5.一些重要的生物反应器
产品进展
大规模动物细胞生物反应器
由于细菌等原核细胞表达系统在转录及修饰方面的
缺陷
许多重要价值的蛋白质（基因工程药物、疫苗、抗
体等）糖基化的需要
哺乳类动物细胞表达系统
当前生产高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的重
要发展趋势
动物细胞反应器
二、生物过程工程理论的发展
发酵工程的主要问题
过程优化与放大
? 在已提供高产菌株的基础上，如何把这些高产菌种在培
养过程中进一步考察它的 生理生化特性,稳定或改进微
生物反应工艺过程，这里要求对生物物性的动态有详尽
的了解，对生化反应做 定量的和动力学 方面的考察
?发酵过程是以微生物反应为核心的，有很多过程环节参与
的综合结果，整个过程贯穿着以 "速率 "为内容的基础研究
?与化学工程相结合形成了生化工程
动力学与反应器工程
?本征动力学,即没有在生物反应器中各种形式的
传递过程等工程因素影响时的微生物反应的固有
反应速率。
─── 形成了经典的以动力学为基础的工程学概念
?生物反应工程：它涉及二方面的内容，即宏观微生物反应
动力学和生物反应器工程。其中 反应器工程 是指包括影响
微生物反应宏观动力学的生物反应器形式、结构、操作方
式、物料混和传递过程特性等
?宏观动力学,但是实际发酵过程是在生物反应器中进行，因
此，从实用意义出发，人们重视一定反应器内检测到的反应
速率即总反应速率及其影响因素，这就是宏观动力学研究。
微生物生长和反应过程研究
?必须从基质进入细胞，胞内反应，代谢产物的胞
内外分泌等全过程进行分析
─── 形成了经典的以化学计量学和热力学研究为
基础的发酵工程生物学
?从工程学角度研究对生长反应的影响。研究各类微生物代谢
平衡的理论、方法和实际有效的实验量化数据。例如胞内反
应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之间的物质和能
量的关系。
?要经过 1000多步胞内反应才能转化为代谢产物和细胞成
分，我们不可能对这些反应进行一一定量的计算
?测量参数及其变化的意义缺乏理解
?最佳工艺控制点为依据的静态操作方法,
只是化学工程宏观动力学概念在发酵工
程上的简单延伸
缺乏以细胞代谢流分析与控制为核心的研究内容
?经典的以动力学为基础的工程学概念
?经典的以化学计量学和热力学研究为基
础的发酵工程生物学
? 仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度, pH,DO等
? 缺乏微观的实时的代谢调控
代谢调控研究
代谢工程研究
发酵过程酶学
研究的困难
过程数据采集
和处理的困难
发酵工艺优化研究
的基本思路
发酵罐
单一生理调控制，
缺乏全局性的概念
发酵过程优化与放大仍是
一个令人困惑的问题？
对于活体细胞调控来说，采用传统的
生物学方法或化学工程的调控方法，存在
很大的问题，国内外都没有很好解决 。
背景
(1).宏观代谢流：
细胞代谢物质流与生物反应器物料流
变化的相关性
生物反应器
细胞生长
细胞代谢物质流与生物反应器物料流
变化的相关性
细胞生长
X m
(cp)Pco2
P
细胞水平的
代谢动力学
SUROUR
HERH+
CERPPR
传统的生物反应器物料流反馈控制
必需高度重视代谢流
及其对反应器的影响 ?产物与代谢流有关
? 不同层次反应的关联方法
(IFB)
葡萄糖
氮源
前体
油
rpm
F
H+
热
(MVS)
SFR
OTR
HTR
H+FR
反应器混
和与传递
常规控制器
生物反应器
s
DO剪切
TpH
(EVs)
(PVs)
数据驱动型方法
复杂性
多容量过程
高度非线性
线性或拟线性关
系的数学摸型
发酵生产完
整过程
发酵过程参数趋势曲线相关
数学模型、静态和动态优化、系统识别、自适应控制、
专家系统、模糊控制、神经元网络、各种混沌现象的研究
困难
动态性
不可预测性
跨尺度观察
FUS-50L(A)发酵罐的研制
以生物反应器中 的观点，
在实验室规模发酵罐，具有十四个
以上发酵过程在线参数检测或控制。
物料流检测
参数检测配置示意图
关键技术
在线
在 2000年上海国际工业博览会上展出的
FUS-50L(A)发酵罐
软
件
设
计
数据处理
功能
BlORADAR。
?在线检测参数
?实验室手工测定参数
?间接参数 (代谢流特征
或工程特征 )
?适应多种反应器特点
?融合多种过程理论和
控制理论
?工艺分析与操作
?远程通讯与异地数据
传送和分析
DO-发酵液中溶解氧浓度,OUR-菌体代谢耗氧速率,CER-二
氧化碳释放速率,RQ-呼吸商 -代谢途径,KLa-生物反应器中氧
传递速率,pH酸碱度、菌体浓度,… 等 40多个参数
9-25小时之间 RQ呈低谷状 必需限制补葡萄糖
基因工程人血清白蛋白 (rh-SA)趋势曲线图
? 50L实验室,700mg/L----7g/L，放大到 500L
庆大霉素发酵
OUR:20~30 mol/h.m3
金霉素发酵
OUR:30~40 mol/h.m3
泰洛菌素发酵
OUR:40 ~50 mol/h.m3
鸟苷发酵
OUR:40~50 mol/h.m3
青霉素 (200h)
OUR:50~70 mol/h.m3
基因工程 植酸酶 发酵
OUR:150~200 mol/h.m3
基因工程毕赤酵母发酵（疟疾疫苗）
OUR:200~300 mol/h.m3
发酵过程优化
传统微生物发酵
初级代谢产物
次级代谢产物
基因工程菌高密度高表达
大肠
枯草
酵母
应用之一
不同发酵产品的过程优化与放大结果
