箱体使液气界面产生波动，大大提高了氧气的溶解量，有利于排出CO2，控制pH值，也促使培养液混合均匀，细胞和颗粒不会下沉。废气通过一个消毒过滤器和止逆阀。整个生物反应器置于传统的细胞培养用CO2培养箱中，便于控制温度和pH值，或者在箱体底部加热控制温度。培养细胞的密度可达到7×106mL-1和100L的工作体积.使用前箱体用γ射线消毒，用后丢弃。特殊的开孔可进行无菌加样、取样，而不必把生物反应器置于层流罩中。装置简单，易于操作，成本低，低剪切力，无空气鼓泡，减低了气泡对细胞的损害。可用于培养动物细胞和植物细胞，并十分适合生产病毒。此反应器已成功悬浮培养重组NS0细胞生产单克隆抗体；悬浮培养人293细胞生产腺病毒(adenovirus)；用昆虫sf9细胞生产棒状病毒(baculovirus)；用微载体Cytodex3培养人393细胞。
第九节 植物细胞培养生物反应器
植物细胞培养是指在离体的条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。植物细胞含有人类所需的成分，而传统的方法从植物中提取分离这些成分已很难满足人们的需求。近年来，利用植物细胞培养来生产有用代谢产物已受到广泛的关注，但是，只有一小部分的产品已成功用于商业化生产，其原因是反应器设计、过程发展以及对反应机理知识的欠缺等工艺上的限制。植物细胞生长缓慢、需氧低，此外，由于它们体积较大、细胞壁较厚、液泡较大而对剪切敏感。因此气升式和柱状生物反应器应用较为普遍。随着植物细胞悬浮培养技术的逐步完善，单细胞培养的成功，各种新型生物反应器的问世，利用植物细胞培养技术成为大规模生产植物代谢产物的有效途径。
一、植物细胞培养过程
植物细胞培养按照培养对象可分为单倍体细胞培养和原生质体培养；按照培养基可分为固体培养和液体培养；按照培养方式可分为悬浮培养和固定化细胞培养。
单倍体培养 一般是指花药在人工培养基上进行培养，从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后再长成单倍体植株；也可以通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。
原生质体培养 将植物的体细胞（二倍体细胞）经纤维素酶等去掉细胞壁处理后，获得的原生质体（protoplast）在无菌培养基上生长、分裂，最终长成植株。也可以将不同植物的原生质体融合而获得体细胞杂交的植株。
固体培养是在微生物培养基础上发展起来的植物细胞培养的方法。培养基添加一定比例的琼脂配制，用培养皿、三角烧瓶或试管分装，经高压灭菌冷却凝固后接种经消毒过的外植体，整个过程需无菌操作。
液体培养 也是在微生物培养基础上发展起来的，可分为静止与振荡两种。静止培养无需任何设备，适合某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床或转床等设备，可使培养物充分混合以利于气体交换。
细胞悬浮培养 是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的液体培养技术。在进行细胞培养时需要提供容易碎裂的愈伤组织进行液体培养。与微生物培养相似，植物细胞的悬浮培养也包括分批培养、半连续培养（也叫流加培养）、连续培养三种方式。目前，植物细胞大规模培养主要采用悬浮培养方式，这主要是由于悬浮培养可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养的吸收；可带走培养物产生的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害；可保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果；可以借鉴发酵工程的成熟技术，容易放大实现规模化。
固定化细胞培养 是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的。是固体培养的一种，但不是使用固体培养基，而是与固定化酶或固定化微生物细胞培养类似的一种植物细胞培养技术，目前应用最广泛的、能很好保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。具体培养方法将在下一节中介绍。
（一）植物细胞培养基
对植物细胞的生长而言，培养基的组成成分是一个决定性的因素。植物细胞培养与动物细胞培养相比，其最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。其培养基主要由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸等组成。
1．无机盐类
对于不同的培养对象和形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中至少含有25mmol/L的硝酸盐和钾。虽然硝酸盐可以单独作为无机氮源，但是加人一点铵盐对细胞生长有利。如果铵盐单独作为氮源，添加一些琥珀酸或其他三羧酸循环酸效果更好。对常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养来说，硝酸盐加上铵的浓度可达到60mmol/L，说明铵可能对某些培养物有重要作用。镁、钙和硫元素的浓度在ｌ～３mmol／Ｌ范围较为合适。所需的钠、磷和氯化物有钙盐、磷酸盐和微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。
2．碳源和能源
蔗糖或葡萄糖是常规的碳源，而果糖的利用效果较差。其他糖类均不合适作为单一的碳源。培养基中蔗糖被迅速分解为葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是2%到4%。通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。
3．植物生长激素
