《发酵工程及设备》 实验指导书 （适用专业：生物工程） 2005年4月 目 录 实验一 土壤中产醋酸菌种的分离筛选……………………………………………………1  实验二 紫外线的诱变育种…………………………………………………………………2  实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件…………………………………………3  实验四 细菌增殖曲线的测定………………………………………………………………4  实验五 木霉T6淀粉酶的固态发酵实验…………………………………………………6  实验六 小型连续发酵实验…………………………………………………………………9  实验七 啤酒麦芽汁制备实验……………………………………………………………11  实验八 啤酒的酿造………………………………………………………………………14  实验九 啤酒风味保鲜期的测定…………………………………………………………15  实验十 反应器的安装与拆卸……………………………………………………………16  实验十一 pH电极的校正…………………………………………………………………17  实验十二 氧电极的校正…………………………………………………………………19  实验十三 体积溶氧传递系数的测定……………………………………………………21  实验十四 反应器培养液的灭菌与接种培养……………………………………………23  实验十五 气升式生化反应器的使用……………………………………………………24  实验十六 中试发酵设备的使用方法……………………………………………………25  实验十七 补料分批发酵动力学研究……………………………………………………27   实验一 　土壤中产醋酸菌种的分离筛选 一．实验目的： 1．根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。 2．加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二．基本原理： 分离上样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富集技术。同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。 三．培养基与仪器 1．培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基 2．仪器：全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管 四．实验步骤 1. 确定方案：首先查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2. 采样：选取离地面5～15 cm处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 3. 增殖：称取0.5g土样（湿重），加到含10ml 25%无菌土样浸出汁的试管中，于26℃、150rpm条件下振荡培养25min，以适宜的样本稀释液系列稀释培养液。然后取0.1 m1涂布于已添加及未添加富集底物的土浸出汁平板。26℃下皿底朝上培养4—10天，将长出的菌落接入斜面，但应挑分离成单个的，以免不纯。 4. 分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。 初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行培养，如果细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。 复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃深层培养24 h后。取出培养液5m1加入试管内，加0.1moL/LNaOH液中和，然后加氯化铁液2—3滴，摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无红褐色沉淀生出，根据所消耗的NaOH量确定产物醋酸的具体生成量。 五．实验结果 菌 株 1 2 3 4 5 6  NaOH的消耗量（ml）        醋酸的生成量（ml）        反应液颜色变化         六．思考题 如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？ 实验二 紫外线的诱变育种 一．目的要求 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二．基本原理 紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。 三．菌种与仪器 菌种：枯草芽孢杆菌； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四．操作步骤 （1）菌悬液的制备 （a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。 （b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。 （c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。 （2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理 （a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。 　　（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。 　　（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。 　　(4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。 　　(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。 (6)培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 　　(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。   (8)观察诱变效应 将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 　　 五．实验结果 1．结果 将实验结果填入下表。 稀释倍数 平均菌落 处理时间 （数/皿） 诱变剂 （min） 10-4 10-5 10-6 存活率% 致死率%  紫外线 （UV） 0（对照）        1        3        结果 处理 透明圈和菌落直径大小（㎜）及其HC比值   1 2 3 4 5 6   透明圈 菌 落 HC比值 透明圈 菌 落 HC比值 透明圈 菌 落 HC比值 透明圈 菌 落 HC比值 透明圈 菌 落 HC比值 透明圈 菌 落 HC比值  UV处理                    对照                     六．