第二节 动物细胞培养
动物细胞和微生物细胞的总体差异
内容 微生物细胞 动物细胞
细胞壁 普遍存在 存在
生长速率 0.1~0.5h-1 0.01~0.05h-1
需氧量 高 低
营养要求 普遍简单 复杂
CO2需求 一些微生物需 CO2 许多需要 CO2形成缓冲液
环境影响 小 大
大小范围 100~2000nm 10000~100000nm
接种浓度 低 高（ 10-5.ml-1）
生长浓度 高（ 109~1010.ml-1） 低（ 106.ml-1）
一、动物细胞培养的特性
动物细胞培养是指在合适的培养条
件下，动物细胞离体生长和增殖，
并保持其特性和功能的技术，这些
细胞不再形成组织。
?细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素
?细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适
应性差
?需氧少，不耐受强力通风与搅拌
?群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）
?培养过程产品分布细胞内外，成本高
?原代培养细胞一般繁殖 50代即退化死亡
两个专业术语
细胞系：首次分离组织的培养称之为
原代培养。原代培养物经传代成功后
即成细胞系。
细胞株：通过选择法或克隆形成法从
原代培养物或细胞系中获得的具有特
殊性质或标记的培养物称为细胞株。
细胞生长的类型
贴壁依赖性 来自动物实体组织的大多数
细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有
转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适
的固体介质上并铺展，才能生长。
非贴壁依赖性细胞 无需贴附到固体介质
上就能生存和生长的细胞。来自血液、
淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为
非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。
生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时
要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞
一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝
分裂，并很快进入对数生长期。一般
数天后就铺满培养表面，并形成致密
的细胞单层。
贴壁培养的优点：
●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表
面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入
新培养液。
●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密
度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更
有效的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液 /细胞的比例。
●适用于所有类型细胞。
.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法
相比
●扩大培养比较困难，投资大；
●占地面积大；
●不能有效监测细胞的生长；
二、细胞培养物的获得
原代培养物
在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的
组织碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水
解酶处理，使组织解离成单个细胞，放
入培养容器中无菌培养。这种原代培养
物中含有各种不同分化的细胞类型，它
们的生长速率不同，成纤维细胞最易生
长，常会在此后的传代培养中占据优势。
仔细控制培养基的成分，可以选择性地
支持某些细胞类型的生长。
转化细胞
正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对
生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模
式的改变，二倍体变成异倍体。更典型的
表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及
细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞
仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。
细胞转化有四种主要途径：①有些细胞在
培养中自发转化②化学转化。某些化学致
癌物会增加转化频率③病毒转化。④致瘤
因子转化
转化细胞由于有无限寿命，在培养中更
易生长，被广泛用于生成生物制品，如
重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人
们对它们的安全性仍然非常关心，对可
能造成的生物危害性进行严格的检测和
控制。
肿瘤细胞
肿瘤细胞是来自于肿瘤组织的细胞或经
肿瘤细胞与其它细胞融合产生的细胞，
如杂交瘤细胞。与转化细胞相比，它们
是恶性的，基本上是非贴壁依赖性的。
肿瘤细胞有很好的增殖特性，生长速率
高。对生长因子的依赖程度低，对培养
环境的要求也不那么苛刻。
体外培养所需的一般条件
适宜的培养皿 血清成分 370C CO25％
95～ 100％湿度 抗生素
肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗
产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技
术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对
其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生
产的单克隆抗体已用于体内治疗,C127细胞生
成重组蛋白的研究也形成了规模。
三、培养基和培养条件
1、培养基配置考虑的因素的
?pH 多数细胞系在 pH7.4下生长得很好。一些
正常的成纤维细胞系以 7.4~7.7最好，转化细胞系
以 pH7.0~7.4更合适。
?缓冲 在高细胞密度下，转化细胞系产生大量二
氧化碳和乳酸，引起 pH下降，需要在培养基中加
入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠,HEPES(N-2-羟
乙基哌嗪 -N’-2-乙磺酸 N-[2-
Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic
acid ] )
温度 低温下 CO2溶解度增加，引起 pH
变化。
黏度 培养基的黏度主要受血清含量的
影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损
伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基吡
咯烷增加培养基黏度
2、细胞培养基的基本组成
（ 1）水
细胞培养用的各种液体都要用水来配置，
对水的纯度要求很高。通常细胞培养用水
的污染物标准可参考医药上注射用水标准，
但原则上应高于注射用水标准。
（ 2）能源和碳源
主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细
胞能用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。
葡萄糖很容易被大多数细胞转化为乳酸。
昆虫细胞更偏爱蔗糖。在多数培养基中谷
氨酰胺作为主要的能源和碳源。使用谷氨
酰胺最大的问题是它的自发降解，降解量
与时间、温度、血清和磷酸浓度有关，降
解产物为氨，对细胞有毒性。
