发酵工艺学第一章：总论第一节：生物技术总论
2学时生物技术定义定义生物技术（Biotechnology）也称生物工艺学，有时也叫生物工程(Bioengineering),这可能强调这一领域源发于生命科学与工程技术的结合有关。
对于生物技术的含义和内容，各种说法不尽相同。从不同的学科和行业支理解生物技术时，总难免带有不同的侧重点。“仁者见仁，智者见智”
定义1：应用自然科学及工程学的原理，依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务。
定义2：利用生物有机体（微生物直至高等动植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器）发展新产品或新工艺的一种技术体系。
定义3：运用现代生物科学、工程学和其他基础学科的知识，按照预先的设计，对生物进行控制和改造或模拟生物机能，用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域。
归纳成三点：
1）：生物技术是一门多学科、综合性的科学技术（见分枝图）
2）：反应中有生物催化剂参加
3）最后目的是建立工业生产过程或进行社会服务，这一过程可称为生物反应过程。
生物催化剂（P5）
细胞（微生物、动物、植物）{
▲酶{
生物技术的种类生物技术的源流可以追溯到公元前的酿酒技术，这种原始的生物技术一直持续了四千多年，但它之所以能以今天的面貌跻身于现代高科技行列，则完全归功于近二三十年来生命科学的飞速发展与辉煌成就，其中特别与微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学和分子生物学等领域在理论与方法以上的突飞猛进有关。
分子生物学的某些突破使人们能够分离基因，并在体外进行重组，创造新物种、新品系。
生物技术正在或即将使人们的梦想和希望变为现实。生物技术的新方法为解决生物学和医学中的一些重大问题提供强有力的手段。当前，生物技术已在医药和化工等领域中崭露头角。一些生物工程药物，例如人生长激素、胰岛素、干扰素和各类细胞生长因子和调节因子等，已陆续投放市场，其意义远比抗生素的发现和应用更为深远。
生物技术的应用领域相当广泛，它将推动一系列新产业群的发展，且这些产业所需投资较少，产值却非常高。
它的最大用武之处是在农业领域，使用细胞融合和基因重组等技术，可以组建出不受气候条件限制和抗病虫害的优质高产作物品种，从而极大提高农作物的劳动生产率。农业终究有一天要成为“粮食工业”，从地球上消灭“饥饿“现象的日子也许会来到。
生物技术在不断发展之中，它的内容也在不断丰富和补充，现阶段的生物技术大致可分为：
基因工程（DNA重组技术）：核酸的分离提取、体外剪切、拚接重组以及扩增与表达技术。蛋白质工程补称为第二代基因工程，它利用蛋白质空间结构和活性之间的最新知识，借助计算机辅助设计和基因定位诱变与改造技术，以构建新的蛋白质细胞工程（细胞融合和大量培养技术）：包括细胞（有时也包括器官或组织）的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器（线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作。
例1：采用显微镜操作技术，将供体细胞核移植到去核的卵细胞或受精卵中，可获得核质杂交的重构卵，并发育成个体，该项技术使高等动物无性繁殖也成为可能，这将使濒临灭绝的珍稀动物繁衍。
例2：细胞大规模培养技术使动植物体内一些经济价值很高的微量成为能够用工业化方式大量生产。
1μg生长因子=1.5＄
1g半导体元件=10＄
酶工程（酶的修饰和利用技术）：包括酶的修饰，固定化酶和固定化技术。
发酵工程（微生物发酵技术）：给微生物提供最适宜的发酵条件生产特定产品的一种技术。
生化工程：包括生物反应器和传感器的设计，生物反应器的程序控制，产品分离精制技术。运用化学工程式的原理和方法对实验室所取得的生物技术成果加以开发，使之成为生物反应过程的一门学科。简单地说：生化工程是为生物技术服务的化学工程。
胚胎工程（胚胎操作和移植技术）
动物不能像植物细胞那样进行体细胞的无性繁殖，外源基因必须导入到生殖细胞可受精卵中，才能将遗传性状传递给后代。
生物技术的发展史
天然发酵阶段（混合发酵）
纯培养技术的建立
通风搅拌发酵技术
基因工程阶段
生物技术的应用
第二节：发酵工业概论发酵工程的定义
Fermentation ～ ferverl 翻涌，CO2
发酵：利用特定的微生物，控制适宜的工艺条件，生产人们所需的产品或达到某些特些目的。游离的整体微生物活细胞
发酵工业的特征原料菌种设备
一般发酵过程
（原料预处理） 培养基
菌种 种子扩大
第二章：工业微生物及其培养
第一节：微生物菌种一、发酵工业对生产菌种的要求要求产率高原料要易得、价廉发酵条件粗放菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。尽量诱变次数少，避免选择缺陷型发酵周期短的优点：感染杂菌的机会减少
提高设备的利用率菌种纯粹，稳定性好菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
抗杂菌能力强如抗噬菌体不是病原菌，不产生有害物质和毒素使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。
二、常用的工业微生物（2学时）
要求复习微生物知识，掌握基本形态霉菌黑曲霉(Asprgillus niger)：柠檬酸，糖化酶、酸性蛋白酶、低聚果糖、果胶酶、单宁酶土曲霉：衣康酸赤霉菌：赤霉素青霉：青霉素木霉：纤维素酶毛霉（Mucor）：产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油。
转化甾族化合物。微小毛霉，米黑毛霉：凝乳酶，脂肪酶根霉（Rhizopus）：米酒、黄酒米根霉（R.oryzae）L-乳酸红曲霉 (Monascus),红曲色素,洛伐他汀
细菌(按教材)
醋酸菌（Acetobacter）
假单胞菌（Pseudomonas）
乳酸菌大肠杆菌芽孢杆菌棒杆菌、短杆菌
酵母：酒精、各类酒、糖醇放线菌：抗生素
生产中菌种的分离、选育和保藏
第三节：种子扩大培养意义种子制备工艺实验室（菌种室） ※（带斜面、茄子瓶、克氏瓶）
斜面、固体培养或液体培养产孢子能力强、孢子发芽快、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可以直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易染菌。
产孢子能力，孢子发芽慢，液体摇瓶，菌丝体作为种子，如链霉菌素生产菌灰色链霉菌不产孢子的细菌，可以固体也可以液体酵母车间种子制备种子罐级数 制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度以及采用发酵罐体积而定。
谷氨酸：
斜面 摇瓶 种子罐 发酵 二级发酵青霉素：
孢子悬浮液 一级种子罐 二级种子罐 发酵 三级发酵
链霉素 四级发酵
种龄：生长旺盛期接种量
取决于菌种在发酵罐中生长繁殖速度
一般：细菌0.5-1% 抗生素10-15%（20-25%）
接种技术
1）一级种子罐接种菌悬液制备：三角瓶内装玻璃珠若干，加自来水或生理盐水，灭菌后，迅速倾入茄子瓶，振荡，制得菌悬液。
减压法接种
火焰封口法
2））二级种子罐 管道输送
种子质量要求
◆纯
◆活力旺盛
◆足够的菌体浓度第三章：发酵机理复习《生物化学》中糖代谢部分，熟练掌握无氧与有氧时代谢产物
4学时第一节：工业微生物基础物质代谢复习p69-93
第二节：糖代谢产物的发酵机理厌氧代谢产物的发酵机理酒精发酵机理葡萄糖 1，6二磷酸果糖 3-磷酸甘油醛 2丙酮酸
总反应式：葡萄糖 + 2ADP + Pi 2乙醇 + 2CO2 + 2ATP
计算从葡萄糖生成酒精的理论收率
作业：1吨薯干（含淀粉65%）可生产得到多少无水乙醇？（实际收率为理论值的95%）
甘油发酵机理
A:亚硫酸盐法
总反应式：葡萄糖 + NaHSO3 甘油 + + CO2
B：碱法甘油发酵（pH7.6）乙醛不能作为正常受氢体
2CH3CHO + H2O CH3COOH + CH3CH2OH
