核磁共振波谱 及其在
生物学中的应用
2003年 9月 4日
联系方法
生命科学学院结构生物学实验室
施蕴渝 3607464
yyshi@ustc.edu.cn
牛小刚
教材
核磁共振原理及其在生物学中的应
用 夏佑林，吴季辉，施蕴渝
学习方式
上课，阅读，作业，
? http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/nmr-
main.htm
? http://www.ch.ic.ac.uk/local/organic/nmr.html
? http://www.spincore.com/nmrinfo/
在大规模测序完成后
蛋白质科学成为新的科学前沿
蛋白质是生物学功能
的主要承担者
"Proteins are central to our
understanding of cellular function
and disease processes,and without a
concerted effort in proteomics,the
fruits of genomics will go
unrealized."
Nature 409,747 (2001)
人类：
约 3-4万个基因
大约 10万个蛋白
发现新蛋白,测定新结构,揭示新功能
基因组研究为蛋白质科学研究
创造了前所未有的机遇
蛋白质组学
活细胞水平上生物学功能
分子机制
现有 483个药物分子靶标，在
未来结构基因组学研究中可能
扩大 10-20倍。
创新药物的研究的基础
PDB Holdings List,2-Sep-2003
Molecule TypeProteins,
Peptides,
and
Viruses
Protein/Nu
cleic Acid
Complexes
Nucleic
Acids
Carbohy
drates total
E
x
p
,
T
e
c
h
.
X-ray
Diffracti
on and
other
17415 841 689 14 18959
NMR 2737 93 540 4 3374
Total 20152 934 1229 18 22333
? 在日本第三代同步辐射光源 Spring-
8同步辐射工厂已于 1997年 10月建成，
其中有 4条结构生物学光束线,2条
结构基因组专用光束线。
RIKEN NMR Park
规模化的核磁实验室
900 MHz x 4
800 MHz x 6
600 MHz x10
进一步发
展为 40台
蛋白质三维结构测定的主要方法
?X-射线晶体衍射，
?NMR
?电镜三维重构
?交叉学科
核磁共振波谱技术
?PDB 数据库中 15-20%结构 由
NMR测定
?PDB数据库中,NMR测定的结构
75%无晶体结构
?精度相当 2.0-2.5 A的晶体结构
? 最大 MW 30KD 260个残基
? 预期上限 60~70 KD
?发展迅速,国际上给以极大重视
生物大分子的复杂性
推动核磁共振波谱学的发展
? 1946年,Purcell和 Bloch观察到核磁共
振现象。于 1952年获得 诺贝尔物理奖
? 1945-1951年间，化学位移和自旋偶合的
发现,NMR技术的化学应用。
? 1953年 世界上第一台商品化 NMR谱仪,
? 1964年 世界上第一台超导磁场的 NMR谱
仪
? 1971年 世界上第一台脉冲傅立叶变换 NMR
谱仪
NMR在生物分子中的应用
? 开始于 50年代
? 困难
?1976年 R.R.Ernst发表了二维核磁共振的理论
和实验的文章。获得 1991年 诺贝尔化学奖
? 1979年 开始瑞士 K.Wuthrich发展了用核
磁共振波谱测定生物大分子溶液结构的
方法 首先将 2D-NMR的方法用于蛋白质，
1982年发表了用 2D-NMR对蛋白质 1H谱进
行分析的系统方法。
? 1998年提出 TROCY方法,2002年获 诺贝尔
化学奖 The 2002 Nobel Prize in
Chemistry:
600MHz TXI 1H{13C/15N} with Z-gradient
0.5 mM Lysozyme
90% H2O
10% D2O
50 mM NaCl
56 min.
2D NOESY
多维异核核磁共振
?90年代
? 13C,15N标记,多维异核核磁共
振波谱
? 2D NMR < 100个残基
?3D,4D NMR 15~35 KD
?相当 2.5A 分辨率晶体结构
?