思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？ (2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？ 实验三 摇床培养确定酵母菌体培养和营养条件 一．实验目的： 掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二．实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。 三．仪器与试剂 1．仪器设备 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。 2．试剂 （1）葡萄糖标准溶液： 准确称取100 ml分析纯葡萄糖（预先在105℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100 ml的容量瓶中，以蒸馏水定容，冰箱中保存备用。 （2）3, 5－二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）： 甲液： 溶解6.9 g苯酚于15.2 ml 10％氢氧化钠中，并稀释至69 ml，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠。 乙液： 称取22.5 g酒石酸钾钠，加到300 ml 10％氢氧化钠溶液中，再加入880 ml1％的3、5－二硝基水杨酸溶液。 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置7－10天以后使用。 （3）37％甲醛溶液 （4）0.05 mol/L氢氧化钠溶液：称取2 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 ml。 四．实验方法 （1）培养基的配制(见表1,2) 表1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4  1 1.0 0.0 0.5 0.5  2 2.0 1.0 1.0 1.0  3 3.0 2.0 2.0 2.0   表2 正交表实验方案 编号 葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD）       0h? 12h 24h 36h 48h 60h  1 (1) (1) (1) (1)        2 (1) (2) (2) (2)        3 (1) (3) (3) (3)        4 (2) (1) (2) (3)        5 (2) (2) (3) (1)        6 (2) (3) (1) (2)        7 (3) (1) (3) (2)        8 (3) (2) (1) (3)        9 (3) (3) (2) (1)        （2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三角瓶装入培养基100 ml，于121℃下灭菌30 min，冷却。 （3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。 （4）测0D值：将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五．思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 大肠杆菌生长的0D值，你将如何选择波长? 实验四　　细菌增殖曲线的测定 一．实验目的： 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线图 二．实验原理 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20mln分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。 三．菌种与培养基 菌种：大肠杆菌 种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 发酵培养基：葡萄糖2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调pH至7.2。 四．仪器 光电比色计，摇床，冰箱 五．操作步骤 1、将在种子培养基中培养20 h的培养液3000rpm离心10min倾去上层液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数系109/m1。 2．取10个盛发酵培养液的三角瓶，各接3m1菌液作种子，在摇床上相同位置30℃振荡培养，并立即取下一瓶为0时的增殖状态．之后于培养1、2、3、4、5、6、7、8、9各取一瓶，约9个间隔的菌液分别吸取5m1菌于无菌试管中，置4℃下保存。 3．用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长600nm处比色，但要求消光度在0.3一0.6之间，若超过，用未接种培养液适当稀释。 六．实验结果： 1．结果 (1) 将测定的OD600值填入下表 培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12  光密度值OD600               （2）以菌悬液0D值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线． 七．思考题 (1) 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点? (2) 细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短?若细胞密度为103／m1，培 养4.5h后，其密度高达2×108／m3，请计算出其代时。 (3) 次生代谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使 次生代谢产物积累更多？ 实验五　　木霉T6淀粉酶的固态发酵实验 1．实验目的 了解和掌握木霉T6菌株在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲线和测定方法。 基本原理 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a－1，4－葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水杨酸被还原为3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722型分光光度计540 nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。 3．培养基 培养基（250mL）：麸皮7g ，面粉0.5g，NaNO3 0.15g，营养盐6.5mL，pH自然。 