磷酸二羟丙酮 甘油 + Pi
总反应式：2葡萄糖 + H2O 2甘油 + 乙醇 + 乙酸 + 2CO2
乳酸发酵机理
同型乳酸发酵：葡萄糖 + 2ADP + Pi 2乳酸+ 2ATP
丙酸发酵机理
丁酸型发酵机理好氧代谢产物的发酵机理
（一）有机酸发酵机理
（二）氨基酸发酵
▲天冬氨酸族氨基酸
L-Asp，L-Thr，L-Lys，L-Met
葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸经CO2固定反应生成四碳二羧酸，后经氨基化反应生成天冬氨酸。
谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等中的天冬氨酸族氨基酸的代谢调节机制：
天冬氨酸激酶为关键酶，受赖氨酸和苏氨酸优先协调反馈抑制。
优先合成，蛋氨酸比苏氨酸、赖氨酸优先合成，苏氨酸比赖氨酸优先合成代谢互锁，赖氨酸分枝途径的初始酶受亮氨酸的反馈阻遏
▲谷氨酸族氨基酸（鸟氨酸Orn、瓜氨酸Cit、精氨酸Arg）
精氨酸是具有胍基的碱性氨基酸，它和组氨酸一起，称为半必需氨基酸，在幼小动物的营养上，有重要价值。瓜氨酸是西瓜和柿子果汁中的游离氨基酸。鸟氨酸以肽的形式，含在细菌的膜万分及抗生物质中。在医药上，除作试剂和输液以外，通常，精氨酸和鸟氨酸一起，用作保肝、强身、解毒剂之类药剂的原料。瓜氨酸有利尿作用。
▲分枝链氨基酸（异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸）
▲芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分子中都含有苯环结构，所以称作芳香族氨基酸。这三种氨基酸在结构上的另一个共同点，是其直链都是丙氨酸。
人体的酪氨酸是由苯丙氨酸转化而得。苯丙氨酸、色氨酸是必需氨基酸，用作氨基酸输液。因为色氨酸是玉米中所缺乏的氨基酸，故又用于饲料添加剂，另外，苯丙氨酸是二肽甜味剂的原料。
第四章：培养基
(2学时)
碳源是组成培养基的主要成分之一。
葡萄糖是碳源中最易利用的糖，几乎所有微生都利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分。但是过多的葡萄糖会过份加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间产物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。
淀粉、糊精等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经酶水解成单糖后再被吸收利用。——缓慢利用
有些微生物还可直接利用玉米粉、薯干
麦芽——啤酒
有机酸——富马酸、醋酸，有机酸的利用会使pH上升氮源：
▲无机氮源——快速利用{
▲有机氮源——缓慢利用，包括蛋白胨、牛肉膏、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉、麸皮水解液、尿素玉米浆是一种用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水浓缩物，含丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，它的平均化学组成：（抗生素工艺学P486）
成分
氨基氮
还原糖
总糖
溶磷
酸度
铁
总灰分
43%
3.9-4.0
2.32-1.9
3.6-3.7
1.25-1.52
10-11
0.05-0.5
20%
黄豆饼粉：水分11%，总氮11.2%,类脂物0.6%,总糖30%,灰分6.5%
麸皮水解液：可以代替玉米浆,俣蛋白质、氮基酸等营养成分比玉米浆少尿素：菌体必须含脲酶方可使用氨水是一种无机氮源，目前常在生产中使用高浓度液氨，注意：因分解容易带来pH波动的问题
培养基类型及选择
A：按纯度合成培养基：化学成分明确、稳定，适合于科研，在生产某些疫苗过程中，为防止异性蛋白等杂质混入，也经常使用。
天然培养基：发酵工业中普遍使用，营养丰富，适合于微生物生长。但成分有波动。
B：按用途孢子培养基：繁殖孢子。注意：①营养不要太丰富（特别是有机氮源）否则，不产孢子；②所用无机盐的浓度要适量；③pH和湿度要适中种子培养基：提供种子。①营养丰富和完全，氮源含量高些，总浓度稀薄，②碳源少量，若糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生在机酸，使pH下降，菌种容易衰老发酵培养基：主要目的是获得产物
例子：谷氨酸发酵培养基成分
种子培养基
发酵培养基
淀粉水解糖(%)
2.5
1 2.5
玉米浆(%
2.5-3.5
0.5-0.8
K2HPO4(%)
0.15
0.15
MgSO4(%)
0.04
0.06
Urea
0.4
3
Fe2+,Mn2+
各2ppm
各2ppm
1、什么时候可用淀粉作为碳源？
2、如何正确利用生理酸、碱性盐，稳定调节发酵过程pH？
3、查阅文献，找出几类典型产品生产所用的培养基，并分析它的组成。
第五章：氨基酸生产第一节：总论氨基酸的用途全世界AA的年需求量10%的速度增长，年总产量120万吨以上，而其需求量达800万吨。作为食品添加剂占40%，饲料添加剂占40%，医药保健品占20%。年产值已接近600亿美元。
1999年国内氨基酸产值30亿元，2000年达40亿元。目前用于AA输液的18种AA原料药品种，14种已工业化，原料药生产厂家从1989年的8家发展到现在的40多家。AA生产企业有100多家，年产量3万吨左右。
医药工业：
(1) 氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元。
食品工业：
我国味精的年产量已达100万吨，产销量占世界第一位。
氨基酸口服液、胶囊等湖北省八峰药业股份有限公司 准备上一条年产1.6亿瓶氨基酸口服液生产线。产品有复合型八峰氨基酸口服液、乐百寿、快快好、好轻松、凡童 五种。
3、饲料工业：
目前作为饲料添加剂的氨基酸有蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸7种。 其中以蛋氨酸(鸡饲料)、赖氨酸为主，近年某些国家已将苏氨酸用作饲料添加剂，主要用于以麦类为主的饲料中。天津化工厂从法国引进1万吨/年蛋氨酸生产装置，另已有三套3000吨/年以上的赖氨酸生产厂：广西赖氨酸厂（5000吨/年）、中外合资泉州大泉赖氨酸有限公司（5000吨/年）、四川化工厂与日本味之素公司合资的赖氨酸厂（6000吨/年）。色氨酸由于价格过高，无法被人们接受。
表3--8 世界氨基酸主要生产厂家生产能力品名
厂家
生产能力
品名
厂家
生产能力
蛋氨酸
日本曹达
20000
谷氨酸
味之素
60000
蛋氨酸
日本住友化学
5000
谷氨酸
日本旭化成
15000
蛋氨酸
日本化药
2500
谷氨酸
协和发酵
15000
蛋氨酸
德国迪高沙
85000
谷氨酸
日本武田药品
15000
蛋氨酸
法国AEC
105000
色氨酸
味之素
100
蛋氨酸
美国孟山都
45000
色氨酸
昭和电工
200
蛋氨酸
墨西哥阿尔拜梅克斯
5000
色氨酸
三井东压
100
蛋氨酸
西班牙Sodeti
4000
色氨酸
田造制药
50
蛋氨酸
苏联Volgograd
4000
色氨酸
日本化药
50
色氨酸
协和发酵
50
赖氨酸
日本味之素
55000
甘氨酸
日本有机合成化学
6000
赖氨酸
日本协和发酵
20500
甘氨酸
协和发酵
5000
赖氨酸
日本东丽
6500
甘氨酸
日本化药
1000
赖氨酸
南朝鲜味元
10000
丙氨酸
武藏野化学研究所
——
丙氨酸
日本化药
——
生产概况提取法，2、化学合成法，3、发酵法，4、酶法
1866年德国的Ritthausen博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，原料取材，命名为谷氨酸。1910年日本的味之素公司用水解法生产谷氨酸。1956年日本协和发酵公司分离到谷氨酸棒杆菌，1957年开始发酵法生产味精。
我国1958年开始研究，1965年在上海天厨味精厂投产。