?
多维 NMR
CBCA(CO)NH triple
resonance spectrum of 2mM
RNase T1 in
90% H2O taken with
a 600MHz Triple Resonance
1H{13C/15N} NMR CryoProbeTM
with Z-gradient,Experiment
time for the full 3D spectrum
was 3.8h and 2 scans were
accumulated for each
increment,The experiment
time for the first 1H,13C plane
of the CBCA(CO)NH
experiment was 6min.
生物大分子核磁共振技术
不断发展
核自旋体系演化的密度算符理论
新的实验方法,新的脉冲序列
样品制备技术,标记技术
计算生物学,生物信息学
90年代末结构基因组学
对 NMR技术提出新的要求
1.快速测定蛋白质的三维结构
2.分子识别,测定复合物的三维结构
蛋白质 -蛋白质
蛋白质 -核酸
蛋白质 -配基
3.分子柔性与运动性
4.膜蛋白
新实验方法
生物样品新的标记方法
? 13C/15N/ 2H标记蛋白质
? 13C/15N/标记 DNA和 RNA
? 选择性标记
? 自旋标记
Residual dipolar couplings实验
有希望用较少的实验数据
快速解出蛋白质结构
residual dipolar couplings实验
Residual dipolar
couplings are
proportional
to (3 cos2 q -1)
The additional information from magnetic
interactions in partially aligned molecules
allows the alignment of parts of the
structures that are not well constrained by
NOEs.0
J,H,Prestegard Nature Stuctural Biology,NMR II Special Issue,1998
TROSY 实验
transverse relaxation
optimized spectroscopy
CRINEPT 实验
分子量极限被突破
250kD
Line Width vs Frequency in TROSY
?c (ns) Mr
320 800,000
60 150,000
20 50,000
dN-H 0.104 nm
HSQC vs TROSY,Aldolase (78 kDa,1 mM !)
Through Hydrogen Bonding
Cross-hydrogen bond 3hJCO,N coupling constant:
Correlation between 3hJCO,N coupling constant value
and the hydrogen bond length,RNO:
RNO = 2.75 -0.25ln(3hJCO,N)+-0.06
3hJCO,N coupling constants give valuable additional
information for a structure refinement
90年代末核磁共振波谱技术的
新进展
高场超导核磁谱仪的使用
900MHz
? 800MHz
高磁场谱仪
? 分 辨 率, ??? ?a (B0)
? 灵 敏 度, S/N ? ? 5/2 (B0)3/2
? 磁各向异性, m ? (B0)2
? 弛 豫 率, R1,2 ? f (B0)
NMR Sensitivity & Dispersion
1H freq,0.1% EB Resolution Price
S/N CH2 ($)
600MHz 1200:1 1.00 800k
700MHz 1512:1 1.17 1,400k
800MHz 1847:1 1.33 2,000k
900MHz 2110:1 1.50 4,500k
低温探头 CryoProbe
30K
Sensitivity 500MHz ~1-1.5GHz
节约测量时间
低样品浓度
Experiment Time Comparison
a) sensitivity specification for standard TXI 5mm,
0.1% ethylbenzene,
500MHz,900:1
b) sensitivity specifications for CryoProbeTM TXI 5mm,
0.1% ethylbenzene:
500MHz,3000:1
600MHz,4000:1
800MHz 6000:1
c) relation between experiment time and sensitivity*:
experiment time = (SNCryoProbe/SNstandard probe)2
* assuming ideal conditions
Experiment Time Comparison
0 20 40 60 80 100
5 0 0 M H z
6 0 0 M H z
8 0 0 M H z
Ex p e r i m e n t ti m e s, C o m p a r i s o n c o n v e n ti o n a l v e r s u s
C r y o Pr o b e s
C r y o P r o b e
C o n v e n t i o n a l P r o b e
%
2.8%
6.3%
11%
Automated structure analysis
生物大分子 NMR能提供什
么重要信息
NMR在生物大分子上的应用
? 蛋白质三维结构测定,原子分
辨率下的结构与功能研究
? 分子柔性与运动性
? 复合物结构测定,分子识别
? 膜蛋白
? 溶液,不需要结晶
核磁共振在生物科学
中的主要应用
?测定生物大分子空间结构
?研究生物大分子与配基的相互作用
