发 酵 工 程 与 设 备 第一章 绪 论 生物技术作为21世纪高新技术的核心，对人类面临的食品、资源、健康、环境等重大问题发挥越来越大的作用。大力发展生物技术及其产业已成为世界各国经济发展的战略重点。 发酵工程的主要内容 发酵工程（Fermentation Engineering）属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学，最初是由一位匈牙利工程师Karl.Ereky于1917年提出的。当时他提出的生物技术这一名词的涵义是指甜菜作为饲料进行大规模养猪，即利用生物将原料转化为产品。现在的生物技术的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学原理依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。因此，生物技术是一门综合性多学科技术，他涉及的基础学科有生物学、化学和工程学。下图为生物技术与基础学科关系的示意图。它逐渐成为与生物学、生物化学、化学工程等多学科密切相关的综合性边缘学科。 现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，它的生命力在于他对社会经济和发展的各个方面都带来了极大冲击和影响。 发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。 发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程）。 在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。 二、发酵工程的发展历史 生物技术的发展和利用可以追溯到1000多年（甚至4000多年）以前如酒类的酿造。而人类有意识地利用酵母进行大规模发酵生产是在19世纪。当时进行大规模生产的发酵产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白酶等初级代谢产物。19世纪中叶，法国葡萄酒的酿造者在酿酒的过程中遇到了麻烦，他们酿造的美酒总是变酸，于是，纷纷祈求于正在对发酵作用机制进行研究的巴斯德。巴斯德不负重望，经过分析发现，这种变化是由乳酸杆菌使糖部分转化为乳酸引起的。同时，找到了后来被称为乳酸杆菌的生物体。巴斯德提出，只要对糖液进行灭菌，就可以解决这个问题，这种灭菌方法就是流传至今的巴斯德灭菌法。 巴斯德关于发酵作用的研究，从1857年到1876年前后持续了20年。否定了当时盛行的所谓“自然发生说”。他认为“一切发酵过程都是微生物作用的结果。发酵是没有空气的生命过程。微生物是引起化学变化的作用者”。巴斯德的发现不仅对以前的发酵食品加工过程给以科学的解释，也为以后新的发酵过程的发现提供了理论基础，促进了生物学和工程学的结合。因此，巴斯德被称为生物工程之父。 到了20世纪初，人们发现某些梭菌能够引起丙酮丁醇的发酵，丙酮是制造炸药的原料，随着第一次世界大战的爆发刺激了丙酮丁醇工业的极大发展。虽然现在竟争力更强的新方法已逐步取代了昔日的发酵法。但它是第一个进行大规模工业生产的发酵过程，也是工业生产中首次采用大量纯培养技术的。这一工艺获得成功的重要因素是排除了培养体系中其他有害的微生物。这在19世纪末，20世纪初，是相当先进的生物技术。因此，可以说，巴斯德是生物工程初始阶段的开拓者。 1929年Flemming爵士发现了青霉素，从此生产技术产品中增加一大类新的产品—抗生素。1929年，英国科学家弗来明在污染了霉菌的细菌培养平板上观察到了霉菌菌落的周围有一个细菌抑制圈，由于这种霉菌是青霉菌，所以弗来明把这种抑制细菌生长的霉菌分泌物叫青霉素。可是他的提取精制，在当时无法做到，弗来明只好忍痛割爱，放弃研究。 10年以后，第二次世界大战的战火越烧越旺，大量伤员急需抢救，英国的一些科学家恢复了弗来明的工作，竟戏剧性的获得了成功。当时，英国本土已经战火弥漫无法试制，美国承担了青霉素的试制任务。要生产这种药物，必须要有一种严格的、将不需要的微生物排除在生产体系之外的无菌操作技术，必须要从外界通入大量的空气而又不污染杂菌的培养技术，还要想方设法从大量培养液中提取这种当时产量极低的较纯的青霉素。美国的科学家和工程师齐心协力，攻克许多难关，到1942年终于正式实现了青霉素的工业化生产。这一伟大成就拯救了千千万万挣扎在战争死亡线上的人们。这是生物工程第一次划时代的飞跃。在这一飞跃中，作为生物技术核心的发酵技术已从昔日的以厌氧发酵为主的工艺跃入深层通风发酵为主的工艺。这种工艺不只是通通气，而与此相适应的有一整套工程技术，如1、大量无菌空气的制备技术，2、中间无菌取样技术，3、设备的设计技术等等。 因此，我们说这是生物工程技术的一次划时代飞跃。尽管后来开发了许多新产品，如数以千计的抗生素、多类氨基酸、不同用途的酶制剂等，就根本来说，青霉素投产后的半个多世纪中，深层培养技术没有出现质的改变。 20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物—抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物发酵工业技术的支柱产业。 20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为生物技术产业的又一个成员。实现了对微生物的的代谢进行人工调节，这又使生物技术进了一步。 20世纪60年代，生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。 70年代，为了解决由于人口迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。 80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为发酵工程技术引入了遗传工程的技术，使生物技术进入了一个新的阶段。 纵观生物技术的发展历史，我们可以知道，生物技术在经历了漫长的以传统工艺技术为主体的时期以后，正向系统的理论和实际应用相结合的方向发展，即奠定了可靠的理论和实践基础，也为今天和今后相当长时期生物技术的产业化准备了条件。 三、发酵工程的特点 在研究用微生物（生物催化剂）进行某种物质生产时，大体上有两种研究方式：一种是各种酶水平上研究微生物细胞内（外）的生物化学反应，如大量摇瓶在实验室里观察限制反应速率的因素和最适的培养方法，这可以认为是一种小规模的研究形式；另一种是大规模的研究形式，即过程放大。利用小型和中型反应器（培养罐）进行培养试验，并进一步在工业规模上研究生产物的分离和精制方法，以确定在细胞水平上的综合的最适培养条件。 一般化学工业的放大，可以说仅需对其放大原理给予充分的研究就足够了。而在发酵技术的放大方面，则需要由小试放大到中试逐步进行探讨。实验室进行的小规模发酵所获得的最适条件的各种参数，能否在工业规模生产使用的一百多立方到数百立方，也同样保证其最适条件，那就是不是轻而易举的事了。这是发酵工程的一个基本特点。例如，从摇瓶试验到各种规模的反应器试验，即使培养液的成分、温度、pH值等参数各种条件完全相同，并且微生物的活性及其培养过程与各个装置之间有着必要的相互关联，但一般情况下，反应结果可能完全不一致。尽管目前已有生物传感器，可以迅速准确地就位监测罐内、塔内或反应器中的反应过程，也有微机处理帮助大大提高了自动化调控的能力，而这些先进装置确实是保证在最适条件下进行发酵的有利武器，但如何保证大规模发酵在最适条件下进行，仍是一个值得研究的课题，它不仅涉及到发酵设备的工程问题，也与各类生物细胞的生理生化特性相关。 一般生物反应过程由四个部分组成。 材料的预处理 包括原材料的选择，必要的物理和化学方法加工，此过程是为提供微生物细胞可以生长和产物形成的基本原料，即培养基的制备过程，包括其配制和灭菌等。 生物催化剂的制备 生物反应的催化剂—酶基本上是由微生物产生的。因此，要选择高产、稳定、高效、容易培养的菌株，并以此菌株再经过多次逐级扩大培养后达到足够的数量并具有理想质量的微生物培养液作为“种子”接到反应器中。也可以利用固定化酶或固定化细胞，这就要通过一定的固定化技术来制备。 生物反应器及反应条件的选择与监控 生物反应器是进行生物反应的核心设备，生物反应主要是在生物反应器中进行的，它为微生物细胞或酶提供合适的反应条件以达到细胞增殖或产品形成的目的。反应器的结构、操作方式和操作条件对反应原料的转化率、产品质量和产品成本有着密切关系。根据发酵周期长短、培养条件等，可采取间歇式操作、多级反应器串联的连续操作等。同时反应参数的检测与控制对生物反应过程的顺利进行也是十分重要的。 产品的分离纯化 这一工序也叫下游加工程序，其目的是用适当的方法和手段将含量较低的产物从反应液中提取出来（指胞外产物）或从细胞中（指胞内产物）提取出来，并加以精制以达到规定的质量要求。包括物理方法、化学方法、生物方法等。生物反应过程主要有这样一些特点： 采用可再生资源作为主要原料，因而原料来源丰实，价格低廉，过程中废物的危害性较小，但由于原料的成分复杂，往往难以控制会给产品质量带来一定的影响。 由于采用的是生物催化剂，反映过程一般在常温常压下进行。但生物催化剂易受环境的影响和杂菌的污染，因而很易失活，难以长期使用。 与一般化工产品相比，其生产设备比较简单，能耗较低。但某些生物反应由于其特殊性质而使反应基质浓度和产物浓度均不能太高，这是因为微生物细胞或生物酶受底物浓度或产物浓度的抑制或不能耐高渗透压所致，不仅使反应器体积增大，而且也加大了提取的困难，因而反应器生产效率较低。 尽管生物反应过程成本低，应用广，但反应极为复杂，较难检测与控制。反应液中杂质多，给分离提纯带来了困难。 四. 生物反应过程的分类 随着生物技术的发展，生物反应过程的种类和规模都在不断的扩大。目前已进行工业生产的主要有酶催化反应过程，微生物反应过程和废水的生物处理过程。 酶催化反应过程 采用游离酶或固定化酶为催化剂时的反应过程。生物体中所进行的反应几乎都是在酶的催化下进行的。工业生产中所用的酶，或是经提取分离得到的游离酶，或是固定在多种载体上的固定化酶 。 微生物反应过程 采用活细胞为催化剂时的反应过程。这既包括一般的微生物发酵反应过程，也包括固定化细胞反应过程和动植物细胞的培养过程。 废水的生物处理过程 它是利用微生物本身的分解能力和净化能力，除去废水中污染物质的过程。废水生物处理过程与微生物反应过程虽然都是利用微生物的反应过程，但与后者相比废水的生物处理具有以下特点： 是由细菌等菌类、原生动物、微小原生动物等各种微生物构成的混合培养系统。 几乎全部采用连续操作系统。 微生物所处的环境条件波动大。 反应的目的是消除有害物质而不是代谢产物和微生物本身。 五、生物化学工程的基本内容 生化工程是运用化学工程的原理和方法将生物技术的实验室成果进行工业开发的一门学科。其原理与方法是指用以解决生产过程中有关化学反应、原料处理和产物的分离、能量的传递、设备的设计与放大、过程的控制和优化等一系列工程技术问题。 在生物化学反应过程的上游加工中最重要的是生物催化剂（包括菌株、酶及其固定化）的制备，因此必须掌握生物催化剂的生理生化特性和培养特性，解决大规模种子培养或固定化生物催化剂的制备以及如何将其在无菌状态下接入生物反应器中等问题。 上游加工中还包括原材料的物理和化学处理、培养基的配制和灭菌等问题，这里包括有物料破碎、混合和输送等多种化工单元操作以及热量传递、灭菌动力学和设备等有关工程问题。 生物反应器是整个生物反应过程的关键设备。它是为特定的细胞或酶提供适宜的生长环境或进行特定的生化反应的设备，它的结构、操作方式和操作条件与产品的质量、产量和能耗有着密切的关系。生物反应器存在着物料的混合与流动、传质与传热等化学工程问题；存在着氧和基质的供需和传递、发酵动力学、酶催化反应动力学、发酵液的流变学以及生物反应器的设计与放大等一系列带有共性的工程技术问题；同时还包括生物反应过程的参数检测和控制。有关这一中游加工过程的工程问题已发展成为生化工程的重要学科分支—生物反应工程。 生物反应过程的下游是对目的产物的提取与精制。这一过程是比较困难的。这是因为一方面生物反应液中的目的产物的浓度是很低微的。例如，浓度最高的乙醇仅为10%左右，氨基酸不超过8%，抗生素不超过5%，酶制剂不超过1%，胰岛素不超过0.01%，单克隆抗体不超过0.0001%；另一方面因为反应液杂质常与目的产物有相似的结构，加上一些具有生物活性的产品对温度、酸碱度都十分敏感，一些作为药物或食品的产品对纯度、有害物质都有严格的要求。总之，下游加工过程步骤多，要求严，其生产费用往往占生产成本的一半以上。 生物技术研究的主要目标是最大限度地提高上游处理、发酵与转化、下游处理这三个步骤的整体效率，同时寻找一些可以用来制备食品、食品添加剂和药物的微生物。从20世纪60~70年代起，生物技术的研究主要集中在上游处理过程、生物反应器的设计和下游的纯化过程方面，这些研究使发酵过程的检测、生物反应体系的检测技术和有效的大量培养微生物的技术及相关仪器方面都有了很大的发展。目前，这些仪器已经可以用于生产各种不同的产品。 在利用微生物生产商品的整个过程中，生物转化这个环节往往是最难优化的。通常用于大规模生产的培养条件往往不是自然条件下微生物的最佳生长条件。因此，人们一般通过化学突变、化学诱变或者紫外线照射来产生突变体，从而改良菌种、提高产量，传统的诱导突变和选择的方法在发酵生产中获得了较大的成功。多种抗生素的大量生产过程就是这种方法的成功例证。 但是通过传统的方法提高产量的幅度是非常有限的，如果一个突变了的菌株某一组分合成太多，那么其他一些代谢物的合成就会受到影响，因此这反过来又会影响微生物在大规模发酵过程中的生长。传统的诱变和选择的方法过程繁琐、耗时过长、费用极高，需要筛选和检测大量的克隆。另外，用传统的方法能提高微生物一种已有的遗传性质，并不能赋予这种微生物以其他遗传特性。总的来说传统的改良菌种的生物技术还仅仅局限在化学工程和微生物工程的领域内。随着DNA重组技术的出现和发展，这种情况发生了根本性的改变。 现代生物技术的发展主要体现在下列几方面： 基因操作技术日新月异，不断完善。新技术、新方法一经产生就迅速的通过商业渠道出售此项技术并在市场上加以应用。 基因工程药物和疫苗研究与开发突飞猛进。新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新和改造。 转基因动物和植物取得重大突破。现代生物技术在农业上的广泛应用作为生物技术的“第二次浪潮”在21世纪将全面展开，给农业畜牧业生产带了新的飞跃。生物技术对农业的总贡献率大于70%，功能性食品在营养学上起着革命性的变化。 阐明生物体（目前主要有人类、水稻、拟南芥等）基因组及其编码蛋白质的结构和功能是当今生命科学的一个主流方向。目前已有多个原核生物及一个真核生物（酵母）的基因组序列被全部测定。与人类重大疾病相关的基因和与农作物产量、质量、抗性等有关基因的结构与功能及其应用研究是今后一个时期研究的热点和重点。 基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。估计在本世纪初，恶性肿瘤、爱滋病的防治可望有所突破。（基因治疗对象：遗传病、恶性肿瘤、艾滋病、乙肝、代谢性病、心血管病等） 蛋白质工程是基因工程的发展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来，形成一门高度综合的学科。 国际上信息技术的飞速发展渗透到了生命科学领域，形成了引人注目、用途广泛的生物信息学。全球通讯网络的日益扩大和完善也大大加速了生物技术的研究、应用和开发。 现代生物技术在近20年的发展中受到了各方面人士的普遍关注，更有许多专家将21世纪称为生命科学的世纪，将现代生物技术产业称为21世纪的朝阳产业。一方面是由于现代生物技术发展迅速，用途广泛；另一方面是由于现代生物技术具有其他技术所无法比拟的优越性，即可持续发展。面对人口膨胀、资源枯竭、环境污染等一系列直接关系到整个人类生死存亡的严重问题。，人们越来越深刻的认识到了发展具有可持续发展的新技术、新产业的必要性和紧迫性。由于生物技术是以生物（动物、植物、微生物、培养细胞等）为原料生产产品的，因此其原料具有再生性，同时利用生物系统生产产品产生的污染物很少，对环境的破坏性很小或几乎没有，重组微生物甚至还可以消除环境中的污染物。鉴于生物技术产业的以上特点，清洁、经济的生物技术必然会在21世纪获得更大的发展。 六、如何学习《发酵工程与设备》 以微生物的生命活动为基础的发酵工业正为人类的健康和生产实践服务，生产了大量的抗生素、酶制剂、氨基酸、维生素、蛋白质以及其他有用产品。为了在今后实际工作中对提高发酵工程的生产效率和创立新的发酵过程有所认识，我们必须运用生物化学、微生物学等已学过的知识，详细了解和掌握发酵条件下的微生物新成代谢的规律和整个反应过程所涉及的各个条件及作用，对微生物各种反应做定量的动力学方面初步研究以控制微生物生命活动的途径，在此基础上，学习和掌握微生物代谢过程中的物质传递机理；同时，认识和了解整个生物反应过程中的设备结构和计算、形式各异的反应器的结构和特点，即在这门课程中，对微生物发酵工业中培养基灭菌、空气除菌、反应动力学数学模型的建立、发酵设备的结构、通气搅拌功率计算和设备放大、设备选型及设计方法进行较为全面的分析和讲解，并在讲解中列举部分实例和有关生化工程设计数据。 另外，要结合有关工艺、技术、设备等方面的知识认真准备和操作实验，做到理论联系实际，便于今后能够较快较好的适应工作。 菌种的扩大培养 菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。 工业规模的发酵罐体积越来越大，目前已达到几十立方米至几百立方米。若按5～10％的接种量计算，就要接入几立方到几十立方米的种子。这单靠试管里的种子直接接入是不可能达到必需的数量和质量的，必须从试管中的微生物菌种逐级扩大为生产使用的种子。这是一个从实验室制备到车间生产的过程。然而，菌种种类不同，生产产品品种不同，其生产方法和生产条件均有所差别，如营养、温度、酸碱度、氧等条件。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛和数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，会使发酵生产周期缩短，设备利用率提高，对杂菌的抵抗能力增加，对发酵生产起到了关键性的作用。所以种子质量的好坏至关重要。 种子必须具备的条件：①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长；②生理性状稳定；③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；④无杂菌污染（不带杂菌）；⑤生产能力稳定。 第一节 种子制备 种子制备过程可分为两大阶段（如图）： a、  b、  ①实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养。 ②生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养。 实验室种子制备 在砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接至适合的斜面培养基上，培养成熟后挑选正常的菌落再接一次试管斜面。对那些产孢能力强、孢子发芽生长繁殖快的菌种可以采取在固体培养基上培养的方法，孢子可直接接入种子罐，从而简化了操作，减少了操作步骤，同时也减少了染菌的机会。例如生产青霉素的产黄青霉菌，采用大米或小米作为固体培养基，取一定量装入250ml茄子瓶中进行灭菌，米粒含水量一定要控制好，米粒不能粘也不能散，灭菌冷却后接入孢子悬浮液，在25～28℃ 培养4～14天。培养期间，还要经常翻动，保持通气均匀。培养结束后，或接入种子罐，或以真空抽去水分至10％以下，于4℃冰箱中保存备用。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌，产卡那霉素的卡那链霉菌都是以摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，在摇床上恒温振荡培养，生长出的菌丝体作为种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌属，短杆菌属，以32℃培养18～24小时的斜面移入250ml 茄子瓶斜面培养基上，或摇瓶培养基上，32℃培养，12小时后可接入种子罐。 生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂培养基斜面上，4℃ 冰箱保藏。3～4个月移种一次，再接种至10ml麦芽汁试管中，25～27℃ 保温培养2～3天后，扩大至含250ml麦芽汁的500ml三角瓶或含500ml麦芽汁的1000ml三角瓶中。25℃培养2天，再移至含5～10L麦芽汁的卡氏罐中，15～20℃ 培养3～5天，再接入发酵罐，因是好氧性菌（菌体增殖期间），所以要通气。具体流程如下：  生产车间种子制备 实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境。种子罐的接种方法一般根据菌种种类而异。孢子悬浮液一般用微孔接种法接种，摇瓶悬浮液种子可在火焰保护下接入种子罐，也可以用差压法接入。种子罐之间或种子罐与发酵罐之间的移种，主要用差压法，通过种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降为零，因为无压会引起染菌。 1. 