迄今日本有18种AA用直接发酵法，4种用酶法。
甘氨酸 + 甲醛 L-Ser
发展趋势瓶颈产品生产技术的突破：L-Trp、L-Ser、L-His,L-Arg
氨基酸衍生物的发展：聚氨基酸(聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸)；5-羟色氨酸，谷胱甘肽，腺苷蛋氨酸等。
第二节：淀粉水解糖的制备许多工业微生物不能利用淀粉（如所有的氨基酸生产菌，大部分酵母），故发酵前必须将淀粉水解成糖。目前已发展成一门独立的工业——葡萄糖工业。
淀粉的结构及特点直链——大米，小麦支链——玉米，高梁，薯类为主复习结构方面概念：α-1，4糖苷键，α-1，6糖苷键，还原性末端（自由醛基），非还原性末端，与碘呈色反应（6 个葡萄糖与1个碘分子形成一圈螺旋，呈蓝色）。
酸水解水解原理：（C6H10O5）n + nH2O n(C6H12O6)
理论转化率 y=180/164×100% = 111%
但存在副反应
复合反应复合二糖主要由α-1，6糖苷键聚合成异麦芽糖
β-1，6糖苷键聚合成龙胆二糖多数复合二糖不能被微生物利用，发酵结果残糖增加，提取精制困难。
复合反应进行的程度与淀粉乳浓度、酸种类、酸浓度、温度有关。
①淀粉乳浓度增加，葡萄糖值增加，复合反应增加。
淀粉乳浓度（%）
DE值
复合糖
13.5
94
6
22.5
89.6
10.4
18-20(10-12Beo)
90-92
7
②酸对复合反应的影响用盐酸水解生成最多，其次为硫酸，最少为草酸分解反应造成的损失约1%左右，主要影响是生成色素。
双酶法制糖工艺味精工业的酸法糖化改为双酶法糖化，使转化率从90％左右提高到97％-98％，味精总收率提高4％，全行业年增产味精 2万多 吨，年节粮8万吨。
由于酶的高度专一性及反应条件的温和，使淀粉水解液的葡萄糖纯度得以提高，颜色浅，出糖率大大增加（DE值可达98%）。
双酶工艺主要包括：液化和糖化两个步骤。
液化是利用液化酶（α-淀粉酶）使淀粉糊化，粘度下降，并水解到糊精和低聚糖的程度。
糖化是用糖化酶将液化产物（糊精、低聚糖）进一步彻底水解成葡萄糖的过程。
液化
α-淀粉酶能水解α-1，4糖苷键，生成糊精及低聚糖。随着糖苷键的断裂，分子量越来越小，反应液粘度不断下降，流动性增加，这种现象，工业上称为液化；因为主要产物为糊精，也称糊化。
（1）液化条件 随酶的不同性质和活力而定国产BF7658α-淀粉酶，在30~35%浓度下，在85~87℃时活力最高，但当温度100℃10分钟则完全失活；
地衣芽孢杆菌的耐热α-淀粉酶热稳定性比BF7658α-淀粉酶高20℃，液化淀粉可在110℃进行，无需钙离子作稳定剂。
（2）液化程度如果让液化长时间进行，最终产物也是葡萄糖等。但这样所得的糖液葡萄值低，作用时间长。而且一部分已液化的淀粉会重新结合成硬束状体，使糖化酶难以作用；另一方面，糖化酶水解糊精及低聚糖分子时，需先与底物分子生成络合结构，这就要求底物分子具有一定的大小范围。
正常液化条件下，控制液化在DE10~20之间。（此时多量糊精及低聚糖，少量单糖）
糖化糖化的温度和pH取决于糖化剂的性质生产上使用的糖化酶主要来自黑曲霉，根霉和拟内孢霉。
黑曲霉UV-11 55~60℃，pH4.0~4.5，DE值可达99%
根 霉 50~55℃，pH4.0~4.5
DE值达最高时应停止酶反应，否则，生成的葡萄糖经α-1，6键起复合反应而使DE值下降。
糖化终了，80℃20分钟灭酶。
新工艺介绍
第三节 谷氨酸发酵的代谢控制代谢途径见P113
主要的酶反应：
α－酮戊二酸 + NH4+＋NADPH2 谷氨酸＋H2O＋NADP
在TCA循环中：
α－酮戊二酸 +NADP＋CoA-SH 琥珀酰CoA＋CO2
葡萄糖 2丙酮酸
理论收率：147÷180×100%=81.7%
完全走乙醛酸途径
1.5 葡萄糖 3丙酮酸 3 乙酰CoA
2乙酰COA 2异柠檬酸
故若完全走乙醛酸补充途径，则 1.5葡萄糖 1谷氨酸
理论收率为147÷（1.5×180）= 54%
菌种的特征：
谷氨酸脱氢酶活力强
α-酮戊二酸氧化能力弱
NADPH再氧化能力低生物素缺陷型
生物素与细胞膜透性的关系
作用机制生物素是羧化酶的辅基，属VB族，它在CO2固定和脂肪酸合成中起催化作用。
结构式：
总反应式：
CH3CO~SCOA + CO2 + ATP HOOCCH2 CO~SCOA +ADP +Pi
然后由乙酰COA与丙二酰CoA反应生成β酮丁酰以至丁酰CoA，
即 C2+ C3 C4 + CO2
C4 + C3 C6 + CO2
……………………
作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶——乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。
细胞膜由磷脂双分子层为其基本结构，其中60%为蛋白质，40%为类脂。磷脂主要是卵磷脂，结构如下：
R1，R2为高级脂肪酸的链，主要有软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸及十八碳三烯酸与二十碳四烯酸。
生物素缺陷型，脂肪酸合成少，磷脂合成少，细胞膜不完整，当磷脂合成减少到正常量的50%左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。
控制的关键生物素亚适量5~10μg/L。发酵初期（0~8h），菌体正常生长；当生物素耗尽后，在菌的再次倍增期间，开始出现异常形态的细胞，菌体伸长、膨大乃至不规则形，边缘有折绉、稍模糊，电镜观察似疱疹样，完成向谷氨酸非积累型向积累型细胞的转变。
讨论：有否别的措施？
除此外，还可甘油缺陷，油酸缺陷型第二层次：添加饱和脂肪酸、表面活性剂，它们的作用主要是在不饱和脂肪酸合成中，作为抗代谢物。即它们存在，油酸合成下降，透性增加。
在高浓度油酸存在时，添加上述三种也无效，必须控制以后的反应，即磷脂、细胞膜的形成或破坏细胞壁。
青霉素和细胞壁关系：
第四节 谷氨酸生产菌及种子扩大培养（2学时左右）
一、菌的特征与菌学性质
现有氨基酸生产菌主要是棒杆菌属（Corynebacterium）
短杆菌属 (Brevibacterium)
小杆菌属 (Microbacterium)
节杆菌属 (Arthrobacter)
共同特征为：
细胞形态为棒杆、短杆
G+，无芽孢，无鞭毛，不能运动都是需氧型生物素缺陷型脲酶强阳性不分解淀粉发酵中菌体发生明显的形态变化，同时细胞膜渗透性的变化。
CO2固定反应酶系活力强乙醛酸循环弱
10、α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱
11、谷氨酸脱氢酶活力强
12、不分解谷氨酸，并能耐高浓度谷氨酸
北京棒杆菌AS1.299,
形态特征：普通光学显微镜观察在普通肉汁斜面上培养6、12、24及48小时的染色培养物，细胞通常为短杆至小棒状，有时微呈弯曲状，两端钝圆，不分枝，呈多种形态，即培养6小时细胞有延长现象；细胞呈单个、成对及V字型排列；细胞大小为0.7-0.9×1.0-2.5μm。
培养特征：
普通肉汁琼脂斜面 中间划直线培养，呈中度生长，菌苔线状，24 h为白色，48 h后稍呈淡黄色，随培养时间的延长颜色稍增深，表面湿润，光滑，有光泽，无粘性，不产生水溶性色素。
普通肉汁琼脂平板 菌落圆形，培养24h菌落为白色，直径约1mm，48 h为2.5 mm，延长培养至一周可达4.5-6.5mm，淡黄色，中央隆起，表面湿润，光滑且有光泽，边缘整齐并呈半透明状，无粘性，不产生水溶性色素。
普通肉汁液体培养普通肉汁琼脂穿刺
二、种子扩大培养
斜面活化 一级种子 二级种子
（1）斜面：肉膏培养基，18~24h，32℃
（2）一级种子：三角瓶200ml/1000ml△，瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖。摇床性能介绍（往复，96rpm,76mm振幅；旋转，偏心距5cm，220 rpm）,瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖
（3）二级种子：种子罐500升，培养基为水解糖
一级种子质量要求：
用显微镜观察，菌体粗壮、均匀，排列整齐。