植物激素是培养基中不可缺少的组成部分，大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。通常激素可分为二类：生长素和细胞分裂素。生长素能促进细胞分裂，常用的有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-Ｄ）和萘乙酸（NAA）。前两种不稳定，能被细胞释放的酶降解，而后两种被细胞降解的较慢，对热稳定。细胞分裂素常用的是6-苄基瞟怜（6-BA），激动素（kt）和玉米素（zeatin）。将分裂素和生长素一起使用，效果更佳。使用量在0.1~10ｍｇ／Ｌ之间，可根据不同细胞株而异。
4．维生素
在各种维生素中，硫胺素（维生素B2）可能是必需的，而烟酸和吡哆辛（维生素B6）对生长有促进作用。一般在培养基中都加了较多的肌醇，它能促进愈伤组织的生长。
5．有机氮源
通常采用的有机氮源有水解酪蛋白、谷氨酰胺或氨基酸混合物。在细胞初级培养的早期生长阶段，有机氮源可促进胚胎发生和多胚性出现。
6．有机酸
在以铵盐作为单一氮源的培养基培养时，加人丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等，能够保证植物细胞生长，并且耐受钾盐的能力也有所提高。
（二）植物细胞培养基的制备
配制培养基所用的蒸馏水最好是用玻璃容器蒸馏过的去矿质盐的蒸馏水，所用的无机盐、碳源、维生素应该采用高纯度级的药品。生长激素在使用前需要重结晶提纯，其酒精－水溶液要用吸附法脱色处理。蛋白水解液最好用酶水解。对于吲哚乙酸、吲哚丁酸、2，4-二氯苯氧基乙酸和萘乙酸这样难溶于水的生长激素类物质，配溶液时可先溶于95%的酒精中，然后慢慢加人蒸馏水，稍微加热，稀释至所需体积，再调节pＨ。由于培养基配比中有些组分量很小，可按培养基配方浓度配成使用浓度的10倍或者更多倍的母液，分成小瓶后冷冻保存，使用时再稀释到正常浓度。为了防止在高浓度下培养基组分间相互作用产生沉淀，钙盐、钠铁盐等要单独配制保存，使用时再稀释混合。维生素每种也是分开配制的。配制细胞分裂素物质，应先用少量浓度为0.5或1mol/L的盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量。在培养基配制过程中可用0.5mol/L的HCl或0.2mol/LNaOH凋节pH，固体培养基加人琼脂0.6%～1.0％，121℃蒸汽灭菌15~20min。大多数培养基成分都经得起高温灭菌，对于一些热敏性化合物，如Ｌ谷氨酰胺、植物生长激素等应该用过滤法灭菌，然后再按无菌操作加人到己灭茵的培养基中。
二、植物细胞培养生物反应器
与天然栽培法相比，利用植物细胞培养技术生产药用代谢产物、食品添加剂、化妆品等具有明显的优势，但能成功地把摇瓶培养的结果放大到生物反应器中而实现大规模培养的较少，可见研究合适的生物反应器对于植物细胞大规模培养生产有用代谢产物是非常重要的。植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，植物细胞较微生物细胞大，对氧需求小，对剪切力却很敏感，因此不象微生物培养那样采用高剪切的搅拌，而混合显得更重要。目前，由于植物细胞悬浮技术的发展，单细胞培养的成功，加上各种新型生物反应器的问世，使得植物细胞有可能像微生物那样在发酵罐中大规模连续培养。用于植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、非搅拌式及其它新型生物反应器，另外还有植物细胞固定化反应器和膜反应器等。
（一）机械搅拌式生物反应器
机械搅拌式生物反应器混合程度高，适应性广，能获得很高的溶氧系数KLa，在大规模生产中广泛使用。但是搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，且植物细胞培养一般只需较低的溶氧系数。因而对于有些对剪切力敏感的细胞，传统的机械搅拌罐并不适用。为此，对搅拌罐进行了改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。Kaman等采用带有1个双螺旋带状叶轮(helicalribbonimpeller)和3个表面挡板的搅拌罐，证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养。Jolicoeur等进行了类似的研究，在反应器中得到与摇瓶相同的高浓度生物量。钟建江等通过培养紫苏细胞进行比较，发现带以微孔金属丝网作为空气分布器的三叶螺旋桨反应器(MRP)能提供较小的剪切力和良好的供氧及混合状态，优于六平叶涡轮桨反应器，并认为在高浓度细胞培养时，MRP型反应器将显示更大的优越性。离心式叶轮反应器(centrifugalim-pellerbioreactor)与细胞升式反应器(cell-liftbiore-actor)相比具有较高升液能力，较低剪切力，较短混合时间，在高浓度下具有高得多的溶解氧系数，表明有用于剪切力敏感的生物系统的巨大潜力。另有方框型桨式搅拌、蝶型涡轮搅拌等不同形式的机械搅拌罐用于植物细胞培养的生产和研究，结果证明不同叶轮产生剪切力大小顺序为涡轮状叶轮>平叶轮>螺旋状叶轮。一种升流式生物反应器(lift-streambioreactor)利用罐中心一根连有多孔板的杆上下移动达到搅拌的目的，可用于培养剪切力敏感细胞。
（二）非搅拌式生物反应器