种子罐级数的确定 种子罐的级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这要根据菌种生长的特性、孢子发芽速度和菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细胞，种子用量的比例少，即需要的接种量少，所以相应的种子罐也少。如谷氨酸生产中，茄子瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃培养7～10小时，菌体浓度达到108～109个/ml，即可作为种子接入发酵罐，这称为一级种子罐扩大培养，也可叫作二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌，就需要二级种子罐扩大培养，也可称为三级发酵。一般50m3发酵罐都采取三级发酵。如果是实验室的中试（5～30L），可以通过直接孢子或菌体接入罐中发酵，即一级发酵。 种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，而且可以减少多次移种可能发生的染菌机会。当然，也要考虑尽可能地延长菌体在发酵罐中生产产物的时间，缩短种子增殖的非生产时间，提高发酵罐的生产率（产物/ml·h）。 此外，种子罐的级数的减少也可通过改善工艺条件，改变种子培养条件，加速菌体的增殖。 2. 接种种龄和接种量 接种龄： 接种龄是指种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。在种子罐中，随着培养时间的延长，菌体量增加，基质消耗和代谢产物积累，菌体量不再增加，逐渐老化。因此，选择适当的种龄接种量是一个至关重要的因素。接种龄一般以菌体处于生长旺盛期，即对数生长期最合适。如果种子过于年幼。接入发酵罐后，会出现前期生长缓慢，整个发酵周期拉长，产物开始形成的时间推迟，而过老的种子也会出现使生产能力下降而使菌体自溶的现象。 对于不同菌种，不同产品品种，不同工艺条件，其接种龄也不相同，具体的生产，接种龄要进行多次试验，从发酵产品产量的多少，即产率大小来确定最适接种龄。 接种量 接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例。抗生素的工业生产，大多数发酵的最适接种量为7～15％或更多。啤酒生产发酵的接种量为5～10％，谷氨酸发酵接种量仅为1％。 接种量大小取决于生产菌的生长繁殖速度。大接种量可以缩短发酵罐中菌体数达到高峰的时间，可以提早形成产物。这是因为种子液中含有胞外水解酶类，种子量大，酶量也多，有利于对基质的作用和利用，同时菌体量多，占有绝对生长优势，可以相对减少杂菌的污染生长机会。但接种量太大，也会造成菌体生长过速，溶氧跟不上，从而影响产物的合成。 3. 种子质量的判断 由于菌种在种子罐中的培养时间较短，使种子的质量不容易控制，因为可分析的参数不多。一般，在培养过程中要定期取样，测定其中的部分参数来观察基质的代谢变化以及菌体形态是否正常。例如酒精酵母的种子罐，一般定时测酸度变化、还原糖含量、耗糖率、镜检等，镜检内容包括测酵母细胞数、酵母出芽率、酵母形态（整齐、大小均匀、椭圆形或圆形）、是否有杂菌等。 影响种子质量的因素 原材料质量 生产过程中有时会出现种子的质量不稳定现象，这主要是由于原材料的质量不一致造成的。有些原材料如麸皮，是用来配制产孢子斜面培养基的。制备霉菌培养基的大米、小米等会因产地、品种、加工方法及颗粒大小不同而使孢子质量受到影响；蛋白胨、琼脂的质量、水质的硬度、污染程度等对生产均会产生不同程度的影响。 2．培养条件 培养条件对种子质量的影响最直观，最显著。如培养温度高于或低于种子的培养温度范围，会使菌种生长过快或过慢，造成菌体过早衰老自溶或拉长培养时间，而影响生产。所以要控制菌体的培养温度在最适的范围内。湿度对产孢子的菌种影响很大，这一湿度是指培养基的湿度，有时也包括空气湿度。如制白酒酒曲时，空气湿度会影响曲中各种不同微生物的生长。在生产抗生素菌种时，孢子就会受湿度的影响而使其生长快慢不一。通气量对于好气性菌体的生长和质量是一个很重要的影响因素。有些菌种的通气量甚至可能影响到它们的代谢途径。如酒精酵母，在通入足够的空气时会利用培养基中的糖合成自身细胞物质，而在通气不足或完全不通气时，则使糖代谢进入无氧代谢（EMP）途径，合成酒精成分。青霉素的菌种在培养时必须通过足够的空气，否则就会影响他们的数量和活力，从而减少发酵液的产率。所以不同的菌种，对通气量的要求是不同的。 3．斜面保藏时间 斜面的保藏时间对菌种的质量具有一定的影响。如抗生素中土霉素生产菌的孢子斜面在培养4天后放入4℃冰箱保藏，在7～8天时就开始自溶了，而培养了5天后再冷藏，20天都未发生自溶。此外，冷藏时间过长会使菌体的活力下降。 第二节 种子质量的控制措施 种子质量的优劣是通过它在发酵罐中所表示的生产率体现的。因此必须保证生产菌种的稳定性，在种子培养期间保证提供适宜的环境条件，保证无杂菌浸入，从而获得优良的种子。 菌种稳定性的检查 生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力，不能有变异种。尽管变异的可能性很小，但不能完全排除这一危险。所以，定期检查和挑选稳定菌株是必不可少的一项工作。方法是：将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。 这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。 杂菌检查 在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。一般的方法是：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等等。 灭 菌 在生物化学反应中，特别是对各种微生物的培养过程中，要求在没有任何杂菌污染的情况下进行，而生物反应系统中又常常有比较丰富的营养物质，极易滋生杂菌，从而使生物反应受到破坏，产生的不良后果一般为： 1. 使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。 2. 杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。 3. 有些杂菌会分解产物，使生产失败。 4. 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。 5. 如发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。 正因如此，大多数培养过程要求必须在严格无菌的条件下培养，必须对生产设备及参与反应的所有介质（生产菌除外）进行灭菌处理。 第一节 灭菌的方法 灭菌，是指用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。常用方法如下： 化学药剂灭菌： 某些化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。如甲醛、氯（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。因化学药剂也会与培养基中的一些成分产生作用，而且加入培养基中后不易去除，所以化学药剂灭菌不用于培养基灭菌。 射线灭菌 紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子能起到灭菌的作用。波长为2.537×10-7的紫外线有灭菌效果。但由于其穿透力低，所以只用于表面消毒和空气消毒。X射线和由Co60产生的γ射线也可灭菌。 干热灭菌 160℃保温1 h。主要针对必须保持干燥的实验器具或材料（培养皿、接种针、固定化细胞用的载体材料等）。 湿热灭菌 湿热灭菌为最基本的灭菌方法，因为蒸汽穿透能力强，且在冷凝时放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀灭微生物。但如果利用蒸汽直接通入培养基中加热灭菌，应考虑扣除冷凝水的体积，否则会降低培养基的浓度。湿热灭菌一般是在120℃维持20～30 min。 过滤除菌 这是利用过滤方法阻拦微生物达到除菌的目的。工业上利用此方法制备无菌空气。在产品的提取中，也可用过滤的方法（如超滤）处理料液，以得到无菌产品。 第二节 培养基灭菌 1. 微生物的死亡速率 在培养基湿热灭菌时，其中微生物受热死亡的速率是与残存的微生物数量成正比的。即  其中：培养基中的活菌个数 ：时间 ：比死亡速率 开始灭菌时，即时，培养基中活菌数为。 积分上式：＝－  或  为经过时间残留的活菌数。 若以为纵坐标，为横坐标作图，结果为一直线，其斜率为。如下图为大肠杆菌在不同温度下的残留曲线。  值越大，表明微生物越容易死亡。 2. 培养基灭菌 培养基的灭菌有分批法和连续法两种。分批灭菌是将配制好的培养基放入发酵罐中，通入蒸汽，使培养基和所有设备一起灭菌。这一过程也称为实罐灭菌。连续灭菌是在配制好的培养基向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，完成整个灭菌过程。连续灭菌时间短，灭菌温度一般高于分批灭菌，所以可减少对营养物质的破坏，灭菌效果优于分批式，但灭菌设备较复杂，投资大，而且所有设备须事先进行空罐灭菌，如发酵罐、加热器、维持罐、冷却器等。 第三节 空气除菌 微生物在繁殖和好氧性发酵过程中都需要氧，而用纯氧是没有必要的。一般是以空气作为氧源，被通入发酵系统。但空气中含有多种微生物，这些微生物一旦随着空气进入发酵系统，它们也会大量繁殖，不仅消耗大量的营养成分，还可能产生各种各样的代谢产物，影响和破坏发酵的正常进行，危害极大。因此，空气必须经过除菌后才能通入发酵液。空气除菌过程是需氧发酵过程的一项十分重要的环节。除菌的方法很多，这里着重介绍过滤除菌。 一． 空气过滤除菌流程 空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气的要求，根据空气的性质制定的。此外，也要从吸气环境的空气条件和所采用设备的特性综合考虑后设计。 对一般要求的低压无菌空气，可直接采用鼓风机增压后进入过滤器，经过一至二次过滤除菌制得。如无菌室、超净工作台等的无菌空气就是采用这一简单流程。一般深层通风发酵，除了要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还需具有一定的压力，这即是比较复杂的空气除菌流程。 空气除菌流程的要求 空气应具有一定的压力，过滤器要高效，设备尽量采用新技术，流程尽可能简化，降低动力消耗，工人操作简便，运转费用低。设备中要用无油润滑，否则有油雾，影响过滤效率。 流程分析 空压机→冷却→分油水→总过滤器→分过滤器 由于不同地区气候条件不同，发酵工厂使用的空气除菌流程有所不同。过滤器要达到高效率，就应该维持一定的气流速度，并且不能受空气中油、水的干扰。气流速度可以控制，但要除去油分和水分，则需要一系列的冷却、分离、加热等设备来保证空气的相对湿度在50～60%。 一般的过滤器用棉花和活性炭制成，活性炭夹在棉花中间。 以下为典型的设备流程 （1） 高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程（如图） 这是比较完善的空气除菌流程，对各种气候环境条件都能适应。分离水分效率较高，并能使空气在达到较低的相对湿度时进行过滤，提高了过滤效率。此流程的特点是：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却至20～25℃，经分水后加热到30～35℃，因为温度升高，相对湿度下降。 空气中的水蒸汽分压与同温度下的饱和水蒸汽压之比为相对湿度或相对湿含量：  —空气中水蒸汽分压（Pa） —同温下水的饱和蒸汽压（Pa） 每1 kg干空气中可含有水蒸汽的kg数为空气的湿含量或绝对湿含量。若Gg kg干空气含有Gw kg水蒸汽，则其湿含量为  P—空气总压强 —干空气的分压强 此式与上式合并得  例1：某除菌流程，空气压力为4 atm（表压），要求空气加热到35℃时，相对湿度=60%，问第二级冷却器应至少把空气冷却到多少度？（假设冷却后的空气中不含水雾） 解：查表得35℃时空气中的饱和水蒸汽分压=5619Pa，加热前冷空气的相对湿度=100%，加热前后空气湿含量没有发生变化，，加热前后压力不变。      (Pa) 查水蒸汽分压表得知26℃水的蒸汽压力为3371Pa，即第二级冷却器至少应把空气冷却到26℃。 (2) 冷热空气直接混合式空气除菌流程（如图） 此流程适用于中等湿含量的地区。它的特点是：可省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为30～35℃，相对湿度为50～60%。 例2． 吸入的空气℃，=80%，冷却后=25℃，=100%，混合后=35℃，=60%，计算混合比（=1 kg/㎝2，=4 kg/㎝2）。 解：吸入空气的湿含量 （kg水蒸汽/kg干空气） 冷却分水后空气湿含量 (kg水蒸汽/kg干空气) 混合空气的湿含量： (kg水蒸汽/kg干空气) 设未处理的空气百分比为 则   (3) 高效前置过滤除菌流程 上述的流程都能降低低空气的相对湿度，改善过滤器的过滤条件。为了提高空气的无菌程度，也可以采用高空采风，因为高度越高，空气中微生物含量越少。一般情况下，每升高10米，空气中微生物含量减少一个数量级。所以一方面可进行高空吸风，另一方面也可以采用高效的前置过滤方法，即在压缩机前设置一台高效过滤器，这样便可降低过滤器负荷（即多次过滤），达到空气除菌的要求。 前置过滤器可采用泡沫塑料（即静电除菌）、超细纤维纸为过滤介质，并串联试用。 二． 对数穿透定律 对数穿透定律 通过滤层杂质数是随滤层厚度的增加而减少的，即  ：过滤常数或除菌常数。 =- =- = 和：一定体积的空气在除菌前后的总菌数（个） ：过滤介质厚度（m） 滤层不能太厚，否则过滤阻力太大；过滤器直径不能太大，否则棉花添料不易填均匀，容易在某一地方形成短路。 穿透率：为穿透滤层的微粒数与原有微粒数的比值。 如果要求每1000次使用周期中只允许有一个杂菌通过，即经过滤后要求无菌度，则  其中 假设原有颗粒数为 (个/) 为分批发酵的时间或过滤器的无菌周期（h） 为通风量（）  —除菌效率 填充率 一般 空隙率 一般采用过滤效率为90%时的滤层厚度作为对比基准。  即微粒的90％被捕获  ∴     假设： a. 空气中微粒在滤层中为均匀递减，即每一纤维薄层除去同样百分率的杂菌。 b. 空气中的微粒与纤维表面接触后即被吸附。 c. 过滤器的过滤效率与空气中的微粒浓度无关。 d. 过滤介质每根纤维的空气流态，不因其它邻近纤维的存在而受影响。 2．对数穿透定律的校正 对数穿透定律是以上面提到的四点假设为前提推导出来的。这只符合滤层较薄的情况。但在实际中，当滤层加厚时，值不是常数。也就是说，空气在过滤时微粒含量沿滤层不是均匀递减，所以以上推出的对数穿透定律就不适合于较厚滤层的情况，需要进行校正。这里从略。 三． 过滤介质 1．棉花：品种不同，要求新鲜，纤维长而疏松，贮存时间长的话，纤维易断，易堵塞。一般，装填密度kg/m3。 2．玻璃纤维：, ％，它的阻力损失小 3．活性炭：mm， mm 此种介质强度高，表面积大，空隙大，阻力小，只有棉花阻力的。 4．超细玻璃纤维纸：  超细玻璃纤维纸是上好的无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，再以造纸法做成。该过滤为高气速过滤，气流速度越高，效率越高。但超细玻璃纤维纸强度小，易断，多用于分过滤器。为了增加强度，可添加： 木浆纤维。但效率较低； 环氧树脂； 多层复合使用。可增加强度，厚度0.25mm。 5．石棉滤板：20％石棉，80％其它纤维，厚度3～5mm，纤维短，粗，效率高。特点：不怕水，受潮不易穿孔和折断。 深层过滤器除菌机理 空气中的微生物粒子大小在，而棉花的纤维直径，形成的网孔为，滤层纤维阻碍气流前进，使其无数次改变速度和方向，绕道前进，从而引起微粒过滤层纤维产生惯性冲击，阻拦，重力沉降，布朗扩散，静电吸引等作用而使其留在纤维上。 1．惯性冲击滞留作用机理 当气流前进时遇到前面的阻碍物而突然改变方向，但颗粒由于惯性力的作用仍然沿直线运动与纤维碰撞而附着在纤维表面，此颗粒就被捕集了。 2． 拦截滞留作用机理 当气速降至以下时，惯性冲击作用已不存在，然而存在着另一种作用，即拦截作用来捕集微粒。这是因为颗粒紧紧地随着气流流动，气流改变流向时颗粒也跟着改变方向，当颗粒与纤维表面接触时就捕集了。 3． 布朗扩散滞留作用机理 有些直径微小的微粒在很慢的气速下作不规则的直线运动，这就是布朗扩散。小颗粒呈布朗运动而发生位移，当它与纤维接触就附着于纤维表面而被捕集了。前提是。 当气流速度较高时，以惯性冲击为主，而当气流速度低于一定限度时，以阻拦和扩散为主，并可认为惯性冲击不起作用。此时的气流速度称为临界速度。 第四章 酶催化反应动力学 酶催化反应的基本特征 酶是生物提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质是蛋白质，少数酶同时含有少量的糖和脂肪。在生物体内，所有的反应均在酶的催化作用下完成，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密联系。目前已知的酶多达2200种以上。根据国际生物化学协会规定的分类方法，不管酶的结构和性质如何，仅根据它所能催化反应的类型，将酶分为六大类，即氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。 作为生物催化剂的酶，它既具有一般催化剂的共性，又应具有生物催化剂的特性。 酶的催化共性 酶参与生物化学反应，它能降低反应的活化能（分子参与化学反应时所需要的最低能量），加快生化反应的速率，但它不改变反应的方向和平衡关系，即它不能改变反应的平衡常数，而只能加快反应达到平衡的速率；酶在反应过程中，其主体结构和离子价态可以发生某种变化，但在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复到原来状态。例如，过氧化氢的分解。在无催化剂存在时，该分解反应的活化能为75.31KJ/mol，在用过氧化氢酶催化时，该分解反应的活化能仅为8.37KJ/mol 酶的催化特性 （1）较高的催化效率 A 酶的分子活力：在最适宜条件下，每1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol） B 酶的催化中心活力：在单位时间内，每一个酶的催化中心所催化底物的量（mol） C 酶活力：在特定条件下，每1min能催化1mol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，或称为国际单位，用U表示。酶活力还可用比活力表示。比活力系指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。1972年国际酶学委员会提出，酶活力一律用Katal为单位，记为Kat。在特定条件下，每秒钟能催化1 mol底物转化的酶量定义为1Kat。而比活力则为每1Kg酶所具有的Katal数，即Kat/Kg。 酶的催化中心活力又常称为酶的转换数，如表4-1列出了酶催化和化学催化反应的转换数大小的比较。结果看出，酶的转换数大大高于化学催化剂，尤其在生理温度下更为明显。 表4-1 酶催化反应和化学催化反应的转换数大小的比较 催化剂 反应 转换数mol/（中心点·S） 温度℃  酶催化剂 菠萝蛋白酶 木瓜蛋白酶 胰蛋白酶 碳酸肝酶  肽的水解 肽的水解 肽的水解 羰基化合物的可逆反应  4×10-3~5×10-1 8×10-2~1×10 3×10-3~1×102 8×10-1~6×105  0~37 0~37 0~37 0~37  化学催化剂 硅胶－氧化铝 硅胶－氧化铝 二氧化钒 二氧化钒  异丙基苯裂解 异丙基苯裂解 环己烷脱氢 环己烷脱氢  3×10-8 2×104 7×10-11 1×102  25 420 25 350  根据实验测定，大部分酶的分子活力为103，最高可达106以上。可以认为，酶在常温、常压和中性条件下作为反应的催化剂，具有很高的催化效率，即有很高的催化活性。 （2）很强的专一性： 酶催化反应有很高的选择性，一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质进行某一种反应，这种特性称为酶的专一性或选择性。酶的专一性是酶作为催化剂最重要的特性，也是酶催化反应过程优于一般化学反应过程的最重要的理由之一。 一种酶若只能催化一种化合物进行一种反应，这种专一性称为绝对专一性，如脲酶只能催化尿素水解生成CO2和H2O。若一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应，这种专一性称为相对专一性，如脂肪酶可以催化所有酯类化合物水解。若一种酶只能催化某化合物在热力学上可能进行的许多反应中的一种反应，这种专一性称为酶的反应专一性，具有不同反应专一性的酶只各自催化不同的反应。如，对同一反应物葡萄糖，以葡萄糖氧化酶为催化剂可得葡萄糖酸；以葡萄糖异构酶为催化剂可得果糖；以己糖激酶为催化剂可得葡萄糖-6-磷酸。绝大多数的酶都具有反应专一性。一种酶只能催化一种底物，则称为酶的底物专一性；一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种，则称为立体专一性。此外，还有官能团专一性、序列专一性等。利用酶催化的这种高度的多种专一性，有可能制备出化学催化反应所不能得到的化合物，这也有利于提高产物的分离纯度。 （3）具有温和的反应条件 酶催化反应温度一般在生理温度25~37℃的范围，仅有少数酶反应可在较高温度下进行。