用琼脂平板检查，无杂菌，无噬菌斑。
OD值净增在0.6左右。
种子培养液pH在6.4左右。
种子培养液残糖含量在0.5%以下二级种子质量要求：
pH在7.2左右；
残糖含量在1.5%以下；其他同一级种子。
第五节：发酵工艺
温度对发酵的影响及控制发酵热：引起发酵过程温度变化的原因是发酵过程所产生的热量，称为发酵热。发酵热包括生物热、搅拌热、蒸发(汽化)热和辐射热等。
（1）生物热：由于菌体的生长繁殖和形成代谢产物，不断地利用营养物质，将其分解氧化获得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物，供合成细胞物质和合成代谢产物所需要的能量。其余部分以热的形式散发出来，这就是生物热。
发酵过程的产热具有明显的时间性。即在不同培养阶段，菌体呼吸作用和发酵作用强度不同，所产生的热量不同。
（2）搅拌热：Q搅拌=P×3600 KJ/h 3600——机械能转变为热能的热功当量
（3）蒸发热：通气时，引起发酵液水分蒸发，发酵液因蒸发而被带走的热量称为汽化热。
Q汽化=4.18 G (I出-I进) G——空气的重量流量；I出——出口空气的热焓。
辐射热：因发酵过程温度与周围环境温度不同，发酵液的部分热量通过罐体向外辐射。客观存在的大小，取决于罐内外温度差，冬天大些，夏天小些。一般不超过5%。
发酵过程需要用冷却方式带走的发酵热为：
Q总 = Q生+ Q搅拌-Q汽化- Q辐射
温度对发酵的影响从动力学角度来看，T升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；另一方面，T升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。
T通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。
影响生物合成方向。如金色链霉菌>35℃时，合成四环素；<30℃时，合成金霉素。
最适温度的选择各种微生物在一定条件下，都有一个最适的生长温度范围；产物合成的最适温度与生长温度往往不同。
谷氨酸产生菌 最适生长30-32℃，产物34-37℃
黑曲霉 37℃，柠檬酸、糖化酶32-34℃
青霉素 30℃，分泌青霉素20℃
变温培养法比常温25℃提高产量16%
pH对发酵的影响及控制
pH对发酵的影响影响酶的活性。影响酶活性中心上有关基团的解离；影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶——底物的结合影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及低谢产物的排泄。
引起菌体的代谢过程不同
柠檬酸 黑曲霉 草酸
乙醇 酵母 甘油
谷氨酰胺 棒杆菌 谷氨酸
发酵过程pH的变化发酵过程pH的调节方式添加CaCO3 采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被利用，剩下的酸根引起pH下降；有机酸发酵时形成钙盐沉淀。
但是，碳酸钙用量大，消毒困难，易堵塞管道，在操作上易引起染菌，而且对产物的提取有影响。此法在工业上不使用。
氨水、尿素流加法其他方法 酶制剂、抗生素发酵通过加糖、淀粉来控制pH。如表霉素 根据代谢需要，改变加糖率，比固定加糖而用酸碱调节pH增产25%。
供氧对发酵的影响通风适量 生成谷氨酸通风过量 生成α-酮戊二酸
通风不足 生成乳酸或琥珀酸
谷氨酸发酵时不同容积发酵罐的搅拌转速和通风比发酵罐容积m3
0.05
0.5
5
10
20
50
搅拌转速r/min
550
300
185
160
140
110
通风比（m3/ m3,Min）
1:0.5-0.6
1:0.3
1:0.18-0.2
1:0.16-0.17
1:0.15
1:0.12
泡沫的消除
泡沫给发酵造成的影响
a） 过多，升到罐顶从轴封渗出，造成染菌；
b） 使发酵罐装填系数减少，设备利用率下降；
c） 影响通风搅拌正常进行，影响氧的传递，妨碍菌的呼吸；
d ）增加菌群的非均一性，微生物随泡沫漂浮。
泡沫形成的规律
泡沫的多少，一方面与搅拌、通风有关；另一方面，与培养基性质有关。蛋白质原料，如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要发泡剂。
泡沫的消除机械消泡：利用机械力将泡沫打破，或借压力变化使泡沫破裂。最常用的是耙式消沫浆。
化学消泡：破泡作用——当消泡剂加入到发泡体系中，由于消泡剂的表面张力低（相对于发泡体系），在消泡剂接触液膜面时，成为泡膜的一部分，使液膜面扩大，变薄，同时使泡膜局部表面张大降低，力的平衡破坏，在力的作用下气泡破裂、合并，最后导致泡沫破灭。
消泡剂选用原则：
消泡剂必须是表面活性剂，具有较低的表面张力。
对气液界面的铺展系数必须足够大，以便能迅速发挥其消泡活性，这就要求消泡剂具有一定的亲水性。
在水中的溶液解度极小，保持持久的消泡或抑泡作用。
无毒，不影响发酵。
常用消泡剂：
天然油脂类，包括豆油、菜子油、花生油、玉米油等。由于油脂分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性差，用量大，一般为发酵液的0.1-0.2%
聚醚类
GP亲水性差，溶液解度小，抑泡性能比消泡性能好；
GPE10亲水性好，易铺展，消泡性能强；但相应溶解度大，消泡活性维持时间短。用量一般为发酵液的0.01-0.03%
(3)硅酮主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，分子式为：
是无色液体，不溶于水，表面张力低达21dyn/cm（泡敌为33，向日葵油40，青霉素发酵液60-68 dyn/cm）。纯的聚二甲基硅氧烷的消泡能力奶低，因此常加分散剂来提高消泡活性，或乳化剂成乳状液。
硅酮消泡剂适用于微碱性发酵，对于微酸性发酵较差。
（4）醇类 十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。
发酵过程主要变化及中间代谢
中间分析菌体形态和浓度 菌体形态的改变是代谢变化的反映，抗生素生产中以菌丝形态作为衡量种子质量，区分不同发酵阶段、控制代谢变化及决定发酵周期的依据之一。
目的产物含量的测定 控制发酵生产以及决定放罐时间的重要参数。
pH 反映营养物质消耗、产物形成的综合指标基质浓度 糖、氮、磷含量。控制这些物质的供给和消耗是提高产量的重要手段。
中间补料
菌体生长代谢需要一个合适的浓度，过高的浓度对菌体生长有抑制作用，过低，不能满足产物合成的需要。
中间补料主产生菌在分泌期有足够多而不过多的养料，使代谢活动朝着有利于合成产物的方向发展，延长分泌期，提高抗生素产量。
补糖：
开始补糖的时间 过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料；
补糖方式 连续流加，少量多次间歇补入和大量少次补入三种方式。
注意要避免环境突然变化对代谢带来影响。
补糖量：以维持稳定的糖浓度；如，四环素发酵还糖维持在0.8-1.2%
例子：谷氨酸追加糖液发酵在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖果液，维持2%左右的糖浓度。
优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵
总糖浓度达20%，产酸高。
补氮：
流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮谷氨酸发酵时，初尿用量和补尿多少取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力；
As1.299 脲酶活力低，耐尿强，初尿用量多2%，流加次数少
T6-13 脲酶活力强，耐尿低，初尿用量少0.6%，流加以少量多次好
As1.524 1-1.4%
第六节：谷氨酸的提取（2～3学时）
发酵液的性质和发酵废液的综合利用发酵液性质发酵呈浅黄色浆状，温度34～36℃，pH7左右谷氨酸以铵盐形式存在含无机盐，有K，Na,NH4+,Mg,Ca,Fe,Cl,SO4,PO4等，还有残糖、色素、尿素等。此外，还有消泡剂。