营养盐配方（g/L）：KH2PO4 3.0；(NH4)2SO4 2.0；Cacl2 0.5；MgSO4.7H2O 0.5；Cocl2 0.003；FeSO4 .7H2O 0.0075；ZnSO4 0.002； pH5~6。 四．实验方法： 1．还原糖的测定 （1）标准曲线的制作 取9支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确浓度为1.00 mg/ml的葡萄糖标准液和3，5－二硝基水杨酸试剂。表中单位为ml。 表1 还原糖标准曲线制作 管号 加入试剂  0 ?  1  2  3  4  5  6  7  8  葡萄糖标准液  0  0.2  0.4  0.6  0.8  1.0  1.2  1.6  2.0  蒸馏水  2  1.8  1.6  1.4  1.2  1.0  0.8  0.4  0  3、5－二硝基 水杨酸试剂  3  3  3  3  3  3  3  3  3  总体积  5.0  5.0  5.0  5.0  5.0  5.0  5.0  5.0  5.0  将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热5 min，立即用冷水冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。在540 nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定1－8号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 （2）发酵液中残留还原糖的测定 发酵液单层滤纸过滤，滤液0.2 ml定容至100 ml，500倍稀释至含糖量2-8 mg/100ml为试样。 取4支干燥试管,编号,按表2所示的量,精确加入待测液和试剂(ml) 表2 还原糖的测定 管号 项目 空白 还原糖    0  1  2  3  样品量 0 2.0 2.0 2.0  蒸馏水 2.0 0 0 0  3、5－二硝基 水杨酸试剂 3 3 3 3  总体积  5.0  5.0  5.0  5.0  加完试剂后,其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同,测定出各管溶液的吸光度值。 （3）计算 以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算样品中还原糖的百分含量：  ? 2．氨基态氮的测定 （1）取发酵滤液5.00 ml，置于100 ml烧杯中，加入15 ml水，磁力搅拌器搅拌5 min后，将电位计插入烧杯中，用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH=8.20，此为游离酸度，不予计量。加入10.0 ml甲醛溶液，立即混匀，速用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH=9.20，计下消耗NaOH标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。 （2）计算 氨基氮（%）=（V-V0）×N×0.014× 20/5×100 式中： V——加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积，ml; V0——加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积，ml; M—— NaOH标准溶液的浓度,mol/L； 0.014——与1.00mlNaOH标准溶液相当的氮的质量，g； （3）淀粉酶活力的测定及计算： CK 样品1 样品2 样品3  底物（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5  酶液（mL） 0 0.5 0.5 0.5   沸水浴10min  DNS（mL） 3 3 3 3  酶液（mL） 0.5 0 0 0  蒸馏水 加蒸馏水至20. 5mL  550nm处测OD值  OD1 OD2 OD3   淀粉酶活力（IU/g干培养基）：本实验条件下，每分钟释放出1umol还原糖所需要的酶量称为一个酶活力单位。 IU/g干培养基＝ 其中：n――稀释倍数；v――浸提比（mL/g干培养基）； k――斜率；M――葡萄糖的分子量； t――反应时间（10min）；1000――转换系数 五．操作步骤： 1．配制培养基，灭菌，冷却。 2．冷却后接种，并搅拌　均匀，置于28℃培养箱进行培养。 3．每隔24h取样，用0.2M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）按一定的浸提比进行浸提1h，离心得粗酶液。共取样6次。 4．分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。 六．实验结果： 1．以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。 2．以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。 3．以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。 七．思考题 1、测定淀粉酶可采用哪些方法？ 2、比较固态发酵和液态发酵异同点。 实验六　　小型连续发酵实验 实验目的 学习组建微生物连续发酵装置，掌握连续发酵的操作原理和方法，运用所学的连续培养知识求算发酵过程的稀释率。 二．基本原理 在分批培养中，一次加入所有的培养基，不予补充，不再更换。随着微生物的活跃生长，培养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可长时间维持。如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流出量能使分裂繁殖增加的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变。连续培养方法的出现，不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向。 三、菌种与培养基 1、菌种：大肠杆菌（E. coli）； 2、培养基(g/L) 　基本培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。培养 8h后接入发酵培养基培养或4℃冰箱保藏。 发酵培养基：葡萄糖2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调pH至7.2。 四、简单连续培养装置  图1 简单连续培养装置 1－培养基贮槽　　2－流出液接受器　　3－蠕动泵　4－恒温水浴　5－磁力搅拌器 6－培养槽中搅拌转子　7－温度调节器　　8－培养基加入管　9－培养液流出量　10－输送管 五．测定方法 1．还原糖的测定：3，5－二硝基水杨酸比色法测定 2．蛋白质浓度的测定：考马斯亮蓝染色法 3．