发酵产品 国际水平 原水平 提高后水平 放大规模
水平
青霉素 6.5万 u/ml 4.5万 u/m 6.3万 u/ml 3M3放大到
120M3 国内领先
红霉素 8000--1万 u/m 5000u/ml 8400u/ml 15L放大到
50M3 国际先进
饲料金霉素 23万 u/ml 1.6万 u/ml 2.1万 u/ml 50L放大到 120M3
国内领先 (110小时 ) (110小时 ) (110小时 )
鸟苷 50g/L 16 g/L 32 g/L 60L放大到 100M3
产率
(100 小时 ) (50 小时 ) (50 小时 )
国际先进
肌苷 90g/L 25g/L 35g/L 50L放大到 50M3
国内领先 (90小时 ) (50小时 ) (50小时 )
工业生产发酵罐系统的设计与制造
生理代谢参数相似 的放大原则，并不
能代表大型发酵罐的几何结构和动力结
构等可设计参数的确定。
应用之二
罐体结构参数与设计
?例如根据 OUR,KLa以及所选用的搅拌桨特性测
算不同发酵罐规模所需的 搅拌功率 研究；
?根据 OUR与菌体细胞 剪切适应量 选择不同规模
发酵罐的 搅拌器形式、转速 或其他结构的研究；
动物细胞反应器 ;
?搅拌器的混和与剪切特性的冷态研究,计算流
体力学 的应用研究；
?H/D设计原理；
?大型发酵罐高功率搅拌器的加工与动平衡研
究，以及传动装置技术和整体罐结构设计研
究；
?根据 耗氧率 进行 发热量 估计及 传热面积 的研
究：
?不同传热结构（夹套、蛇管、半园管和 激光
焊接膨胀型蜂窝夹套 ）的传热效果、强度、
无菌性能和造价研究；
激光焊接膨胀型蜂窝夹套
生物反应器计算流体力学的应用
采用计算流体力学对转速 100rpm,通气速度为 1vvm,
100M3的发酵罐进行了流动场预测 (灰黄霉素 )
改进前的性能 改进后的性能
液体速度分布图
空气体积分布云图
改进前的性能 改进后的性能
工业应用的放大技术研究
以多尺度的观点，采用计算流体力学对生物反应
器进行流型仿真
计算流体力学在阿维菌素发酵过程优化中的
应用
溶氧（ DO）控制与菌体成
团就成为一对生物反应器
设计与控制的主要矛盾
2T发酵 120hr
摇瓶发酵 142hr摇瓶种子 摇瓶发酵 22hr 摇瓶发酵 118hr
2T种子 2T发酵 35hr
50T发酵 12hr 50T发酵 38hr 50T发酵 129hr50T种子
液体剪切速率分布云
改进前的性能 改进后的性能
气升式生物反应器没计
动物细胞反应器主要技术特点
动物细胞无细胞壁，对营养要求严格
对 pH、溶氧、温度、剪切应力、抗污染等环境
因子的高敏感性
悬浮细胞、无血清培养
实现动物细胞生化反应器的大型化、自动化和
精巧化
丝网结构
搅拌桨设计
(2)复杂系统多尺
度观点的应用
── 工程学方法
生物反应器 ——典型的具有时空多尺度结构的复杂系统
反应器内的
浓度场、温
度场、速度
场分布
颗粒团
聚、气
泡聚并
颗粒聚团
内的菌体
细胞
细胞内
代谢网
络
基因 DNA、
RNA网络
反应器 细胞代谢 基因水平
空间尺度
基因水平的分子尺度属于 纳尺度 范围，一
般在 10-9M以下
细胞代谢属于 微尺度 范围，在 10-8-10-4M
反应器工程属于 介尺度 范围，在 10-3-102M
-6 -4 -2 0 2 4 6 [s] log tim
酶浓度变化质量作用
变构控制
m-RNA控制 种群选择
进化
? 微生物和细胞在酶活性水平上（包括酶的激活、抑 制、亚基的
结合和解离、共价修饰和降解）控制的时间常数描述在 ms至 s的
范围内
? 基因表达 调控水平上（诱导、转录的抑制和去抑制）描述至 min
? 细胞内酶 的浓度变化与菌体生长由 小时至天 为单
? 种群 选择和进化水平上则描述至 更大 的单位
时间尺度
具有, 变化着的结构,
由于不同尺寸的边界条件难以区分，甚至还
未能发现，就造成系统结果的差异或最优过
程的严重偏离
经典的以动力学为基础的工程学概念
系统结构性变化的非线性特征
跨尺度观察与操作
?工业规模的生物过程只能在反应器尺度上
进行测量与操作
?可以从低一尺度层次的规律或性质，来预
测研究另一尺度层次的规律或性质
新型食品添加剂呈味核苷酸二
钠生产关键技术优化研究
应用例子之一
参数相关分析与状态方程建立
通过鸟苷发酵过程的数据采集发现：
4040小时 OUR下降，耗糖速率增加，氨氮用量增加
鸟苷产率迅速下降 ── 代谢流迁移
生物反应器：测量观察值
多尺度：细胞代谢流？
状态方程建立与系统识别
w
关键技术
17 种氨基酸的时序变化
纸层析分析
有机酸的积累
实测结果,代谢流分析
35小时：丙酮酸、丙氨酸积累
代谢途径迁移的酶学
测试
─── HMP途经 → EMP途经
关键技术
磷酸果糖激酶 磷酸葡萄糖脱氢酶
丙酮酸激酶
柠檬酸合成酶丙氨酸脱氢酶
化学计量学方法的代谢流研究
关键技术
代谢网络的代谢反应式 代谢方程组
在线检测通气流量、发酵液体积、排气氧和二氧
化碳浓度
离线常规分析菌体、葡萄糖和产物浓度
HPLC测定乙酸、柠檬酸和丙酮酸等有机酸浓度
HPLC测定丙氨酸等 17种氨基酸浓度
关键技术
不同时间代谢流分布 HMP
EMP
丙氨酸
代谢流,HMP→EMP→ 丙氨酸
跨尺度分析与工艺改进
确定以代谢流由 EMP向 HMP途径回复迁移 为目
标进行过程工艺优化，并以 OUR的下降作为跨尺
度操作 的相关因子
发现调控因子 A加入后短期内 OUR的下降速度
就开始放慢，到 48小时开始维持稳定直至放罐，
并且发酵后期的糖耗速率也变慢
关键技术
工艺改进后实施效果