同时，酶催化反应一般是在接近中性的pH值条件下进行。 （4）易变性与失活 酶的化学本质是蛋白质，因而具有蛋白质的所有性质。其中，容易变性的性质，使得酶在应用时，常因变性而使活力下降，甚至完全失去活力，即失活。酶的变性多数为不可逆。引起变性的原因有物理因素及化学因素。物理因素包括热、紫外线、x射线、声波等。化学因素包括酸、碱、表面活性剂、重金属盐等化学药品的影响。因而产生了诸如热变性、酸碱变性、氧化变性等。 此外，酶作为催化剂还存在着酶的提取工艺繁琐，成本昂贵，以及目前大多数酶催化反应还只能在水溶液中进行的不足。 第二节 简单的酶催化反应动力学 简单的酶催化反应动力学是指由一种反应物(底物)参与的不可逆反应。属于此类反应的有酶催化的水解反应和异构化反应。这种简单的单底物酶反应动力学，是酶反应动力学的基础。 Michaelis-Menten 方程 对酶催化反应过程的机理，得到大量实验结果支持的是活性中间复合物学说，该学说认为酶催化反应至少包括两步，首先是底物S和酶E相结合形成中间复合物[ES]，然后该复合物分解成产物P，并释放出酶E。 例如：酶反应  其反应机理可表示为  E：游离酶 ES：酶底物复合物 S：底物 P：产物， K+1，K-1，K+2 ：反应速率常数。 根据化学动力学，反应速率通常以单位时间、单位反应体系中某一组分的变量来表示。对均相酶的催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。因此，上述反应的速率可表示为   rs：底物S的消耗速率（mol/L﹒s） rp：产物P生成速率（mol/L﹒s） v：反应体系的体积（L） ns、np：底物S和产物P的质量（mol） t：时间（s） 对于底物S，随着反应的进行，其量由于消耗而减少，即时间导数﹤0，因此用S来计算反应速率时，需加一负号，以使反应速率恒为正值。而P产物相反，﹥0，不需加负号。根据质量作用定律，P的生成速率可表示为：  [ES]为中间复合物ES的浓度 [ES]为一难测定的未知量，因而不能用它来表示最终的速率方程。 L.Michaelis和M.L.Menten在推导该方程时，曾提出下述假设： （1）与底物浓度[S]相比，酶的浓度 [E]很小，因而可忽略由于生成中间复合物ES而消耗的底物。 （2）不考虑这个逆反应的存在。若要忽略该反应的存在，则必须是产物P为零，换言之，该方程适用于反应的初始状态。 （3）认为基元反应的反应速率最慢，为该反应速率的控制步骤，而这一反应速率最快，并很快达到平衡状态。因此上述假设又称为“平衡假设” 。 速率控制步骤在反应动力学中是一个重要的概念。在一个多步骤的反应体系中，其中反应速率最快的一步称为速率的控制步骤，并且控制步骤的速率决定了该反应的速率。 根据上述假定（3），可列出   K S 为解离常数（mol/l） 反应体系中酶的总浓度为    代入  ………………（1） rp,max：P的最大生成速率 [E0]：酶的总浓度，亦为酶的初始浓度 上式即为米氏方程或称M—M方程。 G．E．Briggs和J．B．Haldane对上述第三点假设进行修正，提出了“拟稳态”假设。他们认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化，“拟稳态”假设是从反应机理推导动力学方程的又一重要假设。   消去得 ………………（2） km：米氏常数(mol/l) km与ks的关系为  从式（1）和式（2）可见，由两种推导方法所得速率方程式形式基本相同，不同的是ks值代表反应的平衡常数，而km值称为米氏常数，它代表动态的平衡常数，表示实际的恒态时的浓率关系。 当<<时，km值才接近于ks km是酶的特征性常数，测定km值具有重要的意义。km值代表反应速率为最大反应速率一半时的基质浓度，其单位为浓度单位。  图4-1 km值是酶的一个很基本的特性常数，它和酶的浓度无关，但和温度、pH等因素有关。 根据km值可以推断酶和底物的亲和力。如果酶的专一性不高，可催化几种底物发生反应时，km值最小的就表示酶与这一底物的亲和力最大，反之，则最小。  图4-2 根据km值，可以估计胞内基质浓度，如<<时，。那么只要稍微改变基质浓度，的变化就很大，即反应速率对基质浓度改变的敏感性很大，如果或时，基质浓度相差1000倍，但反应速率只增加一倍，即在生理上保持>>是没有意义的。 另一个动力学参数为最大反应速率，根据定义，，它表示当全部的酶都是复合物状态时的反应速率。k+2表示单位时间内一个酶分子所能催化底物发生反应的分子数。因此它表示了酶催化反应能力的大小，不同的酶催化反应，其值不同。 上述M—M方程所描述的反应是最简单的单底物无抑制的不可逆反应，即，因此应存在有下述关系   为了表述方便，最大反应速率一般用rmax表示。 从~[S]图的关系曲线可以看出，该曲线表示了三个不同的动力学特点的区域。 当<<，即底物浓度比km值小很多时，该曲线近似为一条直线，这表示反应速率与底物浓度近似正比关系，此时酶催化反应可近似看作一级反应。  式中为总反应的一级反应常数。 这是因为当km值很大时，大部分酶为游离态的酶，而[ES]的量很少。若要提高反应速率，只有通过提高[S]值，进而提高[ES]，才能使反应速率加快。因而此时的反应速率主要取决于底物浓度的变化。    或  k值可以表示瞬时时间内基质转化为产物的份数，或在瞬时时间内有多少份数的基质转化为产物。     ：底物的初始浓度(mol/l) 或  其中（）  当>>时，该曲线近似为一水平线，表示当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。此时，酶催化反应可视为零级反应，反应速率将不随底物浓度的变化而变化。这是因为当km值很小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内游离的酶很少。所以即使提高底物浓度，也不能提高其反应速率。 ∴  即  或  当[S]与km的数量关系处于上述两者之间的范围时，则符合M—M方程所表示的关系式。 例？：有一均相酶催化反应，km值为2×10-3mol/l，当底物的初始浓度[S0]为1×10-5mol/l时，若反应进行1 min，则有2%的底物转化为产物。试求：（1）当反应进行了3 min，底物转化为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别为多少？（2）当[S0]为1×10-6mol/l时，也反应了3 min，底物和产物的浓度又是多少？（3）最大反应速率rmax值为多少？ 解：（1）根据题意，﹤，此时一般可认为按一级反应处理，其动力学方程可表示为：  时，  ∴ mol/l 将已知数据代入上式中，求得 min-1 当 min时，可以求得 mol/l xS=6 % mol/l （2）当mol/l时，仍可视为一级反应， ∴t=3 min时，同样可求得 xS=6 % mol/l mol/l （3）据 得 mol/l·min 酶动力学图解法 要建立一个完整的动力学方程，必须通过动力学实验确定其动力学参数。对Michaelis-Menten方程，就是要确定rmax（或k+2）和km值。但直接应用Michaelis-Menten方程求取动力学参数所遇到的主要困难在于该方程为非线性方程。为此常将该方程加以线性化，通过作图法直接求取动力学参数。应该指出，这种方法虽然简单，但准确程度较差，通常有下述几种作图方法。 1. 双倒数图解法（Lineweaver Burk图解） 由Michaelis-Menten方程式的曲线图可看出，按对应于作图不可能精确地确定的数值，因为最高值是渐近线的极限值，如将Michaelis- Menten方程变化为  以值对应于作图，就得到如图所示的直线。  图4-3 Lineweaver Burk 采用这种作用法时，注意所选用的基质浓度须在值的附近。如果选用的基质浓度远远大于值，则直线斜率很小。如果选用的基质浓度远远小于值，则直线几乎与纵轴平行，因而测定及值均困难。 双倒数法应用广泛，但由两个缺点。一为选用基质浓度不宜等量增加，否则在作图时，点都会集中在纵轴附近，难于正确作图。机制浓度以选用1.0、1.11、1.25、1.43、1.67、2.0、2.5、3.33，5和10等为宜，这样的倒数值几乎是等量递增的。另一缺点为反应速率测定稍有误差，其倒数值必将误差扩大，特别是的低浓度基质测定时，引起的误差更大，这样将影响直线斜率，影响及的测定。 2. 图解法（Hanes Woolf图解）  以为纵坐标，为横坐标，此方程为一直线方程，直线斜率为，与纵轴交点为，与横轴交点为。  图4-4 本作图法适用于处理基质浓度等量递增的数据，但在选择基质浓度时，也要注意，浓度须在的附近。 3. 图解法（Woolf- Augustinesson Hofstee图解）  上式为直线方程式，为纵坐标，为横坐标，直线的斜率为，与纵坐标交于，于横坐标交于，根据直线与两坐标的交点可求出及值，但在选用基质浓度时，也须注意，要在值的附近。  4. 图解法（Eadle Scatchard图解）  此直线方程式，斜率为，与坐标交于，与坐标交于。 5. Henri Michaelis Menten积分方程式 有时在酶反应过程中，基质或产物的浓度可以测得，但反应初速度则难以测定。这时，就可选用积分方程式来测定酶的及值。     式中：为时间时的基质浓度 为时间内所用去的基质浓度，也为时间内所生成的产物浓度。 上式可改写为  上式也是直线方程式，斜率为，直线交点于纵坐标，与横坐标交于。 例4-1：在pH=5.1，15℃时测得葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的初速度为：  5.55 8.33 11.11 13.69 16.66 22.22 27.77  1.63 2.11 2.41 2.76 3.01 3.39 3.47 试从测定结果求这个酶反应的和值。 解：从表及值，计算得及值，作图。从连接各点所得的直线，求得,。 图 第三节 有抑制的酶催化反应动力学 简单酶催化反应动力学有一个显著的特点，即反应速率与底物浓度的关系是一种简单增加的函数关系。而实际上有些酶的催化反应，由于底物浓度过高，其反应速率反而会下降，这种效应称为底物抑制作用。更为重要的是，在酶催化反应中，由于某些外源化合物的存在而使反应速率下降，这种物质称为抑制剂。 抑制作用分为可逆抑制和不可逆抑制两大类。如果某种抑制可用诸如透析或超滤等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，则此类抑制称为可逆抑制。此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如重金属离子Hg2+、Pb2+等对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的抑制都是不可逆抑制。 根据产生抑制的机理不同，可逆抑制分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合性抑制。 竞争性抑制动力学 若在反应体系中存在着与底物结构相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降，这种抑制为竞争性抑制，该物质为竞争性抑制剂。其主要特点是，抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合后，底物就不再与酶结合，反之亦然。在琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸成为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。 竞争性抑制剂的机理式为   式中：I为抑制剂 EI为非活性复合物 底物的反应速率方程为   又：  经整理后可得  KI—抑制剂的解离常数 （mol/l） KmI—有竞争性抑制时的米氏常数（mol/l）。 可以看出，竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变，rmax不受竞争性抑制剂的影响。由于有抑制剂的存在，须有较高的基质浓度，才能维持一定的rmax值。 竞争性抑制剂的抑制程度取决于[S]，[I]，Km和KmI，当[I]增加，或KI减小，都会使KmI值增大，使酶与底物的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应速率下降。若[I]不变，增加[S]，抑制程度降低；若[S]不变，增加[I]，抑制程度增加。在一定的[S]和[I]条件下，KI值越低，抑制程度越大。  图4-5 竞争性抑制的双倒数方程式  或  以对作图，得一直线，其斜率为，与纵坐标的交点为，与横坐标的交点为。  图4-6 竞争性抑制的L-B图 又  以对作图，据此图可求出和值  图4-7 竞争性抑制的KI与I关系图 抑制剂的解离常数  由此可看出，愈小，表明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶催化反应能力的抑制作用就越强。 当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，与的关系为一直线，可称为线型竞争抑制；如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相结合，则与的关系为一抛物线，可称为抛物线型竞争抑制。 例4-2：在一定的酶浓度、pH和温度条件下，没有催化剂时，酶催化反的反应速率为；当抑制剂浓度为5×10-3M时，酶反应速率为，底物浓度与对应的反应结果如下表，求、、值。  1.25 1.00 0.75 0.50  (任意单位) 151 138 118 93  （任意单位） 83.9 72.4 58.8 41.9  解：根据数据作图。有抑制剂时，抑制作用为竞争性抑制 图     非竞争性抑制动力学 若抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制为非竞争性抑制。此时抑制剂既可与游离的酶相结合，也可以与复合物相结合，生成底物-酶-抑制剂的复合物。绝大多数的情况是复合物为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。此外，还有一种三元复合物也能分解为产物，但对酶的催化反应速率仍然产生抑制作用。如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶的抑制就属于非竞争性抑制。 非竞争性抑制的普遍机理式        式中：为非竞争性抑制时的最大反应速率。 对非竞争性抑制，由于抑制剂的作用使最大反应速率降低了倍，并且增加、减小都使其抑制程度增加。此时对的关系如图。  图4-7 根据L—B作图法，上式可整理成  或  以作图，可得一直线，并求出和值。  图4-8 又根据式  可通过实验测得不同下的，进而确定值。 如果也能分解为产物，,同样可整理出形式与类似的速率方程式，所不同的只是所包含的参数上。如何判断复合物是否分解为产物，可通过改变抑制剂用量并测定底物的反应速率来判断。当增加到某一程度，减小直至趋于0，则为不能分解为产物；如果随着的增加，趋于一定值，则为能分解为产物。 非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点是：对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂的影响可减弱；而对非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。从这个意义上说，竞争性抑制作用是可逆的，非竞争性抑制作用是不可逆的。 例4-3：水杨酸抑制谷氨酸脱氢酶催化的脱氢反应。试根据下列实验结果确定抑制类型和及值。又脱氢反应速度r的单位是根据340 nm波长下光吸收速率的增加来表示的。 谷氨酸脱氢酶的反应结果 谷氨酸，mmol  （含40mmol水杨酸）  1.5 0.21 0.08  2.0 0.25 0.10  3.0 0.28 0.12  4.0 0.33 0.13  8.0 0.44 0.16  16.0 0.40 0.18  解：以对和以对作图结果如图所示。显然从图中可以看出反应为非竞争性抑制。 从横坐标截距得mol； 从纵坐标截距得 把和/min代入，得mmol。 图4-9 反竞争性抑制动力学 反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物相结合，生成复合物。如肼对芳香基硫酸酯酶的抑制作用就属此类。机理式为   据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得其速率方程为  式中：    以对作图  图4-10 据L—B作图法，方程为  以对作图，并利用该图求取动力学参数。  图4-11 直线斜率为与纵坐标交点为；与横坐标交点为，在不同的浓度下得一系列平行线。在饱和抑制剂浓度下，反应速率几乎为0。若以～作图，或以～作图，均为直线。 四．线形混合型抑制动力学 线形混合型的最简单机制可表示为：     上式基本上与非竞争性抑制的模型相同，可不同的是，当与结合生成时，由于抑制剂的存在影响了与的结合，因而其解离常数由变为，同样与结合时，其解离常数由变为。 上式中：   根据上述机理式，可推出其速率方程为  对此种抑制，   式中为和的修正系数。当，时，上述抑制实为非竞争性抑制。 以上介绍了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制及混合型抑制的动力学方程，虽然各具特点，但可用一普遍化的机制和公式来表示。 普遍化的机制可用下图表示：  图4-12 酶催化反应的普遍化机制图 若无存在，则为竞争性抑制；若和与有同等的结合力，且无反应活性，则为非竞争性抑制；若无存在，且无反应活性，则为反竞争性抑制。 普遍化的公式为  式中：和分别为与和与相结合形成的解离常数。 当时，为非竞争性抑制；当时为竞争性抑制，当时为反竞争性抑制，当且均为常数值时，称为混合抑制。 例4-4：某酶的值为4.7×10-5 mol/L ，如果值为2.2×10-5mol/L·min，在底物浓度为2×10-4mol/L和在（1）竞争性抑制剂与（2）非竞争性抑制剂的浓度均为5×10-4mol/L情况下，其反应速率分别为多大？假定在上述情况下值均为3×10-4mol/L，则在上述两种抑制情况下的抑制程度各有多大？ 解：（1）对竞争性抑制，可列出下式   （2）对非竞争性抑制，可列出下式  mol/L·min （3）求抑制程度 当无抑制剂存在时的反应速率为  mol/L·min 所以上述两种抑制的抑制程度应分别为 竞争性抑制 非竞争性抑制  五．底物的抑制动力学 有些酶催化反应，在底物浓度增加时，反应速率反而会下降，这种由底物浓度增大而引起反应速率下降的作用称为底物抑制作用。反应机理式为   为不具有催化反应活性，不能分解为产物的三元复合物。应用稳态法处理，可得到底物抑制的酶催化反应动力学方程为   其中：为底物抑制的反应速率mol/l?s  为底物抑制的解离常数mol/l 该式与反竞争性抑制方程类似。 当底物抑制时，与的关系表示在图4-13中。 [S] 图4-13 速率曲线有一最大值，即为最大底物消耗速率。相对应的底物浓度值可通过下式求出 在点（）处可微分且有极值，则   为最佳底物浓度 第四节 复杂的酶催化反应动力学 复杂的酶催化反应包括可逆反应、多底物反应和产物抑制等。 可逆酶反应动力学 有些酶催化反应的逆反应相当明显，反应进行到一定程度即达到平衡状态。如木糖异构酶催化葡萄糖为果糖的反应。 以最简单的单底物可逆酶反应为例，其反应机理可表示为  若将生成反应看作正反应，其速率为  若将生成反应视为逆反应，其速率为  反应的净速率则为  根据稳态假设和物料平衡关系，并令     和分别为正、逆反应的米氏常数。和分别为正、逆反应的最大速率。 反应的净速率式为  若令：为反应平衡常数， 则  由上式可看出，当存在有逆反应时，反应的净速率下降。对木糖异构酶催化葡萄糖成为果糖反应的值为0.92～1.15，得到的最终产品中葡萄糖和果糖大致各占一半。该混合物称为果葡糖浆或异构糖。现已工业化生产。 产物抑制的酶反应动力学 与上述可逆反应不同，产物抑制系指当产物与酶形成复合物后，就停止继续进行反应的情况，特别是当产物浓度较高时有可能出现这种抑制。其反应机理式为   其中为无活性的端点复合物 应用稳态法推导出下列反应速率方程式   ，称为产物抑制解离常数。 与无抑制相比较，最大反应速率值不变，米氏常数增大了倍，同竞争性抑制一样，使反应速率下降。 多底物酶反应动力学 以上描述的都是指单底物的酶催化反应，而实际的酶催化反应是很复杂的。 对于一般的酶催化反应可用下列通式表示：  在这种情况下，动力学方程中包含有、、…及、、…的浓度项，因而非常复杂，动力学参数也很多。属于这类多底物的酶有氧化酶、转移酶、连接酶等。这里仅涉及双底物酶催化反应的动力学。 对双底物酶催化反应的机理，一般认为要让两个底物同时与酶活性部位相结合形成复合物似乎不太可能，而是双底物酶反应系统中复合物的形成有三种最简单的情况，即随机机制、顺序机制和乒乓机制。 随机机制 两个底物和随机地与酶相结合，产物和也随机地释放出来。许多激酶类的催化机制属于此种。其机理可表示为      反应速率可表示为  当假定恒定时，经推导可得  其中    当假定恒定时，同样可推导得  其中   解离常数：    顺序机制 两个底物和与酶结合形成复合物是有顺序的，酶先与底物结合形成复合物，然后再与结合形成具有催化活性的。按同样的方法推导出下列方程式  式中的：为单底物时的米氏常数； ：浓度饱和时，的米氏常数； ：浓度饱和时，的米氏常数。 