?测定生物大分子的动力学性质
?跟踪蛋白质的折叠过程,捕获折叠过程中瞬态中
间物
?测定可滴定基团的解离常数
?测量溶液中分子的扩散系数
?研究酶反应机理
?跟踪活细胞的代谢过程
?用于医学成像以及神经科学中的脑功能成像
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
膜蛋白
? 受体，离子通道 药物作用靶点
? PDB 数据库中 < 30个膜蛋白,
? ~16000水溶性蛋白
? 人 ~36000个基因
? ~10万个蛋白质
? 真核细胞中 ~30% 膜蛋白
? < 0.2%膜蛋白结构已知
膜蛋白结构
? 蛋白质晶体学,电镜三维重构
? NMR 小肽 <50 残基,蛋白质
? 在去垢剂形成的微胶囊 (micelles)中,液体
NMR
? 在去垢剂或脂形成的双层微胶囊 (bicelles)
中,液体 NMR
? 在脂形成的脂双层 (bilayers),
? 固体 NMR
蛋白质动力学
? 蛋白质运动性和功能有密切关系
? 酶的柔性运动性与酶反应机理
?
? NMR弛豫时间
? 1H/2D 交换速率
药物设计和筛选
? 高通量筛选
? 设计，筛选结合
?SAR－ By-NMR 药物筛选
药物设计和筛选
蛋白质折叠 –去折叠研究
? Schematic diagram summarizing the roles of unfolded,partially
folded proteins,and misfolded proteins in biology.
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
捕获折叠过程中瞬态中间物
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
用 NMR连续监测蛋白质复性过程
? Stopped-flow 19F NMR spectra of the refolding of 6-19F-tryptophan
labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase following dilution from
5.5 to 2.75 M urea at 5 ?C in the presence of 3.8 mM NADP+
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
平衡常数测量
A B ABk k? ? ?? ?
?1 1,
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
围棋高级认知功能的 fMRI研究
1.围棋 -高级智能 中华文化瑰宝 2.专业棋手 -高级智能学习
3.围棋 -象棋比较, 为人工智能提供启示
国际象棋：计 算 机 -战胜 -世界冠军
围 棋：业余棋手 -战胜 -计 算 机
反射
镜
BLANK 30sec RANDOM 30sec GAME 30sec
A,(上 )围棋 B.（ 下）国际象棋的 fMRI 结果
围棋与国际象棋的区别：较强的激活 围棋 -右侧，国际象棋 -左侧。
有证据表明, 右半球参与整体水平加工, 本结果提示：
围棋 --更依赖于 -整体水平加工,国际象棋 --更注重于 -局部计算。
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-4
-2
0
2
4
6
B O L D s i g n a l t i m e c o u r s e i n l e f t a n d r i g h t B A 7
B
O
L
D
s
ig
n
a
l
c
h
a
n
g
e
(
%
)
T i m e ( s )
Le ft
R ight
Genome,Proteome,
Metabolomics,Systems Biology
核磁共振现象
?核磁共振（ Nuclear Magnetic Resonance，
简写为 NMR）,是指 核磁矩不为零 的核，
在 外磁场 的作用下，核自旋能级发生塞曼
分裂（ Zeeman Splitting）,共振吸收某一
特定频率的 射频（ radio frequency 简写为 rf
或 RF） 辐射 的物理过程。
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
核磁矩与磁场的相互作用
1H,13C,15N等核自旋量子数 I=?,在外磁场中有两种取向
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
核磁能级间的跃迁
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
乙醇 CH3CH2OH的 1H谱
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
生物学中的应用
2003年 9月 4日
联系方法
生命科学学院结构生物学实验室
施蕴渝 3607464
yyshi@ustc.edu.cn
牛小刚
教材
核磁共振原理及其在生物学中的应
用 夏佑林，吴季辉，施蕴渝
学习方式
上课，阅读，作业，
? http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/nmr-
main.htm
? http://www.ch.ic.ac.uk/local/organic/nmr.html
? http://www.spincore.com/nmrinfo/
在大规模测序完成后
蛋白质科学成为新的科学前沿
蛋白质是生物学功能
的主要承担者
"Proteins are central to our
understanding of cellular function
and disease processes,and without a
concerted effort in proteomics,the
fruits of genomics will go
unrealized."