?小试与中试规模,
17.2克 /L →34 克 /L(60小时 )
?100M3生产规模,
16克 /L → 32克 /L(60小时 )
关键技术
本项目完成后的
市场竞争纪要
?2001年 5月广东星湖公司恢复生产
?2001年 7月，日方提出就, 价格回升问题, 进
行谈判，星湖公司拒绝了日方谈判要求。
?2001年底星湖控制了中国市场，日方退出。
?20O2年价格回升，星湖开始创利
?目前价格已达 17.5万元 /吨
?2003年实施扩产计划，走向国际市场
经济效益与社会意义
?100M3工业规模发酵罐上发酵水平从 17.2g/L提高
27g/L
?产量二次扩产为原来的 300%
?I+G市场价格由原来的超低价回复到较正常的价格年度 新增产值
(万元 )
新增利润
(万元 )
新增税收
(万元 )
新增利税
(万元 )
2001 3129 ----- ----- -----
2002 7281 3450 1725 5175
2003年 1-4
月
5020 2040 680 2720
合计 15430 5490 2405 7895
效益与意义
获奖情况
2003年上海市科技进步一等奖
2004年国家科技进步二等奖
鸟苷生产菌中嘌呤核苷合成途径
三段基因序列的分析
嘌呤核苷生物合成与对应的基因操纵子
关键技术
分别从下列四个菌株中用 PCR拉出上述
序列：
野生型枯草杆菌 （ 160）
低 产 型 肌 苷 生 产 菌 7191
（ 161）
目前肌苷生产菌 （ 162）
目前鸟苷生产菌 （ 163）
Genebank
关键技术
研究结果
肌苷和鸟苷生产菌在 54位 （ 以翻译起始点为 1计 ） 缺
失了一个 A,因此将导致以下的所有 序列发生移码突
变, 所编码的 sAMP合成酶失活, 致使 AMP合成支路受
阻, 有利于肌苷和鸟苷的积累 。
可能是导致生产菌株产苷水平升高的一个重要原因 。
关键技术
(A) PurR dimer,The monomers are colored
according to function (N termini,HTH
motifs,and wings in blue; hoods in cyan; PPi
loops in gold; flexible loops in red; and
PRPP motifs in purple),Other regions are
green in one monomer and gray in the other
and are semitransparent to aid in viewing the
highlighted regions,In this view,the dimer
dyad axis is vertical and in the plane of the
page,Sulfate ions and a HEPES buffer
molecule are rendered as bonds colored by
atomic type (C,yellow; O,red; N,blue; and
S,green),(B) PurR monomer,The stereo
ribbon diagram is colored as the gray subunit
in panel A,Secondary structures are labeled,
Sulfate ions are shown as in panel A,
Residues 163 to 167 and 275 to 285 are not
displayed,as they are disordered,
阻遏蛋白 PurR的三级结构
Model for PurR-DNA binding.
Two PurR dimers (light gray) bind a DNA (dark gray) containing two PurBoxes,
According to this model,each PurBox is recognized by the conserved,positively
charged surface of a winged-helix dimer,PurR dimer-dimer contacts are like the
crystal lattice contact seen in both PurR crystal forms,An A track at the outer edge
of the strong PurBox kinks the DNA,thereby allowing contact with the positively
charged surface of the PRT domain and with the conserved,positively charged
surface surrounding the PRPP site (top of the labeled dimer),
Nucleotide sequence of the pur operon control region from B,
subtilis,The wild-type nucleotide sequence is shown from
position -177 to position +24 with respect to the site of
transcription initiation (+1),The PurBoxes are shaded.
问题?