大量菌体、蛋白质等固形物悬浮在发酵液中，湿菌体约占发酵液的5-8%
发酵液中尚有其他副产物。有机酸类有乳酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等；氨基酸类有Asp、Ala、Val、Pro、Ile、Leu、Gly、His、Gln等。各种氨基酸量小于1%
铵离子0.6-0.8%，残糖0.5%
腺嘌呤0.02-0.05%，而尿嘧啶约占001-0.03%
菌体分离菌体很轻很小，大小为0.7~1.0×1.0~3微米机械分离添加凝聚剂
等电点法提取谷氨酸
p220-223
谷氨酸结晶性质：
α型：晶体粗壮，呈颗粒状，质量重，易沉降，与母液分离容易
β型：晶轴长短不一，呈针状或鳞片状，晶粒微细，纯度低，难沉降。
影响结晶析出的主要因素
温度：（a）影响溶解度；
温度℃
0
5
10
15
20
25
30
35
溶解度%
0.341
0.411
0.495
0.596
0.717
0.864
1.040
1.250
（b）影响晶型
30℃以下，α型为主；30℃以上，β型为主
在中和调等电点过程中，发酵液的温度应缓慢下降，结晶颗粒大。若温度下降过于迅速，晶核小而多。
加酸：
缓慢加酸，使谷氨酸溶解度逐渐降低，可控制一定数量的晶核，即晶核不会形成太多，经养晶育晶后成长壮大，析出的结晶颗粒大。加酸过快，容易形成局部过饱和，晶核过多，结晶细小，不易沉降分离。
晶种：
晶核形成以前，适时投放一定量的晶种，有利于收率的提高，投放晶种条件一定要准确，过早，晶种化掉；过迟，刺激更多晶核形成。
投放目的：控制一定数量的晶核，并以晶核为核心，使其不断长大。
国外的提取技术：
发酵液 菌体过滤（加助滤剂或超速离心） 四效浓缩10倍
冷却到室温调pH3.2 谷氨酸析出90%，纯度86-90%
优点：1 吨水产生0.25吨蒸汽，二次蒸汽利用，很经济
废水量减少为国内的1/10，盐酸用量减少
菌体回用，提取核苷酸等贵重药品，或作为饲料；菌体存在于发酵液中,不利于谷氨酸的结晶分离。
清洁生产工艺
由谷氨酸制成味精p336
第六章 抗生素生产第一节：总论抗生素的定义
——是生物在其生命活动过程中产生的（或得用化学、生物或生化方法所衍生的），在低微浓度下能选择性抑制他种生物机能的化学物质。
作用：抗菌、抗肿瘤、杀虫除草、抑制生物体中某些酶类，有些还具有某些药理活性，如强力霉素——镇咳。新霉素——降胆固醇生产方法：
①微生物发酵法：为主
②少数如氯霉素、磷霉素亦可用化学合成法生产
③半合成抗生素对抗生素分子结构改造而制成的各种衍生物
发展我国自1953年设计制造了4个5吨发酵罐，建立上海第三制药厂，开始生产青霉素，1957年建立华北制药厂，经40多年来发展，国外有的基本抗生素品种我国都有生产，并已研制出国外没有的抗生素——创新霉素等。截止1996年上半年，总计127个品种生产，总产量近几年3万吨，约占世界抗生素产量的1/4。农用抗生素研究生产也获得了可喜的成绩，灭瘟素、春日霉素和有效霉素等。
分类从自然界发现4000多种抗生素，包括半合成的有3万多种，不同领域的科学家提出了不同的分类方法。
应用
（1）抗生素剂量表示法使用剂量不足，达不到抑菌能力使用剂量过高，会产生毒副作用，且引起病原菌的耐药性。
故常用效价单位作为衡量抗生素的一尺度。
▲一个青霉素效价单位——在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标 准菌株发育的最小青霉素剂量。
一个链霉素效价单位——1ml肉汤培养基中完全抑制E.Coli……
一个制霉霉素效价单位——1ml肉汤培养基中完全抑制某种酵母……
（2）在医疗上应用青霉素钾、钠等可控制敏金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等引起的严重感染（败血症、肺炎、脑膜炎等），半合成青霉素和头孢菌素用于对付耐药性金黄色葡萄球菌。
链霉素——抗G-和结核杆菌广谱抗生素有四环素、金霉素、强力霉素
第二节：主要抗生素工业生产过程（2学时）
土霉素生产结构生物合成机制发酵工艺菌种 龟裂链霉菌（Streptomyces Rimosus）菌落灰白色，后期生皱褶，呈龟裂状。菌丝呈树枝状分枝，白色，孢子灰白色、柱形。
生产流程
砂土管孢子 斜面孢子 一级种子 二级种子 发酵
32℃—31+0.5—32℃
提取
砂土管 黄沙：土 = 1：1（沙和土都经处理，水洗至中性，烘干，研细，过筛）
每管装一定量的砂土，塞好棉塞包好，121℃高压蒸汽灭菌后再用160 ℃ 干热灭菌2h
每支砂土管加0.3mL孢子悬浮液，包好，放入装有干燥剂的真空干燥剂内抽干6-12 h，轻轻敲打使其均匀。完后，放入装有干燥剂的密闭瓶内，0-4℃贮藏。
斜面 250 mL茄子瓶 麸皮4%，麦粉2%，琼脂2%，
一级种子 400-500L夹套二级种子 4m3与上不同的是二级罐带搅拌发酵 15%接种量培养基：碳源：淀粉 经α-淀粉酶液化
氮源：黄豆饼粉，硫铵
无机盐：KH2PO4，NaCl,CaCO3，CoCl2
生长因子：酵母粉，玉米浆
采用中间补料，延长抗生素分泌期，是提高抗生素产量的重要方法。土毒素生产过程采用补糖与补氨，以保证其在分泌期有足够多而不过多的养料。
总糖 前期 0-80 h 6.5-8%总糖
中期 80-120 h 5-6.5
后期120-140 h 4-5
末期 140 h后 4%
放罐残糖3%以下，放罐前24 h不补料。
补氨同时为调pH，pH=6.0-6.3，放罐前8 h停止通氨，整个过程通氨水总量350-400升。
提取抗生素提取一般可分为沉淀法，溶媒萃取法，离子交换法。
一、预处理目的 土霉素能和发酵液中钙盐、镁盐,某些有机胺、蛋白质形成不溶性化合物，积聚在体内。预处理目的为：1）使部分土霉素溶液解出来；2）蛋白质（菌丝）沉淀；3）Fe3+沉淀黄血盐使Fe3+沉淀，ZnSO4有利于蛋白质凝固
工艺
发酵液(26000 r/ml) 酸化液+低单位套液
稀释液 净化液
滤液——土霉素草酸滤渣——草酸钙+蛋白质+菌体+铁络合物
纯化液 脱色液
土霉素草酸 土霉素↓ + 草酸
湿晶体 成品
第七章 酶与酶制剂生产
——α-淀粉酶生产工艺生产菌种以芽孢杆菌为主，BF-7658
发酵工艺
斜面 孢子悬浮液 种子罐 发酵罐斜面
马铃薯培养基或淀粉蛋白胨培养基茄子瓶50ml左右，37℃72h
孢子悬浮液用50 ml无菌生理盐水洗下种子及发酵培养工艺配方
种子3m3
发酵30 m3
总配比
基料
补料
豆饼粉
4
5-6.5
4
22.7
玉米粉
3
9-9.5
4
8
Na2HPO4
0.8
0.8
(NH4)2SO4
0.4
0.4
NH4Cl
0.2
0.15-0.2
淀粉酶
10-15万单位
70万单位
CaCl2
-
0.4
体积
8 m3
4 m3
不同阶段通风比为：
种子罐 0-10小时，1,1.3； 10-14小时 1:1.45
发酵罐 0-12小时，1,0.74；12小时以后1:1.46-1.1
中间补料 12小时后，每隔1小时补料一次直至多40小时左右。
pH高于6.5,菌体空泡多，意味着出现衰老，多补一些。补料结束后6-8小时，升至7.5，营养细胞80%不空泡，酶活不增加，放罐。
补料优点：（低浓度发酵和高浓度补料）
有利于菌体生长产酶发酵后残糖、残氮低，便于提取高浓度补料可以保持环境稳定，延长产酶期，增强菌体产酶的诱导作用，增加产酶量。
三、提取工艺 发酵液的预处理见P214-218，P226
酶的提取原理：——蛋白质的沉淀作用利用酒精、丙酮等有机溶剂作为脱水剂因为它们的亲水性大于蛋白质的亲水性，与水分子缔合，破坏蛋白质的水化膜。使蛋白质处于不规则的扩散过程中，颗粒之间互相碰撞，在分子内聚力的影响下，聚合形成大颗粒而沉淀 。
加入电解质或调整到等电点，蛋白质失去电荷。——盐析作用硫酸铵是常用的盐析剂，其优点是即使在较低温度下溶解度仍然很高，盐析时不必加温使盐溶解，其饱和溶液可使大多数酶沉淀，对酶无破坏作用。压滤下来的废液可直接作农肥。
α-淀粉酶食用酶的提取：
发酵液350U/mL
质量指标：5000U/g，保存率85%（半年）
作业：
从生物样品细胞中分离纯化某种酶，首先将该样品制备成粗提液，今选择DEAE层析和盐析二种方法进行分离纯化比较，现测得总蛋白和酶活力的数据列于下表，请将结果填入下列规定的空格中，从中可发现什么?