（ 3）氮源
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞合成
复杂含氮化合物的前体，还作为必不可少的能源
物质。不同种类的细胞对氨基酸的种类和浓度有
不同的要求，但除了谷氨酰胺外，还有 12种氨基
酸不能在细胞内合成，必须依靠从培养基中摄取。
几乎所有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据
需要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含量
低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加氨基酸
的浓度可以提高培养的细胞密度和产物产率。
（ 4）维生素
维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要
生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基
或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。
（ 5）无机离子
无机离子分为两组，一种是含量较高的，，包
括维持膜电势的（ Na+,K+），维持渗透压平
衡（ Na+,Cl－ ），作为酶的辅因子（ Mg2+），
促进细胞贴附（ Mg2+Ca2+），起缓冲作用
（ HPO42-,HCO3-）；另一种势微量元素，如
铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。
（ 6）脂类和磷脂前体
在使用血清的细胞培养中，脂类来自血
清，在无血清培养中，有些细胞需要添加
脂类，如胆固醇、脂肪酸、磷脂。特别是
缺陷型细胞，对某种脂类有很高的依赖性。
2、非营养性物质
（ 1）抗生素
细胞培养中，特别是原代细胞培养中，常使用抗
生素抑制微生物的污染。
（ 2） pH缓冲剂
最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，常用浓度
26mmol/L，接近血中浓度，必须与 5％～ 10％
CO2平衡，否则培养基迅速变碱。 HEPES是缓冲
能力很强的化合物，但由于它相当昂贵，细胞大
规模培养中很少使用。
（ 3）酚红
酚红普遍作为培养基的 pH指示剂
（ 4）保护剂
细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、
剪切、毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物
质。在生物反应器中培养的细胞会受到机械
搅拌和气泡运动所产生的剪切损伤，某些大
分子化合物，如甲基纤维素、葡聚糖,PEG、
聚乙烯吡咯烷酮,Pluronic F68、血清白蛋
白，能够减轻这种损伤。
（ 5）还原剂
某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。 β
－巯基乙醇在杂交瘤细胞培养中能刺激
抗体分泌，并促进胱氨酸利用。
（ 6）血清
常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清
和人血清。最常用的是小牛血清。
血清是极其复杂的混合物，含有食物物质、
代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物
质、采血中引入的污染物。由于历史原因，
商业培养基大都是按添加血清来设计的，使
用血清技术也很成熟，尽管使用血清有许多
缺点，仍将其作为细胞培养最重要的添加剂
普遍采用。
四、细胞计数及活力测定
培养的细胞在一般条件下要求有一定
的密度才能生长良好，所以要进行细
胞计数。计数结果以每毫升细胞数表
示。细胞计数的原理和方法与血细胞
计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡
的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫
做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要
检查活力，以了解分离的过程对细胞是否
有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，
了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不
着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利
用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反
应，也可测定细胞相对数和相对活力。
五、培养物的污染及防止
1、污染途径
（ 1） 空气：空气流动性大，如果培养操
作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，
外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，
培养设施不能设在通风场所。无菌操作应
在净化台内进行，工作时要带口罩
2,器材：各种培养器皿
3,操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟
练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造
成污染。
4,血清：有些血清在生产时就已经被支原体
或病毒等污染，变成了污染。
5,组织样本：原代培养的污染多数来源于组
织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造
成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细
胞生长。
六、动物细胞的大规模培养
（一）培养环境
1、温度 温度是细胞在体外生存的基
本条件之一，来源不同的动物细胞，其
最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的
最适温度是 25～ 280C，人和哺乳动物细
胞的最适温度是 370C，细胞代谢强度与
温度成正比，超出最适温度范围，细胞
的正常代谢和生长将会受到影响，甚至
导致死亡。
2,pH
大规模培养时影响培养液的 pH稳定性的主要因素
有三种：
（ 1）缓冲液的缓冲能力及种类
（ 2）对流空间大小
（ 3）葡萄糖浓度
培养液中正常的缓冲系统是 NaHCO3/CO2系统，
它是一种弱缓冲系统，其 pK为 6.1，低于生理学最
佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的对流
空间加入 CO2以防止它的丢失及增加羟基离子。
也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒
害作用。 HEPES生物缓冲剂也曾被加入
NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于 HEPES
的 pK为 7.0,HEPES被加入后，其缓冲能力为
pH6.8～ 7.2。。但是当 HEPES浓度高于
25mmol/L时，它对大多数动物细胞都有毒害
作用。
动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节
培养液中的 pH：
（ 1）在培养基中添加 NaHCO3作为缓冲剂及
通入含 CO2的空气进行调节
（ 2）用 0.1mol/LNaON或 0.1mol/L HCl进
行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌和
弱混合，利用 NaOH或 HCl进行调节时会发
生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生
毒性作用，因此这种调节方法在动物细胞培