菌种不变
良好的遗传背景 (sAMP)
反应器操作
主流代谢流迁移
16克 /L →30 克 /L
? 主流代谢迁移对生物合成的影响
? 除了生物合成基因外，还存在其他影响产物形成的基因和因素
? 这个基因的表型是受环境条件的影响
? 选择合理的（生物合成和其他）基因塔配和生物反应器操作
-------过程优化
三,过程生物技术的进展
(1)组学研究技术平台
基因组学 生命网络的零件
转录组学 生命网络的零件
蛋白质组学 生命网络的零件
代谢组学 生命网络的零件
相互作用组学 生命活动的途径、网络和模块
表型组学 生命活动的表征
计算生物学 生命活动的数学模型与预测
(2)系统生物学
二十一世纪的生命科学
整体性研究为特征的
一种大科学
生物科技的发展正在以, 结构基因组学 → 功能
基 因 组 学 （ 蛋 白 质 组 学 ） → 系 统 生 物 学
(system biology)→ 合成 生 物学 (synthetic
biology)”路径模式快速演进 。
生物过程工程系统生物学研究
可以对环境参数与细胞的转录组、蛋
白组、代谢组等不同层级的参数进行直接
的，机制性的,理性的，全域性的关联
生物过程系统生物学研究
的重要特点
? 我们所研究的复杂程度与目前已掌握知识
的局限性 。
?, 自上而下, 的研究, 还是, 自下而上,
的研究；, 整体, 研究还是, 局部, 研究 。
自上而下 自下而上
菌种 菌种
生产 生产 特性特性
生理 生理特性 特性
基因 1 基因 2 基因 3 基因 4 基因 1 基因 2 基因 3 基因 4
系统生物学
从完整的系统开始，将某分解成多个
组成部分及相互作用，但全部成分和
相互作用还设有被我们完全了解
现有研究方法
将所有已知组成以及相互作用
组合起来建立一个系统模型。
基本方法
? 反复推敲问题性质以及解决问题的途径,
要求在, 正常, 和, 非正常, 情况下对
问题进行对照摸索 。
?,数据超载, ─── 现代科学技术研究结果
的普遍现象 。
? 数据 → 信息 → 知识：
?数据的简化和归一化,
?将信息转化为知识就需要我们理解数据的真正
含义, 以及它是如何与所要解决的问题联系在
一起的 。
基于信息处理的生物过程检测与控制
生物过程的信息处理与控制系统
Fig,3 Modeling is a key tool for linking the
monitoring and control of biological systems
(Carl-Fredrik Mandenius, Bioprocess Biosyst Eng
(2004) 26,347–351)
生命科学测定技术与分析仪器
──重要的过程检测参数
基因组学
测序技术
转录组学
基因芯片
代谢组学
HPLC
相互作用组学
酵母双杂交
蛋白组学
2D电泳
时间飞行质谱
双链 DNA芯片
关联分析
发酵过程系统生物学研究的
宏观差异分析法
? 发酵过程中采用基于发酵过程参数相关的方法
? 酶和调控因子的差异蛋白质组学
? 基因水平上采用基因芯片的代谢谱整合法
── 精细工程（ Precision Engineering）
───发酵工程研究的生物学重要基础
(3)双组分系统（ TCS）
信号传导蛋白包含多种结构域，这些结构域都是模块
化的，它们能以各种各样的方式组织起来，构建大量的信号
传导回路。
基因组
环境组
转录组 蛋白组 代谢组
基因操作
过程优化
TCS调控网络
转录调
控网络
代谢调
控网络
对今后研究的影响
宏观与微观的联系
揭示过程的本质
实现过程优化与放大
组学研究在细胞过程中的应用
细
胞
过
程
关
联
分
析
RNA样本 转录谱分析
蛋白样本 蛋白谱分析
代谢物样本 代谢谱分析
代谢调控基因精细代谢过程改造菌种
多尺度过程参数相关分析优化环境因子
系统方法研究细胞培养过程的优点：
代谢工程与过程工程的统一
过程与系统的统一
过程优化与菌种改良的统一
过程参数与分子调控的统一
反应器系统与细胞系统的统一
表型研究中环境与基因组的统 一
四、以信息处理为基础的
生物过程检测与控制
检测与控制技术发展的历史回顾
参数 (变量 )分类
直接参数, 物理参数,如温度、通气流量、搅拌转速,…
化学参数,如 DO,pH、排气 02,CO2…
生物量参数, 菌量,OD
间接参数, 由一些直接参数计标得到的各种反映过程特性
的参数。如 OUR,CER,RQ
手工参数, 取样后实验室手工测量参数，离线输入。
经典与现代控制理论
现代控制
数学模型
静态和动态优化
系统识别
自适应控制
专家系统
模糊控制
神经元网络
各种混沌现象的研究
经典控制
开关量控制
PID反馈控制
前馈控制
串级控制
生物反应器复杂系统的认
识与测量控制技术
系统对象认识
对生物反应器的测量与控制系统的
发展产生重要影响
宏观到微观
工程学方法
还原与综合
技术平台的构建
基因组学
测序技术
转录组学
基因芯片
代谢组学
HPLC
相互作用组学
酵母双杂交
蛋白组学
2D电泳
时间飞行质谱
双链 DNA芯片
关联分析
PDQuest linked to ProteinLynx
M@LDITM Automated 2D-Gel-Tof MS
自动 LC ESI-MS/MS 分析
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
1013.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
Isolated
digested
proteins
Waters CapLC
ProteinLynx data
processing and database
searching
ProteinLynx
results browser
Micromass Q-Tof
automated
ESI-MS/MSMS/MS
制备型 HPLC
蛋白质－ DNA相互作用研究
建立发酵试验数据采集与分析系统
多尺度与系统生物学理论与观点
菌种改造、发酵工艺、发酵罐设计统一起来
计算机硬件系统
计算机软件系统
建议
在, 十一五, 和国家中长期规划
组织全国合作,5-10年解决以下问题：
?基因芯片转录谱、代谢物谱、差异蛋白、代谢工程、菌
种筛选平台、过程传感、实时代谢流分析与相关分析软
件包、反应器计算流体力学等配套技术问题。
?结合重大产品开发，开展基础性与应用基础研究，形成平
台技术与推广，基础性自主创新。
?模式生物研究：微生物以及外在环境构建成一种相对封闭
的生态系统，可以作为系统生物学的研究的模式生物。周期
短、见效快。
End
Thanks!