Nature 409,747 (2001)
人类：
约 3-4万个基因
大约 10万个蛋白
发现新蛋白,测定新结构,揭示新功能
基因组研究为蛋白质科学研究
创造了前所未有的机遇
蛋白质组学
活细胞水平上生物学功能
分子机制
现有 483个药物分子靶标，在
未来结构基因组学研究中可能
扩大 10-20倍。
创新药物的研究的基础
PDB Holdings List,2-Sep-2003
Molecule TypeProteins,
Peptides,
and
Viruses
Protein/Nu
cleic Acid
Complexes
Nucleic
Acids
Carbohy
drates total
E
x
p
,
T
e
c
h
.
X-ray
Diffracti
on and
other
17415 841 689 14 18959
NMR 2737 93 540 4 3374
Total 20152 934 1229 18 22333
? 在日本第三代同步辐射光源 Spring-
8同步辐射工厂已于 1997年 10月建成，
其中有 4条结构生物学光束线,2条
结构基因组专用光束线。
RIKEN NMR Park
规模化的核磁实验室
900 MHz x 4
800 MHz x 6
600 MHz x10
进一步发
展为 40台
蛋白质三维结构测定的主要方法
?X-射线晶体衍射，
?NMR
?电镜三维重构
?交叉学科
核磁共振波谱技术
?PDB 数据库中 15-20%结构 由
NMR测定
?PDB数据库中,NMR测定的结构
75%无晶体结构
?精度相当 2.0-2.5 A的晶体结构
? 最大 MW 30KD 260个残基
? 预期上限 60~70 KD
?发展迅速,国际上给以极大重视
生物大分子的复杂性
推动核磁共振波谱学的发展
? 1946年,Purcell和 Bloch观察到核磁共
振现象。于 1952年获得 诺贝尔物理奖
? 1945-1951年间，化学位移和自旋偶合的
发现,NMR技术的化学应用。
? 1953年 世界上第一台商品化 NMR谱仪,
? 1964年 世界上第一台超导磁场的 NMR谱
仪
? 1971年 世界上第一台脉冲傅立叶变换 NMR
谱仪
NMR在生物分子中的应用
? 开始于 50年代
? 困难
?1976年 R.R.Ernst发表了二维核磁共振的理论
和实验的文章。获得 1991年 诺贝尔化学奖
? 1979年 开始瑞士 K.Wuthrich发展了用核
磁共振波谱测定生物大分子溶液结构的
方法 首先将 2D-NMR的方法用于蛋白质，
1982年发表了用 2D-NMR对蛋白质 1H谱进
行分析的系统方法。
? 1998年提出 TROCY方法,2002年获 诺贝尔
化学奖 The 2002 Nobel Prize in
Chemistry:
600MHz TXI 1H{13C/15N} with Z-gradient
0.5 mM Lysozyme
90% H2O
10% D2O
50 mM NaCl
56 min.
2D NOESY
多维异核核磁共振
?90年代
? 13C,15N标记,多维异核核磁共
振波谱
? 2D NMR < 100个残基
?3D,4D NMR 15~35 KD
?相当 2.5A 分辨率晶体结构
?