纯化实验
总蛋白(g)
总活力（U）
比活力
（U/mg蛋白）
纯化倍数
收率（%）
粗提取液
30
21000
/
100
DEAE-层析
0.133
5025
硫酸盐层析
0.048
3467
称取25毫克蛋白酶粉配制成25毫升酶溶液，从中取出0.1毫升酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分种产生1微克酪氨酸的酶量为1个活力单位计算，根据以上数据，求出：
1毫升酶液中所含的蛋白质量及总活力比活力
1克酶制剂的总蛋白含量及总活力。
用1克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取出1毫升测定淀粉酶活力，测知每5分钟分解0.25克淀粉，计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位数。（淀粉酶活力定义：每小时分解1克淀粉的酶量为1个活力单位。）
4、某一酶游离状态下酶活为2000U/g，用卡拉胶固定化后用于酶反应，固定化操作采用如下二种方案：
A、用2g酶粉与200mL 4%卡拉胶溶液混合，得200g固定化酶，每克固定化酶的酶活为12U；
B、用10g酶粉与200mL4%卡拉胶溶液混合，得200g固定化酶，每克固定化酶的酶活为40U。
请计算A和 B酶活力回收率？若该酶很贵，请问选用何方案？若该酶很便宜，又选用何方案？说明理由。
2学时生物技术定义定义生物技术（Biotechnology）也称生物工艺学，有时也叫生物工程(Bioengineering),这可能强调这一领域源发于生命科学与工程技术的结合有关。
对于生物技术的含义和内容，各种说法不尽相同。从不同的学科和行业支理解生物技术时，总难免带有不同的侧重点。“仁者见仁，智者见智”
定义1：应用自然科学及工程学的原理，依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务。
定义2：利用生物有机体（微生物直至高等动植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器）发展新产品或新工艺的一种技术体系。
定义3：运用现代生物科学、工程学和其他基础学科的知识，按照预先的设计，对生物进行控制和改造或模拟生物机能，用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域。
归纳成三点：
1）：生物技术是一门多学科、综合性的科学技术（见分枝图）
2）：反应中有生物催化剂参加
3）最后目的是建立工业生产过程或进行社会服务，这一过程可称为生物反应过程。
生物催化剂（P5）
细胞（微生物、动物、植物）{
▲酶{
生物技术的种类生物技术的源流可以追溯到公元前的酿酒技术，这种原始的生物技术一直持续了四千多年，但它之所以能以今天的面貌跻身于现代高科技行列，则完全归功于近二三十年来生命科学的飞速发展与辉煌成就，其中特别与微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学和分子生物学等领域在理论与方法以上的突飞猛进有关。
分子生物学的某些突破使人们能够分离基因，并在体外进行重组，创造新物种、新品系。
生物技术正在或即将使人们的梦想和希望变为现实。生物技术的新方法为解决生物学和医学中的一些重大问题提供强有力的手段。当前，生物技术已在医药和化工等领域中崭露头角。一些生物工程药物，例如人生长激素、胰岛素、干扰素和各类细胞生长因子和调节因子等，已陆续投放市场，其意义远比抗生素的发现和应用更为深远。
生物技术的应用领域相当广泛，它将推动一系列新产业群的发展，且这些产业所需投资较少，产值却非常高。
它的最大用武之处是在农业领域，使用细胞融合和基因重组等技术，可以组建出不受气候条件限制和抗病虫害的优质高产作物品种，从而极大提高农作物的劳动生产率。农业终究有一天要成为“粮食工业”，从地球上消灭“饥饿“现象的日子也许会来到。
生物技术在不断发展之中，它的内容也在不断丰富和补充，现阶段的生物技术大致可分为：
基因工程（DNA重组技术）：核酸的分离提取、体外剪切、拚接重组以及扩增与表达技术。蛋白质工程补称为第二代基因工程，它利用蛋白质空间结构和活性之间的最新知识，借助计算机辅助设计和基因定位诱变与改造技术，以构建新的蛋白质细胞工程（细胞融合和大量培养技术）：包括细胞（有时也包括器官或组织）的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器（线粒体、叶绿体等）的移植与改建等操作。
例1：采用显微镜操作技术，将供体细胞核移植到去核的卵细胞或受精卵中，可获得核质杂交的重构卵，并发育成个体，该项技术使高等动物无性繁殖也成为可能，这将使濒临灭绝的珍稀动物繁衍。
例2：细胞大规模培养技术使动植物体内一些经济价值很高的微量成为能够用工业化方式大量生产。
1μg生长因子=1.5＄
1g半导体元件=10＄
酶工程（酶的修饰和利用技术）：包括酶的修饰，固定化酶和固定化技术。
发酵工程（微生物发酵技术）：给微生物提供最适宜的发酵条件生产特定产品的一种技术。
生化工程：包括生物反应器和传感器的设计，生物反应器的程序控制，产品分离精制技术。运用化学工程式的原理和方法对实验室所取得的生物技术成果加以开发，使之成为生物反应过程的一门学科。简单地说：生化工程是为生物技术服务的化学工程。
胚胎工程（胚胎操作和移植技术）
动物不能像植物细胞那样进行体细胞的无性繁殖，外源基因必须导入到生殖细胞可受精卵中，才能将遗传性状传递给后代。
生物技术的发展史
天然发酵阶段（混合发酵）
纯培养技术的建立
通风搅拌发酵技术
基因工程阶段
生物技术的应用
第二节：发酵工业概论发酵工程的定义
Fermentation ～ ferverl 翻涌，CO2
发酵：利用特定的微生物，控制适宜的工艺条件，生产人们所需的产品或达到某些特些目的。游离的整体微生物活细胞
发酵工业的特征原料菌种设备
一般发酵过程
（原料预处理） 培养基
菌种 种子扩大
第二章：工业微生物及其培养
第一节：微生物菌种一、发酵工业对生产菌种的要求要求产率高原料要易得、价廉发酵条件粗放菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。尽量诱变次数少，避免选择缺陷型发酵周期短的优点：感染杂菌的机会减少
提高设备的利用率菌种纯粹，稳定性好菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
抗杂菌能力强如抗噬菌体不是病原菌，不产生有害物质和毒素使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。
二、常用的工业微生物（2学时）
要求复习微生物知识，掌握基本形态霉菌黑曲霉(Asprgillus niger)：柠檬酸，糖化酶、酸性蛋白酶、低聚果糖、果胶酶、单宁酶土曲霉：衣康酸赤霉菌：赤霉素青霉：青霉素木霉：纤维素酶毛霉（Mucor）：产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油。
转化甾族化合物。微小毛霉，米黑毛霉：凝乳酶，脂肪酶根霉（Rhizopus）：米酒、黄酒米根霉（R.oryzae）L-乳酸红曲霉 (Monascus),红曲色素,洛伐他汀
细菌(按教材)
醋酸菌（Acetobacter）
假单胞菌（Pseudomonas）
乳酸菌大肠杆菌芽孢杆菌棒杆菌、短杆菌
酵母：酒精、各类酒、糖醇放线菌：抗生素
生产中菌种的分离、选育和保藏
第三节：种子扩大培养意义种子制备工艺实验室（菌种室） ※（带斜面、茄子瓶、克氏瓶）
斜面、固体培养或液体培养产孢子能力强、孢子发芽快、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可以直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易染菌。
产孢子能力，孢子发芽慢，液体摇瓶，菌丝体作为种子，如链霉菌素生产菌灰色链霉菌不产孢子的细菌，可以固体也可以液体酵母车间种子制备种子罐级数 制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度以及采用发酵罐体积而定。
谷氨酸：
斜面 摇瓶 种子罐 发酵 二级发酵青霉素：
孢子悬浮液 一级种子罐 二级种子罐 发酵 三级发酵
链霉素 四级发酵
种龄：生长旺盛期接种量
取决于菌种在发酵罐中生长繁殖速度
一般：细菌0.5-1% 抗生素10-15%（20-25%）
接种技术
1）一级种子罐接种菌悬液制备：三角瓶内装玻璃珠若干，加自来水或生理盐水，灭菌后，迅速倾入茄子瓶，振荡，制得菌悬液。
减压法接种
火焰封口法
2））二级种子罐 管道输送
种子质量要求
◆纯
◆活力旺盛
◆足够的菌体浓度第三章：发酵机理复习《生物化学》中糖代谢部分，熟练掌握无氧与有氧时代谢产物
4学时第一节：工业微生物基础物质代谢复习p69-93
第二节：糖代谢产物的发酵机理厌氧代谢产物的发酵机理酒精发酵机理葡萄糖 1，6二磷酸果糖 3-磷酸甘油醛 2丙酮酸
总反应式：葡萄糖 + 2ADP + Pi 2乙醇 + 2CO2 + 2ATP
计算从葡萄糖生成酒精的理论收率
作业：1吨薯干（含淀粉65%）可生产得到多少无水乙醇？（实际收率为理论值的95%）
甘油发酵机理
A:亚硫酸盐法
总反应式：葡萄糖 + NaHSO3 甘油 + + CO2
B：碱法甘油发酵（pH7.6）乙醛不能作为正常受氢体
2CH3CHO + H2O CH3COOH + CH3CH2OH
磷酸二羟丙酮 甘油 + Pi
总反应式：2葡萄糖 + H2O 2甘油 + 乙醇 + 乙酸 + 2CO2
乳酸发酵机理
同型乳酸发酵：葡萄糖 + 2ADP + Pi 2乳酸+ 2ATP
丙酸发酵机理
丁酸型发酵机理好氧代谢产物的发酵机理