产品进展
大规模动物细胞生物反应器
由于细菌等原核细胞表达系统在转录及修饰方面的
缺陷
许多重要价值的蛋白质（基因工程药物、疫苗、抗
体等）糖基化的需要
哺乳类动物细胞表达系统
当前生产高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的重
要发展趋势
动物细胞反应器
二、生物过程工程理论的发展
发酵工程的主要问题
过程优化与放大
? 在已提供高产菌株的基础上，如何把这些高产菌种在培
养过程中进一步考察它的 生理生化特性,稳定或改进微
生物反应工艺过程，这里要求对生物物性的动态有详尽
的了解，对生化反应做 定量的和动力学 方面的考察
?发酵过程是以微生物反应为核心的，有很多过程环节参与
的综合结果，整个过程贯穿着以 "速率 "为内容的基础研究
?与化学工程相结合形成了生化工程
动力学与反应器工程
?本征动力学,即没有在生物反应器中各种形式的
传递过程等工程因素影响时的微生物反应的固有
反应速率。
─── 形成了经典的以动力学为基础的工程学概念
?生物反应工程：它涉及二方面的内容，即宏观微生物反应
动力学和生物反应器工程。其中 反应器工程 是指包括影响
微生物反应宏观动力学的生物反应器形式、结构、操作方
式、物料混和传递过程特性等
?宏观动力学,但是实际发酵过程是在生物反应器中进行，因
此，从实用意义出发，人们重视一定反应器内检测到的反应
速率即总反应速率及其影响因素，这就是宏观动力学研究。
微生物生长和反应过程研究
?必须从基质进入细胞，胞内反应，代谢产物的胞
内外分泌等全过程进行分析
─── 形成了经典的以化学计量学和热力学研究为
基础的发酵工程生物学
?从工程学角度研究对生长反应的影响。研究各类微生物代谢
平衡的理论、方法和实际有效的实验量化数据。例如胞内反
应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之间的物质和能
量的关系。
?要经过 1000多步胞内反应才能转化为代谢产物和细胞成
分，我们不可能对这些反应进行一一定量的计算
?测量参数及其变化的意义缺乏理解
?最佳工艺控制点为依据的静态操作方法,
只是化学工程宏观动力学概念在发酵工
程上的简单延伸
缺乏以细胞代谢流分析与控制为核心的研究内容
?经典的以动力学为基础的工程学概念
?经典的以化学计量学和热力学研究为基
础的发酵工程生物学
? 仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度, pH,DO等
? 缺乏微观的实时的代谢调控
代谢调控研究
代谢工程研究
发酵过程酶学
研究的困难
过程数据采集
和处理的困难
发酵工艺优化研究
的基本思路
发酵罐
单一生理调控制，
缺乏全局性的概念
发酵过程优化与放大仍是
一个令人困惑的问题？
对于活体细胞调控来说，采用传统的
生物学方法或化学工程的调控方法，存在
很大的问题，国内外都没有很好解决 。
背景
(1).宏观代谢流：
细胞代谢物质流与生物反应器物料流
变化的相关性
生物反应器
细胞生长
细胞代谢物质流与生物反应器物料流
变化的相关性
细胞生长
X m
(cp)Pco2
P
细胞水平的
代谢动力学
SUROUR
HERH+
CERPPR
传统的生物反应器物料流反馈控制
必需高度重视代谢流
及其对反应器的影响 ?产物与代谢流有关
? 不同层次反应的关联方法
(IFB)
葡萄糖
氮源
前体
油
rpm
F
H+
热
(MVS)
SFR
OTR
HTR
H+FR
反应器混
和与传递
常规控制器
生物反应器
s
DO剪切
TpH
(EVs)
(PVs)
数据驱动型方法
复杂性
多容量过程
高度非线性
线性或拟线性关
系的数学摸型
发酵生产完
整过程
发酵过程参数趋势曲线相关
数学模型、静态和动态优化、系统识别、自适应控制、
专家系统、模糊控制、神经元网络、各种混沌现象的研究
困难
动态性
不可预测性
跨尺度观察
FUS-50L(A)发酵罐的研制
以生物反应器中 的观点，
在实验室规模发酵罐，具有十四个
以上发酵过程在线参数检测或控制。
物料流检测
参数检测配置示意图
关键技术
在线
在 2000年上海国际工业博览会上展出的
FUS-50L(A)发酵罐
软
件
设
计
数据处理
功能
BlORADAR。
?在线检测参数
?实验室手工测定参数
?间接参数 (代谢流特征
或工程特征 )
?适应多种反应器特点
?融合多种过程理论和
控制理论
?工艺分析与操作
?远程通讯与异地数据
传送和分析
DO-发酵液中溶解氧浓度,OUR-菌体代谢耗氧速率,CER-二
氧化碳释放速率,RQ-呼吸商 -代谢途径,KLa-生物反应器中氧
传递速率,pH酸碱度、菌体浓度,… 等 40多个参数
9-25小时之间 RQ呈低谷状 必需限制补葡萄糖
基因工程人血清白蛋白 (rh-SA)趋势曲线图
? 50L实验室,700mg/L----7g/L，放大到 500L
庆大霉素发酵
OUR:20~30 mol/h.m3
金霉素发酵
OUR:30~40 mol/h.m3
泰洛菌素发酵
OUR:40 ~50 mol/h.m3
鸟苷发酵
OUR:40~50 mol/h.m3
青霉素 (200h)
OUR:50~70 mol/h.m3
基因工程 植酸酶 发酵
OUR:150~200 mol/h.m3
基因工程毕赤酵母发酵（疟疾疫苗）
OUR:200~300 mol/h.m3
发酵过程优化
传统微生物发酵
初级代谢产物
次级代谢产物
基因工程菌高密度高表达
大肠
枯草
酵母
应用之一
不同发酵产品的过程优化与放大结果
