第八章 基因工程菌培养
一、概述
基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白
质和非蛋白质。
基因操作：
?敲除或插入基因片段、增强 启动子 —
— 代谢工程
?基因插入载体，转化工程菌
蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载
体（如质粒）上，然后转入宿主菌，表达
外源蛋白。
现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这
种方法构建重组菌
非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改
造细胞的一些基因，如在细胞中插入编码
酶的 DNA，产生新的途径或增强某一途径，
从而得到新的化合物或增加产量。
细胞因子、疫苗、酶
产品最主要的用于疾病的诊断和治疗，
此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生
物催化剂。
产品特点：要求高纯度。如果不纯，病人
可能产生的强的免疫反应或副作用这对人
是灾难性的。
有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基
化、磷酸化后才有活性。
附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产
品的质量和安全，降低成本并不重要。
二、宿主 -载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统
要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全，
列入 FDA表中
常用的宿主系统有：大肠杆菌
G+细菌
低等真核细胞
哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠
杆菌作为宿主。
优点：
?人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解
得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因
操作；
?大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高
细胞浓度（ 50g/l）；
?大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
?大肠杆菌 分泌 (secretion)的蛋白通常在
细胞内,当这些蛋白达到高浓度时，会被
水解或形成不溶的 包含体 。包含体中的蛋
白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活
性，必须重新溶解并使它复性。
?大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响
应。热冲击调节子的一种响应是增加 蛋白
水解酶的活性 。在一些情况下，细胞内蛋
白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生
的速率。
2,G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是
G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌
（ excretion）到胞外。它的这一性质对生
产非常有吸引力。
枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应
用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，
会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建
比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，
所以在使用上有较大的限制,
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物
现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等
优点
?生长快 最大生长速率是大肠杆菌的 25%
?个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发
酵液中回收。
?有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。
缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，
外源蛋白分泌到胞外也有限。
只能简单糖基化。
当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译
后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排
列，而且所有转译后处理（修饰）与在整
个动物中相同，在某种情况下可能转译后
修饰有些不同，但它可提供 最接近于天然
副本的产物,此外多数产物 可以分泌到胞
外 。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，
蛋白表达水平较低。用于重组 DNA 生产蛋
白的最常用的宿主是 CHO（中国仓鼠卵巢
细胞）。
三、利用基因工程菌生产的特点
（一）基因工程菌带有外源基因，外源基
因可能在质粒上也可能整合到染色体上，
这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌
往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样
就会大大降低产物的表达。为了抑制基因
丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择
压力，如抗生素。
（二）基因工程菌的培养一般分两段。前
期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱
导因子，诱发产物表达。
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但
是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损
害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白
的能力的细胞一般生长得快得多，从而能
替代有生产能力的菌株，这就导致基因的
不稳定性。
基因的不稳定性原因：
?分离丢失
?结构不稳定性
?宿主细胞调节突变
1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出
现分离丢失。
为什么会出现质粒丢失呢？
质粒可分为高拷贝质粒（ >20拷贝 /细胞）和
低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷
贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代
细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少
遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质
粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可
能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。
虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百
万细胞分裂中一个）。
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会
存在无质粒细胞，例如 1000L发酵液，每
毫升有 109个细胞，总共就有 1015个细胞，
那么在这个反应器中就含有 109个无质粒
细胞。
质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如
溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀
释速率。
许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒
附着在一起形成一个单位。
分离丢失示意图
2、质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外,某些细胞保留
质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外