养时不太合适。通常通过调节培养基中
NaHCO3用量及通气中 CO2浓度来控制发酵
过程的 pH。
3、溶解氧
大规模培养中如何提供足够的氧是非常
重要的。通气得得目的有两个：一是提
供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发
酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过
程。
（二）培养容器
1、多孔板,Petri培养皿和组织培养方瓶都是常
用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易
放入培养箱内培养。
2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在
滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培
养。它体积较大，接种后放入温室或专门的培养
箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入
微载体以增加培养表面积。
3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设
备。它有各种不同形式，容积可以从 1升到几十
立方米。
微载体
微载体是指直径在 60～ 250μm、适合于动物细胞
贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多
好处：①可在反应器中提供大的比表面积②可采用
均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，
提高了培养系统的重演性③可用普通显微镜观察细
胞在微载体上的生长情况④容易放大⑤适合于多种
贴壁依赖性细胞培养⑥容易收获细胞。
微载体培养系统的缺点是：①细胞生长在微载体表
面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长
②微载体价格较贵，一般不能重复使用③需要较高
的细胞接种量。
悬浮培养
悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长
的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的培养，
如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养与微生
物过程比较接近，但由于动物细胞对搅拌和
通气造成的流体剪切很敏感，在反应器的设
计和操作上又有特殊要求 如利用螺旋带叶轮
减小生物反应器培养过程中的剪切作用，并
通过表面充气及诱导表面气泡产生
具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧传
递速率
目前，动物细胞培养用生物反应器主要
包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填
充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反
应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道
蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤
维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气
升式反应器等。
4、细胞大规模培养生物反应器
气升式生物反应器
气升式生物反应器与其它反应器相比，结构
简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了
污染的机会；产生的湍动温和而均匀，剪切
力相当小；当大容易；直接通气供氧，氧传
递速率高，供氧充分；液体循环量大，细胞
和营养成分混合均匀。存在问题：由于液体
混合的能量唯一来自通入的气体，因而通气
量大，泡沫多，而且气泡破碎造成严重的细
胞机械损伤
通气搅拌生物反应器
根据动物细胞培养的特点，要求搅
拌器转动时混合性能好，产生的剪
切力小，气泡产生的不利影响小。
设计有多种形式的搅拌器，应用最
多的是笼式搅拌器。
笼式搅拌器有两个由 200目不锈钢丝网围成的
笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消泡腔，
之间有细管相通。气体交换在通气腔内进行，
其中的液体通过丝网与腔外的液体进行交换。
在气体鼓泡中形成的泡沫经细管进入消泡腔，
经丝网破碎分成气液两部分，既做到深层通气，
又避免泡沫在反应器中积累。
搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空
腔相通，当导流筒随搅拌器转动时，由于离心
力的作用，搅拌器中心的空腔产生负压，使培
养基从底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再从三
个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬
浮细胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于培
养基，被培养基所裹胁，反复循环，充分混合。
在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般搅拌转
速在 30～ 60r/min范围内，混合时间为 12～
24s。
中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞
的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模
拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千
根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的
体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一
种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛
细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养
液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透
膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子
营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔
不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜
渗入管内，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。
优点是：
●占地空间少；
●细胞产量高，细胞密度可达 109
数量级；
●生产成本低，且细胞培养维持时
间长，适用于长期分泌的细胞。
5、细胞生物反应器的控制系统
由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能
沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全
而有效地方法是靠通入培养罐内气体中的
氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目
的，
采用二氧化碳 /碳酸氢钠缓冲液系统来控制
培养液的 pH值，它主要是靠预先加入培养
液中适量的碳酸氢钠和通过改变气体流量
中的二氧化碳含量来实现。
6、生物反应器中的细胞培养模式
分批培养
分批培养是指将细胞和培养基一次性
装入反应器内，进行培养，细胞不断