发酵产品 国际水平 原水平 提高后水平 放大规模
水平
青霉素 6.5万 u/ml 4.5万 u/m 6.3万 u/ml 3M3放大到
120M3 国内领先
红霉素 8000--1万 u/m 5000u/ml 8400u/ml 15L放大到
50M3 国际先进
饲料金霉素 23万 u/ml 1.6万 u/ml 2.1万 u/ml 50L放大到 120M3
国内领先 (110小时 ) (110小时 ) (110小时 )
鸟苷 50g/L 16 g/L 32 g/L 60L放大到 100M3
产率
(100 小时 ) (50 小时 ) (50 小时 )
国际先进
肌苷 90g/L 25g/L 35g/L 50L放大到 50M3
国内领先 (90小时 ) (50小时 ) (50小时 )
工业生产发酵罐系统的设计与制造
生理代谢参数相似 的放大原则，并不
能代表大型发酵罐的几何结构和动力结
构等可设计参数的确定。
应用之二
罐体结构参数与设计
?例如根据 OUR,KLa以及所选用的搅拌桨特性测
算不同发酵罐规模所需的 搅拌功率 研究；
?根据 OUR与菌体细胞 剪切适应量 选择不同规模
发酵罐的 搅拌器形式、转速 或其他结构的研究；
动物细胞反应器 ;
?搅拌器的混和与剪切特性的冷态研究,计算流
体力学 的应用研究；
?H/D设计原理；
?大型发酵罐高功率搅拌器的加工与动平衡研
究，以及传动装置技术和整体罐结构设计研
究；
?根据 耗氧率 进行 发热量 估计及 传热面积 的研
究：
?不同传热结构（夹套、蛇管、半园管和 激光
焊接膨胀型蜂窝夹套 ）的传热效果、强度、
无菌性能和造价研究；
激光焊接膨胀型蜂窝夹套
生物反应器计算流体力学的应用
采用计算流体力学对转速 100rpm,通气速度为 1vvm,
100M3的发酵罐进行了流动场预测 (灰黄霉素 )
改进前的性能 改进后的性能
液体速度分布图
空气体积分布云图
改进前的性能 改进后的性能
工业应用的放大技术研究
以多尺度的观点，采用计算流体力学对生物反应
器进行流型仿真
计算流体力学在阿维菌素发酵过程优化中的
应用
溶氧（ DO）控制与菌体成
团就成为一对生物反应器
设计与控制的主要矛盾
2T发酵 120hr
摇瓶发酵 142hr摇瓶种子 摇瓶发酵 22hr 摇瓶发酵 118hr
2T种子 2T发酵 35hr
50T发酵 12hr 50T发酵 38hr 50T发酵 129hr50T种子
液体剪切速率分布云
改进前的性能 改进后的性能
气升式生物反应器没计
动物细胞反应器主要技术特点
动物细胞无细胞壁，对营养要求严格
对 pH、溶氧、温度、剪切应力、抗污染等环境
因子的高敏感性
悬浮细胞、无血清培养
实现动物细胞生化反应器的大型化、自动化和
精巧化
丝网结构
搅拌桨设计
(2)复杂系统多尺
度观点的应用
── 工程学方法
生物反应器 ——典型的具有时空多尺度结构的复杂系统
反应器内的
浓度场、温
度场、速度
场分布
颗粒团
聚、气
泡聚并
颗粒聚团
内的菌体
细胞
细胞内
代谢网
络
基因 DNA、
RNA网络
反应器 细胞代谢 基因水平
空间尺度
基因水平的分子尺度属于 纳尺度 范围，一
般在 10-9M以下
细胞代谢属于 微尺度 范围，在 10-8-10-4M
反应器工程属于 介尺度 范围，在 10-3-102M
-6 -4 -2 0 2 4 6 [s] log tim
酶浓度变化质量作用
变构控制
m-RNA控制 种群选择
进化
? 微生物和细胞在酶活性水平上（包括酶的激活、抑 制、亚基的
结合和解离、共价修饰和降解）控制的时间常数描述在 ms至 s的
范围内
? 基因表达 调控水平上（诱导、转录的抑制和去抑制）描述至 min
? 细胞内酶 的浓度变化与菌体生长由 小时至天 为单
? 种群 选择和进化水平上则描述至 更大 的单位
时间尺度
具有, 变化着的结构,
由于不同尺寸的边界条件难以区分，甚至还
未能发现，就造成系统结果的差异或最优过
程的严重偏离
经典的以动力学为基础的工程学概念
系统结构性变化的非线性特征
跨尺度观察与操作
?工业规模的生物过程只能在反应器尺度上
进行测量与操作
?可以从低一尺度层次的规律或性质，来预
测研究另一尺度层次的规律或性质
新型食品添加剂呈味核苷酸二
钠生产关键技术优化研究
应用例子之一
参数相关分析与状态方程建立
通过鸟苷发酵过程的数据采集发现：
4040小时 OUR下降，耗糖速率增加，氨氮用量增加
鸟苷产率迅速下降 ── 代谢流迁移
生物反应器：测量观察值
多尺度：细胞代谢流？
状态方程建立与系统识别
w
关键技术
17 种氨基酸的时序变化
纸层析分析
有机酸的积累
实测结果,代谢流分析
35小时：丙酮酸、丙氨酸积累
代谢途径迁移的酶学
测试
─── HMP途经 → EMP途经
关键技术
磷酸果糖激酶 磷酸葡萄糖脱氢酶
丙酮酸激酶
柠檬酸合成酶丙氨酸脱氢酶
化学计量学方法的代谢流研究
关键技术
代谢网络的代谢反应式 代谢方程组
在线检测通气流量、发酵液体积、排气氧和二氧
化碳浓度
离线常规分析菌体、葡萄糖和产物浓度
HPLC测定乙酸、柠檬酸和丙酮酸等有机酸浓度
HPLC测定丙氨酸等 17种氨基酸浓度
关键技术
不同时间代谢流分布 HMP
EMP
丙氨酸
代谢流,HMP→EMP→ 丙氨酸
跨尺度分析与工艺改进
确定以代谢流由 EMP向 HMP途径回复迁移 为目
标进行过程工艺优化，并以 OUR的下降作为跨尺
度操作 的相关因子
发现调控因子 A加入后短期内 OUR的下降速度
就开始放慢，到 48小时开始维持稳定直至放罐，
并且发酵后期的糖耗速率也变慢
关键技术
工艺改进后实施效果
?小试与中试规模,