源蛋白,减少对细胞的有害影响，这就是
结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保
留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，
那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养
基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生
长得比原来的工程菌更快，使得在这种培
养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这
种培养情况就是结构不稳定性。
3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。
这些突变通常 改变细胞调节,结果减少目标
蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启
动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细
胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白
的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，
通过加入乳糖或它的结构类似物（如 IPTG）
来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷
透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的
结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的
表达。
4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体
系统和原宿主 -载体系统的生长速率不同。如
果变异了的宿主载体系统比原来的宿主 -载体
系统有生长优势，那么变异了的系统将最终
占优势，基因不稳定性就出现。
（四）表达的诱导
基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要
有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、
氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
四、重组大肠杆菌的培养策略
关键点：高密度、高表达
菌密度的测定：光密度（ OD值或 A值）
在波长 600～ 660nm
菌生长的障碍是
?重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长
缓慢
?外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后
就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度
疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作
用，甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌
的 比生长速率往往远小于宿主菌。
高表达的障碍是,
?外源基因的不稳定，造成表达的下降
?高生长速率与高表达之间的矛盾
?乙酸的产生
?蛋白的降解
高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取
了连续培养的优点，可消除高浓度底物对
细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度
底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控
制了菌体的生长过程。因此，要实现重组
大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效
的方法就是分批流加补料培养法。现在常
用的是反馈补料培养。有几种反馈控制
控制基质浓度流加
恒 pH流加
恒溶氧流加
控制比生长速率的葡萄糖流加
1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙
酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极
检测发酵液中的葡萄糖含量,葡萄糖电极通
过反馈系统与补糖单元相连。 当葡萄糖浓度
在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由
于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄
糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄
糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制
效应，达到很高的细胞浓度。
2、恒 pH流加
大肠杆菌在 LB培养基上生长,pH会上升。
这是由于菌体分解 LB培养基中的胰蛋白胨，
造成氨积累的原因。因此用 葡萄糖代替酸
液进行恒 pH流加。 实验通过 pH反馈控制
系统流加葡萄糖,使 pH恒定，结果推迟了
比生长速率降低的时间，细胞密度是无流
加的 2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨
水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡
萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往
不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌
不适宜。
3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖 。当培养液的氧饱
和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速
率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，
从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数
下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随
之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。
Konstantinov等进一步发展了这种方法，用
DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、
搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓
度，从而获得高密度和高表达
4、控制比生长速率的葡萄糖流加
菌体的比生长速率与代谢产物的表达
密切相关。比生长速率太大，超过某
一值，易产生乙酸，这一比生长速率
值称为菌体的 乙酸产生临界比生长速
率。 通过考察得出最优比生长速率，
控制溶氧、转速、补糖来控制比生长
速率。
五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8%
2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7%
3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2%
4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4%
5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%
*鲤鱼生长激素基因工程菌
1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发
现，当发酵液的溶氧为 1.8~2.6ppm/L时，
菌体湿重为 1.9~2.08g/L外源基因表达量为
13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到
4.0ppm/L时菌体湿重为 2.27g/L外源基因表
达量为 26.4%。在诱导表达期间，要维持外
源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量
的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大
通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，