大部分脱氢酶属于顺序机制。 3．乒乓机制 最主要的特点是底物和始终不同时与酶结合，其机理式     式中为修改过的酶。这种构型的修改有利于酶与相结合。当生成第二个产物以后，酶又从恢复到构型，以有利于与相结合其速率方程式为 第一节 酶的失活动力学 酶是一种不稳定的物质，常因温度、pH等因素的影响而产生不可逆的活性下降。一般是胞外酶较为稳定，而胞内酶在外部环境中容易失活。酶在保存和参与反应时均可能失活。前者的失活又称为稳定性。在使用时酶的失活规律对于酶催化反应过程的设计和控制都是十分重要的。其中酶的热失活，或称作热变性是最重要的一种酶失活形式。 一、 未反应时的热失活动力学 了解未反应时酶的热稳定性关系到酶的保存。测定酶的未反应时的热稳定的方法，是在一定条件下，使酶溶液恒温保持一定的时间，然后在最适宜的pH和温度下测定残存的酶活力，即残存酶活。在不同温度下反复测定，即可得到一条曲线。该曲线可以表示的酶失活特性，称为酶的热稳定性。若改变保温时间，则会得到不同的稳定曲线。  图4-14 酶的热稳定性（图中数字为恒温失活时间） 如要了解酶在未反应时的失活速率，可将残存的酶活性对其失活时间作图，则又可得到一条曲线，该曲线称为失活曲线。  图4-15 葡萄糖淀粉酶的失活曲线 这些曲线反映了酶的真正热稳定性。酶的热变性失活很复杂。一般将其分为可逆失活与不可逆失活两大类，并提出了多种失活动力学模型。下面主要介绍一步失活模型。 该模型又称为一级失活模型。以和分别表示活性酶与失活酶，则失活反应方程式可表示为  和分别表示正、逆反应的速率常数。 时间为时，活性酶的浓度为，则活性酶的浓度随时间的净减少速率为  系统中酶的总浓度若以表示，则存在下式  为失活的酶浓度。 代入上式，并利用初始条件， ，经整理可得下式  对不可逆失活反应，。因此  多数酶的热失活服从上式，可称为衰变常数，单位为。的倒数称为时间常数。当为的一半的时间称为半衰期。用表示。、和之间的关系为  二、反应时酶的热失活动力学 反应时酶的稳定性将直接关系到酶的使用寿命，因而特别重要。酶在反应中的稳定性称为操作稳定性。 假如做不同温度下反应转化率随时间的变化曲线，即反应过程曲线，可得到如图所示的结果。从图中可以看出，在时间一定时，随着温度的升高，反应速率在增大，因而转化率在提高；但当温度高到某一数值时，其转化率反而下降。这时因为当温度升高到某一值，酶的热失活速率也在加速，致使活性酶的量在减少，因而反应速率下降，最终为0。又从图中曲线可看出，对某一反应时间，就有一转化率最高的温度，该温度称为最佳温度。不同的反应时间，有不同的最佳温度。最佳温度是温度对酶催化速率和酶失活速率双重作用的结果。  图4-16 不同温度下的酶反应过程曲线 （a）以温度T为参数，转化率X与时间t的关系曲线 （b）以时间t为参数，转化率X温度T的关系曲线 在酶的催化反应时，由于有底物和产物的存在，使酶的稳定性或者得到了加强，或者又有所减弱。 对于底物浓度的变化对酶稳定性的影响，提出了下述模型。  根据上述机理可看出，无论是游离酶还是酶的复合物均有可能失活，其失活速率方程可表示为  式中   其中为底物对酶稳定性的影响系数。 为游离酶浓度。 根据上述模型可知： ①时，底物对酶失活没有影响； ②时，酶完全被底物所保护，复合物完全不失活，此时只有游离酶失活； ③时，底物对酶有部分保护作用，能在一定程度上抑制酶的失活； ④时，底物加速酶的失活。 第五章 微生物生长动力学 微生物生长的基本特征 微生物一般包括细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体、支原体和病毒等。在微生物反应过程中，这些微小的微生物却扮演着重要的角色。首先，微生物是反应过程的生物催化剂，他摄取原料中的养分，通过其体内的特定酶系进行复杂化反应，把原料转为有用的产品；同时，它又如同一个微小的容器，原料中的反应物透过微生物细胞周围的细胞壁和细胞膜进入微生物体内，在酶的作用下进行化反应，把反应物转化为产物，接着这些产物又被释放出来。因此，微生物的特征和它在微生物反应过程中的数量变化将是影响微生物反应过程的关键因素。 在微生物细胞的生长过程中，细胞的形态、结构、活性都出在一动态过程中。例如，在反应过程中细胞要经历生长、繁殖、维持、死亡等阶段，不同的菌龄，有不同的活性。从细胞组成分析，它含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸等，这些细胞的基本组成部分含量的大小也随环境的变化而变化。当然，反应系统中各种环境条件也处在动态变化中，如S、P。那将在发酵动力学一章中再作介绍。 微生物生长动力学 微生物生长动力学是研究微生物生长过程的速率及其影响速率的因素，从而获得有关信息。这是细胞水品上的研究。 一、生长现象与繁殖方式 根据微生物的个体形态、群体形态、生理特征、生化反应等生物学特征，微生物可分为成三大类：第一类：非细胞型微生物学（病毒）；第二类是原核细胞型微生物，仅原始细胞核，如细菌、放线菌等；第三类是真核细胞型微生物，霉菌、酵母菌和单细胞藻类，原生动物。 表1 类 别 生长特征 繁殖方式  细菌 个体增重和增大 分裂繁殖  放线菌、霉菌 菌丝伸长和分支 放线菌----无性孢子 霉菌----无性孢子、有性孢子  酵母菌 个体增重和增大 出芽生殖  二、生长的测定： 微生物的生长和产物的生成有着密切的关系，因此生长的测定对发酵的控制很重要。微生物的个体生长，特别是单细胞微生物的个体生长很难测定，而且实用意义不大。微生物的生长可由群体的细胞总重或数目的增加来体现。因此微生物生长的测定，通常是测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小。当培养液复杂，生长测定受到死菌体或培养液干扰而不可能用直接方法测定时，可借助间接方法进行生长测定。 生长测定的方法很多，没有一种通用的方法。为此，在选择测定方法时，除注意测定结果的有效程度外，应注重测定的指标，如细胞总重，细胞数目，代谢活动情况等。生长测定的常用理化方法，分测定细胞数和细胞重量两类。 定细胞数目： （1）、浊度计比浊法 这是测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数量的生长测定法，此法简单而快速，但只适用于色浅和其它悬粒极少的悬浮液测定。由于悬浮液浓度只有一定范围内与光穿透的量成反比，所以应事先将悬浮液浓度控制在一定的范围。 （2）计数器计数法： 这是在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长测定法。此法速度快，若用活体染色剂（亚甲基蓝）染色还可测出活菌数。由于细菌很小，且酵母菌和霉菌不能形成离散的细胞，因此要精确测定细胞数比较困难。 测定细胞重量 （1）细胞干重称量法： 这是直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量的生长测定方法。此法直接可靠，较适用于丝状菌的生长测定。此法必须清除非细胞固体物质。如果培养液中存在大量碳酸钙，纤维素等在细胞洗涤时难以除去的物质，应尽量在细胞重量比杂质重量大得多的条件下测定，即要求被测的菌体细胞浓度较高。 （2）细胞堆积容积测量法： 这是用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积。由此间接表示细胞重量的生长测定法。此法是实际生产中常用的方法。由于细胞密度随时间的变化很小（1.05-1.1）。而且细胞比其他固体物沉降慢，可凭经验直观将二者区别，因而具有一定的正确性。 （3）细胞组成分析法 这是测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等)，间接地算出细胞重量的生长测定法。此法测定大分子物质较正确，尤其用双缩脲反应测定蛋白质简单而快速。由于这些大分子物质的比例在细胞中随着时间变化，因此所选被测样的菌体应处于对数生长期，此时生长速度恒定，细胞组成也恒定。 Lowrey法：可检出10微克级蛋白质，易受葡萄糖尿素干扰 ； 双缩脲法：可检出毫克级蛋白质，受多肽的影响； （4）营养物消耗分析法 这是测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物（磷酸盐、硫酸盐等）的消耗，由此间接表示细胞重量的生长测定法。此法还适用于菌体细胞是主要产物时生长的测定，可由磷源和氧的消耗间接地表示细胞重量。 （5）产物重量分析法 这是测定培养中途形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间接地换算出细胞重量的生长测定法。例如：一般细菌细胞的ATP含量大约是1mgATP/g干细菌细胞，因此测定中间产物ATP便可算出细胞重量。 3、生长的测定还有其它一些理化方法和活菌平板计数法。 无论是用种何种方法，首先是保证一定的有效程度，其次还需要快速、简便，否则实际应用将受到限制。 三、微生物生长动力学 1、微生物生长曲线 微生物生长动力学可反映出细胞适应环境变化的能力。这也是我们学习研究生长动力学的原因。对微生物生长的研究不仅包括活细胞,也包括衰老和濒于死亡的细胞因为微生物产品往往是在衰亡或濒于死亡时大量产生的。 细胞的生长过程，根据均衡生长模型的假设，可以用细胞浓度的变化来描述和表达。若取细胞浓度的对数值与细胞生长时间对应作图，可得到分批培养时的细胞浓度变化曲线。 从该曲线的变化分析，分批培养时细胞的浓度变化可分为延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期等五个阶段。 延迟期系指培养基接种后，细胞浓度在一段时间内无明显增加的这—阶段。它是细胞在环境改变后表现出来的一个适应阶段。如果新培养基中含有较丰富的某种营养物质，而在老环境中则缺乏这种物质，细胞在新环境中就必须合成有关的酶来利用该物质，从而表现出延迟期。许多胞内酶需要辅酶或活化剂，它们又是一些小分子或离子，具有较大通过细胞膜的能力，当细胞转移到新环境时，这些物质可能因扩散作用从细胞中向外流失，这也是产生延迟期的一个原因。延迟期长短与菌种的种龄有关，年青的种子延迟期短，年龄老的种子延迟期长。对于相同种龄的种子，接种量愈大延迟期愈短。 指数生长期，又称对数期，在此阶段中，培养基中营养物质较充分，细胞的生长不受限制，细胞浓度随时间呈指数生长。由于在此阶段，细胞分裂繁殖最为旺盛，生理活性最高。因此在工业微生物反应中，常转接处于指数生长期中期的细胞，以保证转接后细胞能迅速生 长，微生物反应能快速进行。 减速期的存在是由于当细胞大量生长后，培养基中营养物质大量消耗，加上有害代谢物质的积累，细胞的生长速率开始减缓，从而进入减速期。 静止期是由于营养物质已耗尽或有害物质的大量积累，使细胞浓度不再增加。静止期内的细胞浓度为最大浓度。 衰亡期是由于环境恶化，细胞开始死亡，活细胞浓度下降，细胞生长速率为负值。 从上述分析来看，细胞的生长可分为多个不同的阶段，每个阶段都有自己的动力学特点。其中尤以指数生长期和减速期最为重要。  2、微生物生长动力学 比生长速率：微生物生长特点表现为细胞数目或细胞物质（量）增加一倍所需时间。细胞物质（量）增加一倍的时间可能不同与细胞数目增加一倍的时间，因为细胞数目不增加，细胞质量也能增长。若在给定条件下，细胞物质或细胞数增长一倍的时间间隔时常数，则微生物是以指数速度增长，这种条件下可用数学模型来描述。  (5-1)  或  （5-2） ：比生长速率 ：比生长速率 ：细胞浓度(g/L) ：每升细胞数 式（5-1）表明细胞物质随时间而增加，同时式（5-2）说明细胞数目随时间增加而增加。而在大多数情况下生长是以物质的增加来衡量的，因而符号得到应用。Μx为单位体积生长速率，以g/L表示。将式（5-1）积分：  若μ为常数，上式可得： 此式可在△t=td时求得，td即在时所需时间，于是td=ln2/μ=0.693/μ 例5-1 某微生物的μ＝0.125 h-1 ，求td。 解： td=0.639/0.125=50544 h 在微生物培养过程中，菌体浓度的生长速率是菌体浓度、基质浓度和抑制剂浓度的函数，即dx/dt=f( X.S.I) 式（5-1）或（5-2）表明菌体浓度的增长速率与培养液中菌体浓度成比。 比生长速率的意义： 比生长速率就是菌体繁殖速率与培养基中菌体浓度之比，它与微生物的生命活动有联系。  在对数生长期，是一个常数，这时 (2) 无抑制的细胞生长动力学一——Monod方程 现代细胞生长动力学的奠基人Monod早在1942年就指出，细胞的比生长速率与限制性基质浓度的关系可用下式表示：  该方程称为Monod方程，它在形式上与酶催化动力学的M—M方程相似，但Monod方程是从经验得出的，常称为形式动力学，而M—M方程则是从反应机理推导的。该方程中u为比生长速率(s-1)；umax为最大比生长速率(s-1)，Cs为限制性基质浓度(g／L)；Ks为饱和常数(g/L)，其值等于比生长速率恰为最大比生长速率的一半时的限制性基质浓度。 Monod方程是典型的均衡生长模型，其基本假设如下。 ① 细胞的生长为均衡式生长，因此描述细胞生长的唯一变量是细胞的浓度； 培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其它组分为过量不影响细胞的生长； ③ 细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。 根据Monod模型方程，其u与Cs的关系如图4—6所示。  当限制性基质浓度很低时，CS《Ks，此时若提高限制性基质浓度，可以明显提高细胞的生长速率。此时有：  细胞比生长速率与基质浓度为一级动力学关系。 当Cs》Ks时，u=umax，若继续提高基质浓度，细胞生长速率基本不变。此时细胞比生长速率与基质浓度无关，为零级动力学特点。 不同的菌种，不同的培养基，Ks和μm是不同的，我们可从下表看出： 微生物 限制生长基质 Ks μm（hr）  大肠杆菌 葡萄糖 0.22 /  大肠杆菌 乳糖 0.58 /  啤酒酵母 乳糖 2.6~3.0 0.18  啤酒酵母 葡萄糖 0.56 /  纤维素分解素 葡萄糖 0.86 0.125  固氮素 葡萄糖 0.16~0.33 0.13  青霉素 氧气 0.007 0.35  Μm值基本接近，是同一个数量级。Ks和μm值不仅随菌种而异，对不同的限制性基质也不同。 又根据式(4—13)，可得到下述细胞的生长速率公式。  Monod方程虽然表述简单，但它不足以完整地说明复杂的生化反应过程，并且已发现它在某些情况与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程,归纳于表4—2中。这里仅对若干方程加以说明。 在方程(4—29)中。Powell考虑到细胞壁的渗透性，基质的扩散和细胞的大小诸因子，引入了KD因子，称为扩散阻力常数。 实验结果表明，Monod模型中u达到其渐近线的速度太慢，以致不能较好地拟合实验数据。而方程(4—26)和(4—30)则能较好地拟合实验数据。 Moser根据细胞生长是基质浓度的函数这一基本特性出发，为了有利于比较动力学实验数据，提出了更为普遍化的模型。 首先认为，u随Cs变化的推动力是来源于(umax-u)的值，故可有下式存在。  第六章 发酵动力学与发酵过程控制 生物反应动力学是研究生物反应过程的速率及其影响因素，这是生物反应工程学的理论基础之一。这里所涉及的生物反应过程动力学包括两个层次的动力学，一是本征动力学，又称微观动力学，它是指没有传递等工程因素影响时，生物反应固有的速率。该速率除反应本身的特性外，只与各反应组分的浓度、温度、催化剂及溶剂性质有关，而与传递因素无关；二是宏观动力学，又可称为反应器动力学，它是指在一反应器内所观测得到的总反应速率及其影响因素，这些影响因素包括反应器的形式和结构、操作方式、物料的流动与混合、传质与传热等。 用于生物反应过程的复杂性，给生物反应动力学带来了多样性。例如对酶催化反应，反应动力学可表达为分子水平动力学；对微生物发酵反应，其动力学可在细胞水平上表达；对废水的生物处理，则可表达为群体动力学。每个表达水平都有其独特特征，这些特征需要有其特有的动力学处理方法。 第一节 发酵动力学 发酵动力学是研究各种环境因素与微生物代谢活动之间的相互作用随时间而变化的规律的科学。用数学模型定量地表达发酵过程中各种与生长、基质代谢、产物生成有关的因素，是发酵动力学研究的重要方法。研究发酵动力学的目的在于按人们的需要控制发酵过程，而该动力学则要考虑到产品增长速率、菌体增长速率、基质消耗速率，以及影响增长速率的因素。 产物合成动力学 前面已从简单的一级反应速率方程出发描述了微生物的生长，下面根据化学计量关系把它和基质的消耗联系起来。由于代谢产物的形成也与基质的消耗有关，而且产物的形成是微生物代谢活动的结果，因此，微生物生长和产物形成都与营养基质的利用密切相关，并且取决于微生物的自身代谢调节作用。 在连续培养的条件下，由生长、基质利用和产物形成的物料平衡方程，可以看出产物的形成与生长和细胞浓度的关系： 生长  （6－1） 即：细胞量的积累速率 = 细胞生长速率－细胞的消失速率。 —菌体浓度 —比生长速率 —培养液移走速率 —培养液体积 基质的利用  （6－2） 即：基质的消耗速率 = 补料中基质的添加速率－生长消耗的基质速率－产物合成用去的基质速率－维持所消耗的基质速率－基质的移去速率 —基质浓度 —补料速度 —以消耗的基质为基准的细胞得率系数（g细胞/g消耗的基质） —以消耗的基质为基准的产物生成系数，即转化率（g产物/g消耗的基质） —产物的比生产速率。它的意义是单位浓度的生产菌细胞在单位时间形成的产物量。其数学表达式为  （6－3） 或  其中：为产物的浓度；为单位质量细胞生成的产物量；为维持系数，它表示单位浓度的细胞在单位时间里用于细胞物质的转化、营养物质的运输、产物的分泌等生命活动所消耗的基质量。 3．产物的形成  （6－4） 即：产物形成的速率 = 产物合成速率－产物移去速率－产物被破坏速率 —产物破坏常数。 这些方程对稳态和非稳态发酵过程均适用，但在非稳态发酵过程中得到其方程解是困难的。 如果过程中不存在补料或产物的移去，即为间歇发酵，那么碳和能源的方程(2)可改为  （6－5） 显而易见，碳源（一般是培养基组分中成本最高的）被用于细胞的合成和生命活动的维持以及产物的合成中。重排上式得  （6－6） —基质利用的比速率 二、代谢产物形成的动力学模型 Gaden根据产物生成速率与细胞生长速率之间的关系，将其分为三种类型。 类型Ⅰ称为相关模型，或称伴随生长的产物形成模型。它是指产物的生成与细胞的生长相关的过程，此时产物通常是基质的分解代谢产物，代谢产物的生成与细胞的生长是同步的。在伴随生长的产物形成模式中，合成的产物往往是分解代谢的直接产物——初级代谢产物，初级代谢产物的生产速率与生长直接有关。属于此类型的反应有乙醇、葡萄糖酸、乳酸的生产等。其动力学方程可表示为   图6－1 产物生成的动力学关系 从图6－1中可看出，此时产物的浓度-时间曲线与细胞相似；产物、细胞和基质三者的速率－时间曲线和比速率－时间曲线的变化趋势是同步的，都有一最大值，最大值出现的时间相差不大。 类型Ⅱ称为部分相关模型，或称不完全伴随生长的产物形成模型。该类反应产物的生成与细胞生长仅有间接关系。在细胞生长期内，基本无产物生成。属于此类型的有柠檬酸和氨基酸的生产。同样从图中可以看出，对此类生长模型，其μ和下降到一定值后，产物生成才比较明显，增大。当进入产物生成期，与μ和基本同步。其动力学方程可表示为  该式又称为Leudeking-Piret方程。 类型Ⅲ称为非相关模型或称不伴随生长的产物形成模型。产物的生成与细胞的生长无直接联系。它的特点是当细胞处于生长阶段时，并无产物积累，而当细胞停止生长后，产物却大量生成。同样从图中可以看出，在反应前期，都很小，反应后期值很大，而则很小，甚至为0。此时产物生成速率可表示为   习惯上把与生长无关联的产物称为次级代谢产物，他们的合成发生在生长停止之后。次级代谢作用的一个重要特征是，产物的生成只有在生产菌处于低的生长速率条件下才能发生。所以生长速率有可能是分解代谢产物的阻抑作用因子，而与营养限制无关。尽管可把所有与生长无关联的代谢产物称为次级代谢物，但不是所有次级代谢物一定与生长无关联的，因此把微生物的次级代谢定义为对微生物的生长不是必需的发酵产物更为合适。属于这类产物的有抗生素和微生物毒素等。这些物质的生产速率难以同生长联系起来，因为生长和产物的形成是分开的。但是产物的生产比速率仍可由式（6－3）表示，这种比速率对于表达和比较各种发酵过程产物合成的数据是很有用的，因为细胞浓度的影响可以不用考虑。此外，如果营养物质的利用速率以同样的方式表示，便容易求出转化得率，例如，碳源的产物得率可由下式计算  将与μ之间关系作图可表示在下图6－2中：  图6-2 与的不同型式 1——与生长相关 2——与生长部分相关 3——与生长非相关 4——与生长负相关 5——与生长无关 从图中可以看出，除了前述的产物生成的三种类型的动力学外，还有两种模型，一种是与为负相关联系的模型，例如黑曲霉产生黑素，其与关系可表示为  另一种是与无相关联系的模型。 对产物生成动力学的描述还提出了其它一些模型。例如，当要考虑到产物可能存在分解时，则方程可改写为  当考虑到细胞活性上存在差异时，假定高活性细胞所占比例为，低活性细胞所占比例为，则产物生成速率可表示为：  此模型称为细胞活性分布模型。此外还有细胞成熟模型、细胞年令分布模型、细胞成熟时间模型等。 第二节 发酵过程的代谢变化规律 一、分批发酵 1. 概念 所谓分批发酵是指在一封闭培养系统内具有初始限制量基质的一种发酵方式，发酵过程是从接种后开始，按菌种的生长周期进行的。一般分为三个主要阶段。接种后的一段时间内，菌体浓度几乎不增长，这一时期为适应期。生产上要求尽可能缩短适应期，办法是通过使用适当的种子和接种量，即采用生长旺盛期（对数期）的种子和加大接种量。