相对于传统搅拌式反应器，非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结构简单，因此被认为适合植物细胞培养。其主要类型有鼓泡式反应器、气升式反应器和转鼓式反应器等。通过对培养紫苏细胞的生物反应器比较发现鼓泡式反应器优于机械搅拌式反应器。但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低，如果用较大通气量，则产生的剪切力会损伤细胞。研究表明，喷大气泡时，湍流剪切力是抑制细胞生长和损害细胞的重要原因。较大气泡或较高气速导致较高剪切力，从而对植物细胞有害。气升式反应器广泛应用于植物细胞培养的研究和生产。通过胡萝卜细胞培养研究发现，比较搅拌罐、气体喷射罐和带通气管的气升式反应器，最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到。气升式反应器用于多种植物细胞悬浮培养或固定化细胞培养，但其操作弹性较小，低气速时，尤其H/D大，高密度培养时，混合性能欠佳。过量供气，过高的氧浓度反而会影响细胞的生长和次生代谢产物的合成。将气升式发酵罐与慢速搅拌结合使用可弥补低气速时混合性差的弱点，采用分段的气升管，也有利于氧的利用与混合。转鼓式反应器用于烟草细胞悬浮培养的研究发现，与有一个通风管的气升式反应器相比，相同条件下转鼓式反应器中生长速率高，其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反应器。
（三）光生物反应器
许多植物细胞培养过程中需要光照，往往考虑在普通反应器基础上增加光照系统，但在实际中存在很多问题，如光源的安装、保护，光的传递，还有光照系统对反应器供气、混合的影响等。小规模实验往往采用外部光照，反应器表面有透明的照明区，光源固定在反应器外部周围。但大规模生产时透光窗的设置，内部培养物对光的均匀接受等问题难以解决，因此许多人对采用内部光源的反应器进行了研究。Mori等发明的反应器将多个透明圆柱体平行安装在反应器罐内，光源放置在透明圆柱体中，供给CO2的气体交换器在罐内两个圆柱之间。Ogbon-na等研制了一种用于大规模培养光合细胞的新型内部光照搅拌式光生物反应器，它由每个单元都包含光源的多个单元组成。大的光生物反应器通过增加单元数目得到。每个单元中心固定一个玻璃管，光源插入其中，由搅拌桨实现混合，该搅拌浆设计成旋转时不接触玻璃管，玻璃管同时作为挡板，该反应器在低转速下仍有较高混合程度，而且剪切力较小。由于发光体并非机械固定在反应器上，且通过玻璃管与发酵液分离，因此反应器可高压灭菌，而发光体在冷却后插入玻璃管。Yamamurak等研究固定CO2的光反应器，特别之处在于搅拌器具有发光作用。
（四）亲和层析生物反应器
亲和层析生物反应器（affinity chromatography bioreactor (ACBR)）利用一个标准的反应器，加一个亲和层析柱，用于分离收集培养产生的目标蛋白。当细胞培养时，培养物用泵从反应器中抽出，进入柱中循环，所需的产物可分离得到，剩下的培养基回流到反应器。ACBR系统培养生产鼠单克隆抗体重链（HC Mab），其产量提高了8倍；培养生产6-his标记的人体粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子（GM-GSF），比单批培养提高了2倍。用ACBR培养植物细胞，可以解除降解的影响，去除了引起产物抑制途径的蛋白。
（五）固定化植物细胞反应器培养
1．细胞固定化定义与意义
最早应用固定化技术是在酶工程中。细胞固定化是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中、培养液呈流动状态进行无茵培养的一门技术。自从1979年植物细胞固定化成功以来，人们在生物反应器的植物细胞固定化培养方面开展了广泛深人的研究。固定化细胞培养技术是一项新型的细胞培养技术，对植物细胞的固定化并不影响其代谢活动，适合于细胞培养生产活性代谢产物。
植物细胞固定化培养具有许多潜在的优势，如细胞生长较为缓慢，利于次生代谢产物的积累；易于控制化学环境、收获次生代谢产物；细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小；有利于进行连续培养和生物转化。这些都使得固定化细胞培养系统具有很大的发展潜力。
2．植物细胞固定化方法
目前，植物细胞经常采用的固定化方法有：凝胶包埋、表面吸附、网格或泡沫材料固定、膜固定（包括中空纤维）。经常采用的固定剂主要是一些多糖和多聚化合物等，如海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖、明胶、聚丙酰胺等。
下面仅介绍几种最常用的细胞固定化方法：
（1）滴入法
配置一定浓度海藻酸盐的溶液，高温、高压灭菌。将离心收集的植物细胞悬浮液与海藻酸盐溶液混合，倒人塑料注射器中，然后慢慢滴人到含有CaCl2的培养基中，不断搅拌，形成球形颗粒。过滤收集颗粒，清洗后，转人装有培养基的摇瓶中进行培养。与海藻酸盐固定化不同的是卡拉胶必须加热保持液态。可将卡拉胶和细胞悬浮液滴人含钾离子的培养基中形成颗粒，但形成的颗粒大小不如海藻酸盐均匀。而使用琼脂糖固定植物细胞不需要其他离子来保证胶的稳定性。
〔2〕模铸法
将细胞－固定剂的悬浮溶液注人由两块夹子夹紧构成的模子中形成颗粒。这种方法制备的颗粒为柱形颗粒，可用于间歇式培养，不适合填充床式反应器。而且这种方法仅适合制备少量的固定化细胞。
（3）两相法
将细胞－固定剂的悬浮溶液在不断搅拌的情况下分散于豆油等有机相中，形成大小、形状都比较均匀的液滴后置于冰浴中冷却不断搅拌，使其凝固，离心得到颗粒。颗粒的大小主要取决于搅拌的速度。
（4）大规模固定化法
步骤与滴入法基本相同，不同的是采用专门的固定化装置进行植物细胞的固定化。该装置主要由装有固定剂溶液和细胞悬浮液的加料部分、培养基容器部分组成，通过鼓人无菌空气将固定剂溶液和细胞悬浮液喷人含钙离子的培养基中。
（六）植物细胞固定化反应器
1．填充床反应器
已被用于植物细胞的培养。细胞被固定于胶粒、金属或泡沫等支持物之中，固定化细胞不动，通过流动的培养液来实现混合和传质。填充床反应器每单位体积能容纳大量细胞。但是，填充床式固定化细胞反应器存在许多缺点，由于其混合效果低，细胞颗粒大，对必要的氧传递、pH值、湿度控制和气体产物的排除造成了困难，固定化颗粒或碎片会阻塞液体的流动，固定化的材料也会在高压下变形而阻塞填充床。Na-gai等用固定床反应器培养固定化烟草细胞，生长速率与摇瓶相同，胞内合成与摇瓶无明显区别。
2．流化床反应器