不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白
产物的形成。
2,pH值对工程菌生长和表达的影响
在相同通气量和搅拌速度下,pH值对不同
菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有
一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培
养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋
白诱导表达阶段。偏碱性的 pH对外源蛋白
的表达不利，因此，表达时要调节 pH在
6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表
达。
3、诱导时间对外源蛋白表达的影响
诱导时间,加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，
但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒
性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响
诱导时间 酶活力 酶表达水平
0 0.02
1 52.3 37%
2 118.8 57%
3 120.8 67%
4 165.0 68%
5 139.9 64%
*L-天冬酰氨酶
4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在
A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌
体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶
活和表达水平都较高。而菌体进入对数期
后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢
产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。
在此状态下诱导，表达显然受到影响。
诱导时机对酶表达水平和活力的影响
生物量（ A600） 酶活力 酶表达水平
0.015 6.0 15.0%
0.049 19.1 31.1%
0.160 72.5 41.5%
0.225 102.6 49.8%
0.295 165.0 57.7%
0.360 105.5 53.4%
0.410 62.4 44.5%
0.450 30.2 22.5%
*L-天冬酰氨酶
0.034
0.111
0.065
0.07
0.065
0.05
0.04
5、乙酸对生长和表达的影响
（ 1）乙酸的产生及抑制作用机理
当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化
碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生
大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密
度发酵过程中，问题更为严重。
为什么会产生乙酸？
Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代
谢（三羧酸循环）的作用产生的能量足以满
足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在
髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不
能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径
提供 ATP和 NADH。
乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰
酶（ Pta）和乙酰激酶（ Ack），它们催化葡
萄糖代谢中从乙酰辅酶 A生成乙酸的两步酶促
反应。
EL-Mansi和 Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸
在中性 pH环境中以离子化（ CH3COO－ ）和质
子化（ CH3COOH）两种形式存在，质子化的
乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞
内，在细胞内（ pH7.5）解离成 CH3COO-和 H
＋,这样就降低了膜内的 pH值，使膜内外的
pH差减小，减弱了质子的推动力，产生的能
量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生
理活性。
（ 2）减少乙酸积累的对策
?宿主菌
不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱
变使乙酸生成途径中的两个关键酶，
有一个突变了或活性降低了，使乙酸
合成受阻。
?培养基
培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源
的含量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌
产生的乙酸比在复合培养基中产生少。另外
用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，
Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、
甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了
重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。
Klemam等研究了培养基 pH值对产生乙酸的
影响，发现重组大肠杆菌 W3200在葡萄糖浓
度为 5g/L,pH6.0的培养基中乙酸生成量为
6g/L.而 pH7.5为 12g/L。
?降低比生长速率
细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，
一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生
长速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续
培养中，当稀释速率超过 0.2h－ 1才能检测到
乙酸的存在。较低的比生长速率虽然产酸少，
但同时对产物表达不利，因此选取合适的比
生长速率才能达到高密度、高表达发酵。
?降低培养温度
将温度从 370C降低到 26-300C可以降低菌体对
营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。
?透析培养
在重组菌的培养过程中可以利用透析技术
除去发酵液中有害物质，降低乙酸的含量
从而实现重组菌的高密度发酵。 Lee等用
中空纤维膜过滤装置除去乙酸，可以在较
高的葡萄糖浓度下培养重组菌而得到较高
的密度
?限制性流加葡萄糖
利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要
控制其浓度在较低的范围内，减少乙酸的
生成。目前大多数高密度发酵均采取了限
制性流加葡萄糖的方法利用反馈的参数，
如 pH,μ,OUR,CER作为控制对象，
和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使培
养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。
六、甲醇营养型酵母的生长和表达
（一）酵母作为宿主菌的优点
?单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖
快、便于基因工程操作
?具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功
能，具有适合于真核生物基因产物正确折
叠的细胞内环境和糖链加工系统
?分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。
酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主
菌之一，由于人们对酿酒酵母的遗传学和生理
学背景了解得多，及其表达的安全性。
但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：
?缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些
常用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的
诱导物，如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱
导；
?分泌效率低，特别是对分子量大于 30KD的