下一个时期是对数生长期，这一时期的菌体生长情况为  ——经间隔时间后的菌体浓度 ——原始菌体浓度 ——比生长速率 是菌体浓度的自然对数与时间作图所得直线的斜率，在对数生长期的比生长速率最大。 再经过一段时间后，养分已基本消耗，产物不断分泌产生，生长逐渐减速直至中止生长。停止生长的原因目前尚不十分清楚，可能是因为必需养分耗竭，自身毒性代谢物的积累，也可能在后期菌体量过大，发酵液粘度增加影响了通气和搅拌的效果，从而使生长速度停止下来。 从指数生长到生长稳定期之间有一过渡期，称减数期。这一时期的长短取决于菌对限制基质的亲和力。亲和力高（具有低值），则减数期短，反之，则长。 生长速率时，为生长稳定期。这一期间是合成代谢物的主要时期，所以有时可把它叫作生产期或分化期。 2. 分批发酵过程的典型类型 （1）简单反应 生长型 产气杆菌（Aerobacter Cloacae）的生长。糖被消耗，用于生长细胞。 非生长型 黑曲霉（Aspegillus niger）转化葡萄糖成为葡萄糖酸。 （2）并行反应 形成产物在一种以上，形成产物的浓度相应增加。如粘红酵母（Rhodotoruba glutirus）。 （3）相继反应 形成产物过程中，有中间产物的积累，开始时中间积累产物浓度逐渐增加，随着时间的增长，中间产物浓度减少。如假单孢菌（Pseudomonoas Oualis）。 （4）分段反应 两种或两种以上诱导酶的存在引起两个以上反应，使微生物生长出现阶段性。如大肠杆菌（E.Coli）的二阶段式生长，同时供给葡萄糖和山梨醇作为基质。先利用葡萄糖，用完后，再开始利用山梨醇。 又如：弱氧化醋酸杆菌（Acefobacter Suboxydans）  对葡萄糖量有一定限制，浓度过高会产生别的产物，并有抑制作用。（下图）  图6－3 葡萄糖氧化为5-酮葡萄糖酸的曲线图 （5）在合成培养基中连续添加葡萄糖（浓度不同）生长青霉素。控制糖浓度不能过量，防止葡萄糖浓度过高而产生葡萄糖分解产物的阻遏作用。 例6-1：葡萄糖、葡萄糖内酯和葡萄糖酸分别用A、B、C表示，其浓度分别为a、b、c，他们的相继反应如下：  、为反应速率常数。 葡萄糖、葡萄糖内酯和葡萄糖酸，在反应系统中的浓度变化分别为：    假定： ，葡萄糖原始浓度（任意单位），试作图分别解上述相继反应。 解：依题意： 开始反应前：           将已知数代入得积分常数    a b t c a  b  c   a+b+c  0 1 0 0 1  10 0.3679 0.4773 0.1548 1  20 0.1353 0.4651 0.3996 1  30 0.0498 0.3467 0.6035 1  40 0.0183 0.2340 0.7477 1  50 0.0067 0.1507 0.8426 1  60 0.0025 0.0946 0.9029 1  70 0.0009 0.0586 0.9405 1    图6－4 葡萄糖、葡萄糖内酯和葡萄糖酸相继反应结果 3. 分批发酵过程的生产率 体积生产率是以每升发酵液每小时产生的产物克数（）表示的，是对发酵过程总成果的一种衡量。对于分批发酵过程，有必要计算总运转时间内的生产率。总运转时间不仅包括发酵周期，也包括从前一批发酵放罐、洗罐和消毒新培养基所需的时间。这一段时间的间隔可能少到6个小时（酵母生产），多到20小时左右（如抗生素生产）。在分批发酵过程中，产物的生成速率如图示。 图6-5分批培养的生产率，图中分别为培养结束和 放罐检修的工作时间、打料和灭菌时间以及生长停滞期 总的生产率可用从发酵过程的起点到终点的直线斜率表示，最高生产率可通过原点与单产曲线相切的直线的斜率表示，切点位置的细胞浓度或产物浓度比终点（最大值）低。 由下式可求出发酵过程总的运转周期：   总生产率：  由此式可求出发酵操作过程的变化对总生产率的影响。种子量大，将增加值，从而缩短发酵的过程，减少放罐、检修、打料、灭菌的时间，同样可缩短总周期。使用生长活力强的种子可缩短生长停滞期。 例如：在发酵周期短（18～48hr）的面包酵母或谷氨酸的生产过程中，放罐和检修时间长短对总生产率的影响较大；对于长周期（160～200hr）的抗生素发酵过程来说，几小时的发酵罐准备时间的差别对总的生产率影响不大。 4. 丝状微生物发酵的产物产率和基质的利用 霉菌和其它丝状微生物的发酵产物产率和基质利用的动力学是很复杂的，典型的例子是青霉素发酵。如图所示。糖迅速被利用，青霉菌菌丝体旺盛生长。当菌丝体的生长速率降低而过渡到静止期时，基质利用速率变慢，产物形成速率达到高峰；此后糖随着产物的合成被迅速消耗直至耗竭。 图6-6 其它一些抗生素发酵过程也显示出同样模式，但是，目前尚未发现对所有这一类发酵过程均适用的一般规律。例如，链霉素发酵其最高产物合成速率出现在发酵周期的后部，比青霉素发酵晚，后期不出现糖的迅速消耗期。另一种丝状微生物龟裂链霉菌的土霉素合成，与菌丝体的变化具有明显的相关性，这种龟裂链霉菌的发酵过程各阶段菌丝体的主要特征为： ①停滞期：如果接种量小，停滞期持续约90min，在此期间测不出代谢活动。②初级菌丝体的生长：此阶段取决于种子量，持续10～25hr；呼吸和核酸生物合成以及其它代谢活动高速进行，丙酮酸浓度达到高峰，没有或极少有抗生素生成。 ③初级菌丝断片：此期约10hr；在此期间菌丝生长稳定，呼吸和核酸合成速率降低，丙酮酸浓度跌倒最低值，抗生素开始产生。 ④次级菌丝体的生长：在此期间（持续约25hr）次级菌丝体生长比第2阶段高2～4倍，与开始粗壮菌丝相比，菌丝变细小，抗生素的生产迅速增加，核酸合成恢复，但呼吸速率继续下降，糖与氨氮迅速消耗，丙酮酸浓度稍有增加。 根据工业生产实践，可以归纳出丝状微生物发酵过程获得高产的一般规律： （1）在一固定的分批发酵时间内，存在一种得到最佳产率的最适的基质起始浓度。如果基质浓度太高，菌丝体生长过度，消耗大量基质导致“短周期发酵”现象的出现，造成产物生成量减少；如果基质浓度太低，菌丝体生长差，到产物生产期便没有足够的菌丝体制造产物。 （2）为了提高产物形成速率，对菌丝分枝程度也须加以优化。如果菌丝体分枝过少，停滞期和发酵周期均延长。目前已知菌丝体的分枝程度与种子的生长状况有关，因此需寻找最适的种子培养条件。 （3）为了提高氧的传递速率，对深层发酵过程似乎宜采用剧烈的搅拌，但是对于青霉素等利用丝状微生物的发酵过程来说，中等程度的搅拌对高产有利。对此有几种解释，普遍的认为是剧烈的搅拌所施加的剪切力会影响霉菌的形态，促进菌丝过多分枝，而使产量下降。 二、连续发酵 在分批培养中，微生物生长和产物形成的周期总是有限和较短的。如果不断地把新鲜的培养基连续地供给均匀混合的发酵系统，同时又以相同的速率把含有细胞和产物的发酵液从发酵系统中抽出便可使发酵过程连续化。在这种连续的微生物培养过程中，微生物细胞的浓度、比生长速率和环境条件（如营养物质浓度和产物浓度），均处于不随时间而变化的稳定状态下，这与分批培养中培养环境在不断变化有明显的不同。因此，连续培养技术是研究微生物代谢活动对其环境的响应，以及在最佳环境条件下连续生产菌体和其他产物的良好的生产技术。 图6-7 连续培养系统的实验室装置示意图 ㈠连续培养系统 典型的连续培养系统如图所示的恒化器，它主要由能维持恒定的发酵液体积的培养容器、新鲜培养基供给装置（一般采用定量泵控制培养基的供给速率）和无菌的培养基贮槽等部分组成。通常还需要用适当的控制器来控制pH、温度和通气量。新鲜培养基由泵输送到具有匀化装置的培养容器内，同时又从培养容器中抽出同量的培养液，以使培养液的体积在容器内维持恒定。在添加的新鲜培养基中除了一种必须的营养成分外，其他的营养成分都是过量的，一般采用单一生长限制因素使细胞群体处于稳定状态。当系统达到稳定状态时，培养系统中的化学环境保持不变。微生物生长所需的任何一种营养物质均可作为生长限制因素，所以通过对生长环境的控制可以相当灵活地改变细胞的生理状况。 另一种连续培养装置是一种恒浊器，如图。在这种装置的培养容器中，发酵液中的细胞浓度靠监测培养物的光密度装置维持恒定。当浓度上升超过该定点时，该装置启动进料泵，往罐里注入新鲜培养基。因为培养液的体积靠溢流装置维持恒定，而且罐的内容物能很快地被完全混合，其结果是培养容器中的培养物被稀释，部分细胞从容器中被排出。尽管这种装置设备简单，但很少被使用，因为测定罐内的细胞浓度很困难。 如图所示的是另一种塞流型（Plug-flow）微生物培养器，不像前两种具有匀化装置的培养器。在这种塞流型容器中，细胞浓度和养分浓度是随其所处的位置不同而变化的。此图显示出，离开新鲜培养基的输入端越远，细胞浓度越高，而限制性养分的浓度越低。因此塞流型发酵罐可以用来模拟分批培养过程，此时用离进料口的距离代替培养时间。但是如何维持发酵液的塞流状态和向系统中通气的问题防碍了它的实际应用。 图6-8 ㈡连续培养的原理 微生物连续培养技术已有相当长的历史，这里对其原理和应用作一简单的介绍。 对单级恒化器的分析可以作为研究更为复杂的系统的基础。 基于细胞量的物料平衡 图6-9 为了表达恒化器的稳定性质，需要建立一套把细胞和限制性基质与主要的操作参数（如培养基的流速）关联起来的方程，利用物料平衡原理可做到这点。在系统中，细胞的进入速率－细胞的流出速率＋细胞的生长速率－细胞的死亡速率＝细胞的积累速率。即：  式中：  通常添加到单级恒化器中的新鲜料液是不含菌的，故，而且几乎所有的连续培养过程的比生长速率大大超过比死亡速率（），所以上式可简化为：  在连续培养系统达到稳定状态时。则此式可变为：  因此，比生长速率可由培养基流速除以培养液的体积求得。在连续培养技术中被称为稀释速率，用符号“D”表示。  ① 在稳定状态下，细胞的比生长速率便等于稀释速率。 微生物的比生长速率取决于培养液的供给速度（V＝常数）。即人为的改变培养基的加入速度，能够控制比生长速率，但是，在所规定的培养条件下，各种微生物的比生长速率有一定的界限，在<的范围内，上式才能成立。 基于限制性营养成分的物料平衡。 限制性营养成分的物料平衡可表示为： 养分进入系统的速率－养分流出系统的速率－用于生长的养分消耗的速率－用于维持的养分消耗的速率－用于产物形成的养分消耗的速率＝养分在系统中积累的速率：   －细胞得率系数，即消耗每克限制性养分所形成的细胞克数。 －分别为限制性养分进出口浓度。 －维持系数。 －产物形成的比速率（g产物/g 细胞·小时） －基质变成产物的转换系数。 同生长相比，细胞用于维持限制性营养成分的需求往往是很低的（即），而且产物形成的需求也可忽略，因此可略去。故在稳定状态下（）。  ② 用此式时需作以下几个假定：第一，细胞的得率系数假定与生长速率或稀释速率无关。虽然在多种操作条件下这种假定是成立的，但必须谨慎，因为得率系数可能随稀释速率的大范围波动而变化。第二，假定细胞浓度的绝对值与除限制性营养成分以外的所有营养成分无关。第三，限制性营养成分的细胞得率系数只受限制性养分的影响，但是其它环境因素如pH、温度和溶解氧必须维持恒定。 生长模式 式①和②是连续培养的两个稳定方程。为了把同稀释速率关联起来，需要有一种表示生长速率是限制性基质浓度的函数的数学模式。Monod方程是最常用的模型：  是基质饱和常数，是生长速率时的基质浓度。此模型表示，生长速率只是限制性营养成分浓度的函数，并假定与其它营养成分或其它环境因素无关。如将它用于连续培养可得：    将其代入，得一把稳态细胞浓度同稀释速率关联起来得表达式：  ……（） 根据以上两式，在理论上恒化器中各参数的变化如图所示： （三）产率 发酵工艺的优劣是根据转化率和总的产率评价的，在连续培养中，细胞产率可由下式确定：  将前式代入：  …… （a） 为了找到达到最大产率值时稀释速率，可通过对的导数求得：  ……（b） 如果仍然不受的影响，可用前式（a）解上式（b）求：  …… () 有意义的是，达到最大的细胞产率的稀释率，并不等于达到最大的细胞得率时的稀释率。因此，过程的最佳化往往必须采取折衷的方法，要同时考虑到产率、转化率和流出液的残留基质浓度。 1.分批培养过程与连续培养过程产率的比较 通过验证分批发酵过程总生产率与的乘积之比（其中是在稀释速率下的细胞浓度），可比较分批和连续发酵过程的菌体生产率。这可将式代入式得到。值可由下式表达：  连续培养产率与分批培养产率之比为：  若种子量变为5％、发酵工艺周期为10hr、细胞得率为、最终细胞浓度为时，通过上式可算出不同生长速率下两种培养过程的细胞产率的比值。其结果列入表内。 分批和连续培养产率的比较 分批培养中最大比生长速率（）  分批培养中最大比生 速率（）   0.05 0.09 0.80 4.6  0.10 0.21 1.0 6.8  0.20 0.53 1.2 9.5  0.40 1.5    从这些数字可以清楚地看出，菌生长得越快，连续发酵比分批发酵越有利。 2.微生物产物的形成 采用同样的方法也可比较分批发酵和连续发酵的发酵产物（如抗生素、有机酸）形成的产率。但是在比较这两种发酵过程产物的产率时，从经济的角度出发，不仅要考虑过程产物产率，而且也要考虑发酵液离开发酵系统后进入回收工段时的产物的浓度，因为产物回收的成本与要处理的液体量成正比而与产物的浓度成反比。因此，即使连续发酵过程的产率高于分批发酵过程，但是如果连续发酵过程的最终产物浓度太低时也是不经济的，因为许多工业发酵过程的提取成本很高，它的成本决定了生产过程的经济效益。如果产物的生成与生长有关联，则式（Ⅰ）无论对产物还是对菌体来说都是正确的。但如果产物的生成与生长无关或部分有关，就不适于采用式（Ⅰ）所示的关系进行比较，最好对各因素分别考虑。 （四）恒化器的实际运行情况与理论状态的对比 到目前为止所讨论的仅是理想的恒化器的特性，实际上，恒化器并不总是按理想的方式工作的。下图表示的是在不同限制条件下，在恒化器连续培养过程中所出现的异常曲线。 图6-10 1. 碳源限制性恒化器 在碳限制性条件下，最常见的异常状态为图（a）。在低稀释速率时，细胞浓度随稀释速率减少而降低，细胞得率系数也随之下跌。这种与理论状况偏离的现象是由于细胞把系统中所提供的碳源大部分用于满足细胞的维持需求所造成的。这一维持能主要用于细胞对营养物质的主动运输，供给维持细胞正常的生理结构和蛋白质转换等方面所消耗的能量。维持细胞的碳能源的量大致恒定在一定范围内，它与细胞的生长速率无关，它相当于细胞以最高速率生长时总能量需求的5～10％。 当降低（即低）时，碳源主要用于细胞的维持，而用于新细胞合成的量少了，导致细胞得率降低。但在较高的下，也常观察到细胞得率的降低，这是由于生成和积累了某些中间代谢产物，如乙酸、丙酮酸、乙醇等。微生物在这种情况下对C源的浪费原因，在多数情况下还不清楚。 2. 受N或硫酸盐限制的恒化器 另一种类型的不正常状态在N或硫酸盐限制生长的条件下出现。图（b）：当减少时，细胞浓度增加。在此条件下，细胞的分裂受到限制，从而积累可作C源和能源使用的化合物如多糖、脂类等。这些物质的积累导致细胞变大和质量的增加，从而使测得的细胞得率明显地增加。如果细胞地得率以每升含克细胞蛋白或细胞氮的量来表示，则所得数据会更接近于理论预期曲线。 3. 受或磷酸盐限制的恒化器 微生物的生长受或磷酸盐限制时，微生物在恒化器中的生长状况会出现图c的异常状况。表面看图c与图b相似，即细胞浓度随减少而增加，但事实上引起这种异常现象得原因有所不同，因为和磷酸盐同细胞中核酸的含量有化学计量关系，缓慢生长的细胞比迅速生长的细胞所需的RNA要少。因此，随着降低，细胞的生长速率也降低。同量的钾、镁或磷酸盐足以支持比快速生长的细胞数目更多的以低速生长细胞的生长。如果细胞浓度以每毫升发酵液中RNA或总核酸量作曲线，则曲线将如虚线所示。 4. 非恒化连续培养 图b和c的异常现象说明，细胞成分的改变也会使细胞对每一种必需营养成分的需求发生改变。在连续培养时，如果细胞生长在化学成分不明确的培养基中，其生长情况便出现图d的状况。在这种情况下，很难确定培养基中的限制性组分是哪一个。况且，由于生长速率改变时微生物对营养物质的需求也会改变，因此不同的生长速率就会出现不同种类的限制性因素。其产生的结果是，随着的增加，X连续地降低。因此这种连续培养类型被称为非恒化连续培养。 （五）连续培养过程中的主要问题 与分批培养相比较，连续发酵过程具有许多优点：在连续发酵达到稳定状态之后，①其非生产时间几乎等于0，因此设备利用率高；②操作比较简单；③产品质量比较稳定；④对发酵设备以外的外围设备（如蒸汽锅炉、泵）的利用率高；⑤可以及时排出在发酵过程中产生的、对发酵过程有害的物质等。但是连续发酵技术也有一些问题，其中最主要的是菌种的稳定性问题。 1. 杂菌污染问题 在连续发酵过程中，需要长时间连续不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就不可避免地发生杂菌污染问题。虽然可以通过选用耐高温、耐极端pH值和能够利用特殊营养物质的菌株作生产菌控制杂菌的生长，但这种方法的应用范围是有限的，不能适用于所有的连续发酵过程。因此，杂菌污染问题仍然是连续培养中难以解决的问题。 为了更好地了解连续培养中杂菌污染问题，需要了解污染的杂菌在什么样的条件下会在系统中发展成为主要的微生物群体。在一种碳源限制性连续培养系统中，用纯种生物作为生产菌。此生物的生长速率和基质浓度之间的关系如图所示。  图6－ 连续培养系统中杂菌的生长速率和基质浓度的关系 假设连续培养系统被外来的生物污染，这些污染菌的积累速率可用以下物料平衡式表示： 污染菌积累的速率＝污染菌进入的速率－污染菌流出的速率＋污染菌生长速率  式中是污染菌的浓度，在稀释率为时的残留限制性基质浓度为。 将污染的生物的生长速率－基质浓度曲线与连续培养系统中作为生产菌的生物的曲线作比较，分别示于图（a）、(b)、(c)。 由于限制性养分浓度是，生物的生长速率比系统的稀释率要小（a）。因此的积累由下式表示：  结果是负值，污染物不能在系统中存留。这是一次性污染，没有造成持续污染。 污染物的生长速率与基质浓度的关系则与图a中的有显著不同。在基质浓度为的情况下，生物能以比大的比生长速率生长。生物的物料平衡为：  因为比大的多，故是正的，菌开始积累，结果打破了原系统的平衡关系，造成系统中基质浓度下降到，此时杂菌的比生长速率，从而建立了新的稳定状态。然而系统中的生产菌在此基质浓度下，以比原有的比生长速率小的速率生长，因为，因此生产菌将从系统中被冲走。  生物侵入的成功与失败决定于系统的稀释速率。由(c)可看出，在稀释率为下，式中是一临界稀释速率，竞争不过，被冲走；如果稀释率增加到，污染物将和一样有竞争力，而原来的菌被冲走。 因此，在培养基浓度高时，造成杂菌积累，被洗出，成为杂菌污染。在培养基浓度低，也较小情况下，可以淘汰。所以在了解杂菌性能后，既要控制稀释率，又要控制培养基浓度来排除杂菌污染。 在分批培养中，任何能在发酵培养液中生长的污染物将存活和开始积累，但在连续培养中污染物能否生长取决于它在培养环境中的竞争能力。因此用连续培养技术可选择性地积累一种能有效使用限制性养分的菌种。 2. 生产菌株突变问题 虽然微生物细胞的遗传物质DNA的复制过程是一种高度精确的复杂过程，但在复制过程中总会出现差错引起突变，差错的可能性一般为百万分之一。尽管突变可能性很低，但一旦在连续培养系统中的生产菌细胞群体中某一个细胞发生了突变，而且突变的结果使这一细胞获得在给定条件下高速生长的能力，那么它就有可能像图b中的杂菌一样，取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。而且，恒化器运行的时间越长，所形成的突变菌株的数目就越多，发酵过程失败的可能性也越大。 （六）多种基质的发酵作用和混合培养 当一种微生物以分批培养的方式在含有混合碳源的培养基中生长时，它们通常在某一时间内只利用某一种碳源化合物，此现象是碳分解代谢物阻遏造成的，多种碳能源物质的相继利用会出现多次生长现象 (分段反应：大肠杆菌利用葡萄糖和山梨醇两种C源) 。 在连续培养中，微生物对多种碳源的利用情况与在分批培养中所观察到的情形有些不同，即在某些条件下多种碳源物质能同时被利用。使菌体同时利用多种碳源的关键因素是维持低浓度的分解代谢物。连续培养提供了利用多种基质的有利条件，所以连续培养法广泛地应用于污水处理系统。 在自然界的物质循环中，微生物起着重要的作用。但是仅靠一种微生物的作用是不能完成这样复杂的物质转换过程的。它需要多种微生物的联合作用。若将多种微生物的联合作用用于生产实践，就构成了混合培养技术。它越来越广泛地受到重视。 在一种稳定的混合培养系统中，各种微生物群体的营养需求是各不相同的，而且是相互依赖的。连续培养技术可以建立起这种系统，因为它能创造一种具有高度选择性的只适于某一类微生物生存的条件，而使这类微生物得以积累。这种技术已在许多生产实践中得到应用。例如，英国壳牌石油公司利用甲烷为原料生产SCP的技术，这一技术就是建立在利用连续的培养方法组建的由多种微生物组成的一个稳定的混合培养系统的基础之上。这一混合培养系统由四种微生物组成，其中只有一种微生物（假单孢杆菌）能够利用甲烷作碳源和能源。另一种丝状微生物能够利用假单孢杆菌氧化甲烷生成的甲醇，它不仅由此获得C源和能源，而且也消除了甲醇对假单孢杆菌的抑制作用，有利于假单孢杆菌的生长。因此利用这种协同方式的混合培养技术，可以比纯培养法获得较高的细胞物质产量。如果把另外两种微生物――黄杆菌和不动杆菌从系统中除去，这种协同式发酵作用就会变得不稳定。由此可以推测，这两种微生物的作用是从发酵液中将那些对假单孢杆菌和丝状微生物有抑制作用的代谢物去除。这种微生物群体在营养上是自我满足的，因此其他微生物不可能作为污染物在发酵液中生长。 （七）简单恒化器的改进 ㈠带有细胞重新循环的单级恒化器 如把出口中的一部分菌体再循环使用，能改善简单恒化器的性能，然而要做到无杂菌污染的再循环是困难的，因而微生物反应的再循环操作受到限制。但是，微生物的再循环却是废水处理过程的一种，在活性污泥法中使用很普遍。 图中各部分符号的命名同一般恒化器一样，只是添加两个参数：，为再循环的比例，为浓缩因子，代表离开发酵罐和细胞分离器的发酵液中的细胞浓度。 