生长，产物也不断形成，经过一定时
间反应后，将整个反应系取出。
流加培养
流加培养是指先将一定量的培养液装
入反应器，在适宜条件下接种细胞，
进行培养，细胞不断生长，产物也不
断形成。随着细胞对营养物质的不断
消耗，新的营养成分不断补充至反应
器内，使细胞进一步生长代谢。到反
应终止时，取出整个反应系。
半连续培养
半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，
是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，
剩余部分重新补充新的营养成分，在按分批
培养的方式进操作。这是反应器内培养液体
积保持不变的操作方式。
连续培养
连续培养是指将细胞种子和培养液一起加
入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液
不断加入反应器内，另一方面又将反应液
连续不断地取出，反应条件处于一种恒定
状态。与分批培养和半连续培养不同，连
续培养可以控制细胞所处的环境条件长时
间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化
状态下，促进细胞生长和产物形成。
灌注培养
灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新
鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应
液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使
细胞处于一种不断的营养状态。
当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞补充
足够的营养以及去除有毒的代谢废物。通过调
节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废
物代谢低于抑制水平的状态下。一般在分批培
养中细胞密度为（ 2！ 4） × 106cell/ml，在灌注
系统中可达到（ 2～ 5） × 107cell/ml。
7、培养基研究进展 —— 无血清培养基
通常动物细胞的生长均有赖于血清的存在，
在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞
将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜
在的污染源、不同批号蛋白含量差异大及价格
高等，给生物制品的生产造成了不利。这就引
发了人们对无血清培养基的研究。结果发现，
只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，
如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因
子等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生
长，尤其是 CHO、杂交瘤及重组骨髓瘤细胞
等。
其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生
长的最重要的多肽。 CHO细胞能在仅含重组人
胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传
代。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还
能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生
长。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗
体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另
外．动物细胞培养应用无血清培养基的成功，
还将为某些疫苗的生产降低成本。
动物细胞和微生物细胞的总体差异
内容 微生物细胞 动物细胞
细胞壁 普遍存在 存在
生长速率 0.1~0.5h-1 0.01~0.05h-1
需氧量 高 低
营养要求 普遍简单 复杂
CO2需求 一些微生物需 CO2 许多需要 CO2形成缓冲液
环境影响 小 大
大小范围 100~2000nm 10000~100000nm
接种浓度 低 高（ 10-5.ml-1）
生长浓度 高（ 109~1010.ml-1） 低（ 106.ml-1）
一、动物细胞培养的特性
动物细胞培养是指在合适的培养条
件下，动物细胞离体生长和增殖，
并保持其特性和功能的技术，这些
细胞不再形成组织。
?细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素
?细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适
应性差
?需氧少，不耐受强力通风与搅拌
?群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）
?培养过程产品分布细胞内外，成本高
?原代培养细胞一般繁殖 50代即退化死亡
两个专业术语
细胞系：首次分离组织的培养称之为
原代培养。原代培养物经传代成功后
即成细胞系。
细胞株：通过选择法或克隆形成法从
原代培养物或细胞系中获得的具有特
殊性质或标记的培养物称为细胞株。
细胞生长的类型
贴壁依赖性 来自动物实体组织的大多数
细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有
转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适
的固体介质上并铺展，才能生长。
非贴壁依赖性细胞 无需贴附到固体介质
上就能生存和生长的细胞。来自血液、
淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为
非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。
生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时
要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞
一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝
分裂，并很快进入对数生长期。一般
数天后就铺满培养表面，并形成致密
的细胞单层。
贴壁培养的优点：
●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表
面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入
新培养液。
●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密
度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更
有效的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液 /细胞的比例。
●适用于所有类型细胞。
.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法
相比
●扩大培养比较困难，投资大；
●占地面积大；
●不能有效监测细胞的生长；
二、细胞培养物的获得
原代培养物
在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的
组织碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水
解酶处理，使组织解离成单个细胞，放
入培养容器中无菌培养。这种原代培养
物中含有各种不同分化的细胞类型，它
们的生长速率不同，成纤维细胞最易生
长，常会在此后的传代培养中占据优势。