外源蛋白几乎不分泌；
?表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；
?不适于高密度培养。
（二）甲醇营养型酵母
甲醇营养型酵母主要包括 Candida、
Torulopsis,Hansenula,Pichia。 用
作表达宿主株的主要是 Hansenula和
Pichia。
基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型
酵母作为第二代酵母表达系统。
甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇
作为唯一的碳源和能量来源。因为甲醇能
诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如 醇氧化
酶（ Alcohol Oxidase,AOX）二羟丙酮
合成酶（ Dihydroxy-acetone
synthase,DHAS）和过氧化氢酶
（ Catalase），表达的 DHAS的含量甚至
可达到总细胞蛋白的 60-80%。而当以葡
萄糖、甘油或乙醇作为碳源时,AOX几乎
不表达。
进一步研究表明,AOX的表达是转录水
平调控的，其启动子能非常有效地控制外
源基因的表达。已经在 P.pastoris染色体
中鉴定了二个 AOX基因（ AOX1和
AOX2）,AOX1编码的蛋白质与 AOX2
编码的蛋白质有 97%的同源性，但 AOX1
基因的启动子（ PAOX1）受甲醇强烈诱
导，而 PAOX2则很弱。 H.polymorpha染
色体只有一个 AOX基因，也受甲醇调节。
甲醇营养性酵母的另一个特点是 甲醇代谢
所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体
中，形成区域化。 在葡萄糖为碳源时，菌
体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，
而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占
到整个细胞体积的 80%，里面的蛋白质主
要 AOX和 DHAS。
自 1987年 Gregg等首次在 P.pastoris菌中
表达乙型肝炎表面抗原以来，短短几年间，
至少有 40多种外源蛋白在 P.pastoris 和
H.polymorpha中获得表达。表达产物分
泌到培养液中或聚集在胞浆，表达量最高
的可达全菌蛋白的 32%或每升 12g产物。
H.polymorpha表达比 P.pastoris有更多的
优点，如更高的耐热性（理想温度为 37-
430C，而 P.pastoris为 300C）和在甲醇诱
导下更快的生长速率，可减少培养时间，
降低污染机会。 H.polymorpha更适于大
分子量蛋白（ 150KD）的表达与分泌。
为了提高外源蛋白在酵母细胞中的稳定性，免
受蛋白酶的降解，通常采用以下几种方法：
?在培养液中补加一些富含氨基酸的组分如胃
蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，给酵母细胞蛋
白酶提供过量的底物，以减少目的蛋白的水解；
?由于 P.pastoris能耐受较宽的 pH范围
（ pH3.0-7.0），因此可调培养液 pH 值抑制蛋
白水解酶活性；
?改造 P.pastoris表达宿主菌株，缺失基因组
中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白稳定。
酵母细胞是真核生物，具有一些亚细胞结构，
如过氧化物酶体等，它们对细胞的功能极端重
要，过氧化物酶体内不含 DNA，也无蛋白质合
成机制，所有过氧化物酶体内的蛋白都由核基
因编码表达，再转运入过氧化物酶体。因此蛋
白质结构中必定存在一些进入过氧化物酶体所
必须的局部信息。如果把外源蛋白运输进入过
氧化物酶体储存起来，不仅可使蛋白免受蛋白
水解酶降解，增加其稳定性，还可减少外源蛋
白对宿主的毒害作用。
目前已鉴定出二种甲醇营养型酵母分拣外源蛋
白进入过氧化物酶体所需的靶信号 PTS1和
PTS2。
由于甲醇营养型酵母表达系统具有以下的
优点
（ 1）应用 AOX启动子，转录效率高，易
于诱发调控；
（ 2）表达质粒易于整合到基因组，不易
丢失，适于高密度发酵，产量高；
（ 3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等,
因此最近十几年来，人们越来越多的应用
它作为外源基因表达的系统。
（三）甲醇营养型酵母培养中的影响因素
1、甲醇浓度的影响
例：基因工程菌 P.Pestoris表达（人骨
唾液酸） rHSA
按摇瓶培养方法每 24h分别补加甲醇使
其在培养基中浓度为 5,10,20,30、
40,50g／ L诱导培养 96h，结果见表
2(表中数据为 2个发酵瓶平均值 )。
在甲醇浓度为 10g／ L时毕赤酵母表达目的蛋白
量达到最高，这可能是当甲醇浓度小于 10g／ L，
甲醇成为限制性底物，限制了蛋白的表达当浓度
高于 20g／ L时，甲酵浓度过高，对菌的生长和
目的蛋白的表达有抑制作用。因此，在摇瓶条件
下，甲醇的最佳诱导浓度为 10g／ L。
2,pH对基因工程菌 P.Pastoris表达 rHSA的影
响
按摇瓶培养方法，把菌种接至用 0.2mol/L的磷
酸缓冲液配制好的摇瓶培养基中,pH分别为
5.43,5.72,5.84,5.98,6.29,6.59和 7.05，
每 24h加甲醇至终浓度 10g／ L进行诱导培养。
由基因工程菌 P.Pastoris表达目的蛋白和细胞
光密度曲线 (图 1)可以看出 pH为 5.84时目的蛋
白表达量最高。 pH为 5.43时，目的蛋白基本
没有表达，但细胞光密度极大，说明在低 pH
值条件下，适合细胞生长而不适合目的的蛋白
表达；当 pH值在 5.72— 7.00时，细胞光密度基
本相同，而目的蛋白表达量基本是呈逐渐下降
的趋势,pH为 7.05时，目的蛋白表达量明显
下降。因此，既利于 P.Pastoris细胞生长又利
于目的蛋白高表达的 pH范围为 5.72— 6.59。
3、接种量对基因工程菌 P.Pastoris表达
rHSA的影响
在用重组毕赤酵母生产人骨唾液酸蛋白的研
究中发现，产物表达量与接种量有关。在
BMGY中培养菌体至 A600为 9，离心后水洗，
分别用 4,2,1,1／ 2,1／ 5,1／ 10倍体
积 BMMY(1％甲醇 )重悬，进行 2d的诱导表
达。结果表明产量随发酵密度增大而明显提
高，重悬于 1／ 5体积的 BMMY中 (相当于菌
体吸收度 A600约 45)的表达量最高，为
0.204g／ L，但增大到 A600为 90时，表达量
有所下降 (见图 2)。
4,(NH4)2SO4浓度对蛋白表达的影响
氮源是宿主菌合成异源蛋白所必须的成分，
试验不同浓度的 (NH4)2SO4对菌体生长的影
响，所得结果见图 l。
(NH4)2SO4浓度太高或太低都会对蛋白的表达产
生不利影响。当 (NH4)2SO4浓度低于 50mg／ L
时，蛋白的表达很明显受到限制，而 (NH4)2SO4
浓度高于 3.0g／ L时则会抑制蛋白表达。另外由
于一般高密培养 P.Pastorisr表达白蛋白通常只
补加碳源和微量元素，而只以流加氨水调节 pH
来补充氮源。但诱导过程中 pH下降很少，因而
补充的氮源也很少，可能会限制菌的生长和白
蛋白的分泌。由图 1也可以看出开始诱导后每
24h补加 (NH4)2SO4,使其浓度维持在 2g/L左
右，蛋白表达量最大。
5、微量量元素 PTM1的影响
对比加入 PTM1与不加 PTM1所分泌的总蛋白，
前者明显高于后者，这说明加入 PTM 1能够明
显提高 rHSA的表达，从图 3可知，总蛋白质量
浓度由 119.0mg／ L增加到 192.3mg／ L，增加
了 61.6％。这是因为微量元素中含有 Ca2+，
Fe3+,Zn2+,Mg+等金属离子，还有 Co2+,I-、
Mo2+在微生物培养中经常使用这些金属离子，
有助于提高培养的细胞浓度、细胞得率和细胞
产率；前 24h白蛋白量增加迅速，此后增加缓
慢，至 60h达最高，然后呈下降趋势，可能是
产生的蛋白酶分解了所分泌的白蛋白。
总结：
基因工程菌在代谢控制方面与传统微生物
有许多相似之处，比如补料控制,pH控制、
温度控制、溶氧控制等，使菌体能够达到
高密度。它的特殊之处在于外源基因的稳
定性、外源蛋白表达的诱导、蛋白降解的
防止以及生长与表达的协调等方面，以达
到高表达的目的。
最后二次课的安排
本周五 庄英萍老师讲发酵中的参数相
关分析实例
下周二 张嗣良老师讲发酵工程的展望
希望我的课对大家有用
考试人人过关
祝大家成功
思考题
1、利用基因工程菌生产，有什么优势？常用的宿主菌有
哪些？
2、利用基因工程菌生产有哪些特点？
3、重组菌基因不稳定性的原因有哪些？
4、在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？
5、基因工程菌高表达的障碍是什么？
6、常规的高密度培养的措施有哪些？
7 重组菌与传统微生物在产物表达上有什么区别？