这种恒化器中基于细胞量的物料平衡（分离器不计在内）可写成：  注入的培 再循环 排出的 生长出 细胞的 养基中带 液流中 细胞 的细胞 积累 进的细胞 的细胞 上式中假定细胞的死亡系数是很小的，死亡的细胞数被忽略不计。 在系统达到稳定状态时（），解上式，代入，并假设补入的培养基没有菌种，得：  换句话说，用浓缩的细胞循环，稀释速率不再等于比生长速率。总是小于1。（因为浓缩因子C>1）,则。 在同样的边界条件下，基于生长限制性基质的物料平衡为：  随注入的 再循环 基质 基质 基质 培养基流 流进的 排出 消耗 积累 入的基质 基质 Monod模型  经转换后变为 将代入得：  代入前式：  按这些方程作的曲线与常规的恒化器相应的曲线作比较，如图。 曲线是由上式按下列常数计算的： 曲线E和B是在出口处测量的细胞生产率，A是带有细胞循环的发酵罐的细胞浓度，C是带有细胞循环的排出细胞浓度。 图中也显示出各种情况下的细胞产率曲线。由于细胞再循环的结果，有可能增加系统中的总的产率。因为整个系统可以在大于最大比生长速率的一种稀释速率下运行。在培养容器中细胞浓度增加，基质消耗的速率也按比例地增加。 ㈡多级连续培养 第一种多级连续培养系统如图示（在这种系统中虚线表示的是略去第二级的进料管）。因为没有细胞的再循环，唯一的进料量为。 在第一级连续发酵系统中，基于细胞量和限制性基质的物料平衡与单级恒化器的一样。第二级连续培养系统的细胞量的物料平衡可写成：  细胞 细胞 细胞 细胞 流进 流出 生长 积累 速率 速率 速率 速率 第二级恒化器中的限制性基质的物料平衡：  基质 基质 基质 基质 进入 流出 消耗 积累 速率 速率 速率 速率  表示第二级罐中细胞和限制性基质的物料平衡上两式的稳态解与第一级的解作比较示于表中。在这种情况下，第一级和第二级的稀释速率分别为和。从第二级的稳态解可清楚地看出，微生物细胞在第二级罐中的生长速率和稀释速率是不相等的，如果不向第二级罐中另外添加限制性养分，在第二级中的微生物细胞的净生长将是少的。因此在恒定的控制条件下，不向第二级另外添加培养基时，细胞几乎仅在第一级中生长，第二级中几乎不生长。 细 胞 量 基 质  第一级     第二级     第二级带补料     如果向第二级发酵罐添加物料液，此液流可以含有限制性营养物质，也可以含有附加的其他营养物质、诱导剂或抑制剂，则这种连续培养系统便可以用来研究微生物的代谢调节作用。在此系统中，第一级为第二级连续提供了生理状况始终如一的微生物细胞群体。 这里需要强调的是，以上讨论的各种组合方式的恒化器，无论是单级、带循环的恒化器还是多级恒化器，有一点是共同的，即每一个反应器内物料液流动完全符合全混流的假设，反应器内物料混合是均一的，物料的反混程度为最大，这是所有设计关系式推导的物理基础，必须引起特别重视。 三、补料分批发酵 补料分批发酵也叫半连续发酵、半连续培养，流加发酵（fed-batch fermentation），它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法。 在20世纪初人们就知道在酵母培养基中，假如麦芽汁太多，会使生长过旺，造成供氧不足，供氧不足会产生厌氧发酵生成乙醇，减少菌体的产量。因此，采用降低麦汁初始浓度，让微生物生长在营养不太丰富的培养基中，在发酵过程中再补加营养，用这一方法可大大提高酵母的产量，阻止乙醇的产生。有时，采用补料分批发酵虽然降低了菌体的生长速率，但细胞得率提高了。如今，补料发酵的应用范围已相当广泛，包括单细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生素、维生素、酶制剂、有机酸等生产几乎遍及整个发酵行业。 补料分批发酵与分批发酵相比，特点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾。②避免在培养基中积累有毒代谢物，即代谢阻遏。与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题，因此，其应用范围较广。 四、固态发酵 固态发酵是微生物在固态培养基上生长和代谢的一种发酵方式。这种固态发酵的方法，设备简单，生产容易，原料易得，能源消耗低，成本低廉。 对于多数真菌而言，固态发酵方式更接近其在自然环境下的生长条件，所以与液态条件相比，单位体积的产物生成结果往往要高。 但固态发酵存在一个显著特点，就是菌体、基质、产物均处于一个非均一的发酵系统中，尤其是在一个大规模的固态发酵系统中，随着发酵的进行，菌体呼吸产热，料芯散热慢，菌体生长、基质利用和产物合成都不均匀。湿度也是一个较难控制的参数。湿度也易随着产热而不断挥发，造成固体面干燥，不利于菌体的生长和生产。此外，自动化控制水平也不及液态发酵。 但由于设备简单，单位体积原料的产物生成量大，给后处理带来了一定的效率，所以近年来又引起了重视。 第三节 发酵参数的检测和控制 在还没有搞清生产菌控制其代谢活动的机制之前，发酵过程的控制主要依赖于能反映发酵过程变化的参数的控制。因此，建立各种监测系统，对于发现和分析发酵过程中出现的问题，及时对发酵过程实施人工控制，是发酵过程高产和稳产的重要条件。 即使在科学技术高度发展的今天，一般还不能对次级代谢产物的发酵过程进行最佳控制，十分令人遗憾。许多生产单位承认，他们难于确定什么样的环境条件可以使发酵产物（抗生素）的合成达到最佳的产率。其主要困难是缺少各种可以在发酵罐中“在线”（on-line）测定的探测传感器，如细胞浓度、细胞活性、关键性酶的活性等参数。譬如，至今为止，发酵行业中检测细胞浓度的方法还是依靠定时从发酵罐中取样“离线” （off-line）测定的方法。这种方法不但繁琐费时，而且也不能及时反映发酵系统中的状况。鉴于这种情况，目前很多发酵行业的发酵过程控制只不过是执行事先拟定好的工艺操作计划而已。 用于发酵工程中的传感器，除了应满足对一般测量仪器的要求外，还应具有以下几个方面的特性：⑴传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽（120～135℃，30min以上）无菌处理。⑵传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在1～2周内其测定误差应小于5％。⑶最好能在使用过程中随时校正。⑷材料不易老化，使用寿命长。⑸传感器探头安装和使用方便。⑹探头不易被物料粘住、堵塞。⑺价格便宜。 目前已设计出先进的能在发酵罐内装设的有测定温度、pH、溶氧、氧化还原电位、泡沫和液位等参数的传感器，但是还有许多重要的传感器，特别是能监测化学物质变化的生物传感器还难于在罐内使用。为此，在生产实践中可用以下的补救办法使用这些传感器达到在线测定的目的：⑴传感器可用一些化学试剂进行冷灭菌，如还氧乙烷、过氧乙酸或季铵盐类等，然后用无菌手续安装到罐内。这种方法只适用于小型发酵罐。⑵采用连续取样或罐外循环的办法，把不耐热的传感器安装在罐外流动样品槽内，以便可以用化学试剂对整个罐外循环系统灭菌，灭菌后再用无菌水冲洗，然后与发酵罐内接通。⑶用多孔氟塑料管道（透气法）监测惰性载气带出的样品（例如，挥发性有机化合物如乙醇等被输送到有传感器的容器内测量）。⑷利用透析装置，以水为载体，使发酵液中的低分子化合物透过半透膜，进入水中被输送到有传感器的容器中测定。 虽然缺乏适用的传感器是对发酵过程实施最佳控制的障碍，但是随着电脑技术的发展，人们可以绕过这种障碍。现在已设计出了可以控制和管理发酵系统的小型电脑。利用电脑运算速度快的特点，根据能够在线测量得到的各种参数和提供的数学模型，便可获得发酵系统中的基质和细胞浓度的瞬时值。例如，发酵过程的氧呼吸，可以通过系统中氧的平衡来求得。根据氧的吸收和其它参数，并借助于一定的数学模型可间接求得细胞浓度和生长速率。因此，缺少测量细胞浓度的传感器似乎不再是对发酵过程实施控制的障碍。 反映发酵过程变化的参数可以分为两类：一类是可以直接采用特定的传感器监测的参数。它们包括各种反映物理环境和化学环境变化的参数，如：温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液粘度、浊度、pH、离子浓度、溶解度、基质浓度等，又被称为直接参数。另一类参数是到目前为止还没有可供使用的传感器监测的参数，它们包括细胞生长速率、产物合成速率和积累速率、呼吸商等。这些参数需要根据一些直接监测出来的参数，借助于电脑快速运算的功能和特定的数学模型才能得到。因此这类参数又被称为间接参数。 发酵过程中的直接参数的检测 ㈠物理环境参数的监测 ⒈温度的影响及检测 在发酵过程中，需要维持生产菌的适宜的培养条件，其中比较重要的就是保持菌生长和合成产物所需要的最适温度。因为微生物的生长及产物的合成都是在各种酶催化下进行的，而温度恰恰是保证酶活性的重要因素，所以在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。 ⑴影响发酵温度的因素 发酵过程中，由于菌体对培养基利用而发生的生物反应及搅拌时产生的摩擦等等，都会产生一定的热量。同时罐壁的散热、水分的蒸发等也带走了一部分热量，发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热：  生物热（）：它是生产菌在生长繁殖过程中，本身所产生的大量的热。生物热主要是培养基中的碳水化合物、脂肪和蛋白质被微生物分解成、水以及其他物质时释放出来的。释放出来的能量部分用来合成高能化合物，供微生物合成和代谢活动的需要，部分用来合成产物，其余部分则以热的形式散发出来。生物热大量产生于菌体的对数生长期，这一阶段所产生的大量热成为发酵过程热平衡的主要因素。 搅拌热：在好气性培养的发酵设备中都有大功率的搅拌。搅拌器带动发酵液作机械运动，造成液体与设备之间、液体与液体之间的摩擦，产生数量可现的热。从电机的电能消耗中扣除部分其他形式的能的散失，可得到搅拌热的估算值。 蒸发热：蒸发热是随发酵罐排出的尾气带走的水蒸发的热量。其温度和湿度随控制条件和季节的不同而各异。水的蒸发以及排出的气体还夹带着部分显热（）散失到外界。 辐射热：因罐内外温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热在一年四季是不同的，冬天影响大些，因罐内外温差大。 由于、和在发酵过程中是随时间变化的，因此发酵热在整个发酵过程中也随时间变化。为了使发酵保持在一定温度下进行，必须采取措施，如在夹套层或蛇管内通入冷水来控制，对小型发酵罐，散热较快，需用热水保湿。  （上册），发酵热的测定方法。 ⑵温度对发酵的影响 由于微生物反应是由各种生物酶参加的反应，所以从酶动力学来看，温度升高，反应速度加大，生长代谢加快，产物生产期提前。但酶本身很易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快。它表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，产物产量减少。 以青霉菌为例，不同的温度（13～35℃）对青霉菌生长、呼吸强度和青霉素生长、呼吸强度和青霉素生产的各种酶的影响作用是不同的。见（上册）。 根据阿累尼乌斯方程式：    （菌体生长代谢反应的活化能：） 图 （活化能的大小说明酶反应速率受温度大小影响而变化，根据上式可测得青霉菌生长的活化能，呼吸的活化能，青霉素合成的活化能，所以青霉素合成速率对温度最敏感。） 温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还会通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。如温度会影响基质和氧在发酵液中的溶氧和传递速率，菌体对某些物质的分解吸收速率等。 此外，温度还会影响生物合成或代谢调节的方向和最终产物。这点不难理解，因为温度会影响生物体内的酶的活性。如，金色链霉菌能同时产生四环素和金霉素。在30℃以下时，该菌主要合成金霉素。35℃时，该菌只产生四环素而停止生成金霉素。 ⑶最适温度的选择 所谓的最适温度就是最适于菌体生长和产物合成的温度。不同的菌体，不同的培养条件，不同的酶反应，不同的生长阶段，最适温度应是不同的，而且菌体生长的最适温度不一定等于产物合成的最适温度。如青霉素生产菌的最适生长温度是30℃，而最适青霉素合成温度为20℃。乙醇生产菌的最适生长温度为30℃，最适合成温度为33℃。所以在接种的初始阶段，应考虑生长菌体为主，优先调节适于生长的温度，待到产物合成阶段，即调节最适合成温度，以满足生物合成的需要。 此外，根据环境条件的优劣，可以通过调节温度来加以弥补。如通气条件较差或溶氧较低时，可适当降低温度，因为降低温度可以提高氧的溶解度。又如培养基浓度较低或较易被菌体利用的培养基，提高培养基温度会使养分提前耗竭，菌体生长过盛，易发生自溶，使产物产量降低。 温度可以通过水银温度计、热电铝、热敏电阻和金属电阻温度计监测发酵系统中的温度，并通过与其相偶联的执行机构（如改变冷却水阀门的开度）对发酵温度进行自动控制。 2．泡沫的控制 ⑴泡沫的产生及其影响 在微生物深层培养过程中，由于通气、搅拌、代谢气体的产生等原因以及培养基中蛋白质、糖份、代谢物等能够稳定泡沫的表面活性物质，使发酵液产生泡沫，这是大多数发酵过程出现的正常现象。有时，这些泡沫是需要的，因为它可以增加气液接触面积，导致氧传递速率的增加。但有些好气性发酵中，在发酵旺盛期产生的大量泡沫，会引起“逃液”，给发酵造成困难，带来很多负作用，如⑴降低了发酵罐的填料系数。一般的发酵过程，填料系数0.6～0.7，其余部分容纳泡沫，而通常的情况，泡沫只占培养基的10％左右。⑵泡沫的存在增加了微生物菌群的非均一性。由于泡沫液位的变化，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮，粘在罐壁，影响了菌体浓度以及整体效果。⑶增加了污染杂菌的机会，培养基随泡沫溅到轴封处容易染菌。⑷导致产物损失。大量起泡引起“逃液”，如降低通气量或加消泡剂，将干扰工艺过程，尤其是加消泡剂会给提取工艺带来困难。 对泡沫起决定性因素的是培养基的物理化学性质。尤其是培养液中所含的蛋白质、微生物菌体等具有稳定泡沫的作用。起泡剂一般都是表面活性物质，这些物质具有亲水基团和疏水基团。分子带极性的一端向着水溶液，非极性的一端向着空气，并在表面作定向排列，增加了泡沫的强度。培养液的温度、pH、浓度和泡沫的表面积对泡沫的稳定性都具有一定的影响。 ⑵泡沫的控制 泡沫控制的方法有两类：机械消泡和消泡剂消泡。但近年来也注意从微生物本身的特性入手，筛选生长期不产泡沫的菌体突变株，防止泡沫的形成，最简单的当属单细胞蛋白生产。或者可利用几种微生物的混合培养，即通过一种微生物产生的泡沫形成物质被另一种协作菌同化的作用来控制培养过程中产生的泡沫。 （）机械消泡 一个理想的生物反应器，应具有优化工艺系统，使气体、培养基成分、代谢物、微生物具有较好的分散度和湍流程度，尽量增加装置，而能量消耗小。那么，在反应器中装一个耗能小的消泡系统，不仅要求保证不含“逃液”，使设备保持无菌，而且菌体不能受到机械损伤。 机械消泡是根据物理学的原理，即靠机械作用引起压力变化（挤压）或强烈振动，促使泡沫破裂，这种消泡装置可放在罐内或罐外。在罐内最简单的是在搅拌轴上方装一个消泡桨，它可使泡沫被旋风离心压制破碎。罐外消泡法，是把泡沫引出罐外，通过喷咀的喷射加速作用或离心力消除泡沫。 机械消泡的好处是，不需引进其他物质，如消泡剂，这样可以减少培养液性质上的微小改变。也可节省原材料，减少污染机会。但缺点是不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。 （）消泡剂消泡 化学消泡的机理有两种： a.如果泡沫的表层带有极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某些具有强极性的物质与发泡物质争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破碎。 b.如果泡沫液膜的表面强度较大，可加些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，使泡沫破碎。 有的消泡剂能同时降低液膜的机械强度和液膜的表面粘度，这是比较好的消泡剂。同时还应具有较小的表面张力和溶解度，以利于附着在泡沫表面上。消泡剂还应对菌体无毒性，对发酵、提取过程以及产品质量无影响，成本低，来源广等。 工业上使用的消泡剂种类较多，有天然油脂类，如玉米油、豆油、棉子油、米糠油、猪油、鱼油等。使用时应注意油脂的新鲜程度，否则对菌的生长和产物的合成有抑制作用。聚醚类：如聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙稀甘油（泡敌）。此类消泡剂用量少，0.03～0.035％，而消泡能力却大于植物油10倍以上。高级醇类：最常用的是十八醇，还有聚二醇，它具有消泡效果持久的特点，对霉菌类效果最佳。硅酮类：这类消泡剂主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。它常与分散剂（微晶）一起使用，或与水配成10％的纯硅酮乳液。它适用于细菌和放线菌的发酵。 对于消泡剂的应用应注意在使用之前作比较试验，找出消泡剂对微生物生理特性影响最小，消泡效率最大的条件。其次，在使用天然油脂时一次不能加得太多，过多的油脂会被脂肪酶分解为有机酸、脂肪酸、降低pH、使DO下降，影响发酵的正常进行。 常用安装在发酵罐中的电导式或电容式泡沫探头监测泡沫，并与消泡装置或消泡剂添加装置联接控制泡沫。 3．压力：可用相当简单的薄膜式压力计测量，这种压力计能经得起灭菌处理。测得的气动信号可直接或通过一简单的装置转换为电信号，启动装在发酵罐上的罐压调节阀以调节罐压。 4．轴输入功率：目前有两种用来测量轴功率的装置，即扭力（功率）计和应变仪。由于扭力计系统只能放在罐外测量，其测定值包含轴封摩擦力的损失。用应变仪测量则可以避免这一缺点，虽然仪器较贵，但是其精度较高，还是值得应用的。仪器的应变片安装在发酵罐内的搅拌轴上，导线从轴向孔中引出罐外，电讯号通过旋转轴上的滑动环传出。 5．搅拌器转速：发酵罐的搅拌器的转速，依罐的大小而异。小罐的搅拌器转速要比大罐的快些。但是所有发酵罐搅拌器的叶尖的线速度，在一般情况下几乎是恒定的值，即为150～300。下表是不同大小的通用型发酵罐搅拌器转速范围。 罐 的 容 积 （升） 转速范围（r.p.m） 罐 的 容 积 （升） 转速范围（r.p.m）  3 200～2000 200 50～400  10 200～1200 500 50～300  30 150～1000 10，000 25～200  50 100～800 50，000 25～160   6．空气流量：通入发酵罐中的无菌空气的流量常用转子流量计测定。流量计中浮动转子的位置可以通过电容或电阻原理转换为电信号，经过放大之后启动控制器便可实现气体流量控制自动化。 7．料液流量：常用的流体流量检测器有转子流量计（像气体流量计一样也可以制成能实现自动控制的型式）、电磁流量计和通过测定发酵罐的重量变化间接测定液体流量的应变器。 8．浊度：浊度测量尚未得到应有的注意。浊度对某些产品的生产量是及其重要的，因为它可以及时反映细胞的生长状况。目前浊度测量只限于采用定时取样的离线测定方法。显然这种测定方法不能及时反映发酵罐的浊度变化。一般可用比浊计或分光光度计测定样品的浊度。 ㈡ 化学环境参数的检测 除pH、氧化还原电位、溶解氧和排出的废气中的与外，目前大多数的化学参数还没有适当的传感器可供使用。 pH 可用一种复合的玻璃――参比电极方便地测量发酵液的pH。这些电极经得起高压灭菌，有些pH计的读数易受仪表接地好坏的影响，为此把电源的变化器隔离和把仪表屏与发酵罐接地连在一起，但是即使这样做也不能完全克服这一问题。高温消毒会使一些电极阻抗升高和转换系数下降，从而引起测量上的误差。另外，电极的液洛部位的液接界面电位也因电极与大分子有机物接触而发生变化。一般好的电极也只能耐高温灭菌30～50次，若继续使用，转换系数便显著下降，使性能破坏，不能再用。 ⑴pH对菌体细胞的影响及发酵过程pH的变化 发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一个重要的参数。不同环境pH对菌体细胞产生明显的作用。这些作用可以表现在许多方面。例如，各种微生物都有最适生长pH值，超过这个pH范围，微生物生长就受到影响甚至停止。有的适宜于酸性培养，有的中性，有的宜于碱性。一般来说，霉菌和酵母菌的最适pH为3~6，大多数细菌和放线菌适于中性和微碱性pH6.3~7.6。 发酵过程pH的变化会引起ATP生产率的减少，因此引起细胞产量的减少，倍增时间增加。如葡萄糖进行酒精发酵时，当pH从7.2变为5.01时，每100mgmol葡萄糖形成的ATP从224mgmol降到153mgmol，相当于菌体从2.58g降到1.77g，倍增时间从2小时增到4小时。 pH变化对细胞壁的机械强度也有明显的作用，膨胀或收缩改变了内部的渗透压，如青霉菌在pH>7时，菌丝体膨胀，细胞壁强度降低。 有时，离子毒性作用也由于pH的变化而间接形成。即在环境pH条件下，一些不离解的分子透过细胞壁，在中性的细胞内部发生离解，从而改变了细胞内部的组成。一般在使用有机酸缓冲液时的抑制作用就是这种效应的结果。 由此可见，尽管pH变化对菌种细胞影响是多种多样的，其最后的作用结果也各不相同，但菌体细胞对pH的变化是异常敏感的，所以pH值是发酵过程中很重要的参数。 然而，在发酵过程中，由于微生物生命活动的结果，使培养液环境的pH发生不断变化，如果不加以控制调节的话，就要影响过程的进行。培养液pH变化是在特定环境条件下微生物生命活动的综合结果，在同一时间也许既存在着pH上升的因素，又存在着使pH降低的可能，最后趋势则决定于这些因素的综合结果。 