仔细控制培养基的成分，可以选择性地
支持某些细胞类型的生长。
转化细胞
正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对
生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模
式的改变，二倍体变成异倍体。更典型的
表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及
细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞
仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。
细胞转化有四种主要途径：①有些细胞在
培养中自发转化②化学转化。某些化学致
癌物会增加转化频率③病毒转化。④致瘤
因子转化
转化细胞由于有无限寿命，在培养中更
易生长，被广泛用于生成生物制品，如
重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人
们对它们的安全性仍然非常关心，对可
能造成的生物危害性进行严格的检测和
控制。
肿瘤细胞
肿瘤细胞是来自于肿瘤组织的细胞或经
肿瘤细胞与其它细胞融合产生的细胞，
如杂交瘤细胞。与转化细胞相比，它们
是恶性的，基本上是非贴壁依赖性的。
肿瘤细胞有很好的增殖特性，生长速率
高。对生长因子的依赖程度低，对培养
环境的要求也不那么苛刻。
体外培养所需的一般条件
适宜的培养皿 血清成分 370C CO25％
95～ 100％湿度 抗生素
肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗
产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技
术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对
其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生
产的单克隆抗体已用于体内治疗,C127细胞生
成重组蛋白的研究也形成了规模。
三、培养基和培养条件
1、培养基配置考虑的因素的
?pH 多数细胞系在 pH7.4下生长得很好。一些
正常的成纤维细胞系以 7.4~7.7最好，转化细胞系
以 pH7.0~7.4更合适。
?缓冲 在高细胞密度下，转化细胞系产生大量二
氧化碳和乳酸，引起 pH下降，需要在培养基中加
入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠,HEPES(N-2-羟
乙基哌嗪 -N’-2-乙磺酸 N-[2-
Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic
acid ] )
温度 低温下 CO2溶解度增加，引起 pH
变化。
黏度 培养基的黏度主要受血清含量的
影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损
伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基吡
咯烷增加培养基黏度
2、细胞培养基的基本组成
（ 1）水
细胞培养用的各种液体都要用水来配置，
对水的纯度要求很高。通常细胞培养用水
的污染物标准可参考医药上注射用水标准，
但原则上应高于注射用水标准。
（ 2）能源和碳源
主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细
胞能用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。
葡萄糖很容易被大多数细胞转化为乳酸。
昆虫细胞更偏爱蔗糖。在多数培养基中谷
氨酰胺作为主要的能源和碳源。使用谷氨
酰胺最大的问题是它的自发降解，降解量
与时间、温度、血清和磷酸浓度有关，降
解产物为氨，对细胞有毒性。
（ 3）氮源
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞合成
复杂含氮化合物的前体，还作为必不可少的能源
物质。不同种类的细胞对氨基酸的种类和浓度有
不同的要求，但除了谷氨酰胺外，还有 12种氨基
酸不能在细胞内合成，必须依靠从培养基中摄取。
几乎所有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据
需要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含量
低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加氨基酸
的浓度可以提高培养的细胞密度和产物产率。
（ 4）维生素
维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要
生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基
或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。
（ 5）无机离子
无机离子分为两组，一种是含量较高的，，包
括维持膜电势的（ Na+,K+），维持渗透压平
衡（ Na+,Cl－ ），作为酶的辅因子（ Mg2+），
促进细胞贴附（ Mg2+Ca2+），起缓冲作用
（ HPO42-,HCO3-）；另一种势微量元素，如
铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。
（ 6）脂类和磷脂前体
在使用血清的细胞培养中，脂类来自血
清，在无血清培养中，有些细胞需要添加
脂类，如胆固醇、脂肪酸、磷脂。特别是
缺陷型细胞，对某种脂类有很高的依赖性。
2、非营养性物质
（ 1）抗生素
细胞培养中，特别是原代细胞培养中，常使用抗
生素抑制微生物的污染。
（ 2） pH缓冲剂
最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，常用浓度
26mmol/L，接近血中浓度，必须与 5％～ 10％
CO2平衡，否则培养基迅速变碱。 HEPES是缓冲
能力很强的化合物，但由于它相当昂贵，细胞大
规模培养中很少使用。
（ 3）酚红
酚红普遍作为培养基的 pH指示剂
（ 4）保护剂
细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、
剪切、毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物
质。在生物反应器中培养的细胞会受到机械
搅拌和气泡运动所产生的剪切损伤，某些大
分子化合物，如甲基纤维素、葡聚糖,PEG、
聚乙烯吡咯烷酮,Pluronic F68、血清白蛋
白，能够减轻这种损伤。
（ 5）还原剂
某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。 β
－巯基乙醇在杂交瘤细胞培养中能刺激
抗体分泌，并促进胱氨酸利用。
（ 6）血清
常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清
和人血清。最常用的是小牛血清。
血清是极其复杂的混合物，含有食物物质、
代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物
质、采血中引入的污染物。由于历史原因，
商业培养基大都是按添加血清来设计的，使
用血清技术也很成熟，尽管使用血清有许多
缺点，仍将其作为细胞培养最重要的添加剂
普遍采用。
四、细胞计数及活力测定
培养的细胞在一般条件下要求有一定
的密度才能生长良好，所以要进行细
胞计数。计数结果以每毫升细胞数表
示。细胞计数的原理和方法与血细胞
计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡
的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫
做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要
检查活力，以了解分离的过程对细胞是否
有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，
了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不
着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利
用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反
应，也可测定细胞相对数和相对活力。
五、培养物的污染及防止
1、污染途径
（ 1） 空气：空气流动性大，如果培养操
作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，
外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，
培养设施不能设在通风场所。无菌操作应
在净化台内进行，工作时要带口罩
2,器材：各种培养器皿
3,操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟
练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造
成污染。
4,血清：有些血清在生产时就已经被支原体
或病毒等污染，变成了污染。
5,组织样本：原代培养的污染多数来源于组
织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造
成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细
胞生长。
六、动物细胞的大规模培养
（一）培养环境
1、温度 温度是细胞在体外生存的基
本条件之一，来源不同的动物细胞，其
最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的
最适温度是 25～ 280C，人和哺乳动物细
胞的最适温度是 370C，细胞代谢强度与
温度成正比，超出最适温度范围，细胞
的正常代谢和生长将会受到影响，甚至
导致死亡。
2,pH
大规模培养时影响培养液的 pH稳定性的主要因素
有三种：
（ 1）缓冲液的缓冲能力及种类
（ 2）对流空间大小
（ 3）葡萄糖浓度
培养液中正常的缓冲系统是 NaHCO3/CO2系统，
它是一种弱缓冲系统，其 pK为 6.1，低于生理学最
佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的对流
空间加入 CO2以防止它的丢失及增加羟基离子。
也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒
害作用。 HEPES生物缓冲剂也曾被加入
NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于 HEPES
的 pK为 7.0,HEPES被加入后，其缓冲能力为
pH6.8～ 7.2。。但是当 HEPES浓度高于
25mmol/L时，它对大多数动物细胞都有毒害
作用。
动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节
培养液中的 pH：
（ 1）在培养基中添加 NaHCO3作为缓冲剂及
通入含 CO2的空气进行调节
（ 2）用 0.1mol/LNaON或 0.1mol/L HCl进
行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌和
弱混合，利用 NaOH或 HCl进行调节时会发
生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生
毒性作用，因此这种调节方法在动物细胞培
养时不太合适。通常通过调节培养基中
NaHCO3用量及通气中 CO2浓度来控制发酵
过程的 pH。
3、溶解氧
大规模培养中如何提供足够的氧是非常
重要的。通气得得目的有两个：一是提
供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发
酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过
程。
（二）培养容器
1、多孔板,Petri培养皿和组织培养方瓶都是常
用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易
放入培养箱内培养。
2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在
滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培
养。它体积较大，接种后放入温室或专门的培养
箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入
微载体以增加培养表面积。
3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设
备。它有各种不同形式，容积可以从 1升到几十
立方米。
微载体
微载体是指直径在 60～ 250μm、适合于动物细胞
贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多
好处：①可在反应器中提供大的比表面积②可采用
均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，
提高了培养系统的重演性③可用普通显微镜观察细
胞在微载体上的生长情况④容易放大⑤适合于多种
贴壁依赖性细胞培养⑥容易收获细胞。
微载体培养系统的缺点是：①细胞生长在微载体表
面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长
②微载体价格较贵，一般不能重复使用③需要较高
的细胞接种量。
悬浮培养
悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长
的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的培养，
如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养与微生
物过程比较接近，但由于动物细胞对搅拌和
通气造成的流体剪切很敏感，在反应器的设
计和操作上又有特殊要求 如利用螺旋带叶轮
减小生物反应器培养过程中的剪切作用，并
通过表面充气及诱导表面气泡产生
具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧传
递速率
目前，动物细胞培养用生物反应器主要
包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填
充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反
应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道
蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤
维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气
升式反应器等。
4、细胞大规模培养生物反应器
气升式生物反应器
气升式生物反应器与其它反应器相比，结构
简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了
污染的机会；产生的湍动温和而均匀，剪切
力相当小；当大容易；直接通气供氧，氧传
递速率高，供氧充分；液体循环量大，细胞
和营养成分混合均匀。存在问题：由于液体
混合的能量唯一来自通入的气体，因而通气