8 与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点？
9 重组菌与传统菌在发酵过程控制中有哪些相同之处？
10 重组大肠杆菌的诱导因子有哪些？重组酵母的诱导因
子有哪些？
一、概述
基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白
质和非蛋白质。
基因操作：
?敲除或插入基因片段、增强 启动子 —
— 代谢工程
?基因插入载体，转化工程菌
蛋白类产物大多是外源基因片段整合到载
体（如质粒）上，然后转入宿主菌，表达
外源蛋白。
现代基因工程发酵的蛋白质产物主要是这
种方法构建重组菌
非蛋白质产物大多可以通过代谢工程，改
造细胞的一些基因，如在细胞中插入编码
酶的 DNA，产生新的途径或增强某一途径，
从而得到新的化合物或增加产量。
细胞因子、疫苗、酶
产品最主要的用于疾病的诊断和治疗，
此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生
物催化剂。
产品特点：要求高纯度。如果不纯，病人
可能产生的强的免疫反应或副作用这对人
是灾难性的。
有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基
化、磷酸化后才有活性。
附加值高。治疗蛋白最主要的是保证产
品的质量和安全，降低成本并不重要。
二、宿主 -载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统
要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全，
列入 FDA表中
常用的宿主系统有：大肠杆菌
G+细菌
低等真核细胞
哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠
杆菌作为宿主。
优点：
?人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解
得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因
操作；
?大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高
细胞浓度（ 50g/l）；
?大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
?大肠杆菌 分泌 (secretion)的蛋白通常在
细胞内,当这些蛋白达到高浓度时，会被
水解或形成不溶的 包含体 。包含体中的蛋
白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活
性，必须重新溶解并使它复性。
?大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响
应。热冲击调节子的一种响应是增加 蛋白
水解酶的活性 。在一些情况下，细胞内蛋
白水解酶使蛋白的降解速率几乎等于产生
的速率。
2,G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是
G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌
（ excretion）到胞外。它的这一性质对生
产非常有吸引力。
枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的应
用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，
会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建
比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，
所以在使用上有较大的限制,
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物
现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等
优点
?生长快 最大生长速率是大肠杆菌的 25%
?个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发
酵液中回收。
?有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。
缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，
外源蛋白分泌到胞外也有限。
只能简单糖基化。
当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译
后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排
列，而且所有转译后处理（修饰）与在整
个动物中相同，在某种情况下可能转译后
修饰有些不同，但它可提供 最接近于天然
副本的产物,此外多数产物 可以分泌到胞
外 。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，
蛋白表达水平较低。用于重组 DNA 生产蛋
白的最常用的宿主是 CHO（中国仓鼠卵巢
细胞）。
三、利用基因工程菌生产的特点
（一）基因工程菌带有外源基因，外源基
因可能在质粒上也可能整合到染色体上，
这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌
往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样
就会大大降低产物的表达。为了抑制基因
丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择
压力，如抗生素。
（二）基因工程菌的培养一般分两段。前
期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱
导因子，诱发产物表达。
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但
是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损
害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白
的能力的细胞一般生长得快得多，从而能
替代有生产能力的菌株，这就导致基因的
不稳定性。
基因的不稳定性原因：
?分离丢失
?结构不稳定性
?宿主细胞调节突变
1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出
现分离丢失。
为什么会出现质粒丢失呢？
质粒可分为高拷贝质粒（ >20拷贝 /细胞）和
低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷
贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代
细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少
遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质
粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可
能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。
虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百
万细胞分裂中一个）。
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会
存在无质粒细胞，例如 1000L发酵液，每
毫升有 109个细胞，总共就有 1015个细胞，
那么在这个反应器中就含有 109个无质粒
细胞。
质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如
溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀
释速率。
许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒
附着在一起形成一个单位。
分离丢失示意图
2、质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外,某些细胞保留
质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外
源蛋白,减少对细胞的有害影响，这就是
结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保