流化床反应器是利用无菌流体通入使固定化细胞悬浮于反应器中。通常采用小固定化颗粒。这些小颗粒良好的传质特性是流化床反应器的主要优点。为了使基质转化为产物更完全，通常使之在反应器中停留时间延长。通常采用大气量使固定化颗粒悬浮。同时保持低流速，或者使液体迅速通过流化床进行循环，这都会导致液体的高度混合。流化床反应器的最大缺点是剪切力和颗粒碰擅会损坏固定化细胞，同时，流体动力学的复杂性使之难以放大。Dubuis等用新型环回式流化床反应器(loopfluidizedbedreactor)进行coffeaarabica培养，测定了生长和产物合成的动力学参数，认为该反应器操作方便，消除了气体直接喷射引起的剪切力，易于测定放大所需的参数，适合中试和工业化生产。
3．膜反应器
膜生物反应器是近年来广泛使用的一种固定化反应器。由于膜的理化特性会严重影响膜反应器的操作，因此，膜的选择十分重要。膜的孔径大小一定不能影响必要基质和产物的扩散，孔径为几十微米的膜便能截留植物细胞。为加速传质通常采用薄的步孔膜，然而，膜的厚度一定要足以在长期操作中保持机械稳定。膜的化学特性（亲水性和疏水性）也很重要，可以用来选择性地传递培养液中的营养物质。一旦选定膜，接下来便是确定反应器的结构。虽然可采用压力驱动，但大多数膜反应器设计成依靠扩散来给细胞传递营养物质。对于给定
的膜型式及厚度，传质与膜表面积成正比。此时，首先考虑的是应采用能提供大的比表面积（表面积／反应器体积）的反应器。最常用的膜反应器是中空纤维和螺线式卷绕反应器（如图６－37所示）。在中空纤维反应器中，细胞既可处于纤维管中，又可处于管外，螺线式卷绕膜反应器实质上是卷成圆筒形的平板反应器，虽然未见在实际应用中采用螺线式卷绕反应器的报道，但有人采用平板反应器培养烟草细胞。研究表明，除了膜以外，细胞层的厚度也很重要。厚层细胞的内层部分通常会形成营养缺乏和产物积累，这种条件对植物细胞的形态和化学分化是有利的。Lang也研究了植物细胞膜反应器，将细胞固定在膜上3mm厚一层，培养基在膜下封闭回路循环流动，营养透过膜扩散至细胞层，次级代谢物分泌透过膜扩散至培养基。Humphrey对植物细胞培养微孔膜通气反应器进行了研究，分析了氧传递，为需要小剪切力的植物细胞培养的膜通气反应器提供设计依据，设计应考虑的因素包括管的长度、直径和膜厚度，进气的组成和压力，细胞生长培养阶段等。
第十节 微藻培养生物反应器
微藻(microalgae)是指那些在显微镜下才能辨别其形态的微小藻类类群，它们是个体微小、结构简单的单细胞植物，绝大多数营光能自养生活，广泛分布于淡、海水中。微藻的培养和研究始于18世纪末，1890年，荷兰细菌学家Beijerrinck用细菌培养的方法培养小球藻（Chlorella）和其它单细胞藻类获得成功。自20世纪50年代以来，微藻应用和培养的研究得到了稳定的发展。我国朱树屏教授1942年培养单细胞藻类，它先后替代粮食、饲料。80年代以来，微藻的培养和利用得到的迅猛的发展，已成为海洋开发中的新领域。藻类作为保健食品、绿色食品和低热量、低脂肪食品，以其独特的风味和营养价值，已越来越引起发达国家的重视。科学家预计，到2000年，藻类将为世界提供10%的蛋白质。世界上已知的微藻大约有10，000种左右，普遍富含蛋白质、β-胡萝卜素、α-亚麻酸、ω-多不饱和脂肪酸、虾青素、多糖等多种生理活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、防治心血管疾病等生理保健功能。
微藻能有效利用光能、CO2和无机盐类合成蛋白质、脂肪、碳水化合物以及多种高附加值生物活性物质，可以培养微藻来生产健康食品、食品添加剂、动物饲料、生物肥料及其他天然产品。与传统农作物相比，开发微藻资源具有许多优点：如效率高、能耗低；生长速度比普遍农作物快；容易收获和加工；可生产出极有生理价值的化合物；适于土地贫瘠或一些高盐碱度地区的生长；生产简单、投资少，很易被不同操作水平的养殖者掌握等。另外，开发微藻资源对于减缓土地、环境、能源和人口危机，研制和生产出新型生物医学产品及功能性食品，弥补传统作物的不足与局限以及促进传统农业向工业化生产过渡都具有重要意义。
另外，近年来分子遗传学和基因工程研究证实，大肠杆菌的载体和启动因子往往可以适用于蓝藻，尤其是单细胞蓝藻的转基因，这使得蓝藻基因工程得到了较快的发展，利用藻类为宿主的基因产物的生产也日益受到关注，因此微藻的培养受到广泛重视。
一、微藻培养生物反应器
与一般的动植物细胞培养不同，微藻具有光合效率较高；可以在非常广阔的区域范围内培养；应用前景广等特点。微藻的高密度培养是实现微藻资源开发利用的关键，而构建适合于微藻生长的光生物反应器则是实现微藻高密度培养的重要课题。目前，微藻培养主要有开放式大池培养和密闭式生物反应器培养两种方式。
（一）开放式大池培养系统
开放式大池培养系统是最古老、最简单的藻类培养系统。它包括天然大池和人工大池 两种型式。天然大池不加任何特殊装置，费用低，但不能进行纯培养，光照、温度等无法控制。
人工开放式培养一般用水泥池，再附加搅拌、二氧化碳控制等装置。于是，足够的二氧化碳供应和较适宜的培养条件可以提高光合效率和细胞浓度。最突出特点是技术简单、投资低廉及操作简便，在螺旋藻、小球藻和盐藻的大规模培养中取得了良好的效果。但开放式培养存在易受污染、培养条件不稳定、单位体积产率低、下游处理成本高、不易保持纯种培养等缺点，而且产品单一、多以藻粉为主、缺乏应有的后加工、深加工及应用研究。虽有许多尝试改进该系统，但对于大部分有开发价值的微藻，特别是基因工程微藻，开放式培养并不适宜。
（二）密闭式反应器
密闭式反应器装配有光照、二氧化碳供应、搅拌和温度控制系统。除了能采集光源外，其他很多方面与传统微生物发酵用生物反应器相似，它培养条件稳定，可无菌操作，易进行高密度培养，具有较大的面积体积比，受光面积大，光能利用率较高，已成为今后的发展方向。目前密闭式反应器有多种形式，如发酵罐式、管式和板式等光生物反应器。
1．管式光反应器（Tubular photobioreactor）