大肠杆菌的增殖曲线测定（具体操作步骤见实验四） 大肠杆菌接种于母种培养基，在37℃培养6h，将培养液在3000rpm离心10min，倾去上清液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数为107个/ml，接种于发酵培养基，在相同条件下进行培养，并每隔一定时间进行取样，用无菌的相同培养液作为CK，将上述菌液于600nm波长比色（要求消光度在0.3－0.6间，如果超过用未接种的培养液适当稀释），然后将培养液在红外线烘箱110－120℃内烘干至恒重，以菌悬液OD值为纵坐标，相对应的菌体浓度为横坐标，绘制直线，求出斜率1/K。 K＝生物量/OD值 六．操作步骤： 1．制备好的发酵培养液倒入2L的三角瓶中。用棉塞固定玻璃管， 玻璃管上端接内径3mm、外径5mm的橡皮管。用弹簧夹夹住，灭菌备用。 2．灭菌后冷却至30℃的三角瓶安装于恒温水浴中培养。 3．将大肠杆菌培养液以10％的接种量接入三角瓶中，先进行搅拌间歇式培养，若有无菌空气导管，也可通气搅拌培养。 4．将补料用的3L培养基装在3L的三角瓶中，将送料的橡皮管的一端插入，用棉塞固定，另一端用油纸包好，灭菌备用。 5．定时取出测定间歇培养的菌液浓度，以求出增殖速度。 μ=dx/xdt (μt=dx/x (μ(t2－t1)=ln(x2/x1) (μ= (lnx2－ln x1)/ (t2－t1) 6．取下输液用的橡皮管，剥去牛皮纸纸，与蠕动泵进液口相接，将培养器的输液橡皮管接到蠕动泵出液口。 7．据菌体增殖速度，以较小稀释率开始流加培养基，此时稀释率必须小于此增殖率。 F≤μ(　F≤(lnx2－ln x1)/ (t2－t1) 七．实验结果 1．将测定的OD600值及相应的生物量填入下表 培养时间（h） 对照 0 1.5 3 4 5 6 7 8 9 10 12  光密度值OD600              生物量（g/L）               2．绘制大肠杆菌连续发酵过程中的还原糖、蛋白质浓度和生物量的时间曲线(注明何时补料) 八．思考题： 测定微生物比生长速率有什么重要的意义？ 实验七 啤酒麦芽汁制备实验 一．实验目的： 了解和掌握啤酒麦芽汁制备的方法；了解糖化工艺条件对麦芽汁组分的影响；了解α—氨基氮的测定方法及其对麦芽汁的影响。 二．麦芽汁制备的工艺要求 （1）原料中有用成分得到最大限度萃取。指原料麦芽和辅料中的淀粉转变成可溶性无色糊精和可发酵性糖类的转化程度，它关系到麦芽汁收率或原料利用率。 （2）原料中无用的或有害的成分溶解最少。主要指麦芽的麦壳物质、原料的脂肪、高分子蛋白质等，它们会影响啤酒风味和啤酒的稳定性。 （3）麦芽汁的有机或无机成分的数量和配比应符合啤酒品种、类型的要求。啤酒的风格、类型的形成，除了酵母品种和发酵技术外，麦芽汁组成是主要的物质基础。 三．原辅料与仪器 １．原辅料 ①优级（或一级）大麦芽粉、大米粉、酒花（或酒花浸膏、颗粒酒花）。 ②耐高温α-淀粉酶（使用量为0.06~0.08ml/100g淀粉）、糖化酶（用量为30u/g大麦、大米）、复合酶（用量为大麦用量的0.3%）。 ③乳酸（或磷酸）。 ④0.025mol/l碘液。 ２．实验仪器 温度计（120℃）、恒温水浴锅（4孔）、糖度计、布氏漏斗、台秤、分析天平、纱布、玻璃仪器。 四．实验方法 1．α—氨基氮——甲醛滴定法 2．麦芽汁的糖度——糖锤度计直接测定法 五．麦芽汁制备操作步骤 1．工艺选择 根据麦芽汁质量指标分析数据、成品啤酒的类型和质量要求、辅料种类等，结合糖化原理选择设计适合的糖化方法，并给出糖化工艺曲线。本实验选用优质麦芽，采用适于淡爽型啤酒的复式浸出糖化法。糖化工艺曲线见下图。  图2 麦芽的糖化工艺曲线 2．外加酶糖化法 （1）水处理 取1500ml水煮沸10min，冷却澄清过滤，备用。 （2）麦芽汁制备 称取30g大米粉，按1:8~9加水比加入处理后的热水进行混合，水温52℃，用乳酸或磷酸调pH至6.5，按7u/g大米的量添加耐高温α-淀粉酶，保温10min。以1℃/ min速率升温到93℃，保温20min迅速升温至100℃，煮沸20min即完成辅料的糊化和液化。然后于5min内降温至63℃用于混醪。注意，在蒸煮过程中应适当补水，维持原体积。 麦芽粉70g投入50℃热水中，加水比为1：3，用乳酸或磷酸调pH至5.2，保温30min，是蛋白质休止。然后升温至63℃与糊化醪混合，加糖化酶30u/ (g大麦·大米)，保温30min，进行第一段糖化，充分发挥β——淀粉酶及核苷酸酶、内切酶的活性。然后再于5min内升温至68℃进行第二段糖化，主要发挥麦芽中α——淀粉酶的催化作用，提高麦汁收率。用碘液检测醪液不呈蓝色时，再升温至75℃，保温15min，糖化过程结束。在糖化过程中应注意补水，维持原体积。 （3）过滤 将醪液用4层纱布过滤，如果醪液不清，返回再过滤，直至麦汁澄清。用糖度计测一道麦汁糖度，用78~80℃热水400ml分2~3次洗槽。洗槽水与滤液混合，测其糖度。添加约0.05g酒花，煮沸70min，补水至糖度为10°Bx，趁热用滤纸过滤，即得到澄清的麦汁。 3．协定法糖化 （1）取50g麦芽，在EBC标准磨上粉碎； （2）将已经粉碎好的麦芽粉放入已称重的糖化杯中，加200mL46℃水，不断搅拌并在46℃水浴中保温30min； （3）使醪液以1℃/ min速率升温到70℃。此时杯内加入100mL70℃水，保持恒温。 （4）5min后用玻璃棒取麦芽汁1滴，置于白滴板上，再加碘液1滴，混合后观察碘液颜色变化。直到碘液呈纯黄色不再变色，停止保温，糖化结束。 （5）在10~15min内急剧冷却到室温； （6）冲洗搅玻璃棒拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g； （7）用玻璃棒搅拌糖化杯，并注于漏斗中进行过滤，即获得麦芽汁。 六．实验结果 测定麦汁的还原糖、麦芽糖、α-氨基酸等基本理化指标，并填入下表中。 α—氨基氮（mg/L） 麦芽汁的糖度（°）  协定法糖化    外加酶糖化法     七．思考题 啤酒糖化中要提高麦汁α—氨基氮水平的方法有哪些？你所采用的方法优点是什么？ 补充材料： 1、麦芽汁制备俗称糖化。所谓糖化是指将麦芽和辅料中高分子贮藏物质（如蛋白质、淀粉、半纤维素等机器分解中间产物）通过麦芽中各种水解酶类（或外加酶制剂）作用降解为低分子物质并溶于水的过程。溶解于水的各种干物质称为浸出物，糖化后未经过滤的料液称为糖化醪，过滤后的清夜称为麦芽汁，麦芽汁中浸出物含量和原料干物质之比（质量分数）称为无水浸出率。 麦芽的组成是酿造啤酒的物质基础之一，麦芽汁的组分和颜色关系将直接影响成品的类型和质量。 2、啤酒的度数 啤酒的度数则不表示乙醇的含量,而是表示啤酒生产原料,也就是麦芽汁的浓度,以12度的啤酒为例,是麦芽汁发酵前浸出物的浓度为12%(重量比)。麦芽汁中的浸出物是多种成分的混合物,以麦芽糖为主。 啤酒商标上标的度数却不是指酒精含量，而是指麦芽汁中含糖的浓度，通常以每公斤麦芽汁中含糖类物质的质量(克)的1/10为标准．例：每公斤麦芽汁中若含有120克糖类物质，该啤酒就是12度，其酒精含量一般为3％-3.5％。 实验八 啤酒的酿造 一．实验目的 了解和掌握啤酒酿造全过程及其中间控制。 二．实验原理 利用啤酒酵母对麦芽汁中某些组分进行一系列的生物化学代谢，产生酒精及各种风味物质，形成具有独特风味的酿造酒。