?
多维 NMR
CBCA(CO)NH triple
resonance spectrum of 2mM
RNase T1 in
90% H2O taken with
a 600MHz Triple Resonance
1H{13C/15N} NMR CryoProbeTM
with Z-gradient,Experiment
time for the full 3D spectrum
was 3.8h and 2 scans were
accumulated for each
increment,The experiment
time for the first 1H,13C plane
of the CBCA(CO)NH
experiment was 6min.
生物大分子核磁共振技术
不断发展
核自旋体系演化的密度算符理论
新的实验方法,新的脉冲序列
样品制备技术,标记技术
计算生物学,生物信息学
90年代末结构基因组学
对 NMR技术提出新的要求
1.快速测定蛋白质的三维结构
2.分子识别,测定复合物的三维结构
蛋白质 -蛋白质
蛋白质 -核酸
蛋白质 -配基
3.分子柔性与运动性
4.膜蛋白
新实验方法
生物样品新的标记方法
? 13C/15N/ 2H标记蛋白质
? 13C/15N/标记 DNA和 RNA
? 选择性标记
? 自旋标记
Residual dipolar couplings实验
有希望用较少的实验数据
快速解出蛋白质结构
residual dipolar couplings实验
Residual dipolar
couplings are
proportional
to (3 cos2 q -1)
The additional information from magnetic
interactions in partially aligned molecules
allows the alignment of parts of the
structures that are not well constrained by
NOEs.0
J,H,Prestegard Nature Stuctural Biology,NMR II Special Issue,1998
TROSY 实验
transverse relaxation
optimized spectroscopy
CRINEPT 实验
分子量极限被突破
250kD
Line Width vs Frequency in TROSY
?c (ns) Mr
320 800,000
60 150,000
20 50,000
dN-H 0.104 nm
HSQC vs TROSY,Aldolase (78 kDa,1 mM !)
Through Hydrogen Bonding
Cross-hydrogen bond 3hJCO,N coupling constant:
Correlation between 3hJCO,N coupling constant value
and the hydrogen bond length,RNO:
RNO = 2.75 -0.25ln(3hJCO,N)+-0.06
3hJCO,N coupling constants give valuable additional
information for a structure refinement
90年代末核磁共振波谱技术的
新进展
高场超导核磁谱仪的使用
900MHz
? 800MHz
高磁场谱仪
? 分 辨 率, ??? ?a (B0)
? 灵 敏 度, S/N ? ? 5/2 (B0)3/2
? 磁各向异性, m ? (B0)2
? 弛 豫 率, R1,2 ? f (B0)
NMR Sensitivity & Dispersion
1H freq,0.1% EB Resolution Price
S/N CH2 ($)
600MHz 1200:1 1.00 800k
700MHz 1512:1 1.17 1,400k
800MHz 1847:1 1.33 2,000k
900MHz 2110:1 1.50 4,500k
低温探头 CryoProbe
30K
Sensitivity 500MHz ~1-1.5GHz
节约测量时间
低样品浓度
Experiment Time Comparison
a) sensitivity specification for standard TXI 5mm,
0.1% ethylbenzene,
500MHz,900:1
b) sensitivity specifications for CryoProbeTM TXI 5mm,
0.1% ethylbenzene:
500MHz,3000:1
600MHz,4000:1
800MHz 6000:1
c) relation between experiment time and sensitivity*:
experiment time = (SNCryoProbe/SNstandard probe)2
* assuming ideal conditions
Experiment Time Comparison
0 20 40 60 80 100
5 0 0 M H z
6 0 0 M H z
8 0 0 M H z
Ex p e r i m e n t ti m e s, C o m p a r i s o n c o n v e n ti o n a l v e r s u s
C r y o Pr o b e s
C r y o P r o b e