从具体过程来说，微生物生命活动对环境pH的影响主要在两种情况下发生。其一就是酸性或碱性代谢产物的形成，使培养液的pH发生变化，如在通风发酵中，许多微生物在过量的糖存在下，产生有机酸等代谢物，使pH值降低。其二：当菌体自溶时，蛋白质分解或其他含氮化合物产生氨或产生其他碱性物质。其次就是菌体对培养基中生理酸性或生理碱性物质的利用，使环境的pH发生变化。所谓生理酸性或生理碱性物质也是相对而言的，有些物质可能是生理酸性物质，也可能在另一条件下表现为生理碱性物质，主要由菌的生理特性所决定。如氨基酸作为主要或唯一碳源进行好气性培养时，引起氨的产生，当其量超过菌体需氮量时，就会引起pH值的上升。如果以氨基酸进行厌氧代谢，在脱氨作用时，即产生碱也产生酸。 对于这些由于菌体代谢所引起的pH变化，如果不加以控制的话，必然要干扰微生物反应的正常进行。因此，需要对pH进行控制。 ⑵电极及其测量系统 用电极电位法测量溶液的pH值，可以获得较准确的结果。配合自动电位差计后，就能实现自动记录和监控。 电极电位法的原理是用两个电极插在被测溶液中，电极1为指示电极（如pH玻璃电极），它的电位随着被测溶液的pH变化而变化。电极2为参比电极（如甘汞电极，氯化银电极），其电位固定不变。这两个电极在溶液中构成一组原电池，该电池产生的电动势的大小与溶液的pH值有关，电动势与pH值的变化关系可用下式表示：图  因此，只要准确地测量两个电极间的电动势，就可以测得溶液中的pH值。 根据电极法原理构成的测量装置，既为实验室或工业用的pH计（或叫酸度计）。该装置是由发送器（即电极部分）和测量仪器（如电位差或高阻转换器等）两大部分所组成。对溶液pH值的测量，实际上是由发送器所得的毫伏信号经测量仪表放大指示pH值，此毫伏信号实际上就是由指示电极、参比电极和被测溶液所组成的原电池的电动势。 作为指示电极的玻璃电极是由一种非常薄的球形薄膜玻璃做成。薄膜的厚度一般为0.2 mm，极易破碎。玻璃电极内充有pH值恒定的标准溶液，成为内缓冲溶液。在玻璃电极中插入一根作为电极引出导线用的内电极，一般为电极（银丝或铂丝镀银后再镀），此电极为内参比电极。图 作为参比电极的甘汞电极，它的外壳是一个玻璃管，里面有一根小玻璃管，顶部伸出测量电极电位的引线（或接线柱），引线的下端浸没在汞中。汞的下面有糊状甘汞（），汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会掉下来。图小管的外面充以液。末端用多孔陶瓷作为液与被测溶液沟通点，叫“液洛部”。使用时，要拔去电极上P的橡皮塞，使电极中有少量溶液通过多孔陶瓷渗入到被测液中，实现电极引线和溶液间的电的连通。 电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：  甘汞电极的缺点是其电位随温度的变化而变化，易受温度的影响。常温时电位的稳定性也较差，这方面的性能不及氯化银电极。 电极的结构和原理都和甘汞电极相似。在一根铂丝（或银丝）上涂纯银，然后使其表面覆盖一层膜，将它浸没在盛有溶液的具有毛细孔的玻璃管内。电极电位产生于银与的界面，其电极反应为：  电极电位是由的浓度决定，与被测离子浓度无关。此电极的优点是在较高温度时，电极电位较稳定，一般可以用于250℃以下。 ⑶发酵液pH测量玻璃电极 发酵过程对pH测量电极的要求 a．耐高温灭菌消毒 b．长时间稳定性 c．一定的液洛部流通要求。在发酵液的pH测量过程中，参比电极的溶液不断通过液洛部渗到发酵液中，构成测量系统，为防止杂菌夹带造成污染，微孔直径要小于菌体（一般在3μ左右）。但太小则造成液流不畅。 d．结构要紧凑。指示pH电极与参比电极组成单根装置，便于生产或实验现场装置，这种电极为复合电极。 B．复合玻璃电极 把氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起，形成单根的玻璃装置，使用安装就很方便。如果改变球泡玻璃的组成配方，使能耐高温蒸煮（达135℃），就可以成为一个在发酵工业上广泛使用的pH电极发送器。 它的基本构造和性能在做pH电极校正实验时涉及，不再重复。 ⑷发酵的pH控制 在微生物发酵过程中，是否需要对pH进行控制？用什么介质来控制pH？控制规律如何？要解决这些问题，首先还是发酵工艺问题。 如前所述，由于微生物的生命活动结果，致使周围环境pH发生变化，从工艺角度考虑，要调节控制pH的方案可以有很多种。 配置合适的培养基，选用不同的生理酸性和生理碱性物质，并使培养基 具有缓冲pH作用。 在培养过程中加入酸性或碱性物质，这些酸或碱仅起pH调节作用，不作 为菌体基质消耗。 在培养过程中流加酸碱性的基质，例谷氨基酸发酵中的通氨，既是菌体 消耗的基质，也是pH调节试剂。 流加生理酸性或碱性基质，通过菌体代谢活动达到pH控制。 也有的把 pH控制与代谢调节结合起来，也就是说把pH参数变化作为反 映菌体代谢情况的依据之一，通过加入基质来控制pH，即达到控制代谢调节，达到最高产量的目的。 溶解氧： 在好气性微生物的发酵过程中，必须连续地通入无菌空气，氧由气相溶解到液相，然后经过液流传给细胞壁进入细胞质，以维持菌的生长和产物的生物合成。所以培养液中溶解氧浓度是一个重要的参数。 溶解氧浓度可用化学滴定法，也可用以电化学为基础的电极法及其他的物理方法来测量。 化学滴定法与电极法相比较，溶氧电极法测量有很大的优点：操作简单，受溶液中其他离子干扰小，可以快速连续就地测量，以满足发酵罐等设备中氧浓度的控制要求。因此，DO电极测量在许多领域中，如微生物学、医药生理学、化学工程、机械工程、海洋学、环境保护学等得到广泛应用，出现各种不同用途类型的DO电极。如在发酵罐中使用可蒸汽灭菌的溶氧电极，测量生物组织中氧含量的DO微电极，气体分析中的快速响应氧电极，锅炉给水中的微量氧测量电极等等。 在生物工程中，由DO电极所获得的测试数据不仅可以给出微生物生理生化信息与动态信息，而且还可作为发酵罐放大，发酵中间控制等的基础。 目前市场上已经可以买到可进行高温灭菌的溶氧探头。大多数商品的氧电极都是银－铅电极。如图。每个电极的阴极表面覆盖有一层聚合物膜(如聚四氟乙烯薄膜)，阴极和膜之间含有电解质溶液。这类复膜电极的响应时间较慢（90％的响应为20～200秒），适用于长期监测发酵液的溶氧水平，不适用于氧的浓度快速变化的场所。如果用这些探头测量氧吸收速率的变化，必须用动态法作响应校正。复膜式氧电极对温度变化相当敏感，必须用热敏电阻对电子线路进行温度补偿。 废气中浓度的测定： 监测废气的成分对于发酵过程的研究和控制是很重要的。测量废气中的和的浓度可获得相当多的信息，如发酵罐的氧传递能力、培养物的摄氧率和呼吸商。利用顺磁气态氧分析仪可以测定废气中的含量。在发酵废气中，氧含量一般为19～20％，因此选用量程为0～21％的氧分仪，如果有16％～21％的量程的仪器型号更好。国内现有产品CD－01或QZS顺磁氧分析仪可满足使用要求。除此之外，还有一种时间响应较慢，但价格便宜得多的测定系统。它的测定方法是将废气通入一种溶氧测定装置中，通过测定溶解的氧浓度，换算成废气中的氧含量。如果能控制适当的温度，此方法方便、可靠，但粘度和稳定性比顺磁气态氧分析仪差一些。 废气中浓度的监测： 是微生物的代谢产物，同时它往往也是合成所需的一种基质。它是细胞代谢的不可忽视的指标。一般我们可以通过对发酵尾气的分析来获得废气中的含量。可以用来测量含量的仪表原理较多，如热导式、气相色谱法、电导式电极法和红外分析仪及质谱仪。后两种在发酵工业中较常使用。而热导式分析仪价格较低，稳定性较好，但精度较差 。红外分析仪精度高，可达±1％，量程0～5％，由于发酵排气中一般在3％以下，因此此种分析仪较为理想，根据使用要求可采用不同量程的规格。国产的HQG型或QGS型均能适合连续测量。 也可采用自动分析装置系统。但至今没有一种可以安装在发酵罐内进行在线连续测量的装置。其主要原因是这些装置都不能经受高温蒸汽灭菌的处理。 二、发酵过程中间接参数的获得 前面谈到的都是直接参数的检测，程中，我们可以通过这些直接参数进一步计算获得有关发酵的信息，这些信息就是间接参数。如果把这些有关的传感器与计算机联接成通过按一定计算式而设计的电子线路，就可以直接显示或打印间接参数。例如，当产物的形成和积累与的释放和吸收相关联时，利用pH控制机构向发酵系统中流加酸、碱溶液，根据添加的酸、碱液的积分和微分值，便可获得任意时刻产物的合成速率和产物浓度的数值。再如，当短时地停止发酵系统的供气，根据测定溶解氧的探头测得的溶氧变化情况和电脑的运算，便可以求得发酵系统的体积摄氧率和体积氧传质速率，如图。利用这一方式可以获得任何一种表明发酵过程瞬时状况的系数。 呼吸商RQ是反映发酵系统中微生物细胞生理特性情况的参数，综合反映了菌体细胞对有关营养基质代谢情况的信息，它在数值上等于细胞生命活动产生的的摩尔数与所消耗的氧的摩尔数之比，=（呼吸强度）。在装备有电脑和测定各种直接参数的传感器的发酵系统中，这一参数可由电脑根据各种传感器测定的直接参数随时向发酵操作人员提供。所需的直接参数包括：由顺磁气态分析仪和红外分析仪提供的无菌空气中和发酵系统排出的废气中的氢气和气的分析数据，流量计提供的气体流量和温度计、压力计以及湿度计提供的温度、压力和湿度等数据。当然还需要一个由这些直接参数计算呼吸商的数学模型。电脑还可以随时提供由上述直接参数求得的其它间接参数。如，氧的吸收速率可以从下列氧的平衡式由电脑运算求得：  的吸收速率在氧为限制性基质的条件下与细胞的生长速率有如下的关系：  上式可以重排成便于电脑运算的形式：  根据碳源物质的物料平衡，也可获得碳源物质与微生物细胞生长的类似关系式：  由于发酵液的溶解氧的浓度为ppm级，可以忽略不计。然而C源物质在发酵液中的浓度可高到，故不能忽视。因为目前还缺乏测定发酵液中C源物质的探头，所以不能由上式解出细胞的浓度和生长速率，而必须依赖的平衡来间接估测这两个参数。 第七章 生物反应器中的物质传递 在微生物反应过程中，物质的传递是一个重要的因素。例如基质向细胞内扩散；发酵产物向细胞外扩散；好氧性微生物反应需要充分供给氧气，这些都涉及传质过程。微生物反应过程的传质有几种水平：胞内传质、细胞膜－胞外传质和超细胞传质。 细胞内部的结构是不均一的，各个部位中有着不同的组成、结构和功能。胞内存在蛋白质从核糖体传向细胞膜、RNA从细胞核传向细胞质等传递过程，这些物质的传递对细胞的功能都是极为重要的。目前虽已有人对细胞内的传递提出若干模型，但应用仍有很大困难。并且人们认为，细胞的体积很小，其内部起控制作用的依然是生化反应动力学，并非传质动力学。这意味着细胞内部可被看作混合极好的均一体。 传质的第二个水平是细胞膜和它外部环境之间大的传质。这个传质过程必须足够快，否则将影响细胞的生长。 传质的第三个水平是超细胞传质。由于细胞的外表面常常覆盖有一层粘性多糖物质，使细胞相互粘结在一起。经粘结的微生物颗粒，又会逐渐发展变大，最后形成絮凝体，其尺寸要比单个微生物体大得多，这些微生物体被深深埋藏在絮凝体内部的粘性物质中，它们不能与基质直接接触，反应基质必须以扩散的方式进入絮凝体内部，从而达到微生物体内。 对于需氧的微生物反应，还存在一个氧从气相通过扩散进入液相，进而又经扩散进入絮凝体内部供给细胞进行呼吸的传递过程。因此从宏观来看，整个反应体系存在着气、液、固三相之间的传质。图（氧从气泡传递到细胞的示意图）给出了一个非均相微生物反应过程的示意图。 从图中可看出，氧在传递过程中有下述各项传递阻力： 氧从气相主体扩散到气－液界面的阻力 通过气－液界面的阻力 通过气泡外测的滞流液膜，到达液相主体的阻力 液相主体中的传递阻力 通过细胞或细胞团外的滞流液膜，到达细胞团与液体界面的阻力 通过液体与细胞团之间界面的阻力 细胞团内在细胞与细胞之间的介质中的扩散阻力 进入细胞的阻力 其中①～④项属供氧方面的阻力；⑤～⑧项为耗氧方面的阻力。当单个细胞以游离状态悬浮于液体中时第⑦项阻力消失。 微生物反应是在液相中伴随着微生物生长发生的反应。如果参与反应的底物以不同于液相的其它相加入时，整个反应体系便成为非均相体系。由于底物必须从一个相转移到液相，因此底物在不同相际界面的传递速度极为重要。固定化酶反应体系的物质传递时固－液物质传递的例子。微生物反应体系中可找到气－液、固－液、液－液等体系的物质传递实例。 需氧培养时，气－液体系中氧的传递极为重要。分批反应或连续反应过程中，微生物呼吸和底物微生物氧化所需要的氧，可分别从半分批或连续方式所通入的空气中得到。常温下，与1atm空气相平衡的水中，氧的溶解度很低，仅在10ppm以下。可是每微生物培养体系中却含有1～10亿个细胞。这些细胞的需氧量极高（与自然生态系统比较是个异常现象）。如果反应过程中停止通气，则在几秒钟内溶氧浓度就变为0，因此，如何能比较经济地满足这样高的需氧量是个大问题。 一般微生物反应所需的时间要比化学反应的长，在生产有用物质的成本中，运转费用占的比例非常大，而其中大部分则为供给微生物反应所必需的氧（通气搅拌）的成本。被送入反应器的空气中，被微生物实际利用的氧的比例却又低得惊人（20%以下的占多数），大部分未被利用的氧则从反应器中排出。基于上述情况，需氧微生物反应中氧的传递是很重要的。 最初，生物化学工程是随着第二次世界大战后期兴起的需氧微生物反应（深层培养）、抗生素的大量生产而形成的。也可以说，生物化学工程是从解决供氧问题（送入大量无菌空气，怎样比较经济的满足高需氧量的问题）的必要性饿形成发展起来的。即使在今天，许多化学工程工作者仍热衷于这个课题，在氧传递方面正在从事高性能反应器的开发。 §1.微生物的氧消耗速度与氧的需求 溶解（度）氧 溶解氧是直接影响微生物的环境因素。DO直接参与微生物消耗底物以及菌体生长所必 要的代谢反应，应该把溶解氧看作是一种营养源（底物）。氧属于难溶性气体，其溶解度是在10ppm以下（与1atm空气平衡时的数值，），是极低的。气体的溶解度受气体分压、温度和盐（电解质）浓度等的影响。气相中氧分压的影响服从亨利定律（Henry′s law），用下式表示：  式中为与平衡时的氧溶解度；－亨利常数，因温度而异。下图表示与1atm空气（空气+饱和水蒸汽）相平衡的纯水中的DO与H和温度的关系。气体在盐水溶液中的溶解度比在纯水中的要小，这种现象称为盐类效应，一般可用下列Setchnow式表示：  另外，气体在溶有葡萄糖、蔗糖等非电解质溶液中的溶解度降低。培养微生物用的培养基团因含有多种盐类（这些盐类的浓度比较低）和糖类、氧的溶解度要比图中所示的数值更低。 氧的消耗速度 需氧代谢中，氧是呼吸的最终氢受体（或电子接受者），与氢结合为水。担负这种生化 反应的酶是氧化酶。氧化酶大致可分为细胞色素酶和黄素酶两种。 在有脂肪族、芳香族碳氢化合物等参加的底物的利用过程中，氧被碳氢化合物直接吸收，催化这个反应的酶是加氧酶。 对于一般的微生物反应，总的需氧量是与以燃烧反应为基准的物料平衡也有关系： 碳源燃烧需氧量=菌体燃烧需氧量+氧消耗量+代谢产物燃烧需氧量 即： 式中：根据上式得：  为生成1g菌体的需氧量，等于氧菌体得率的倒数。如常数A、B、C为已知，从上式可以推算。特别是当只以菌体生长为目的时，。上式是个有效的推算法。根据上式，如果菌体得率增加，则氧的需要量减少。 可是，上式缺乏速度概念，这在工程学上并不那么有利的。为了得到同样的菌体量，如果生长速度慢，则单位时间、单位培养液的供氧量，即氧的需要速度就小而且办得到，这是明确的。由于投入动力与氧的需要速度有一定关系，从工程学角度来说氧需求的速度更为重要。已知氧比消耗速度（呼吸速度）的关系式为：   如。如果碳源消耗于菌体、水和外，不生成代谢产物，则可用前式（其中）  因此：  氧消耗速度可从下式得到：   分批操作时，由于及随时间变化，也明显与时间有关。一般，在对数生长期的后半期达到最大，（如果用推算最大值是安全的）。值因所使用菌株、培养条件而迥然不同，约0.05～0.250（）左右。 三、与DO的关系 如果在微生物培养过程中不时取样，并将样品适当量稀释（因为菌体浓度高，DO电极的响应成问题），放入容器中，使其密封，用DO电极测定（溶氧低时最好用精度高的电极测定），跟踪溶氧的变化，可得图（a）所示的曲线。在某值以上时，DO随时间线性地减少，但与DO无关，为一定值；DO在以下，与DO有一定关系，随着DO的降低大致呈双曲线的形式下降。称为临界溶解氧浓度。但这个数值是不严密的；它因测定粘度的不同而略有变化，应该认为它是个粗略的标准。所谓直线地减少，这意味着0级反应，即DO在以上时，细胞内呼吸酶系的酶类完全被氧所饱和，属于酶反应控制。一般，在空气饱和值的百分之几以下。 在<时，对DO的依赖性可认为是由呼吸酶表面的氧不饱和所引起的，多数情况近似于米氏方程式：  在图a中，由于，上式积分得：  四、伴随着生长的氧适应 分批式需氧微生物反应中，改变空气供给（通气、搅拌）的技术，以保持DO一定，这在实验室是可能的，但在工业过程中却不能实施。工厂一般是在空气供给条件恒定的情况下操作的。这样做的结果是DO在初期接近空气饱和值，慢慢地减少，在后半期降低到接近于0，直到静止期再急激上升。这种情况下，微生物适应低水平的DO，其生长活性及呼吸活性就发生变化。酵母是经常用来检查这种情况的例子，需氧培养的酵母有很发达的线粒体，呼吸酶系的生物合成也旺盛；可是随着转移到厌氧条件，线粒体成为空胞构造，逐渐消失，呼吸活性减弱，转而生成乙醇。 一般，DO对微生物的生长速度和呼吸速度将产生影响。如果DO变化，为了适应这种变化，代谢系统也随之而变化，因此代谢产物生成速度也发生变化，然而要将这些复杂的变化定量化是困难的。通常，为了维持需氧代谢，常常控制一定的培养条件，使DO保持在以上。 恒化器式连续操作中，DO维持一定水平，而这个水平可以通过控制稀释率来制定。 §2.气体吸收 气体吸收是气相成分单向往液相扩散溶解的物质传递过程。物质传递速度的机理，主要模型有根据Whiteman建议的稳定模型（1923年提出）与Higbie提供的不稳定模型（1935年提出），前者以双膜学说（two-film theory）。后者以渗透学说（penetration theory）而闻名。从工程学角度说，前者简便，主要适用于需氧微生物的反应器设计。 一般说，溶解气体与液体中的溶质发生化学反应时，反应将影响吸收速度。这样的吸收称为化学吸收。与此相反，不伴随反应的单纯吸收称为物理吸收，两者须加以区分。先简单地说明物理吸收。 稳定模型 这种模型以下列三种假定为前提： 1．在气、液两相的主流内，溶解气体主要通过对流传递，可是沿着气液界面的气、液两侧各存在着层流薄膜，溶质气体只靠分子扩散在两界膜内移动。 2．溶解气体在两界膜内的浓度分布与时间无关（稳定状态）。 3．在界面处，气相中的分压与液相中的浓度之间常常达到平衡，在那里完全不存在物质传递的阻力。 假定在界面气、液两侧的界膜厚度各为，氧分子通过双膜的溶解过程如图示。 通过气膜的传氧推动力为，继续通过液膜时推动力为。在稳定传质过程中，通过两膜的传氧速率应相等。   上式中和均无法测量，故此式无实用价值。为了实用，应将不可测量的参数改写成与之有函数关系并且可以测量的其它参数。 令： 根据亨利定律：  再仿照热力学的方法，用总传质系数代替分传质系数，用总的传质推动力代替分推动力，把前式改写为：  式中 溶氧的浓度是可以测量的，可以算出，故以（）为溶氧推动力比较方便。总传质系数分别与膜传质系数的关系为：  对于氧的难溶于水来说，（H很小），气膜传递阻力与液膜传递阻力相比可忽略，即，因此（）  这是因为氧难溶于水，液膜阻力对溶氧速率起控制作用，相比之下不起明显作用，所以。 上式中的是可以测量的，实用价值比前式进了一步。但其中是每单位界面上每小时的传氧量，由于界面面积不能测量，也不能测量，另外的单位为，也无法直接测量。因此此式仍不实用。 如在上式两边各乘以，－单位体积培养液中气液两相的总界面积（），则得：  是每液体中每小时的溶氧量，是实际可以测量的，据此可以算出。 的单位虽然是，但它是根据单位液体体积的溶氧速率计算出来的，∴称之为体积溶氧系数。 上式是从双膜理论导出的在通气液体中传氧速率的公式，是这个领域内科学试验的基本依据之一。 尽管双界膜理论用于通气搅拌的传质问题不完全符合两相界面的实际情况，但它的研究和建立已有很长久的历史，从理论到解决工程问题的方法都较为成熟，因而目前仍然被认为是工程上解决传质问题的基本理论。 不稳定模型 这个模型是指气体不稳定地被吸收到不紊乱的液体（即静止或层流流动的液体）中的情况。如果含有某一溶解气体的气相与某液体相接触时，则液侧界面近傍的浓度分布随时间变化，不成为稳定状态。若只考虑不稳定分子扩散的吸收，则在时间内平均吸收速率可用下式表示：   比较和上式，则渗透学说中的具有这样的意义： 要使用不稳定模型，必须明确地知道接触时间，因此，不稳定模型可适用于（濡壁塔那样的流态）和界面明确的设备，但不适用于像通气搅拌、气泡塔和填充塔之类实用的吸收设备。 影响的因子 需氧微生物反应器的性能，用体积系数表示，体积系数高的设备性能好。当然，为了提 高性能，只要增加就可以了。值决定于设备的特性及操作条件，至于怎样的设备较为恰当，则难以得出一般的关系式。另外，培养液中含有各种盐类、表面活性物质和微生物（认为是一种微粒子），它与纯水有显著的不同，在含有这些因子的微生物反应中，要得到实际的的相关式更加困难。 一般受液体流动状态的影响，可是在实际设备中其依赖性不强。因此，决定值大小的主要是值的大小。 气泡群的多大呢，可参考通气搅拌罐中从各种浓度的甘油水溶液对的吸收实验所求得的Calderbank与Moo-young的相关式（如图示）。直径在0.8mm以下的气泡犹如钢体球的性质，用下式表示：。气泡直径在2.5mm以上，气泡变形成为旋转椭圆体，界面变动的结果，增大，用下式表示：。 上两式中：Sherwood数： Grashof数： Schmidt数： 在用前两式表示的范围内，不依赖于，但如图所示，当0.8mm<<2.5mm时，依赖于。用水为吸收剂的常用气体吸收设备，可认为在1左右。 