啤酒是酒类中酒精含量最低的饮料酒，而且营养丰富。 三．实验材料与方法 1．实验材料 浓缩麦芽汁、活性干酵母、发酵桶、pＨ计及糖度计等。 2．实验方法 （1）啤酒酸度的测定——电位滴定法 （2）啤酒中酒精含量的测定—— （3）啤酒的色度测定——比色法 （4）啤酒中细菌总数——显微镜直接计数法 （5）啤酒中大肠菌群数的测定——平板计数法 四．实验步骤 1．酵母活化： 取2g蔗糖放入100mL水中，煮沸晾凉至25℃左右。称取4g活性干酵母放入上述糖水中，在25℃下保温30min以上。 2．称取350g白糖放入1000mL水中，煮沸制成一定浓度的糖水。将约600g浓缩麦芽汁和上述以冷却的糖水倒入发酵桶中，并加入7Ｌ工艺用水（纯净水、净化水或凉开水等），搅拌均匀。调整麦汁的温度使其接近室温。测定麦汁的浓度和pＨ，将活化好的酵母倒入发酵桶中，再搅拌均匀。盖好桶盖，即进入前发酵阶段。 3．发酵液的浓度下降到4.5°Ｐ，主发酵阶段结束，转入后发酵阶段。 4． 将前发酵的酒液装入干净的瓶子中，每瓶再加入浓度为30％的糖水５mL。将液量控制在85％～90％。在室温下放至2d后转入1℃冷藏柜中，后发酵１周以上，即可成为成品啤酒。 五．实验结果 测定啤酒酸度、酒精含量、色度、细菌总数、大肠菌群数，并将数据填入下表。 酸度 酒精含量 色度 细菌总数 肠菌群数         六．思考题 1、为什么酿造啤酒要进行后发酵处理？ 2、本实验中麦芽起到哪二个作用？ 实验九 啤酒风味保鲜期的测定 一．实验目的 通过对啤酒风味保鲜期的预测，了解啤酒的抗老化能力以及啤酒的保鲜时间。 二．实验原理 在糖化发酵过程中会产生一定量的羰基化合物，它们是啤酒老化的主要原因。用硫代巴比妥酸法（TBA）测定的是以二烯醛为代表的一类羰基化合物，而非啤酒、麦汁中全部的羰基化合物，硫代巴比妥酸与羰基化合物发生呈色反应，在530nm有吸收峰。 三．实验仪器及试剂 （1）实验仪器：分光光度计，恒温水浴锅等。 （2）试剂： TBA溶液：取0.33g硫代巴比妥酸，用50%（v/v）的冰醋酸溶解并定溶至100ml ，配为0.33%（v/v）的TBA溶液。 四．实验步骤 （1）取同一批次的啤酒，其中四瓶放置于60℃水中加速陈化，每隔12h从水浴锅中取走一瓶啤酒，轻拿轻放，冷却至室温后放于4℃冰箱内。另取一瓶作为对照事先放置于冰箱中保存。 （2）待四个样品全部陈化后进行过滤，取滤液，在530nm下测定不同的陈化样品的TBA值（以对照啤酒为空白），计算⊿TBA。 CK 12h 24h 36h 48h  水（ml） 2 0 0 0 0  啤酒滤液（ml） 0 2 2 2 2  TBA溶液（ml） 2 2 2 60℃2 2   充分混匀，在60℃水浴锅中加热60min后，用冰水冷却  在530nm处测定不同陈化时间的吸光度   五．实验结果 1．TBA的测定结果 12h 24h 36h 48h  ⊿TBA       2．风味保鲜程度RSV的计算 RSV=（12/⊿TBA12+24/⊿TBA24+36/⊿TBA36+48/⊿TBA48）/4 六．思考题 RSV的数值越大，表示成品啤酒的保鲜时间越长还是越短？ 实验十 反应器的安装与拆卸 生物反应器是生物工程的重要组成部分，是生物技术转化为产品的关键设备，在生物工程中处于中心地位。机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是进行液体发酵的特殊设备。实验室使用的小型发酵罐，其容积可从1 L至数百升。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 一．实验目的 认识和了解生物反应器的结构与功能，掌握生物反应器安装和拆卸的操作规程。 二．基本原理 园筒形反应器具有上盖和下盖，上盖可以取下，它与罐体是通过橡皮垫圈和螺栓密封的。盖上设有接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、消泡剂和酸碱液注入口、取样口、备用口、压力表、安全阀等；罐底部设有夹套层，用以热交换，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；中部侧面装有温度传感器及溶氧电极和pH电极插口。与罐体连接的部分布有无菌空气系统，并配备一台自动调控装置。整个装置处于工作状态时，必须保持无菌状态，而操作结束后，必须移走培养液，并进行清洗罐体等。因此必须进行安装和拆卸步骤。 三．实验装置 16升园柱形不锈钢机械搅拌式生物反应器（发酵罐）。   图3 16L机械通风式搅拌生物反应器 四．实验步骤 首先拧下螺栓，打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。插入校正完毕的pH电极和氧电极于罐侧面相关位置，并与放大器连接。加入配置好的培养液，加盖（由于盖上的零件较多，必须对准位置后再盖上去），并对称地拧紧螺母，直至上盖被密封固定。将事先清洗干净并开启的尾气过滤器装于盖上，安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，以及灭过菌的无菌空气过滤器进气管等，剩余的孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。 使用完毕后拆卸时与以上步骤相反，并彻底清洗罐体及零件。 五．思考题 为什么要进行生物反应器安装和拆卸，这两个操作步骤是在生物反应的什么时间进行的？ 实验十一 pH电极的校正 一．实验目的 了解pH电极的基本原理，掌握其校正方法及步骤。 二．基本原理 待校正的pH电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起的复合玻璃电极。 复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡相通，内充以恒定pH植的标准缓冲溶液，从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极（即指示电极）。在外层玻璃管引入银丝，其表面覆盖一层AgCl薄膜。从上部扩大部分边上的注液口加入饱和氯化钾溶液，就形成氯化银电极，在外玻璃管的下部，开有一小口，装有多孔陶瓷芯，使KCl溶液可稍许向外溶液渗漏，即所谓液络部。 复合电极的基本性能参数有电极转换系数（也称Nernst斜率），电极零电位，电极内阻，参比电阻，电极响应时间，耐高温冲击的次数等等，它们都有一定的要求和测试方法，对新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极，其性能参数要发生变化，对某些性能参数要进行测定，决定是否可投入使用。  图4 复合玻璃电极的构造 三．实验步骤： 打开pH操纵器、测量范围和温度开关，将pH电极的电插头插入放大器插孔。首先测标准pH试剂的温度，然后记下缓冲液瓶子标签上的温度条件下所得到pH值。缓冲液和电极组件应该是在同样的温度，如果不是，则允许2~3分钟时间达到热平衡。温度恒定后，调节温度。 将电极浸入缓冲液pH7.0（0.2mol/LNa2HPO4　16.47mL，0.1mol/L柠檬酸3.53mL）中，一获得稳定读数就立即将pH表（asymmetry）设定到缓冲液的值。 