（一）有机酸发酵机理
（二）氨基酸发酵
▲天冬氨酸族氨基酸
L-Asp，L-Thr，L-Lys，L-Met
葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸经CO2固定反应生成四碳二羧酸，后经氨基化反应生成天冬氨酸。
谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等中的天冬氨酸族氨基酸的代谢调节机制：
天冬氨酸激酶为关键酶，受赖氨酸和苏氨酸优先协调反馈抑制。
优先合成，蛋氨酸比苏氨酸、赖氨酸优先合成，苏氨酸比赖氨酸优先合成代谢互锁，赖氨酸分枝途径的初始酶受亮氨酸的反馈阻遏
▲谷氨酸族氨基酸（鸟氨酸Orn、瓜氨酸Cit、精氨酸Arg）
精氨酸是具有胍基的碱性氨基酸，它和组氨酸一起，称为半必需氨基酸，在幼小动物的营养上，有重要价值。瓜氨酸是西瓜和柿子果汁中的游离氨基酸。鸟氨酸以肽的形式，含在细菌的膜万分及抗生物质中。在医药上，除作试剂和输液以外，通常，精氨酸和鸟氨酸一起，用作保肝、强身、解毒剂之类药剂的原料。瓜氨酸有利尿作用。
▲分枝链氨基酸（异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸）
▲芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分子中都含有苯环结构，所以称作芳香族氨基酸。这三种氨基酸在结构上的另一个共同点，是其直链都是丙氨酸。
人体的酪氨酸是由苯丙氨酸转化而得。苯丙氨酸、色氨酸是必需氨基酸，用作氨基酸输液。因为色氨酸是玉米中所缺乏的氨基酸，故又用于饲料添加剂，另外，苯丙氨酸是二肽甜味剂的原料。
第四章：培养基
(2学时)
碳源是组成培养基的主要成分之一。
葡萄糖是碳源中最易利用的糖，几乎所有微生都利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分。但是过多的葡萄糖会过份加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间产物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。
淀粉、糊精等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经酶水解成单糖后再被吸收利用。——缓慢利用
有些微生物还可直接利用玉米粉、薯干
麦芽——啤酒
有机酸——富马酸、醋酸，有机酸的利用会使pH上升氮源：
▲无机氮源——快速利用{
▲有机氮源——缓慢利用，包括蛋白胨、牛肉膏、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉、麸皮水解液、尿素玉米浆是一种用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水浓缩物，含丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，它的平均化学组成：（抗生素工艺学P486）
成分
氨基氮
还原糖
总糖
溶磷
酸度
铁
总灰分
43%
3.9-4.0
2.32-1.9
3.6-3.7
1.25-1.52
10-11
0.05-0.5
20%
黄豆饼粉：水分11%，总氮11.2%,类脂物0.6%,总糖30%,灰分6.5%
麸皮水解液：可以代替玉米浆,俣蛋白质、氮基酸等营养成分比玉米浆少尿素：菌体必须含脲酶方可使用氨水是一种无机氮源，目前常在生产中使用高浓度液氨，注意：因分解容易带来pH波动的问题
培养基类型及选择
A：按纯度合成培养基：化学成分明确、稳定，适合于科研，在生产某些疫苗过程中，为防止异性蛋白等杂质混入，也经常使用。
天然培养基：发酵工业中普遍使用，营养丰富，适合于微生物生长。但成分有波动。
B：按用途孢子培养基：繁殖孢子。注意：①营养不要太丰富（特别是有机氮源）否则，不产孢子；②所用无机盐的浓度要适量；③pH和湿度要适中种子培养基：提供种子。①营养丰富和完全，氮源含量高些，总浓度稀薄，②碳源少量，若糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生在机酸，使pH下降，菌种容易衰老发酵培养基：主要目的是获得产物
例子：谷氨酸发酵培养基成分
种子培养基
发酵培养基
淀粉水解糖(%)
2.5
1 2.5
玉米浆(%
2.5-3.5
0.5-0.8
K2HPO4(%)
0.15
0.15
MgSO4(%)
0.04
0.06
Urea
0.4
3
Fe2+,Mn2+
各2ppm
各2ppm
1、什么时候可用淀粉作为碳源？
2、如何正确利用生理酸、碱性盐，稳定调节发酵过程pH？
3、查阅文献，找出几类典型产品生产所用的培养基，并分析它的组成。
第五章：氨基酸生产第一节：总论氨基酸的用途全世界AA的年需求量10%的速度增长，年总产量120万吨以上，而其需求量达800万吨。作为食品添加剂占40%，饲料添加剂占40%，医药保健品占20%。年产值已接近600亿美元。
1999年国内氨基酸产值30亿元，2000年达40亿元。目前用于AA输液的18种AA原料药品种，14种已工业化，原料药生产厂家从1989年的8家发展到现在的40多家。AA生产企业有100多家，年产量3万吨左右。
医药工业：
(1) 氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元。
食品工业：
我国味精的年产量已达100万吨，产销量占世界第一位。
氨基酸口服液、胶囊等湖北省八峰药业股份有限公司 准备上一条年产1.6亿瓶氨基酸口服液生产线。产品有复合型八峰氨基酸口服液、乐百寿、快快好、好轻松、凡童 五种。
3、饲料工业：
目前作为饲料添加剂的氨基酸有蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸7种。 其中以蛋氨酸(鸡饲料)、赖氨酸为主，近年某些国家已将苏氨酸用作饲料添加剂，主要用于以麦类为主的饲料中。天津化工厂从法国引进1万吨/年蛋氨酸生产装置，另已有三套3000吨/年以上的赖氨酸生产厂：广西赖氨酸厂（5000吨/年）、中外合资泉州大泉赖氨酸有限公司（5000吨/年）、四川化工厂与日本味之素公司合资的赖氨酸厂（6000吨/年）。色氨酸由于价格过高，无法被人们接受。
表3--8 世界氨基酸主要生产厂家生产能力品名
厂家
生产能力
品名
厂家
生产能力
蛋氨酸
日本曹达
20000
谷氨酸
味之素
60000
蛋氨酸
日本住友化学
5000
谷氨酸
日本旭化成
15000
蛋氨酸
日本化药
2500
谷氨酸
协和发酵
15000
蛋氨酸
德国迪高沙
85000
谷氨酸
日本武田药品
15000
蛋氨酸
法国AEC
105000
色氨酸
味之素
100
蛋氨酸
美国孟山都
45000
色氨酸
昭和电工
200
蛋氨酸
墨西哥阿尔拜梅克斯
5000
色氨酸
三井东压
100
蛋氨酸
西班牙Sodeti
4000
色氨酸
田造制药
50
蛋氨酸
苏联Volgograd
4000
色氨酸
日本化药
50
色氨酸
协和发酵
50
赖氨酸
日本味之素
55000
甘氨酸
日本有机合成化学
6000
赖氨酸
日本协和发酵
20500
甘氨酸
协和发酵
5000
赖氨酸
日本东丽
6500
甘氨酸
日本化药
1000
赖氨酸
南朝鲜味元
10000
丙氨酸
武藏野化学研究所
——
丙氨酸
日本化药
——
生产概况提取法，2、化学合成法，3、发酵法，4、酶法
1866年德国的Ritthausen博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，原料取材，命名为谷氨酸。1910年日本的味之素公司用水解法生产谷氨酸。1956年日本协和发酵公司分离到谷氨酸棒杆菌，1957年开始发酵法生产味精。
我国1958年开始研究，1965年在上海天厨味精厂投产。
迄今日本有18种AA用直接发酵法，4种用酶法。
甘氨酸 + 甲醛 L-Ser
发展趋势瓶颈产品生产技术的突破：L-Trp、L-Ser、L-His,L-Arg
氨基酸衍生物的发展：聚氨基酸(聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸)；5-羟色氨酸，谷胱甘肽，腺苷蛋氨酸等。
第二节：淀粉水解糖的制备许多工业微生物不能利用淀粉（如所有的氨基酸生产菌，大部分酵母），故发酵前必须将淀粉水解成糖。目前已发展成一门独立的工业——葡萄糖工业。
淀粉的结构及特点直链——大米，小麦支链——玉米，高梁，薯类为主复习结构方面概念：α-1，4糖苷键，α-1，6糖苷键，还原性末端（自由醛基），非还原性末端，与碘呈色反应（6 个葡萄糖与1个碘分子形成一圈螺旋，呈蓝色）。
酸水解水解原理：（C6H10O5）n + nH2O n(C6H12O6)
理论转化率 y=180/164×100% = 111%
但存在副反应
复合反应复合二糖主要由α-1，6糖苷键聚合成异麦芽糖
β-1，6糖苷键聚合成龙胆二糖多数复合二糖不能被微生物利用，发酵结果残糖增加，提取精制困难。
复合反应进行的程度与淀粉乳浓度、酸种类、酸浓度、温度有关。
①淀粉乳浓度增加，葡萄糖值增加，复合反应增加。
淀粉乳浓度（%）
DE值
复合糖
13.5
94
6
22.5
89.6
10.4
18-20(10-12Beo)
90-92
7
②酸对复合反应的影响用盐酸水解生成最多，其次为硫酸，最少为草酸分解反应造成的损失约1%左右，主要影响是生成色素。
双酶法制糖工艺味精工业的酸法糖化改为双酶法糖化，使转化率从90％左右提高到97％-98％，味精总收率提高4％，全行业年增产味精 2万多 吨，年节粮8万吨。
由于酶的高度专一性及反应条件的温和，使淀粉水解液的葡萄糖纯度得以提高，颜色浅，出糖率大大增加（DE值可达98%）。