值与气体负荷成正比例，与平均气泡直径成反比，三者之间存在下列关系：  设不通气时的液体深度为，通气时的液体深度为，为了与的定义基准相配合，可按下式定义：  另：可按下式定义： 式中，是直径为的气泡个数。 以上是关于的概念。 下面将叙述与微生物培养体系有关的几个重要因素。 培养液中含有多种盐类，其离子强度约为0.2～0.5左右。若离子强度增加，则增加，增加的程度随投入动力的增大而加大，有时可增加到纯水的5～6倍。在盐类溶液中，气泡群细小且难以合并，滞流气体也处于增多的倾向。有时因微生物反应而分泌表面活性物质，致使微生物反应液容易起泡。譬如纯水中加入少量表面活性物质有时略有增加；反之，也有减少的情况。可以认为微生物气体吸收不仅使反应受到影响，而且作为悬浮微粒子的微生物也使体系受到物理的影响。将死亡菌体悬浮于培养基中，根据值测定的实验结果，可知道不论是酵母还是丝状菌，其值都降低。 体积溶氧系数的测定方法 气体吸收的体积传递系数，可采用下列几种方法测定： ①亚硫酸盐氧化法 ②极谱法 ③氧的物料衡算法 ④溶氧电极法 用上述各种不同方法测出的结果互相不能比较，因为方法的机理不同。用同一方法测得 的结果才能相比较。 ㈠亚硫酸盐氧化法（经典方法） 原理：常用，它在溶液中浓度1M左右时，在相当大的范围内，并在存在时，被氧化的速度很快，氧溶解速度控制了氧化反应。  这个反应是基团反应，反应级数随浓度、DO和用作催化剂的浓度的范围而不同，而且以外的微量金属离子的存在大大影响反应速度的敏感性。  每分钟溶解氧的摩尔数：  用亚硫酸盐氧化法测体积溶氧系数 将上面实验测定的代入：式可算出。 在亚硫酸盐氧化法中，由于水中的的催化下很快被溶氧所氧化，成为，所以在整个氧化过程中，溶液中溶氧的浓度为，即。另外，在25℃、1atm下，空气中氧的分压为0.21atm，与之相平衡的纯水中的溶氧浓度。但在亚硫酸盐氧化法的具体条件下，规定。 已知： ∴ ㈡溶氧电极法（最先进、最合理的方法） 优点：①耐高温 ②连续测量 1．原理：把溶解氧转化为电流信号图 阳极： 阴极： 电流直接指示溶解氧浓度  半透膜只允许与表面贴得很紧  氧的流动速率：     要求材料透氧能力越小越好。  （）       半透膜的厚度一般是1～2密尔（） 2．应用溶氧电极测定 通气搅拌系统的体积传氧系数（）为溶解氧积累：    用此式测定时，先在培养过程中的某一时刻停止通气（A点），根据溶解氧浓度随时间的增加而减少的数据求出。    然后在溶解氧浓度下降到某一点（B点），再开始通气，C随着时间增加而增大，得值（即曲线的斜率）  假定从通气停止过渡状态期间所求得的适用的话，则可用前式作出像图b那样的图，并推算出和值。 还可利用稳定状态的培养系统来测定。例如（恒化器）连续培养时，式 左边为零。  稳态时可由通气进出口的氧分压差求得：  式中：  根据电极显示值求C值 如果温度为T时，水被空气所饱和，可得到氧分压式：  当总压为1bar，温度为20℃时，  将水蒸汽分压忽略，则 相应的浓度可根据Henry定律计算：    温度T=30℃时水中氧的亨利常数 （T=30℃）（查表得）  液相氧的饱和浓度值 将电极显示值E(%饱和)换算成氧浓度为  若E=100，则  测定的三个用途： 对生物反应器的传氧性能进行测定，以便选择最佳条件进行操作，并对其进行评价。 对发酵过程传氧性情况进行了解，以便判断发酵过程的供氧情况。 为通风罐的研究过程找出设备参数（如），操作变数（如N－搅拌器转数 Q－通风量）与的关系，以便进行运用发酵罐的放大和合理设计。 第八章 生 物 反 应 器 尽量减少杂菌和噬菌体污染是微生物反应器所必须具备的第一个条件。反应器内壁和管道焊接的部分，要求平滑、无裂缝和塌陷。此外，阀门应保持清洁。所有阀门和接管处必须用蒸汽灭菌。容器主体的结构要简单、容易清洗。当反应器受到的外压略大于内压时，要防止液体和空气从反应器外流入器内。 根据反应是否需要氧气为基准，微生物反应器可分为需氧微生物反应器（通气发酵罐）和厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐）。厌氧微生物反应器，除了必须具备上述对付杂菌和噬菌体的措施外，还要很好地考虑温度和pH控制方便，那么，这种反应器的设计和操作还是比较容易的。对于设计需氧微生物反应器，除了考虑对付杂菌污染和温度、pH容易控制外，还要求尽量降低动力费用和提高溶解氧容量传质系数。 通常，可先设计出实验室规模的各种型式的反应器，但真能应用到工业上的只有少数几种类型。除了一、二种型式外，大部分微生物反应器都是针对微生物悬浮在培养基中的，统称为深层发酵罐的形式。 §1.通气搅拌罐 通气搅拌罐是最常用的需氧微生物反应器，典型的形式如图示。反应器主体用不锈钢制造，搅拌桨叶有平叶涡轮式或弯叶涡轮式。实验室规模的反应器中，一般采用一挡搅拌器，而工业规模反应器则装配两挡以上的搅拌器。安装搅拌轴的轴承必须无菌密封。罐内装配4～6块挡板。无菌空气从分布器或喷咀吹进；罐温用夹套或蛇管调节。操作时，为要使气体和气泡能停留在反应器的液面上部空间，液体装量只能装到占反应器总容积的70～80％。培养液容易产生泡沫，须用机械方法破泡或加消泡剂消泡。如培养液直接在罐内用蒸汽灭菌，则蛇管需有相应的传热面积，以配合灭菌后冷却需要。反应过程中所产生的热量来自微生物反应热和克服搅拌粘性应力所消耗的能量。对间歇操作，则以前者为主，可以微生物反应热的最大值作为设计基准。 通气搅拌罐有下列优点：⑴ pH和温度容易控制 ⑵尺寸放大的方法大致已确定 ⑶适用于CSTR等。反之，也有下列缺点：⑴搅拌功率消耗大 ⑵因罐内结构复杂，不易清洗干净，易被杂菌污染。此外，虽装有无菌密封装置，但在轴承处还会发生杂菌污染。 ⑶培养丝状菌时，常用搅拌桨叶的剪切力致使菌丝易被切断，细胞易受损伤。 机械搅拌发酵罐 搅拌的作用：①液体通风后进入的气泡在搅拌中随着液体旋转使之所走路程延长，使发酵液中保持的空气数量增加，实际上是增加了传质量。②通过搅拌，大气泡被搅拌器打碎，增加比表面积。③搅拌速度越快，搅拌雷诺准数增加，增加了传氧速率。。 发酵罐的基本条件 发酵罐应具有适宜的高径比。一般高度与直径之比为1.7～4倍左右，罐身越高，氧的利用率较高。 发酵罐能承受一定的压力：因为罐在消毒及正常工作时，罐内有一定的压力（气压和液压）和温度，所以罐体各部分要能承受一定的压力。 发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧。 发酵罐应具有足够的冷却面积。这是因为微生物生长代谢过程放出大量的热量必须通过冷却来调节不同发酵阶段所需的温度。 发酵罐应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底。 搅拌器轴封应严密，尽量减少泄漏。 发酵罐罐体的尺寸比例 罐体各部分的尺寸有一定的比例，罐的高度与直径之比一般为1.7～4倍左右，新型的高位罐高：径=10以上，其优点使大大提高了空气的利用率，但压缩空气的压力需要较高，料液不易混合均匀。 发酵罐通常装有两组搅拌器，两组的间距s约为搅拌器直径的三倍。大型发酵罐，可安装三组以上的搅拌器。最下面一组搅拌器与风管出口较近为好，与罐底的距离c一般等于搅拌器直径，但也不易小于，否则会影响液体的循环。最常见的发酵罐各部分比例尺寸如图（《发酵工程与设备》）。 发酵罐的部分部件 ①搅拌器和挡板 搅拌器分平叶式、弯叶式、箭叶式三种，国外多用平叶，我国多用弯叶。其作用式打碎气泡，使空气与溶液均匀接触，使氧溶解于醪液中。平叶式功率消耗较大，在同样雷诺准数时，提供溶解氧多；箭叶式，较小，混合较好，适合于菌丝体发酵液，因为剪切力小，弯叶式介于二者之间。 挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。挡板宽度一般为（0.1～0.2）D，装设4～6块即可满足全挡板条件。全挡板条件是指在一定转数下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。达到全挡板条件的要求，须满足：  竖立的蛇管、列管、排管等，也可起挡板作用，故一般具有冷却列管式的罐内不另设挡板，但对于盘管，仍应设挡板。挡板的长度从液面起至罐底为止。挡板与罐壁之间的距离为，避免形成死角，防止物料与菌体堆积。 ②消泡器 消泡器的作用是将泡沫打破。最常用的形式有锯齿式、梳状式及孔板式。孔板式的孔径约10～20mm。 ③空气分布装置 空气分布装置的作用是吹入无菌空气，并使空气均匀分布。分布装置的形式有单管及环形管等。常用的是单管式，管口正对罐底中央，与罐底的距离约40mm，这样的空气分散效果较好。距离过大，分散效果较差，这可根据溶氧情况适当调整。空气由分布管喷出上升时，被搅拌器打碎成小气泡，并与醪液充分混合，增加了气液传质效果。环形管的分布装置以环径为搅拌器直径的0.8倍较有效，喷孔直径为φ5～8mm，喷孔向下，喷孔的总截面积约等于通风管的截面积。这种空气分布装置的空气分散效果不如单管式。同时由于喷孔容易堵塞，现已很少采用。通常风管内空气流速取。 通风量在时，气泡的直径与空气喷口直径的次方成正比，也就是喷口直径越小，气泡直径越小，而氧的传质系数越大。但实际生产的通风量均超过上述范围，此时气泡直径与风量有关，而与喷口直径无关，所以单管的分布装置的分布效果并不低于环形管。 ④轴封 轴封的作用是使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄漏和污染杂菌。常用的轴封有填料函和端面轴封两种。 填料函式轴封是由填料箱体，填料底衬套，调料压盖和压紧螺栓等零件构成，使旋转轴达到密封的效果。 填料室的宽度可根据轴封的直径决定，其宽度为：   填料室的高度为： 填料函式轴封的优点是结构简单。主要缺点是：①死角多，很难彻底灭菌，易渗漏和灭菌 ②轴的磨损较严重 ③填料压紧后摩擦功率消耗大 ④寿命短。因此目前多采用端面式轴封。 端面式轴封又叫机械轴封。密封作用是靠弹性元件（弹簧、波纹管等）的压力使垂直于轴线的动环和静环光滑表面紧密地相互贴合，并作相对转动而达到密封。 优点：①清洁 ②密封可靠，在较长地使用期中，不会泄漏或很少泄漏 ③无死角，可以防止杂菌污染 ④使用寿命长，质量好的可用2～5年不需维修。 ⑤摩擦功率耗损小，一般为填料函式的10～50％。 ⑥轴或轴套不受磨损 ⑦它对轴的精度和光洁度没有填料函那么要求严格，对轴的震动敏感性小。∴在工厂得到广泛应用。但结构比填料函复杂，装拆不便，对动环和静环的表面光洁度及平直度要求高，否则易泄漏。 部分参数的计算 ⑴溶解氧容量传质系数 对一挡搅拌器而言，的经验式大体上可整理为通气时罐内单位体积液体所需功率和通气线速度的函数， 即  式中：，根据搅拌罐所需功率的知识，即，则上式也可整理为：的形式，多挡搅拌器的大型反应器中，可采用通用式表示：  式中：上两式中，通气项以表示。微生物反应器的通气量则可用单位vvm表示。它是指单位体积培养液单位时间（分钟）中通入的空气体积，通常为1～2 vvm。 ⑵所需功率 有挡板条件下，如不通气时搅拌所需功率为，按照J.H.Rushton等的研究，可将搅拌功率整理为以搅拌桨叶直径为基准的雷诺数对功率准数的关系。湍流状态时=常数，常数值决定于搅拌器形状。详见化学工程手册等。但Rushton关系式中的的却不包括传动和动力传递部分所需的功率，它只代表有效的搅拌功率。 通气情况下，搅拌所需功率大为减少。通气时搅拌所需功率的改良式为：  时搅拌电动机所消耗的功率。尽管反应器的类型不同，容积不同（30～42）和结构不同，但上述关系总是成立的。此外，通气搅拌罐的总消耗功率等于通气时的搅拌所需功率与通气本身所需功率之和。 自吸式发酵罐 自吸式发酵罐是一种不需要空气压缩机，而在搅拌过程中自吸入空气的发酵罐。这种发酵罐起源于六十年代，最初用于醋酸的发酵，转子的转数为，吸气比为0.07vvm。这种设备的耗电量小，能保证发酵所需的空气，并能使气泡分离细小，均匀地接触，吸入的空气中70～80％的氧被利用，使酒精转化为醋酸的转化率达96～97％，每吨醋酸发酵液耗电量约为。 在我国，自吸式发酵罐已用于医药工业、酵母工业、生产葡萄糖酸钙、力复霉素、维生素C、酵母、蛋白酶等。取得了良好的成绩。通过实践，证明自吸式发酵罐有这些优点： 节约空气净化系统中的空气压缩机、冷却器、油水分离器、空气贮罐、总过滤器设备，减少厂房占地面积。 减少工厂发酵设备投资约30％左右，例如应用自吸式发酵罐生产酵母，每升容积酵母的产量可高达30～50g。 设备便于自动化、连续化，降低老定强度，减少劳动力。 酵母发酵周期短，发酵液中酵母浓度高，分离酵母后的废液量少。 设备结构简单，溶氧效率高，操作方便。 缺点：由于罐压较低，对某些产品生产容易造成染菌。 工作原理：自吸式发酵罐的构件主要使自吸搅拌器和导轮，又称转子及定子。转子由罐底向上升入的主轴带动，当转子转动时空气则由导气管吸入。在转子启动前，先用液体将转子浸没，然后启动马达使转子转动，由于转子高速旋转，液体或空气在离心力的作用下，被甩向叶轮外缘，在这个过程中，流体便获得能量，若转子的转速愈快，旋转的线速度也愈大，则流体的动能也愈大，流体离开转子时，由动能转变为压力能也愈大，排出的风量也越大。图当转子空膛内的流体从中心被甩向外缘时，在转子中心处形成负压，转子转速愈大，所造成的负压也愈大，由于转子的空膛用管子与大气相通，因此大气的空气不断地被吸入，甩向叶轮的外缘，通过导向叶轮而使气液均匀分布甩出。由于转子的搅拌作用，气液在叶轮周围形成强烈的混合流（湍流），使刚离开叶轮的空气立即在循环的发酵液中分裂成细微的气泡，并在湍流状态下混合，翻腾，扩散到整个罐中，因此自吸式充气装置在搅拌的同时完成了充气作用。 带升式发酵罐 机械搅拌发酵罐其通风原理是罐内通风，靠机械搅拌作用使气泡分割细碎，与培养基充分混合，密切接触，以提高氧的吸收系数；设备构造比较复杂，动力消耗较大。采用带升式罐可以克服这些缺点，其特点是：结构简单，冷却面积小；无搅拌传动设备，节约动了约50％，节约钢材；操作无噪音；料液可充满达80～90％，而不需加消泡剂；维修、操作及清洗简便，减少杂菌感染。缺点：不能代替好气量较小的发酵罐，对于粘度大的发酵液溶氧系数较低。 工作原理：在罐外装设上升管，上升管两端与罐底及罐上部相连接，构成一个循环系统。在上升管的下部装设空气喷咀，空气喷咀以250～300（）的速度喷入上升管，借喷咀的作用使空气泡分割细碎，与上升管的发酵液密切接触。由于上升管内的发酵液轻，加上压缩空气的喷流动能，使上升管的液体上升，罐内液体下降而进入上升管，形成反复的循环，供给发酵液所耗的溶解气量，使发酵正常进行。 伍式发酵罐 伍式发酵罐的主要部件是套筒、搅拌器。 图 搅拌时液体沿着套筒外向上升至液面，然后由套筒内返回罐底，搅拌器是用六根弯曲的空气管子焊于圆盘上，兼作空气分配器。空气由空心轴导入，经过搅拌器的空心管吹出，与被搅拌器甩出的液体相混合，发酵液在套筒外侧上升，由套筒内部下降，形成循环。这种发酵罐多应用纸浆废液发酵生产酵母。设备的缺点是结构复杂，清洗套筒较困难，消耗功率较高。 五、文氏管发酵罐 图 用泵将发酵液压入文氏管中，由于文氏管的收缩段中液体的流速增加，形成真空将空气吸入，并使气泡分散与液体混合，增加发酵液中的溶解氧。 这种设备的优点是：吸氧的效率高，气、液、固三相均匀混合，设备简单，无须空气压缩机及搅拌器，动力消耗省。据实验证明：收缩段中液体的雷诺准数在以上时，气体的吸收率最高。如果液体流速再增高，虽然吸入气体量有所增加，但由于压力损失也增加，动力消耗也增加，总的吸收效率反而降低。其缺点是：气体吸入量与液体循环量之比降低，对于耗氧量较大的微生物发酵不适宜。 此设备已适用于宇宙飞船的密封舱中，利用藻类的光合作用将气体中的还原成氧。如果氮气中含有4％，利用文氏管装置只要一个循环就可使其中的降低到2％。此外，在污水处理和石油发酵中也正在研究使用。 六、塔式发酵罐 图 塔式发酵罐又叫空气搅拌高位发酵罐，其特点是：罐子高，高：径=6左右，罐内装有导流筒。由于液位高，空气利用率高，节省空气约50％，节省动力约30％，不用搅拌器，设备简单，但底部有沉淀物；温度高时降温较难。塔式罐适用于多级连续发酵，有的多级连续发酵具有十多层筛板。我国有用于医药抗生素产品的生产。 §2. 发酵罐的比拟放大 比拟放大所要解决的问题就是通过实验室里用小型设备进行科学实验，获得了满意的高产量和高效率后，再把这些成果再大的生产设备装置中予以再现。 比拟放大的基本方法，首先是必须找出系统中的各有关参数，把这些参数组成几个具有一定物理含义的无因次数，并且建立它们之间的函数式，然后用实验的方法在试验设备里求出函数式中所包含的常数和指数，则这个关系式便可用作与此试验设备几何相似的大型设备的设计。这个方法也就是化工过程研究常采用的基本方法之一。 而发酵过程不单纯是化工过程，它是一个复杂的生物化学过程。它受到了外因（环境因素）和内因的影响。外因参数如：培养基、温度、pH、氧化还原电位、溶氧速率、物理和流体力学因素（粘度、搅拌强度、混合时间、通风量）等；内因有微生物活性。有些因素目前已被认识了，但尚不能测量和控制，有些则尚未被认识。在设计研究过程中，我们假定有些因素是不变的，只研究少数参数对发酵过程的关系，并在此基础上进行比拟放大。 发酵罐的比拟放大，以什么为比拟的基准呢？这要对具体情况作具体的分析。首先要从大量的科学试验的材料中，把握住影响生产过程的主要矛盾和次要矛盾，在着重解决主要矛盾的同时不使次要矛盾过分激化。 微生物反应通风搅拌罐放大的方法有这样几种： 以体积溶氧系数为基准的放大。 以单位培养液体积搅拌功率（）相等为基准的放大。 以搅拌涡轮尖端线速率（）为基准的比拟放大。 以混合时间（）相等为基准的比拟放大。 一、以体积溶氧系数为基准的比拟放大法 有的菌种在深层培养时耗氧速率很快，因此，溶氧速率能否与耗氧速率平衡就成为生产成败额限制性因素。耗氧速率可以用实验法测定，即在小试验罐里，用适当的仪器测量记录醪液中溶氧浓度，先正常通气搅拌，溶氧水平为图中的AB线，此时溶氧的供需是平衡的；然后停止通气而继续搅拌，醪中溶氧为菌体所耗用而直线下降。到C点以后溶氧浓度下降的速度显著缓慢下来，进而成为水平线段，表示菌体的正常代谢活动停止。C点所表示的溶氧浓度即为临界溶氧浓度。从BC为直线可以认为当醪内溶氧浓度高于时，菌体耗氧速率与醪内溶氧浓度无关，因此，过高的溶氧是不需要的。另外，从BC线的斜率可以算出菌体的耗氧速率（）或（），也可算出醪内溶氧浓度变化速率。 如果上述试验是在菌体耗氧速率最高阶段进行的，那么当耗氧最盛时，溶氧浓度达到溶氧供耗平衡的条件为：  －体积溶氧速率 式中和为实验测得的数值。若约为5％饱和度，即左右。已知。 则此发酵过程应该具有的值应比上述计算值略高，否则，当耗氧最盛时，醪内溶氧将有可能降至以下。 实验证明，有的菌株能在很短的时间内就把接近饱和的溶氧消耗降低到，有的则需要较长的时间。对于前者，供氧问题显然是主要矛盾。用溶氧系数相等的原则比拟放大设备是合理的。 二、以单位培养液体积搅拌功率相等为准则的放大 的放大，即为放大，因为这个量与密切相关，而且很容易测量。（是两只涡轮不通气时的搅拌功率） 例： 公称容积 罐径 圆柱部分高 总高 封头高 料液高 搅拌直径 （） （） （） （） （） （） 试验罐500 700 1400 1800 200 1180 245 生产罐10000 1800 3600 4550 475 3000 630（几何相似）  1．（搅拌转速）的确定：      2．通风量 (代表大罐，－小罐) 通风准数： （）  3．计算不通风搅拌功率     差一点，是计算上的误差     按单位体积搅拌功率为基准的放大在10~20倍时计算简单方便，放大倍数太大就不准确了。 此式适合于牛顿流体（如细菌发酵、基质为糖蜜的是牛顿流体、霉菌、放线菌发酵不是）。牛顿流体的主要特征是其粘度μ只是温度的函数，与流动状态无关；非牛顿流体的粘度不仅是温度的函数，而且随流动状态而变。 三、比拟放大的其他准则 按剪率放大准则 发酵液离罐壁越近，线速度越小。 图 在搅拌区域以外， 在放大罐时，搅拌器叶片半径愈大，愈大。 同一罐内：   即：  若：， 则： 比较： 相等按几何相似放大：   不管什么发酵，我们选择叶轮线速度，超过这一范围，一般是不 适合的。 剪率大，能将气泡分散得很小，但太大对菌丝体有害。 同一罐内，搅拌器直径小的剪率>搅拌器直径大的剪率 混合时间（） 加一滴其他物质（如红墨水），它每一分子都均匀分散在发酵液中的时间为混合时间。。 搅拌液流速度压头（）和搅拌液流循环量（） 比值对比拟放大的影响：   （）  则：  同一罐中： 令：  则：  即在同一罐中，放大搅拌器直径速度头降低了，但增加了，这是一对矛盾。大可提高传氧速率，大可缩短混合时间。   结论：同一罐中，    几何相似放大过程中：    单位体积醪液循环量：  ，因此在放大过程中，一定是增加的，但这并不影响放大，因放大时，总体积量增加，因此，实际上单位体积醪液循环量可能下降。  对发酵是有影响的，而一般放大时总比小罐的小，因此往往下降，设计时也要考虑这一点。 四、不同基准比拟放大结果的比较 1．恒混合时间不变     2．恒剪率   3．恒不通风单位体积搅拌功率  4．按通风情况下单位体积搅拌功率相等进行放大     即    5．不变情况下放大       恒时：  ①如果要兼顾，恒，且     解得：  即 显然这时不存在几何相似。 ②要求恒，恒    由A式： 代入B式     由此可见，如要兼顾恒和恒，必须要放弃几何相似，而朝增大和降低（搅拌器）方向移动。 由上可见，发酵工程的比拟放大，由于涉及到微生物复杂的代谢活动，已经是一个非常复杂的问题，如果再加上醪液的非牛顿特性，更增添了复杂的因素。主要表现在影响生产过程的矛盾错综复杂，而且对它们之间的互相制约和联系的情形所知不深，往往解决了这个矛盾又激化了另外的矛盾。要成功地进行比拟放大发酵过程地关键在于对其全部地生物化学反应进行更全面的了解，只有掌握了控制生成预期产物的机理，才能把比拟放大建立在正确的实验基础上。