将蒸馏水漂洗电极玻璃球泡部位，然后用软纸轻轻擦干，再浸入第二种缓冲液pH9.2（1/15mol/LNa2HPO4）或pH4.0（0.2mol/LNa2HPO4　7.71mL，0.1mol/L柠檬酸12.29mL）中，获得稳定读数后，用斜率电位计（mV/pH）纠正pH值。如此反复2~3次，直至读数与被测试剂相同并稳定。以上程序不得颠倒，否则不能获得有效的校准。 四．思考题 （1）为什么pH电极在生物反应之前要进行校正？ （2）在pH电极的校正操作过程中应注意哪些事项？ 实验十二 氧电极的校正 一．实验目的 了解溶解氧（DO）电极的基本原理，掌握其校正方法。 二．基本原理：  a　电解型电极　　 b　原电池型电极 图5 氧电极的类型 a、(极谱型)电解型电极 电解型电极是由一个阴极（贵重金属如铂或金）、一个阳极（Ag/AgCl）和一种电解质，如中性NaCl溶液组成的。在某一溶氧浓度一定的溶液系统中，通过电极之间约0.6~0.8的电压，使溶解氧在阴极上被还原，从电极的电流~电压极谱图（图6）可以看出，OA为极谱残余电流；A点为氧的分解电压，当外加电压大于分解电压A，这时电极输出电流Ⅰ随着电压增大而增加，当达B点后，电极电流就不再随着外加电压而增加，即电极电压进入恒  图6 扩散电流与氧浓度的关系 定区，这时称为饱和电流或扩散电流。当外加电压继续增至C点时，电极输出电流迅速增加，这是由于水被还原成氧所造成的。从图中也可看出饱和电流与溶氧浓度成正比关系。因此，只要把外加电压固定在电流电压图中的平坦部分，电极输出电流就可以校正测量溶解氧，这个固定电压常选在0.6～0.8V之间。 反应式为： 阴极： O2 + 2H2O +2e- → H2O2 + 2OH- H2O2 +2e- → 2OH- 阳极： Ag +Cl- → AgCl + e- 总反应：4Ag + O2 + 2H2O + 4Cl- → 4AgCl + 4OH- 用NaCl或KCl作为电解质，电解质在使用过程中被消耗，必须在一段时间后补充。 b、原电池型电极 原电池型电极不采用外电压，而是选用参比电位比阴极电位高的碱性金属（锌、铝或镉）作阳极，以贵重金属（银或金）作阴极，这是氧就在阴极自发地被还原，产生电动势。 银—铅电池型电极的电子反应为： 阴极：O2 +2H2O + 4e- → 4OH- 阳极：Pb → Pb2+ + 2e- 总反应：O2 +2Pb + 2H2O → 2Pb(OH)2 随着时间的推移，这一反应也会氧化电极。 为了校正氧电极，使液体被空气中的氧饱和，假定饱和度被扩大至100%显示。电极的零点适宜用氧气调节，因为电极显示是氧分压而不是氧浓度，显然在1M KCl溶液中饱和时氧的实际浓度只有其在水中浓度的73%，但还是假定空气饱和时，在1M KCl溶液中得到与在水中相等的数值显示。 三．实验器材及仪器 氮气、压缩空气、水浴锅、铁架台、推车、带夹套烧杯、气体分布管、胶管、磁力搅拌器、DO测量放大器（指示组件）。 四．实验步骤 将氧电极置于与恒温水浴（温度调至与被测发酵液相等）相连接的内部盛有水的带夹套烧杯中，并置于气体分布管的上方，电极的连线与放大器连接并将放大器开关打开。 a.设置0： 设置压力选择器至0（mmHg），调节零电位器，使数字显示器达到0值。 b.设置满量程： 将空气通入气体分布管，使带夹套烧杯中的水被空气饱和，使其达到充分搅拌。设置压力选择器至三档中的任何一档（即100，200，800 mmHg），使数字显示器指向约95%，再操作斜度电位器，仔细调节指示值，至95%显示。 c.精度检查： 用惰性气体N2通入气体分布管，使水饱和。显示器将指向0，而在此操作期间，压力选择器、0和斜度电位器不在调节。 五．思考题 （1）为什么在生物反应之前要对DO电极进行校正？是否每次反应都必须校正？为什么？ （2）在校正溶氧电极时应如何控制数字显示器，为什么？ 实验十三 体积溶氧传递系数的测定 一．实验目的 学习运用溶氧电极法测量计数获得kLa值。 二．基本原理 单位体积发酵的氧传递系数kLa可称为“通气效率”，可以用来表征发酵罐的通气情况。由于各发酵罐设备情况不同以及整个发酵过程中培养液物性的变化，kLa不是常数，通过kLa的测定，就可以了解发酵过程中氧的传递效果的好坏，对提高氧的利用率和增产节能都有着重要意义。 三．实验方法 （1）根据电极显示值求C值： 如果温度为T时，水被空气所饱和，可得到氧分压式： Po2 = （P – PH2O ）Yo2 空气 P――总压 PH2O――水蒸气压=f（T） Yo2 空气――空气中氧的分子分数=0.21 当总压为1bar，温度为20℃时 Po2 = （1 – 2.34×10-2）×0.21= 0.205（bar） 相应的浓度可根据Henry定律计算： H = Po2/Xo2 * Xo2 *――液相中氧的分子分数 =  ≈水的克分子浓度 = = 55.55 温度T = 30OC时水中的亨利常数：H （T = 30OC）= 4.81×104 bar C*α = 0.21×55.55/4.81×104 空气氧饱和浓度值C*α = 2.42×10-4Mol/L 将电极显示值E（%饱和）换算成氧浓度为： C = E/100×C*α = E/100×2.42×10-4Mol/L （2）KLa的获得： 可以运用动态测定法获得KLa值，此法就是在非稳定时用下列衡算式： =kLa (C*－C)－Qo2 X………………………（1） 首先观察暂停通气后C值随是的下降速度率求得一Qo2值，其次再观察重新通气时的C值(图7)。  图7 动态电极法测定kLa的曲线 停止通气——再通气实施的溶解氧浓度变化 利用动态过程的数据求 将（1）式加以整理： C =(+Qo2X) + C*……………（2） 将重新通气后的过渡阶段C值对应于（+ Qo2 X）值作图，应当得到一直线，这条直线的斜率就表示（－）值。 四．实验器材 溶氧电极、发酵罐、培养液、控制台等。 五．实验步骤 1．溶解氧（DO）浓度的测定 （1）将组装好的氧电极与测定装置连接好，插入水中，接通电源约5min （长时间未使用的氧电极预热约30 min）。 （2）将氧电极浸入饱和亚硫酸钠溶液（无氧水）中，DO值减小到一定后，调节溶氧仪的调节旋钮，使仪表指针至零点。 （3）从无氧水中取出氧电极后，用水冲洗，并用滤纸吸去覆膜上的水滴后将氧电极插入已充分通入空气的纯水中，至指针稳定后，调节校正旋钮使指针与饱和DO值吻合。 （4）重复（2）、（3）两步骤，使显示数值稳定在一定范围内。 2．kLa的测定 （1）将培养基加入至发酵罐，插入调整好的氧电极，设定好相应的温度、通风量及搅拌转速。 （2）连接氧电极输出端。 （3）接入适量的种子液，开始培养。 （4）培养一定时间，此时DO值为一定，停止通气。 （5）当DO值下降至1~2mg/Kg时，通气，DO值迅速回升，渐渐恢复至原值。 （6）进行不少kLa于3个搅拌转速条件下的测定，每一搅拌转速条件至少进行两次测定，利用转速（n）计算kLa的值。 六．实验结果 T（℃） C* E C －             七．思考题 1、为什么要测定kLa？本实验是用何种方法测定kLa值的？ 2、测定kLa值有没有其他方法？采用不同的方法测得的kLa值能否进行比较，为什么？ 实验十四 反应器培养液的灭菌与接种培养 一．实验目的 学习和掌握生物反应器灭菌与接种培养的操作，认识和掌握运用现代化反应器的操作规程及方法。 二．