管式光反应器是目前应用最为普遍的光生物反应器之一。它是利用透明材料制成的管道安放成不同的形式，借助外部光照条件进行工厂化藻类培养。含有微藻的培养液通过泵或空气升液器的作用在管道中循环流动。由于二氧化碳通过泵进入藻液后在管道中流动，与藻液接触时间长，因而CO2的利用率高。
Print SJ等设计制作的光生物反应器，可以被认为是微藻光生物反应器发展史上的里程碑。管式反应器分为垂直管式、倾斜可调管式、水平管式等多种形式。水平管式采用泵循环、气升循环等方式混合，多数采用自然光，有的采用人工光源。Lee等针对一天中太阳光照的变化，对水平设置的管道进行改进，将管道反应器设计成与地面角度可调的形式，能更好利用太阳能。研究发现当倾斜角度为80°时，小球藻的产量是水平放置时的6倍。刘晶瞒等利用自制的细管式光生物反应器，对螺旋藻进行高密度培养，并研究了螺旋藻液的流变特性和光强的影响及以及光暗比对反应器体积产率与面积产率的影响，发现体积产率有光暗比饱和现象，而对于面积产率，存在着最佳光暗比。垂直管式采用机械搅拌、鼓泡、气升混合，可分为螺旋管式和鼓泡柱式等。
（1）气升式光生物反应器
气升式光生物反应器一般由罐体、气体提升管、内光源密封管、热交换装置、气体分布器、内外光源等部分组成。罐体、气体提升管和内光源密封管由耐热玻璃制作，可进行蒸汽消毒。以日光灯管作为内外光源。Richmond A等设计了一种新型的气升式管状光生物反应器。该系统的核心在于将160m长的Polycarbonate管分成8只，以集合管相连。它能适合于高密度生长的Isochrysis galbana，其产量最高可达1，500mgdwl-1d-1。张栩等在气升式光生物反应器中培养裙带菜配子体无性系。比生长速率最高为0.0262d-1，在快速生长期，日平均增重达到30%。王长海等用气升内环流光生物反应器对紫球藻进行培养，透明的反应器外部以12支40Ｗ荧光灯为光照系统，利用CＯ2为碳源，细胞的生长速度和生物量产率分别达到了0.952ｄ-1和42031ｇ/ｍ2。李志勇等采用气升内环流光生物反应培养螺旋藻，效果优于静置和机械搅拌反应器，最大细胞干重可达3 64ｇ/Ｌ。
李志勇等采用的反应器的结构示于图6-38，罐体直径182mm，高1000mm，提升管直径131mm，高600mm。内光源管直径45mm。总体积为15L，工作体积13L。提升管底部设有可替换的不锈钢烧结板制成的圆形气体分布器，空气和CO2定量混合后由此进入反应器中，形成均匀、细小的气泡，具有较高的气液传质面积，罐体内设有热交换装置，以维持培养温度。反应器并配置溶氧、pH、温度等在线监测系统，几何参数如下:高径比(H/D)5.5，提升管截面积Ar/下降截面积Ad1.1，气体分布器直径50mm，气体分布器孔径80μm，照光面积与体积的比值50m-1。
(2) 气升式循环磁处理光生物反应器
李志勇等成功开发出世界上第一台管道气升式循环磁处理光生物反应器微藻生产系统，初步实现了螺旋藻的高效纯种连续培养。管道气升式循环磁处理光生物反应器主要由光生物
反应器主体和相应的供气、光源、磁处理、热交换、加料、收获以及检测和控制系统组成。反应器主体采用可耐高温消毒的硼硅玻璃制作，包括气升管道、下降管和除气室三部分。实验采用的可调恒定磁处理装置如图6-39所示(实际应用中可用永磁铁代替)，磁极间距２ｃｍ；通过手柄调节电流强度来改变磁场强度。采用40Ｗ的荧光灯作光源。在控制仪表上设定控制温度和pＨ值，利用循环水热交换器由电磁阀自动控制温度；pＨ由二氧化碳通过电磁阀自动调节。由安装在除气室中的温度传感器、pＨ电极、溶氧电极通过二次仪表显示读出温度、pＨ值与DO，并可通过记录仪输出。由空气过滤器通入纯净空气，通气量从转子气体流量计读出。受光区光照面积与培养体积之比为222.33ｍ2/ｍ3，只需40Ｌ/ｈ的较小通气量即可获得良好的混合效果，培养过程中，藻液溶氧水平能维持在4ｍｇ/Ｌ左右。实际运行结果表明，当工作体积为12Ｌ时分批培养螺旋藻，最大细胞干重可达2.4ｇ/Ｌ。该生物反应器独特的外环流结构特点和循环磁处理效果可实现微藻生长过程的反复强化。此外，还具有良好的混合与光能利用性能，并能实现生长过程主要参数如ｐＨ、溶解氧、温度等的自动在线检测与控制。将磁处理技术应用于微藻培养，一定程度上开辟了微藻高密度培养的新途径。
（3）气升式螺旋管式光生物反应器
2001年，L．Tavieso等用螺旋管式光生物反应器来培养螺旋藻，当稀释率为1∶5时，最大产量可达到0.40g/L?d。此反应器可连续工作948个小时，比较适用于热带地区。这种新型的生物反应器——螺旋管式光生物反应器最初作为鼓泡式反应器使用，但接下来就作为气升式反应器使用。反应器的结构如图三所示。使用前，反应器、热交换装置、脱气装置以及另外的一些管道系统最初用自来水清洗，然后用0.2%的次氯酸钠循环洗涤，最后用蒸馏水洗去有机物及一些无机残余物。培养时，当培养物量下降时，可用蒸馏水补足到原来的体积。为防止起泡，可加入一些消泡剂。
2．板式光反应器
板式光生物反应器主要是由透明的玻璃或有机玻璃板制成，可以根据太阳光强度及入射方向的变化，调节最适的采光方向，增大透光率，反应器内部的藻液混合常采用两种方式，一种是气升式混合，一种是鼓泡式混合。反应器主要由光源、循环装置、板式反应器、控温系统、培养介质与CO2供给系统组成。反应器采用太阳光或卤素灯，光强通过调节光源与反应器的距离或光辐射入射方向加以控制。
1986年Ramasde等人首次开发平板式光生物反应器。1996年，Hu等研制出了斜板式光生物反应器，用于螺旋藻的大规模室外培养。由于该类型的反应器具有结构相对简洁，可以随意调节放置角度以便使其获得最佳的取光效果，容易加工制造，可以根据需要设计不同的光径以及操作条件容易控制等优点，使其成为具有良好使用价值的光生物反应器。许波、王长海等人用平板式光生物反应器培养微藻，其培养密度、单位体积和单位面积的细胞生物量都有所增加。
徐明芳等采用自行设计的光辐射板式光生物反应器，用有机玻璃板卷封粘接成长方形结构，用厚度为30ｃｍ光电辐射板（内设发光二极管，LED）交叉固定于反应器内侧，作为内部光源发射中心，使均匀发射的光能极大透过发光表面直接照射在浅层藻液上，实现了螺旋藻单藻种群的优势生长。
3．光纤光生物反应器