量大，泡沫多，而且气泡破碎造成严重的细
胞机械损伤
通气搅拌生物反应器
根据动物细胞培养的特点，要求搅
拌器转动时混合性能好，产生的剪
切力小，气泡产生的不利影响小。
设计有多种形式的搅拌器，应用最
多的是笼式搅拌器。
笼式搅拌器有两个由 200目不锈钢丝网围成的
笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消泡腔，
之间有细管相通。气体交换在通气腔内进行，
其中的液体通过丝网与腔外的液体进行交换。
在气体鼓泡中形成的泡沫经细管进入消泡腔，
经丝网破碎分成气液两部分，既做到深层通气，
又避免泡沫在反应器中积累。
搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空
腔相通，当导流筒随搅拌器转动时，由于离心
力的作用，搅拌器中心的空腔产生负压，使培
养基从底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再从三
个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬
浮细胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于培
养基，被培养基所裹胁，反复循环，充分混合。
在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般搅拌转
速在 30～ 60r/min范围内，混合时间为 12～
24s。
中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞
的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模
拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千
根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的
体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一
种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛
细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养
液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透
膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子
营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔
不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜
渗入管内，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。
优点是：
●占地空间少；
●细胞产量高，细胞密度可达 109
数量级；
●生产成本低，且细胞培养维持时
间长，适用于长期分泌的细胞。
5、细胞生物反应器的控制系统
由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能
沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全
而有效地方法是靠通入培养罐内气体中的
氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目
的，
采用二氧化碳 /碳酸氢钠缓冲液系统来控制
培养液的 pH值，它主要是靠预先加入培养
液中适量的碳酸氢钠和通过改变气体流量
中的二氧化碳含量来实现。
6、生物反应器中的细胞培养模式
分批培养
分批培养是指将细胞和培养基一次性
装入反应器内，进行培养，细胞不断
生长，产物也不断形成，经过一定时
间反应后，将整个反应系取出。
流加培养
流加培养是指先将一定量的培养液装
入反应器，在适宜条件下接种细胞，
进行培养，细胞不断生长，产物也不
断形成。随着细胞对营养物质的不断
消耗，新的营养成分不断补充至反应
器内，使细胞进一步生长代谢。到反
应终止时，取出整个反应系。
半连续培养
半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，
是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，
剩余部分重新补充新的营养成分，在按分批
培养的方式进操作。这是反应器内培养液体
积保持不变的操作方式。
连续培养
连续培养是指将细胞种子和培养液一起加
入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液
不断加入反应器内，另一方面又将反应液
连续不断地取出，反应条件处于一种恒定
状态。与分批培养和半连续培养不同，连
续培养可以控制细胞所处的环境条件长时
间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化
状态下，促进细胞生长和产物形成。
灌注培养
灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新
鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应
液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使
细胞处于一种不断的营养状态。
当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞补充
足够的营养以及去除有毒的代谢废物。通过调
节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废
物代谢低于抑制水平的状态下。一般在分批培
养中细胞密度为（ 2！ 4） × 106cell/ml，在灌注
系统中可达到（ 2～ 5） × 107cell/ml。
7、培养基研究进展 —— 无血清培养基
通常动物细胞的生长均有赖于血清的存在，
在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞
将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜
在的污染源、不同批号蛋白含量差异大及价格
高等，给生物制品的生产造成了不利。这就引
发了人们对无血清培养基的研究。结果发现，
只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，
如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因
子等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生
长，尤其是 CHO、杂交瘤及重组骨髓瘤细胞
等。
其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生
长的最重要的多肽。 CHO细胞能在仅含重组人
胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传
代。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还
能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生
长。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗
体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另
外．动物细胞培养应用无血清培养基的成功，
还将为某些疫苗的生产降低成本。