基本原理 一般小型台式玻璃生物反应器置于高压中灭菌，而金属制生物反应器的灭菌是采用夹套层蒸汽加热灭菌的方式进行的，可将反应器内培养液的温度升至121℃，以达到灭菌的效果，灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。 三．材料及仪器 1．材料 菌种：黑曲霉 培养基：5%葡萄糖，1%酵母汁，0.5%蛋白胨，pH5.5。 2．仪器与设备 16升不锈钢制生物反应器、反应器控制台、三角瓶、胶管、接种针、火柴。 四．实验步骤 1．灭菌 在反应器安装就序后，接通电源，打开控制台总开关，开启冷却水阀，分别按下温度、pH、溶解氧、搅拌器开关键，调节搅拌器转速约1000rpm， 调整灭菌时间（30min），设置灭菌温度（121℃），同时，按下灭菌开关键。使电加热器对罐底夹套层进行加热，罐内温度逐渐上升，待温度升至105℃左右时，关闭废气出口阀。温度继续上升至灭菌温度，自动保温至设定时间后，由冷却水自动冷却至设置的发酵温度。 2．培养条件的确定： 通人反应器的空气是从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌的培养罐内。在控制台上，设定所需的搅拌转速、发酵温度、pH值，并将空气流量计的流量调至确定值。 3．接种与培养： 　 将事先培养好的培养液（在三角瓶中进行摇床培养，处于对数生长期的细胞，以无菌操作方式倒入已灭过菌的带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角瓶内）由接种口接入罐内，接种时，要在接种口的隔膜周围放上浸有酒精的棉花或用1~3ml乙醇覆盖，点燃，以产生上升的气流来防止杂菌污染。接种塞从无菌筒内取出，然后将接种针穿过火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，拧紧连接螺帽，直至插入部分固定。接种量大体上是培养液的百分之几。如调节pH值和泡沫时，可将酸液和碱液及消泡剂装入三角瓶，灭菌后，分别经蠕动泵与反应器连接，与罐体连接的方法与接种相同。这样，通过控制台的自动控制，就可以自动地连接流加，使罐内保持所需pH值和泡层状态。 4．取样 为了了解培养过程中反应物的变化情况，必须定时地进行取样，取样时，要关闭排气口，使罐内处于正压状态，打开取样口，培养液即可自动流出。但是，在第二次取样时，必须注意将残液放净后再取样。 五．思考题 1. 本实验是采用何种方式灭菌的？你所了解的反应器灭菌方式有哪几种？ 2. 如何保证接种过程中不使反应器内部发生杂菌污染？ 实验十五 气升式生化反应器的使用 一．实验目的： 认识和了解气升式生物反应器的结构与功能，掌握气升式生物反应器使用时的操作规程。 二．基本原理： 气升式反应器有多种型式，比较典型的两种为内循环与外循环式生物反应器（如图8）。空气在喷嘴口以250~300m/s的高速喷入环流管，由于喷射的作用，气泡被分散于液体中，上升管内的反应液密度较小，加上压缩空气的动能使液体上升，罐子内液体下降进入上升管，形成气——液混合流连续循环流动。罐内培养液中的溶解气由于菌体的代谢而逐渐减少，当其通过环流管时，由于气——液接触而被重新达到饱和。  图8 气升式生化反应器示意图 1— 消泡剂 2— 冷凝器 3—蠕动泵 4—加热带 5—导流筒 6—喷嘴 7—流量计量 8— 无菌空气 9— 溶氧仪 10— 取样器 11— 无菌水 12— 氧电极 三．实验装置 本实验所用的小型气升式生化反应器（图8）为不锈钢和玻璃制成。罐体下部有保温装置，以便于操作过程中的加热保温或冷却。罐底部安装有空气分布器，以便于提高溶氧效率。罐内装有导流筒，以增加气液的流动与混合。本实验室使用容积为5L的气升式生化反应器。 四．操作步骤 1．气升式生物反应器的安装 将清洗干净的罐体组装好后，连接好pH电极（为延长电极使用寿命，可在培养液杀菌后再将其安装于罐内）、氧电极、消泡电极等，排气、无菌空气等组件的安装与自控式机械搅拌罐的类同。从顶盖的接种口将配制好的培养基加入。与外相接管口，除排气口加棉塞，并包牛皮纸或铝箔外，其他可用的橡胶塞或截水夹封住。 2．杀菌操作 将组装好的气升式生化反应器直接放入杀菌锅内，在121℃下杀菌15min，当培养液较多时，采用常规杀菌时间有可能造成杀菌不彻底，应充分注意。 3．冷却与接种 气升式生化反应器取出后，首先将通风管接好，然后接通冷却水，同时通入适量的无菌空气，以加快冷却过程。同时连接好相关的传感器。未进行蒸汽杀菌的传感器，例如pH电极，在75%酒精溶液中浸泡15min，用无菌水冲洗后快速安装于反应器内。连接好各种传感器的管线及通风、水管等。 检查温度、通风等条件正常后接菌，接菌操作与机械搅拌罐一样。 4．取样 除接种前后应取样分析外，在一定时间间隔定时取样。取样时，去掉从取样口最初流出的几毫升培养液后再取样。培养过程中应定时检查水、电气管线路，以确保安全，正常。 5．培养结束 取样后残留培养液应进行蒸汽杀菌，然后排放到规定的场所。将气升式生化反应器拆分开后，认真清洗干净。 五．思考题 1、比较机械搅拌式生物反应器与气升式反应器的异同点。 2、气升式反应器可适用于何种类型的微生物发酵？ 实验十六 中试发酵设备的使用方法 一．实验目的 了解中试（30～100L）生物反应器的结构与功能，并掌握其使用时的操作规程。 二．基本原理 生物反应器是生物技术开发中的关键性设备，一个微生物技术产品从实验室到工业生产的开发过程中，需要逐级放大培养（依次进行小试，中试，生产），使得大型发酵罐的性能与小型发酵罐接近，以使大型发酵罐的生产效率与小型发酵罐的相似。因为在不同大小的发酵罐中进行的生物反应过程虽然是相同的，但在质量、热量和动量的传递上却会有明显的差别，从而导致生物速率的差别。 三．培养装置  图9 70L容积的中式培养装置示意图 发酵罐为不锈钢制的圆柱形，外有夹套以便加热或冷却。对于生产中使用的大型发酵罐，罐内装有冷却管。搅拌可采用电动机带动或磁力搅拌器，空气过滤可采用介质层过滤或聚乙烯醇PVA滤芯空气过滤器，在液面上方一般还有安装有机械消泡器，采用可蒸汽杀菌的pH复合电极及pH控制装置，使用2台泵，一台用于流加酸，一台用于流加碱。 四．操作步骤 1．空消 首先，清洗培养罐内部，特别要注意在空气分布或取样管导出残留污物。罐内加入20%～30%的水后，通入加热蒸汽（蒸汽需经过滤膜过滤），在121℃下杀菌15min。杀菌过程中不断地打开阀门，确保彻底杀菌。杀菌完成后，从取样管将罐内液体排出。 2．培养基制备 培养基的加入量一般为罐容积的50%～60%。将称量好的培养基组分，经溶解后加入到发酵罐中。此时培养液的体积为实际所需培养基容积的80%。由于蒸汽杀菌过程中有大量的蒸汽转变为水，使发酵液体积增大。对于合成培养基的灭菌操作，葡萄糖与磷酸盐应分别灭菌后，在开始培养前加入以避免在杀菌过程中，葡萄糖与氮化合物之间发生美拉德反应，以及磷酸盐与其他金属离子形成沉淀。 3．安装控制装置 安装调试好PH电极、氧电极、消泡电极等。 4．实消与冷却 夹套内通入加热蒸汽，是培养液温度达到80℃以上。随后将蒸汽直接通入发酵罐，在121℃下杀菌15min。杀菌过程中，间断打开各阀门，排出内部空气，以保证各出管内杀菌完全。此时如果不采用夹套预热至一定温度，直接通入蒸汽杀菌的话，培养基装置内冷凝水增加，将增加培养液体积调节的难度。 杀菌完全后，夹套内通入冷却水，进行培养基的冷却。