这是利用光导纤维的光传递性质，将氙灯作为光源安装在反应器外，将光纤直接安置在培养液中，并使它与反应器内部的光分散系统相匹配，使光线均匀地从内部照射藻液，由于光传播途径的缩短，可使光更充分的被细胞利用。同时由于作为光源的氙灯在反应器内部，因而反应器不受内部氙灯散热的影响。该系统采用超滤技术，不断分离产物，补充新鲜培养液，达到高密度培养目的，最大生物量达10ｇ/Ｌ。同时，使用中空纤维筒作为气体交换装置，CO2和O2的交换率更高。所使用的氙灯与太阳光的光谱几乎相同，但效率较低。1994年，Lee采用发光二级管作为光源的生物反应器，大大提高了光源的效率。
4．溢流喷射光生物反应器
华南理工大学研制出的实验室规模的小型光生物反应器，其主要结构包括浅层溢流光生物反应器、溢流喷射器、贮槽、循环系统、热交换系统和参数控制系统。反应器外形为扁平箱式，内部设有一层层交叉分布的隔板，隔板一端设有挡板，使藻液在隔板上形成一层浅液层，并靠溢流作用逐层向下流动。它采用溢流喷射装置对藻液进行搅拌和通气，气液混合均匀，简化了流程和设备。并且已成功从8升放大到100升。其基本结构及参数见图6-44。
第十一节 嫌氧发酵生物反应器
微生物发酵分嫌氧和好氧两大类，故发酵设备也分为两大类。酒精、啤酒及丙酮、丁醇溶剂等属于嫌氧发酵产品；谷氨酸、柠檬酸、酶制剂和抗生素等属于好氧发酵产品，在发酵过程中需不断通入无菌空气。
嫌氧发酵产品的典型代表是酒精和啤酒。酒精发酵灌具有通用性，其可以用于其它嫌氧发酵产品的生产，如丙酮、丁醇等有机溶剂。而啤酒发酵设备则具有专用性。酒精既可以在食品、医药等方面应用，又可以作为生物能源物质，成为酒精燃料。
用生物技术生产酒精是今后发展的重要领域之一。本节简单介绍嫌氧发酵的典型设备：酒精发酵设备和啤酒发酵设备。
一、酒精发酵设备
（一）对酒精发酵罐的要求
（1）及时移走热量：在酒精发酵过程中，酵母将糖转化为酒精，欲获得较高的转化率，除满足生长和代谢的必要工艺条件外，还需要一定的生化反应时间，在生化反应过程中将释放出一定数量的生物热。若该热量不及时移走，必将直接影响酵母的生长和代谢产物的转化率；
（2）有利于发酵液的排出；
（3）便于设备的清洗，维修；
（4）有利于回收二氧化碳。
（二）酒精发酵罐的结构
1．罐体
筒体为圆柱形，底盖和顶盖为锥形和椭圆形。为了回收二氧化碳气体及其所带出的部分酒精，发酵罐宜采用密闭式。罐顶装有人孔，视镜，CO2回收管，进料管，接种管，压力表
及测量仪表接口管等。罐底装有排料口和排污口，罐身上下部有取样口和温度计接口，对于大型发酵罐，为了便于维修和清洗，往往需在罐底装有人孔。如图6-45所示。
2．换热装置
换热装置，对于中小型发酵罐，多采用罐顶喷水淋于罐外壁面进行膜状冷却；对于大型发酵罐，罐内装有冷却蛇罐，和罐外壁喷洒联合冷却装置；为避免发酵车间的潮湿和积水，要求在罐体底部沿罐体四周装有集水槽。
3．洗涤装置
酒精发酵罐的洗涤，过去均由人工操作，不仅劳动强度大，而且二氧化碳一旦未彻底排除，工人入罐清洗会发生中毒事故。因此，采用水力喷射洗涤装置，从而改善了工人的劳动条件和提高了操作效率。水力洗涤装置如图6-46所示。
对于>20m3的酒精发酵罐，采用φ36×3mm的喷水罐，
管上开有φ4×30个小孔，两头喷嘴直径9mm。
上述这种水力洗涤装置，在水压力不大的情况下，水力喷射强度和均匀度都不理想。
（三）酒精发酵罐的计算
1．结构尺寸的确定
全容积：
（6-126）
式中 ——进入发酵罐的发酵液量，m3；
——装液系数，0.85~0.90。
带有锥形底、盖及圆柱形筒身的发酵罐：
（6-127）
式中 ——罐的直径，；
——罐的圆柱部分高度，；
——罐底高度，；
——罐盖高度，。
根据发酵罐的全体积V和高径比H/D等，可确定发酵罐的结构尺寸。
2．发酵罐罐数的确定
对于间歇发酵：发酵罐数目为
（6-128）
式中 ——发酵罐个数，个；
——每24小时内进行加料的发酵罐数目，个；
——发酵周期所需要时间，。
3．发酵罐冷却面积计算
发酵罐冷却面积的计算可按传热方程式来确定，即：
（6-129）
式中 ——总的发酵热，J/h；
——总传热系数， ℃)；
——对数平均温度差，℃；
——冷却面积，。
（1）总的发酵热
嫌气发酵过程中总的发酵热有：生物合成热；蒸发热损失；罐壁向周围散发的热损失三部分。生物合成热是维持微生物生命活动的呼吸热，促进微生物增殖的繁殖热，以及微生物形成代谢产物的发酵热。由于各种微生物的生理特性和代谢途径不同，故对于微生物的生物合成热至今尚难准确计算。
对于确定酒精、啤酒等嫌气发酵的发酵热，一般按发酵最旺盛时单位时间糖度降低的百分值来计算，通常以消耗1Kg麦芽糖发酵放出的热量约为650KJ为计算基准。葡萄糖的发酵热反应式：
每公斤葡萄糖的酒精发酵的生成热：
麦芽糖的热反应式：
发酵最旺盛时，每小时下降的糖度=0.75~1度（即醪液中干物质减少的百分比），则酒精发酵时的生成热：
式中 ——发酵罐中所盛的醪液量；
——发酵糖度下降的百分数。
据资料，在100g麦芽糖中可发酵糖实际的发酵放热量为41860J，因此，消耗1麦芽糖发酵放出的实际热量为418，600J。如果发酵液不进行冷却，发酵温度可升高10℃，对于小型试验罐，也可在发酵罐旺盛时，测定其冷却水的进出口的温度和单位时间内的耗水量：
（6-130）
由所得的的热量，再扩大应用到生产罐上，则生产罐的热量为
式中 ——小型试验罐中发酵液的体积，m3；
——生产罐中发酵液的体积，m3。
代谢气体带走的蒸发热量与糖液温度，发酵程度的好坏，除间接测定外，目前还难具体计算，一般计算可取的5~6%。
不论发酵罐置于室外或室内，均要向周围空间散失热量，这部分热量由对流和辐射组成：
式中 ——对流，辐射给热系数，；
——散热的表面积，m2（发酵罐的表面积）；
——罐表面温度，可取用比发酵温度稍低一点的温度，℃；
——周围空气的温度，℃；
对流，辐射联合给热系数，当壁面温度30~350℃，空气作自然对流时，可用下面近似公式：
=4.187（8+0.05）
所以总的发酵热是：
（2）平均温度差的计算
（6-131）
式中 ——主发酵时的温度发酵温度，℃；