17.2克 /L →34 克 /L(60小时 )
?100M3生产规模,
16克 /L → 32克 /L(60小时 )
关键技术
本项目完成后的
市场竞争纪要
?2001年 5月广东星湖公司恢复生产
?2001年 7月，日方提出就, 价格回升问题, 进
行谈判，星湖公司拒绝了日方谈判要求。
?2001年底星湖控制了中国市场，日方退出。
?20O2年价格回升，星湖开始创利
?目前价格已达 17.5万元 /吨
?2003年实施扩产计划，走向国际市场
经济效益与社会意义
?100M3工业规模发酵罐上发酵水平从 17.2g/L提高
27g/L
?产量二次扩产为原来的 300%
?I+G市场价格由原来的超低价回复到较正常的价格年度 新增产值
(万元 )
新增利润
(万元 )
新增税收
(万元 )
新增利税
(万元 )
2001 3129 ----- ----- -----
2002 7281 3450 1725 5175
2003年 1-4
月
5020 2040 680 2720
合计 15430 5490 2405 7895
效益与意义
获奖情况
2003年上海市科技进步一等奖
2004年国家科技进步二等奖
鸟苷生产菌中嘌呤核苷合成途径
三段基因序列的分析
嘌呤核苷生物合成与对应的基因操纵子
关键技术
分别从下列四个菌株中用 PCR拉出上述
序列：
野生型枯草杆菌 （ 160）
低 产 型 肌 苷 生 产 菌 7191
（ 161）
目前肌苷生产菌 （ 162）
目前鸟苷生产菌 （ 163）
Genebank
关键技术
研究结果
肌苷和鸟苷生产菌在 54位 （ 以翻译起始点为 1计 ） 缺
失了一个 A,因此将导致以下的所有 序列发生移码突
变, 所编码的 sAMP合成酶失活, 致使 AMP合成支路受
阻, 有利于肌苷和鸟苷的积累 。
可能是导致生产菌株产苷水平升高的一个重要原因 。
关键技术
(A) PurR dimer,The monomers are colored
according to function (N termini,HTH
motifs,and wings in blue; hoods in cyan; PPi
loops in gold; flexible loops in red; and
PRPP motifs in purple),Other regions are
green in one monomer and gray in the other
and are semitransparent to aid in viewing the
highlighted regions,In this view,the dimer
dyad axis is vertical and in the plane of the
page,Sulfate ions and a HEPES buffer
molecule are rendered as bonds colored by
atomic type (C,yellow; O,red; N,blue; and
S,green),(B) PurR monomer,The stereo
ribbon diagram is colored as the gray subunit
in panel A,Secondary structures are labeled,
Sulfate ions are shown as in panel A,
Residues 163 to 167 and 275 to 285 are not
displayed,as they are disordered,
阻遏蛋白 PurR的三级结构
Model for PurR-DNA binding.
Two PurR dimers (light gray) bind a DNA (dark gray) containing two PurBoxes,
According to this model,each PurBox is recognized by the conserved,positively
charged surface of a winged-helix dimer,PurR dimer-dimer contacts are like the
crystal lattice contact seen in both PurR crystal forms,An A track at the outer edge
of the strong PurBox kinks the DNA,thereby allowing contact with the positively
charged surface of the PRT domain and with the conserved,positively charged
surface surrounding the PRPP site (top of the labeled dimer),
Nucleotide sequence of the pur operon control region from B,
subtilis,The wild-type nucleotide sequence is shown from
position -177 to position +24 with respect to the site of
transcription initiation (+1),The PurBoxes are shaded.
问题?