为保证罐内正压，应通入适量无菌空气。 5．操作条件的设定 在无菌条件下连接好酸、碱消泡剂等流入管线。设定好通风量（一般为0.5～2L/min.L）、温度和pH。 6．接菌、培养 将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火后打开接种口，加入无菌水，调节好罐内培养液量（必要时应加入葡萄糖、磷酸盐等溶液），进而将种子培养液注入。接种?量一般为1%～10%，盖好接种口后，调节搅拌转数至所需值，培养开始。 7．取样 为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分析。由于罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。取样时应将上一次取样时残留在取样管中的培养液去除后在取样。另外，取样后应通入加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。 8．培养结束 将电极与培养液 全部取出，培养液在121℃下杀菌15min后，排出到指定地点。罐内应冲洗干净。 五．思考题 1、小型和大型生物反应器设计上有什么不同点？ 2、发酵罐的放大有哪些方法？国内常用的方法有哪些？ ? 实验十七 补料分批发酵动力学研究 一．实验目的 加深对培养方法的认识，了解补料分批续培养过程控制方法。 二．实验原理 补料分批培养，是一种介于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式，是在分批培养的过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。流加培养同时兼有间歇培养和连续培养的某些特点，其优点是，可使发酵系统中维持很低的底物浓度，减少底物的抑制或其分解代谢物的阻遏作用，不会出现当某种培养基成分的浓度高时影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。 三．菌种与培养基 1.啤酒酵母 2．培养基(g/L) (NH4 )2S04 4.0，K2S04 4.0，Na2HP04·2H20 2.0，MgSO4 0.5， CaCl 0.1，NH4Fe(SO4)2·12H20 0.02，葡萄糖0.5，盐溶液10ml液10 m1[(mg/L)：ZnSO4·7H20 0.2，Cu SO4·5H20 0.01]，含维生素和微量营养物质的溶液1.0 m1[(mg/L)：维生素Bl 0.2，烟酸5.0，对氨基苯甲酸0.3，泛酸(盐)0.5，生物素0.006，内消旋肌醇50，维生素B6 1.0]，pH 5.0。流加的浓葡萄糖液质量浓度为25 g／100 ml；0.1 mol/L NH3用于调节发酵液的pH。保持培养基中糖的质量浓度在0.5 g/L，流加液的糖的质量浓度为25—30 g/100 m1。 四．实验方法 1．流加培养前的准备工作 在培养罐中加入去离子水，将温度传感器、除菌过滤器安装好，pH和溶氧电极标定后安装好，用硅橡胶管连接好取样口、流加液入口、pH调节剂入口和消泡剂人口，不需要的接口全部封好。橡胶管用弹簧夹夹住，排气口用一小段棉花塞好。确认所有连接没有问题后，打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象(轻轻堵住排气口，看其他地方是否漏气)，确认正常。 2.种子培养 （1）液体试管培养 自斜面菌种挑起一环酵母菌体。接入装有10ml l0—12。Bx麦芽汁的液体试管中，摇匀后，置于30℃培养箱培养24 h。 （2）三角瓶培养 将上述培养好的液体试管种子接入用250ml三角瓶装的灭过菌的100mll0—12。Bx的麦芽汁中，接种量10％，在30℃下培养15－20h。 3．流加培养 培养罐中加入已调配好的培养基后，放在灭菌锅中灭菌121℃，20－30 min，葡葡糖和消泡剂分别同时灭菌。培养罐取出后，开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,冷却到发酵温度30℃。利用硅皮管将25 g/100m1葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75％酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。通气量在3—5 L/min，搅拌转数在200一600rpm接种量10％。开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖，使发酵罐内葡萄糖浓度达到20—30g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养掖pH为5.0。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10％左右。流加培养7—10h，每隔0.5-1h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度。取样口经常用75％的酒精浸泡以保持清洁。培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。清洗培养罐。在发酵过程中消泡剂应尽量少加。 四．分析方法 1．菌体量(X) 生物量的测定 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验采用比浊法。以空白培养基为对照，在550 nm处测定发酵液的吸光值。 2．还原糖的测定 3．乙醇含量测定：采用重铬酸钾比色法。 （1）原理 在酸性溶液中，被蒸出的乙醇与过量重铬酸钾作用，被氧化为醋酸。根据反应中生成的三价铬的颜色深浅进行比色测定，求得试样中酒精含量。 （2）实验方法 ①标准曲线的制备 吸取1 ml无水乙醇于100 ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀。分别吸取此稀释乙醇溶液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50ml容量瓶中，各加15ml重铬酸钾溶液，加水至刻度，混匀。此标准系列相当于试样中含有0、1、2、3、4、5、6、7％（V/V）的酒精。 此空白标准做参比，在波长610nm，用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度。用吸光度对酒精浓度作图，绘制曲线。 ②菌种发酵液酒精产率的测定 在500 ml蒸馏瓶中，加100g（100 ml）试样，蒸馏。最后加水补足100ml。吸取1ml蒸馏液于50ml容量瓶中，加入15ml重铬酸钾溶液，加水至刻度，混匀，在波长610nm处测定其吸光值，并在酒精标准曲线上查得蒸馏液中酒精含量（％，v/v），即为原试样中酒精含量。 五．实验结果 （1）画出培养液中葡萄糖(g/L)、酵母菌体量(g/L)和副产物乙醇(g/L))随流加培养时间的变化曲线。 （2）计算酵母产率(质量分数，葡萄糖)。 （3）分析酵母产率和副产物乙醇的关系。 六．思考题 1、试分析补料分批发酵在工业上应用情况？ 2、在发酵过程中可采用哪些措施以减少副产物乙醇对酵母细胞生长的影响？