留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，
那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养
基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生
长得比原来的工程菌更快，使得在这种培
养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这
种培养情况就是结构不稳定性。
3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。
这些突变通常 改变细胞调节,结果减少目标
蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启
动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细
胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白
的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，
通过加入乳糖或它的结构类似物（如 IPTG）
来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷
透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的
结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的
表达。
4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体
系统和原宿主 -载体系统的生长速率不同。如
果变异了的宿主载体系统比原来的宿主 -载体
系统有生长优势，那么变异了的系统将最终
占优势，基因不稳定性就出现。
（四）表达的诱导
基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要
有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、
氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
四、重组大肠杆菌的培养策略
关键点：高密度、高表达
菌密度的测定：光密度（ OD值或 A值）
在波长 600～ 660nm
菌生长的障碍是
?重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长
缓慢
?外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后
就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度
疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作
用，甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌
的 比生长速率往往远小于宿主菌。
高表达的障碍是,
?外源基因的不稳定，造成表达的下降
?高生长速率与高表达之间的矛盾
?乙酸的产生
?蛋白的降解
高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取
了连续培养的优点，可消除高浓度底物对
细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度
底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控
制了菌体的生长过程。因此，要实现重组
大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效
的方法就是分批流加补料培养法。现在常
用的是反馈补料培养。有几种反馈控制
控制基质浓度流加
恒 pH流加
恒溶氧流加
控制比生长速率的葡萄糖流加
1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙
酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极
检测发酵液中的葡萄糖含量,葡萄糖电极通
过反馈系统与补糖单元相连。 当葡萄糖浓度
在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由
于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄
糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄
糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制
效应，达到很高的细胞浓度。
2、恒 pH流加
大肠杆菌在 LB培养基上生长,pH会上升。
这是由于菌体分解 LB培养基中的胰蛋白胨，
造成氨积累的原因。因此用 葡萄糖代替酸
液进行恒 pH流加。 实验通过 pH反馈控制
系统流加葡萄糖,使 pH恒定，结果推迟了
比生长速率降低的时间，细胞密度是无流
加的 2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨
水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡
萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往
不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌
不适宜。
3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖 。当培养液的氧饱
和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速
率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，
从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数
下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随
之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。
Konstantinov等进一步发展了这种方法，用
DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、
搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓
度，从而获得高密度和高表达
4、控制比生长速率的葡萄糖流加
菌体的比生长速率与代谢产物的表达
密切相关。比生长速率太大，超过某
一值，易产生乙酸，这一比生长速率
值称为菌体的 乙酸产生临界比生长速
率。 通过考察得出最优比生长速率，
控制溶氧、转速、补糖来控制比生长
速率。
五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8%
2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7%
3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2%
4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4%
5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%
*鲤鱼生长激素基因工程菌
1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发
现，当发酵液的溶氧为 1.8~2.6ppm/L时，
菌体湿重为 1.9~2.08g/L外源基因表达量为
13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到
4.0ppm/L时菌体湿重为 2.27g/L外源基因表
达量为 26.4%。在诱导表达期间，要维持外
源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量
的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大
通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，
不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白
产物的形成。
2,pH值对工程菌生长和表达的影响
在相同通气量和搅拌速度下,pH值对不同
菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有
一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培
养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋
白诱导表达阶段。偏碱性的 pH对外源蛋白
的表达不利，因此，表达时要调节 pH在
6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表
达。
3、诱导时间对外源蛋白表达的影响
诱导时间,加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，
但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒
性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响
诱导时间 酶活力 酶表达水平
0 0.02
1 52.3 37%
2 118.8 57%
3 120.8 67%
4 165.0 68%
5 139.9 64%
*L-天冬酰氨酶
4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在
A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌
体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶
活和表达水平都较高。而菌体进入对数期
后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢
产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。
在此状态下诱导，表达显然受到影响。
诱导时机对酶表达水平和活力的影响
生物量（ A600） 酶活力 酶表达水平
0.015 6.0 15.0%
0.049 19.1 31.1%
0.160 72.5 41.5%
0.225 102.6 49.8%
0.295 165.0 57.7%
0.360 105.5 53.4%
0.410 62.4 44.5%
0.450 30.2 22.5%
*L-天冬酰氨酶
0.034
0.111
0.065
0.07
0.065
0.05
0.04
5、乙酸对生长和表达的影响
（ 1）乙酸的产生及抑制作用机理
当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化
碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生
大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密
度发酵过程中，问题更为严重。
为什么会产生乙酸？
Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代
谢（三羧酸循环）的作用产生的能量足以满
足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在
髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不
能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径
提供 ATP和 NADH。
乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰
酶（ Pta）和乙酰激酶（ Ack），它们催化葡
萄糖代谢中从乙酰辅酶 A生成乙酸的两步酶促
反应。
EL-Mansi和 Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸
在中性 pH环境中以离子化（ CH3COO－ ）和质
子化（ CH3COOH）两种形式存在，质子化的
乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞
内，在细胞内（ pH7.5）解离成 CH3COO-和 H
＋,这样就降低了膜内的 pH值，使膜内外的
pH差减小，减弱了质子的推动力，产生的能
量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生
理活性。
（ 2）减少乙酸积累的对策
?宿主菌
不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱
变使乙酸生成途径中的两个关键酶，
有一个突变了或活性降低了，使乙酸
合成受阻。
?培养基
培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源
的含量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌
产生的乙酸比在复合培养基中产生少。另外
用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，
Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、
甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了
重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。
Klemam等研究了培养基 pH值对产生乙酸的
影响，发现重组大肠杆菌 W3200在葡萄糖浓
度为 5g/L,pH6.0的培养基中乙酸生成量为
6g/L.而 pH7.5为 12g/L。
?降低比生长速率
细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，
一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生
长速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续
培养中，当稀释速率超过 0.2h－ 1才能检测到
乙酸的存在。较低的比生长速率虽然产酸少，
但同时对产物表达不利，因此选取合适的比
生长速率才能达到高密度、高表达发酵。
?降低培养温度
将温度从 370C降低到 26-300C可以降低菌体对
营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。
?透析培养
在重组菌的培养过程中可以利用透析技术
除去发酵液中有害物质，降低乙酸的含量
从而实现重组菌的高密度发酵。 Lee等用
中空纤维膜过滤装置除去乙酸，可以在较
高的葡萄糖浓度下培养重组菌而得到较高
的密度
?限制性流加葡萄糖
利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要
控制其浓度在较低的范围内，减少乙酸的
生成。目前大多数高密度发酵均采取了限
制性流加葡萄糖的方法利用反馈的参数，
如 pH,μ,OUR,CER作为控制对象，
和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使培
养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。
六、甲醇营养型酵母的生长和表达
（一）酵母作为宿主菌的优点
?单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖
快、便于基因工程操作
?具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功
能，具有适合于真核生物基因产物正确折
叠的细胞内环境和糖链加工系统
?分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。
酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主
菌之一，由于人们对酿酒酵母的遗传学和生理
学背景了解得多，及其表达的安全性。
但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：
?缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些
常用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的
诱导物，如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱
导；
?分泌效率低，特别是对分子量大于 30KD的
外源蛋白几乎不分泌；
?表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；
?不适于高密度培养。
（二）甲醇营养型酵母
甲醇营养型酵母主要包括 Candida、