菌种不变
良好的遗传背景 (sAMP)
反应器操作
主流代谢流迁移
16克 /L →30 克 /L
? 主流代谢迁移对生物合成的影响
? 除了生物合成基因外，还存在其他影响产物形成的基因和因素
? 这个基因的表型是受环境条件的影响
? 选择合理的（生物合成和其他）基因塔配和生物反应器操作
-------过程优化
三,过程生物技术的进展
(1)组学研究技术平台
基因组学 生命网络的零件
转录组学 生命网络的零件
蛋白质组学 生命网络的零件
代谢组学 生命网络的零件
相互作用组学 生命活动的途径、网络和模块
表型组学 生命活动的表征
计算生物学 生命活动的数学模型与预测
(2)系统生物学
二十一世纪的生命科学
整体性研究为特征的
一种大科学
生物科技的发展正在以, 结构基因组学 → 功能
基 因 组 学 （ 蛋 白 质 组 学 ） → 系 统 生 物 学
(system biology)→ 合成 生 物学 (synthetic
biology)”路径模式快速演进 。
生物过程工程系统生物学研究
可以对环境参数与细胞的转录组、蛋
白组、代谢组等不同层级的参数进行直接
的，机制性的,理性的，全域性的关联
生物过程系统生物学研究
的重要特点
? 我们所研究的复杂程度与目前已掌握知识
的局限性 。
?, 自上而下, 的研究, 还是, 自下而上,
的研究；, 整体, 研究还是, 局部, 研究 。
自上而下 自下而上
菌种 菌种
生产 生产 特性特性
生理 生理特性 特性
基因 1 基因 2 基因 3 基因 4 基因 1 基因 2 基因 3 基因 4
系统生物学
从完整的系统开始，将某分解成多个
组成部分及相互作用，但全部成分和
相互作用还设有被我们完全了解
现有研究方法
将所有已知组成以及相互作用
组合起来建立一个系统模型。
基本方法
? 反复推敲问题性质以及解决问题的途径,
要求在, 正常, 和, 非正常, 情况下对
问题进行对照摸索 。
?,数据超载, ─── 现代科学技术研究结果
的普遍现象 。
? 数据 → 信息 → 知识：
?数据的简化和归一化,
?将信息转化为知识就需要我们理解数据的真正
含义, 以及它是如何与所要解决的问题联系在
一起的 。
基于信息处理的生物过程检测与控制
生物过程的信息处理与控制系统
Fig,3 Modeling is a key tool for linking the
monitoring and control of biological systems
(Carl-Fredrik Mandenius, Bioprocess Biosyst Eng
(2004) 26,347–351)
生命科学测定技术与分析仪器
──重要的过程检测参数
基因组学
测序技术
转录组学
基因芯片
代谢组学
HPLC
相互作用组学
酵母双杂交
蛋白组学
2D电泳
时间飞行质谱
双链 DNA芯片
关联分析
发酵过程系统生物学研究的
宏观差异分析法
? 发酵过程中采用基于发酵过程参数相关的方法
? 酶和调控因子的差异蛋白质组学
? 基因水平上采用基因芯片的代谢谱整合法
── 精细工程（ Precision Engineering）
───发酵工程研究的生物学重要基础
(3)双组分系统（ TCS）
信号传导蛋白包含多种结构域，这些结构域都是模块
化的，它们能以各种各样的方式组织起来，构建大量的信号
传导回路。
基因组
环境组
转录组 蛋白组 代谢组
基因操作
过程优化
TCS调控网络
转录调
控网络
代谢调
控网络
对今后研究的影响
宏观与微观的联系
揭示过程的本质
实现过程优化与放大
组学研究在细胞过程中的应用
细
胞
过
程
关
联
分
析
RNA样本 转录谱分析
蛋白样本 蛋白谱分析
代谢物样本 代谢谱分析
代谢调控基因精细代谢过程改造菌种
多尺度过程参数相关分析优化环境因子
系统方法研究细胞培养过程的优点：
代谢工程与过程工程的统一
过程与系统的统一
过程优化与菌种改良的统一
过程参数与分子调控的统一
反应器系统与细胞系统的统一
表型研究中环境与基因组的统 一
四、以信息处理为基础的
生物过程检测与控制
检测与控制技术发展的历史回顾
参数 (变量 )分类
直接参数, 物理参数,如温度、通气流量、搅拌转速,…
化学参数,如 DO,pH、排气 02,CO2…
生物量参数, 菌量,OD
间接参数, 由一些直接参数计标得到的各种反映过程特性
的参数。如 OUR,CER,RQ
手工参数, 取样后实验室手工测量参数，离线输入。
经典与现代控制理论
现代控制
数学模型
静态和动态优化
系统识别
自适应控制
专家系统
模糊控制
神经元网络
各种混沌现象的研究
经典控制
开关量控制
PID反馈控制
前馈控制
串级控制
生物反应器复杂系统的认
识与测量控制技术
系统对象认识
对生物反应器的测量与控制系统的
发展产生重要影响
宏观到微观
工程学方法
还原与综合
技术平台的构建
基因组学
测序技术
转录组学
基因芯片
代谢组学
HPLC
相互作用组学
酵母双杂交
蛋白组学
2D电泳
时间飞行质谱
双链 DNA芯片
关联分析
PDQuest linked to ProteinLynx
M@LDITM Automated 2D-Gel-Tof MS
自动 LC ESI-MS/MS 分析
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
1013.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m /z0
100
%
1619.2 8968.6 4
836.5 8
893.6 7
1251.9 3
969.7 0
970.6 9
13.8 0
1060.2 3
1061.2 6
1252.9 7
1254.0 0
1570.1 7
1448.1 4
2313.6 9
2312.7 6
1621.1 4
1670.2 5
1671.2 4
1672.1 4
1873.4 6
1853.3 8 2019.5 71876.4 1 2271.8 3
2036.5 7
2314.7 5
2315.8 0
2366.8 3
2367.9 0
2368.8 5
2369.9 1 2718.0 9
Isolated
digested
proteins
Waters CapLC
ProteinLynx data
processing and database
searching
ProteinLynx
results browser
Micromass Q-Tof
automated
ESI-MS/MSMS/MS
制备型 HPLC
蛋白质－ DNA相互作用研究
建立发酵试验数据采集与分析系统
多尺度与系统生物学理论与观点
菌种改造、发酵工艺、发酵罐设计统一起来
计算机硬件系统
计算机软件系统
建议
在, 十一五, 和国家中长期规划
组织全国合作,5-10年解决以下问题：
?基因芯片转录谱、代谢物谱、差异蛋白、代谢工程、菌
种筛选平台、过程传感、实时代谢流分析与相关分析软
件包、反应器计算流体力学等配套技术问题。
?结合重大产品开发，开展基础性与应用基础研究，形成平
台技术与推广，基础性自主创新。
?模式生物研究：微生物以及外在环境构建成一种相对封闭
的生态系统，可以作为系统生物学的研究的模式生物。周期
短、见效快。
End
Thanks!