——分别为冷却水进出口温度，℃。
（3）总传热系数
由于发酵液组分时常变化，且主发酵期醪液上下翻腾，传热情况较复杂，故k值取经验值。
（4）冷却水耗用量的计算
热平衡方程为
Q发=Q水=WCP（t2-t1） （6-132）
（6-133）
式中 ——冷却水在平均温度的比热，时的比热 ；
——冷却水进出口温度，℃。
二、啤酒发酵设备
近年来，啤酒发酵设备向大型、室外、联合的方向发展。迄今为止，使用的大型发酵罐容量已达1500吨。大型化的目的主要有两方面：由于大型化，使啤酒的质量均一化；由于啤酒生产的罐数减少，使生产合理化，降低了主要设备的投资。
啤酒发酵器的变迁过程，大概可分三个方向：①发酵容器材料的变化。容器材料由陶瓷向木材→水泥→金属材料演变。现在的啤酒生产，后两种材料都在使用。我国大多数啤酒发酵设备容器为内有涂料的钢筋水泥槽，新建的大型容器一般使用不锈钢。②开放式向密闭式转变。小规模生产时，糖化投资量较少，啤酒发酵容器放在室内，一般用开放式，上面没有盖子，对发酵的管理、泡沫形态的观察和醪液浓度的测定比较方便。随着啤酒生产规模的扩大，投资量越来越大，发酵容器已开始向大型化和密闭化发展。从开放式转向密闭发酵的最大问题是发酵时被气泡带到表面的泡盖的处理。开放发酵便于撇取，密闭容器人孔较小，难以撇取，可用吸取法分离泡盖。③密闭容器的演变。原来在开放式长方形容器上面加穹形盖子的密闭发酵槽，随着技术革新过渡到用钢板、不锈钢或铝制的卧式圆筒形发酵罐。后来出现的是立式圆筒体锥底发酵罐。这种罐是二十世纪初期瑞士的奈坦发明的，所以又称奈坦式发酵罐。
目前使用的大型发酵罐主要是立式罐，如奈坦罐，联合罐，朝日罐等。由于发酵罐量的增大，清洗设备也有很大进步，大多采用CIP自动清洗系统。
（一）前发酵设备
传统的前发酵槽均置于发酵室内，大部分为开口式。制造材料：钢板、钢筋混凝土、也有用砖砌、外面抹水泥的发酵槽，形式以长方形和正方形为主。
尽管发酵槽的结构形式和材质各不相同，但为了防止啤酒中有机酸对各种材质的腐蚀，前发酵槽内均要涂布一层特殊材料作为保护层。如果采用沥青蜡涂料作为防腐层，虽然防腐效果较好，但成本高，劳动强度大，且年年要维修，不能适应啤酒生产的发展。因此采用不饱和聚脂树脂、环氧树脂或其他特殊涂料较为广泛，但还未完全符合啤酒低温发酵的要求。
开放式前发酵槽如图6-47所示。前发酵槽的底略有倾斜，利于废水排出，离槽底10~15cm处，伸出嫩啤酒放出管，该管为活动接管，平时可拆卸，所以伸出槽底的高度也可适当调节。管口有个塞子，以挡住沉淀下来的酵母，避免酵母污染放出的嫩啤酒，使嫩啤酒放空后，可拆去啤酒出口管头。酵母即从槽底该管口直接流出。
为了维持发酵槽内醪液的低温，在槽内装有冷却蛇管或排管，前发酵槽的冷却面积，根据经验对下面啤酒发酵罐每立方米发酵液约为0.2m2冷却面积。蛇管内通入的冷水。
密闭式发酵槽具有回收二氧化碳，减少前发酵室内通风换气的耗冷量以及减少杂菌污染等机会的优点。因此，这种密闭式发酵罐已日益被新建的啤酒厂采用。
除了在槽内装置冷却蛇管，维持一定的发酵温度外，也需在发酵室内配置冷却排管，维持室内低温。但这种冷却排管耗金属材料多，占地面积大，且冷却效果差，故新建工厂多采用空调装置，使室内维持工艺要求的温度和湿度。
（二）前发酵设备的计算
1．发酵槽数目的确定
采用小容量的发酵槽，将导致一系列生产消耗的增加，若一个发酵槽内可容纳一次糖化冷却麦汁的整数倍，那么发酵槽数目一般按以下公式计算：
（6-134）
式中 n——每日糖化次数；
t——前发酵时间；
Z——在一个发酵槽内容纳一次糖化麦芽汁量的整数倍。
由此可见，在一个发酵槽内容纳一次糖化麦芽汁量的前提下，发酵槽的数目仅仅取决于每日糖化次数和前发酵时间，而与生产量及生产的不平衡性无关。
2．前发酵槽容积
计算一次糖化麦汁量或其量的整数倍，同时适当考虑泡沫所占的空间。即可确定前发酵槽的容积。
m3 （6-135）
式中 V——前发酵槽的全容积，m2；
Z——一个发酵槽中容纳糖化一次麦汁量的整倍数；
V0——糖化一次麦汁量，m2；
Φ——装液系数，0.8~0.85。
也可按下式计算
m3 （6-136）
式中 R——产量系数，对120啤酒，R=5.6m3/吨原料，对100啤酒，R=6.7m3/吨原料；
G——每次糖化用料总量，t
Z——每池容纳一次糖化麦汁量的整倍数；
0.1——余隙空间，可取0.07，即7~10%。
3．发酵池冷却面积计算
啤酒发酵槽的冷却面积：
m2 （6-137）
葡萄糖的热反应式为：
每公斤葡萄糖的酒精发酵的生成热：
若所用原料是麦芽糖，其热反应式：
每公斤麦芽糖的酒精发酵的生成热：
每立方米麦汁在发酵期间每小时放热量：
式中 ——主发酵期间麦汁糖度降低的糖浓度差的百分数，%；
——主发酵期间放热不平衡系数，1.3~1.5；
——发酵1Kg麦芽糖的放热量，KJ/Kg；
——猪发酵期间，麦汁实际需要冷却的天数；
——发酵天数，对于间歇发酵的发酵期间其第一天和最后一天是不需冷却的；
——麦汁平均密度，。
（三）后发酵设备
后发酵槽又称贮酒罐，该设备主要完成嫩啤酒的继续发酵，并饱和二氧化碳，促进啤酒的稳定，澄清和成熟。
后发酵设备的工艺要求：贮酒室内要维持比前发酵室更低的温度，一般要求0~2℃，特殊要求达-2℃左右；后发酵过程残糖较低，发酵温和，产生发酵热较少，故槽内一般无须再装置冷却蛇管；后发酵的发酵热借室内低温将其带走，因此贮酒室的建筑结构和保温要求，均不能低于前酵室。室内低温的维持，是借室冷却排管或通入冷风循环而得。后者比前者应用更广。
后发酵槽是金属的圆筒形密闭容器，有卧式和立式。如图6-48所示。
工厂大多采用卧式。由于发酵过程中需要饱和二氧化碳，所以后发酵槽应制成耐压0.1-0.2Mpa表面的容器。后发酵槽槽身装有人孔、取样阀、进出啤酒接管、排出二氧化碳接管、压缩空气接管、温度计压力表和安全阀等附属装置。
后发酵槽的材料，近几年来采用碳钢与不锈钢压制的复合钢板制作酒槽。该材料保证酒槽的安全、卫生和防腐性，并且造价比不锈钢的低。