Torulopsis,Hansenula,Pichia。 用
作表达宿主株的主要是 Hansenula和
Pichia。
基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型
酵母作为第二代酵母表达系统。
甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇
作为唯一的碳源和能量来源。因为甲醇能
诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如 醇氧化
酶（ Alcohol Oxidase,AOX）二羟丙酮
合成酶（ Dihydroxy-acetone
synthase,DHAS）和过氧化氢酶
（ Catalase），表达的 DHAS的含量甚至
可达到总细胞蛋白的 60-80%。而当以葡
萄糖、甘油或乙醇作为碳源时,AOX几乎
不表达。
进一步研究表明,AOX的表达是转录水
平调控的，其启动子能非常有效地控制外
源基因的表达。已经在 P.pastoris染色体
中鉴定了二个 AOX基因（ AOX1和
AOX2）,AOX1编码的蛋白质与 AOX2
编码的蛋白质有 97%的同源性，但 AOX1
基因的启动子（ PAOX1）受甲醇强烈诱
导，而 PAOX2则很弱。 H.polymorpha染
色体只有一个 AOX基因，也受甲醇调节。
甲醇营养性酵母的另一个特点是 甲醇代谢
所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体
中，形成区域化。 在葡萄糖为碳源时，菌
体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，
而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占
到整个细胞体积的 80%，里面的蛋白质主
要 AOX和 DHAS。
自 1987年 Gregg等首次在 P.pastoris菌中
表达乙型肝炎表面抗原以来，短短几年间，
至少有 40多种外源蛋白在 P.pastoris 和
H.polymorpha中获得表达。表达产物分
泌到培养液中或聚集在胞浆，表达量最高
的可达全菌蛋白的 32%或每升 12g产物。
H.polymorpha表达比 P.pastoris有更多的
优点，如更高的耐热性（理想温度为 37-
430C，而 P.pastoris为 300C）和在甲醇诱
导下更快的生长速率，可减少培养时间，
降低污染机会。 H.polymorpha更适于大
分子量蛋白（ 150KD）的表达与分泌。
为了提高外源蛋白在酵母细胞中的稳定性，免
受蛋白酶的降解，通常采用以下几种方法：
?在培养液中补加一些富含氨基酸的组分如胃
蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，给酵母细胞蛋
白酶提供过量的底物，以减少目的蛋白的水解；
?由于 P.pastoris能耐受较宽的 pH范围
（ pH3.0-7.0），因此可调培养液 pH 值抑制蛋
白水解酶活性；
?改造 P.pastoris表达宿主菌株，缺失基因组
中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白稳定。
酵母细胞是真核生物，具有一些亚细胞结构，
如过氧化物酶体等，它们对细胞的功能极端重
要，过氧化物酶体内不含 DNA，也无蛋白质合
成机制，所有过氧化物酶体内的蛋白都由核基
因编码表达，再转运入过氧化物酶体。因此蛋
白质结构中必定存在一些进入过氧化物酶体所
必须的局部信息。如果把外源蛋白运输进入过
氧化物酶体储存起来，不仅可使蛋白免受蛋白
水解酶降解，增加其稳定性，还可减少外源蛋
白对宿主的毒害作用。
目前已鉴定出二种甲醇营养型酵母分拣外源蛋
白进入过氧化物酶体所需的靶信号 PTS1和
PTS2。
由于甲醇营养型酵母表达系统具有以下的
优点
（ 1）应用 AOX启动子，转录效率高，易
于诱发调控；
（ 2）表达质粒易于整合到基因组，不易
丢失，适于高密度发酵，产量高；
（ 3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等,
因此最近十几年来，人们越来越多的应用
它作为外源基因表达的系统。
（三）甲醇营养型酵母培养中的影响因素
1、甲醇浓度的影响
例：基因工程菌 P.Pestoris表达（人骨
唾液酸） rHSA
按摇瓶培养方法每 24h分别补加甲醇使
其在培养基中浓度为 5,10,20,30、
40,50g／ L诱导培养 96h，结果见表
2(表中数据为 2个发酵瓶平均值 )。
在甲醇浓度为 10g／ L时毕赤酵母表达目的蛋白
量达到最高，这可能是当甲醇浓度小于 10g／ L，
甲醇成为限制性底物，限制了蛋白的表达当浓度
高于 20g／ L时，甲酵浓度过高，对菌的生长和
目的蛋白的表达有抑制作用。因此，在摇瓶条件
下，甲醇的最佳诱导浓度为 10g／ L。
2,pH对基因工程菌 P.Pastoris表达 rHSA的影
响
按摇瓶培养方法，把菌种接至用 0.2mol/L的磷
酸缓冲液配制好的摇瓶培养基中,pH分别为
5.43,5.72,5.84,5.98,6.29,6.59和 7.05，
每 24h加甲醇至终浓度 10g／ L进行诱导培养。
由基因工程菌 P.Pastoris表达目的蛋白和细胞
光密度曲线 (图 1)可以看出 pH为 5.84时目的蛋
白表达量最高。 pH为 5.43时，目的蛋白基本
没有表达，但细胞光密度极大，说明在低 pH
值条件下，适合细胞生长而不适合目的的蛋白
表达；当 pH值在 5.72— 7.00时，细胞光密度基
本相同，而目的蛋白表达量基本是呈逐渐下降
的趋势,pH为 7.05时，目的蛋白表达量明显
下降。因此，既利于 P.Pastoris细胞生长又利
于目的蛋白高表达的 pH范围为 5.72— 6.59。
3、接种量对基因工程菌 P.Pastoris表达
rHSA的影响
在用重组毕赤酵母生产人骨唾液酸蛋白的研
究中发现，产物表达量与接种量有关。在
BMGY中培养菌体至 A600为 9，离心后水洗，
分别用 4,2,1,1／ 2,1／ 5,1／ 10倍体
积 BMMY(1％甲醇 )重悬，进行 2d的诱导表
达。结果表明产量随发酵密度增大而明显提
高，重悬于 1／ 5体积的 BMMY中 (相当于菌
体吸收度 A600约 45)的表达量最高，为
0.204g／ L，但增大到 A600为 90时，表达量
有所下降 (见图 2)。
4,(NH4)2SO4浓度对蛋白表达的影响
氮源是宿主菌合成异源蛋白所必须的成分，
试验不同浓度的 (NH4)2SO4对菌体生长的影
响，所得结果见图 l。
(NH4)2SO4浓度太高或太低都会对蛋白的表达产
生不利影响。当 (NH4)2SO4浓度低于 50mg／ L
时，蛋白的表达很明显受到限制，而 (NH4)2SO4
浓度高于 3.0g／ L时则会抑制蛋白表达。另外由
于一般高密培养 P.Pastorisr表达白蛋白通常只
补加碳源和微量元素，而只以流加氨水调节 pH
来补充氮源。但诱导过程中 pH下降很少，因而
补充的氮源也很少，可能会限制菌的生长和白
蛋白的分泌。由图 1也可以看出开始诱导后每
24h补加 (NH4)2SO4,使其浓度维持在 2g/L左
右，蛋白表达量最大。
5、微量量元素 PTM1的影响
对比加入 PTM1与不加 PTM1所分泌的总蛋白，
前者明显高于后者，这说明加入 PTM 1能够明
显提高 rHSA的表达，从图 3可知，总蛋白质量
浓度由 119.0mg／ L增加到 192.3mg／ L，增加
了 61.6％。这是因为微量元素中含有 Ca2+，
Fe3+,Zn2+,Mg+等金属离子，还有 Co2+,I-、
Mo2+在微生物培养中经常使用这些金属离子，
有助于提高培养的细胞浓度、细胞得率和细胞
产率；前 24h白蛋白量增加迅速，此后增加缓
慢，至 60h达最高，然后呈下降趋势，可能是
产生的蛋白酶分解了所分泌的白蛋白。
总结：
基因工程菌在代谢控制方面与传统微生物
有许多相似之处，比如补料控制,pH控制、
温度控制、溶氧控制等，使菌体能够达到
高密度。它的特殊之处在于外源基因的稳
定性、外源蛋白表达的诱导、蛋白降解的
防止以及生长与表达的协调等方面，以达
到高表达的目的。
最后二次课的安排
本周五 庄英萍老师讲发酵中的参数相
关分析实例
下周二 张嗣良老师讲发酵工程的展望
希望我的课对大家有用
考试人人过关
祝大家成功
思考题
1、利用基因工程菌生产，有什么优势？常用的宿主菌有
哪些？
2、利用基因工程菌生产有哪些特点？
3、重组菌基因不稳定性的原因有哪些？
4、在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？
5、基因工程菌高表达的障碍是什么？
6、常规的高密度培养的措施有哪些？
7 重组菌与传统微生物在产物表达上有什么区别？
8 与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点？
9 重组菌与传统菌在发酵过程控制中有哪些相同之处？
10 重组大肠杆菌的诱导因子有哪些？重组酵母的诱导因
子有哪些？