C o n v e n t i o n a l P r o b e
%
2.8%
6.3%
11%
Automated structure analysis
生物大分子 NMR能提供什
么重要信息
NMR在生物大分子上的应用
? 蛋白质三维结构测定,原子分
辨率下的结构与功能研究
? 分子柔性与运动性
? 复合物结构测定,分子识别
? 膜蛋白
? 溶液,不需要结晶
核磁共振在生物科学
中的主要应用
?测定生物大分子空间结构
?研究生物大分子与配基的相互作用
?测定生物大分子的动力学性质
?跟踪蛋白质的折叠过程,捕获折叠过程中瞬态中
间物
?测定可滴定基团的解离常数
?测量溶液中分子的扩散系数
?研究酶反应机理
?跟踪活细胞的代谢过程
?用于医学成像以及神经科学中的脑功能成像
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
膜蛋白
? 受体，离子通道 药物作用靶点
? PDB 数据库中 < 30个膜蛋白,
? ~16000水溶性蛋白
? 人 ~36000个基因
? ~10万个蛋白质
? 真核细胞中 ~30% 膜蛋白
? < 0.2%膜蛋白结构已知
膜蛋白结构
? 蛋白质晶体学,电镜三维重构
? NMR 小肽 <50 残基,蛋白质
? 在去垢剂形成的微胶囊 (micelles)中,液体
NMR
? 在去垢剂或脂形成的双层微胶囊 (bicelles)
中,液体 NMR
? 在脂形成的脂双层 (bilayers),
? 固体 NMR
蛋白质动力学
? 蛋白质运动性和功能有密切关系
? 酶的柔性运动性与酶反应机理
?
? NMR弛豫时间
? 1H/2D 交换速率
药物设计和筛选
? 高通量筛选
? 设计，筛选结合
?SAR－ By-NMR 药物筛选
药物设计和筛选
蛋白质折叠 –去折叠研究
? Schematic diagram summarizing the roles of unfolded,partially
folded proteins,and misfolded proteins in biology.
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
捕获折叠过程中瞬态中间物
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
用 NMR连续监测蛋白质复性过程
? Stopped-flow 19F NMR spectra of the refolding of 6-19F-tryptophan
labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase following dilution from
5.5 to 2.75 M urea at 5 ?C in the presence of 3.8 mM NADP+
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
平衡常数测量
A B ABk k? ? ?? ?
?1 1,
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
围棋高级认知功能的 fMRI研究
1.围棋 -高级智能 中华文化瑰宝 2.专业棋手 -高级智能学习
3.围棋 -象棋比较, 为人工智能提供启示
国际象棋：计 算 机 -战胜 -世界冠军
围 棋：业余棋手 -战胜 -计 算 机
反射
镜
BLANK 30sec RANDOM 30sec GAME 30sec
A,(上 )围棋 B.（ 下）国际象棋的 fMRI 结果
围棋与国际象棋的区别：较强的激活 围棋 -右侧，国际象棋 -左侧。
有证据表明, 右半球参与整体水平加工, 本结果提示：
围棋 --更依赖于 -整体水平加工,国际象棋 --更注重于 -局部计算。
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360
-4
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B O L D s i g n a l t i m e c o u r s e i n l e f t a n d r i g h t B A 7
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T i m e ( s )
Le ft
R ight
Genome,Proteome,
Metabolomics,Systems Biology
核磁共振现象
?核磁共振（ Nuclear Magnetic Resonance，
简写为 NMR）,是指 核磁矩不为零 的核，
在 外磁场 的作用下，核自旋能级发生塞曼
分裂（ Zeeman Splitting）,共振吸收某一
特定频率的 射频（ radio frequency 简写为 rf
或 RF） 辐射 的物理过程。
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
核磁矩与磁场的相互作用
1H,13C,15N等核自旋量子数 I=?,在外磁场中有两种取向
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
核磁能级间的跃迁
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
乙醇 CH3CH2OH的 1H谱
核磁共振基本原理 -引言
吴季辉