为改善后酵的操作条件，较先进的啤酒厂将贮酒槽全部放置在隔热的贮酒室内，维持一定的后酵温度。毗邻贮酒室外建有绝热保温的操作通道，通道内保持常温，开启发酵液的管道和阀门都接通到通道里，在通道内进行后发酵过程的调节和操作。贮酒室和通道相隔的墙壁上开有一定直径和数量的玻璃窥察窗，便于观察后发酵室内部情况。
（四）后发酵槽的计算
后发酵罐的容量应和啤酒的过滤能力配合起来，就是说一天的过滤量要相当一个罐或几个罐的贮酒量，不能滤半个罐就停下来。那样，就有大量空气进入罐内，严重影响啤酒。如果滤酒时贮酒罐的背压用二氧化碳，情况就会好得多。一般小型啤酒厂，采用单个贮酒罐满足每日装酒产量，而大中型啤酒厂则要数个贮酒罐才能满足要求。
若选定每个后酵槽的容量后，根据后发酵槽总的有效容积，可按下式确定后发酵罐的数目：
（6-138）
式中 N——后发酵槽数目，个；
V——后酵罐总的有效容积，m3；
VS——每个后发酵槽的有效容积，m3。
已知每个后发酵槽的有效容积VS和该槽的填料系数，则可以确定后发酵槽的全体积：
（m3） （6-139）
式中 ——装料系数，取0.9-0.95。
贮酒罐的容积随着生产发展逐渐扩大，在国内最小的多在10~15t，最大的已有100~200t。
表6-7 立式与卧式罐的参数比较
立式
卧式
容量m3
10~15
10~120
罐径mm
1500~2300
1500~2500
罐长m
2~3
2~30
圆柱部分板厚mm
6~8
6~12
封头厚度mm
6~10
6~10
操作压力Pa
（0.5~1.0）×105
（0.5~1.47）×105
（五）啤酒大容量发酵罐
为了适应大生产的需要，近年来世界各国啤酒工业在传统生产基础上作了较大改进，各种形式的大容量发酵设备应运而生。在国际上，啤酒工业发展的趋势是改进生产工艺，扩大生产设备能力，缩短生产周期和使用电子计算机等仪器进行自端控制，使啤酒工业出现了－－次革命。我国的啤酒工业从80年代开始，也发展迅速。大容量发酵设备及及其发酵工艺等新技术得到推广，大容量发酵罐已在新老厂中应用广泛。
1．圆筒体锥底罐
圆筒体锥底罐可以用不锈钢板或碳钢制作，用碳钢材料时，需要涂料作为保护层。图6-49为52m3锥底罐结构图。
罐的上部封头设有人孔、视镜、安全阀、压力表、二氧化碳排出口；如果采用二氧化碳为背压，为了避免用碱液清洗时形成负压，可以设置真空阀；锥体上部中央设不锈钢可旋转洗涤喷射器具体位置要能使喷出水最有力地射到罐壁结垢最厉害的地方。大罐罐体的工作压力根据大罐的工作性质而定，如果发酵罐兼作贮酒罐，工作压力可定为（）。
这种发酵设备一般置于室外。将已经灭菌的新鲜麦芽汁于酵母由底部进入罐内，发酵最旺盛时，使用全部冷却夹套，维持适宜的发酵温度。冷媒多采用乙二醇或酒精溶液，也可以用氨作冷媒。其优点是：能耗低，采用的管径小，生产费用可以降低。最终，沉积在锥底的酵母，可以通过打开锥底阀排出。
如果放置在露天，罐体保温绝热材料可以采用聚氨酯泡沫塑料、脲醛泡沫塑料、聚苯乙烯泡沫塑料或膨胀珍珠岩矿棉等，厚度约，具体厚度可以根据当地的气候选定。如果采用聚氨酯泡沫塑料作保温材料，可以采用直接喷涂后，外层用水泥涂平。为了罐型美观和牢固，保温层外部可以加薄铝板外套，或镀锌铁板保护，外涂银粉。
为了加强冷却时酒液的自然对流，在发酵后期，并可以用二氧化碳洗涤以除去酒液中的酒味，或人工充二氧化碳。可以在发酵罐顶部设二氧化碳回收总管，送二氧化碳站处理；然后，在发酵罐底部高于酵母层的位置上设置二氧化碳喷射环送入高纯度二氧化碳。
大型发酵罐和贮酒设备的机械洗涤，现在普遍使用自动清洗系统。改系统设有碱液、热水罐、甲醛溶液罐和循环用的管道和泵。洗涤剂可以重复使用，浓度不够时可以添加。使用时先将的热碱液用泵送往发酵罐，贮酒罐中高压旋转不锈钢喷头，压力不小于，使积垢在液流高压冲洗下迅速溶于洗涤剂内，达到清洁的效果。洗涤后，碱液流回贮槽，每次循环时间不应少于，而后，再分别用泵送热水，清水，甲醛液，按工艺要求交替清洗。
2．大直径露天贮酒罐
大直径露天贮酒罐是一种通用罐，既可以做发酵罐又可以做贮酒罐。大直径罐是大直径露天贮酒罐的一种，其直径与罐高之比远比圆柱锥底罐要大。大直径罐一般只要求贮酒保温，没有较大的降温要求，因此其冷却系统的冷却面积远较圆柱锥底为小，安装基础也较前者简单。
大直径罐基本是一柱体形罐，略带浅锥形底，便于回收酵母等沉淀物和排除洗涤水。因其表面积与容量之比较小，罐的造价较低。冷却夹套只有一段，位于罐的中上部，上部酒液冷却后，沿罐壁下降，底部酒液从罐中心上升，形成自然对流。因此，罐的直径虽大，仍能保持罐内温度均匀，锥角较大，以便排放酵母等沉淀物。罐顶可设安全阀，必要时设真空阀。罐内设自动清洗装置，并设浮球带动一出酒管，滤酒时可以使上部澄清酒液先流出。为加强酒液的自然对流，在罐的底部加设一喷射环。环上的喷射眼的孔径为1毫米以下。当在罐中心向上股泡时，酒液运动的结果，使底部出口处的酵母浓度增加，便于回收，同时挥发性物质被带走，可以回收。大直径罐外部是保温材料，厚度达100-200毫米。如图6-50是总容积为54大直径罐的结构图。
3．朝日罐
朝日罐又称单一酿槽，它是1972年日本朝日啤酒公司研制成功的前发酵和后发酵合一的室外大型发酵罐。它采用了一种新的生产工艺，解决了沉淀困难，大大缩短了贮藏啤酒的成熟期。
朝日罐为一罐底倾斜的平底柱形罐，其直径与高度之比为，用厚的不锈钢板制成的。罐身外部设有两段冷却夹套，底部也有冷却夹套，用乙醇溶液或液氨为冷媒。罐内设有可转动的不锈钢出酒管，可以使放出的酒液中二氧化碳含量比较均匀。朝日罐设备结构合生产系统的示意图见图6-51。
朝日罐发酵法的优点是：使用朝日罐进行一罐法生产，可以加速啤酒的成熟，提高设备的利用率，使罐容利用系数达到左右；在发酵液循环时酵母分离，发酵液循环损失很少；还可以减小罐的清洗工作，设备投资和生产费用比传统法要低。缺点是：动力消耗大，冷冻能力消耗大。
浙江工业大学：生物工程设备：6第六章 new生物反应器结构与设计计算
| 课件名称： | 浙江工业大学：生物工程设备 |
| 课件分类： | 生物 |
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