双酶工艺主要包括：液化和糖化两个步骤。
液化是利用液化酶（α-淀粉酶）使淀粉糊化，粘度下降，并水解到糊精和低聚糖的程度。
糖化是用糖化酶将液化产物（糊精、低聚糖）进一步彻底水解成葡萄糖的过程。
液化
α-淀粉酶能水解α-1，4糖苷键，生成糊精及低聚糖。随着糖苷键的断裂，分子量越来越小，反应液粘度不断下降，流动性增加，这种现象，工业上称为液化；因为主要产物为糊精，也称糊化。
（1）液化条件 随酶的不同性质和活力而定国产BF7658α-淀粉酶，在30~35%浓度下，在85~87℃时活力最高，但当温度100℃10分钟则完全失活；
地衣芽孢杆菌的耐热α-淀粉酶热稳定性比BF7658α-淀粉酶高20℃，液化淀粉可在110℃进行，无需钙离子作稳定剂。
（2）液化程度如果让液化长时间进行，最终产物也是葡萄糖等。但这样所得的糖液葡萄值低，作用时间长。而且一部分已液化的淀粉会重新结合成硬束状体，使糖化酶难以作用；另一方面，糖化酶水解糊精及低聚糖分子时，需先与底物分子生成络合结构，这就要求底物分子具有一定的大小范围。
正常液化条件下，控制液化在DE10~20之间。（此时多量糊精及低聚糖，少量单糖）
糖化糖化的温度和pH取决于糖化剂的性质生产上使用的糖化酶主要来自黑曲霉，根霉和拟内孢霉。
黑曲霉UV-11 55~60℃，pH4.0~4.5，DE值可达99%
根 霉 50~55℃，pH4.0~4.5
DE值达最高时应停止酶反应，否则，生成的葡萄糖经α-1，6键起复合反应而使DE值下降。
糖化终了，80℃20分钟灭酶。
新工艺介绍
第三节 谷氨酸发酵的代谢控制代谢途径见P113
主要的酶反应：
α－酮戊二酸 + NH4+＋NADPH2 谷氨酸＋H2O＋NADP
在TCA循环中：
α－酮戊二酸 +NADP＋CoA-SH 琥珀酰CoA＋CO2
葡萄糖 2丙酮酸
理论收率：147÷180×100%=81.7%
完全走乙醛酸途径
1.5 葡萄糖 3丙酮酸 3 乙酰CoA
2乙酰COA 2异柠檬酸
故若完全走乙醛酸补充途径，则 1.5葡萄糖 1谷氨酸
理论收率为147÷（1.5×180）= 54%
菌种的特征：
谷氨酸脱氢酶活力强
α-酮戊二酸氧化能力弱
NADPH再氧化能力低生物素缺陷型
生物素与细胞膜透性的关系
作用机制生物素是羧化酶的辅基，属VB族，它在CO2固定和脂肪酸合成中起催化作用。
结构式：
总反应式：
CH3CO~SCOA + CO2 + ATP HOOCCH2 CO~SCOA +ADP +Pi
然后由乙酰COA与丙二酰CoA反应生成β酮丁酰以至丁酰CoA，
即 C2+ C3 C4 + CO2
C4 + C3 C6 + CO2
……………………
作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶——乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。
细胞膜由磷脂双分子层为其基本结构，其中60%为蛋白质，40%为类脂。磷脂主要是卵磷脂，结构如下：
R1，R2为高级脂肪酸的链，主要有软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸及十八碳三烯酸与二十碳四烯酸。
生物素缺陷型，脂肪酸合成少，磷脂合成少，细胞膜不完整，当磷脂合成减少到正常量的50%左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。
控制的关键生物素亚适量5~10μg/L。发酵初期（0~8h），菌体正常生长；当生物素耗尽后，在菌的再次倍增期间，开始出现异常形态的细胞，菌体伸长、膨大乃至不规则形，边缘有折绉、稍模糊，电镜观察似疱疹样，完成向谷氨酸非积累型向积累型细胞的转变。
讨论：有否别的措施？
除此外，还可甘油缺陷，油酸缺陷型第二层次：添加饱和脂肪酸、表面活性剂，它们的作用主要是在不饱和脂肪酸合成中，作为抗代谢物。即它们存在，油酸合成下降，透性增加。
在高浓度油酸存在时，添加上述三种也无效，必须控制以后的反应，即磷脂、细胞膜的形成或破坏细胞壁。
青霉素和细胞壁关系：
第四节 谷氨酸生产菌及种子扩大培养（2学时左右）
一、菌的特征与菌学性质
现有氨基酸生产菌主要是棒杆菌属（Corynebacterium）
短杆菌属 (Brevibacterium)
小杆菌属 (Microbacterium)
节杆菌属 (Arthrobacter)
共同特征为：
细胞形态为棒杆、短杆
G+，无芽孢，无鞭毛，不能运动都是需氧型生物素缺陷型脲酶强阳性不分解淀粉发酵中菌体发生明显的形态变化，同时细胞膜渗透性的变化。
CO2固定反应酶系活力强乙醛酸循环弱
10、α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱
11、谷氨酸脱氢酶活力强
12、不分解谷氨酸，并能耐高浓度谷氨酸
北京棒杆菌AS1.299,
形态特征：普通光学显微镜观察在普通肉汁斜面上培养6、12、24及48小时的染色培养物，细胞通常为短杆至小棒状，有时微呈弯曲状，两端钝圆，不分枝，呈多种形态，即培养6小时细胞有延长现象；细胞呈单个、成对及V字型排列；细胞大小为0.7-0.9×1.0-2.5μm。
培养特征：
普通肉汁琼脂斜面 中间划直线培养，呈中度生长，菌苔线状，24 h为白色，48 h后稍呈淡黄色，随培养时间的延长颜色稍增深，表面湿润，光滑，有光泽，无粘性，不产生水溶性色素。
普通肉汁琼脂平板 菌落圆形，培养24h菌落为白色，直径约1mm，48 h为2.5 mm，延长培养至一周可达4.5-6.5mm，淡黄色，中央隆起，表面湿润，光滑且有光泽，边缘整齐并呈半透明状，无粘性，不产生水溶性色素。
普通肉汁液体培养普通肉汁琼脂穿刺
二、种子扩大培养
斜面活化 一级种子 二级种子
（1）斜面：肉膏培养基，18~24h，32℃
（2）一级种子：三角瓶200ml/1000ml△，瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖。摇床性能介绍（往复，96rpm,76mm振幅；旋转，偏心距5cm，220 rpm）,瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖
（3）二级种子：种子罐500升，培养基为水解糖
一级种子质量要求：
用显微镜观察，菌体粗壮、均匀，排列整齐。
用琼脂平板检查，无杂菌，无噬菌斑。
OD值净增在0.6左右。
种子培养液pH在6.4左右。
种子培养液残糖含量在0.5%以下二级种子质量要求：
pH在7.2左右；
残糖含量在1.5%以下；其他同一级种子。
第五节：发酵工艺
温度对发酵的影响及控制发酵热：引起发酵过程温度变化的原因是发酵过程所产生的热量，称为发酵热。发酵热包括生物热、搅拌热、蒸发(汽化)热和辐射热等。
（1）生物热：由于菌体的生长繁殖和形成代谢产物，不断地利用营养物质，将其分解氧化获得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物，供合成细胞物质和合成代谢产物所需要的能量。其余部分以热的形式散发出来，这就是生物热。
发酵过程的产热具有明显的时间性。即在不同培养阶段，菌体呼吸作用和发酵作用强度不同，所产生的热量不同。
（2）搅拌热：Q搅拌=P×3600 KJ/h 3600——机械能转变为热能的热功当量
（3）蒸发热：通气时，引起发酵液水分蒸发，发酵液因蒸发而被带走的热量称为汽化热。
Q汽化=4.18 G (I出-I进) G——空气的重量流量；I出——出口空气的热焓。
辐射热：因发酵过程温度与周围环境温度不同，发酵液的部分热量通过罐体向外辐射。客观存在的大小，取决于罐内外温度差，冬天大些，夏天小些。一般不超过5%。
发酵过程需要用冷却方式带走的发酵热为：
Q总 = Q生+ Q搅拌-Q汽化- Q辐射
温度对发酵的影响从动力学角度来看，T升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；另一方面，T升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。
T通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。
影响生物合成方向。如金色链霉菌>35℃时，合成四环素；<30℃时，合成金霉素。
最适温度的选择各种微生物在一定条件下，都有一个最适的生长温度范围；产物合成的最适温度与生长温度往往不同。
谷氨酸产生菌 最适生长30-32℃，产物34-37℃
黑曲霉 37℃，柠檬酸、糖化酶32-34℃
青霉素 30℃，分泌青霉素20℃
变温培养法比常温25℃提高产量16%
pH对发酵的影响及控制
pH对发酵的影响影响酶的活性。影响酶活性中心上有关基团的解离；影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶——底物的结合影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及低谢产物的排泄。
引起菌体的代谢过程不同
柠檬酸 黑曲霉 草酸
乙醇 酵母 甘油
谷氨酰胺 棒杆菌 谷氨酸
发酵过程pH的变化发酵过程pH的调节方式添加CaCO3 采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被利用，剩下的酸根引起pH下降；有机酸发酵时形成钙盐沉淀。
但是，碳酸钙用量大，消毒困难，易堵塞管道，在操作上易引起染菌，而且对产物的提取有影响。此法在工业上不使用。
氨水、尿素流加法其他方法 酶制剂、抗生素发酵通过加糖、淀粉来控制pH。如表霉素 根据代谢需要，改变加糖率，比固定加糖而用酸碱调节pH增产25%。
供氧对发酵的影响通风适量 生成谷氨酸通风过量 生成α-酮戊二酸
通风不足 生成乳酸或琥珀酸
谷氨酸发酵时不同容积发酵罐的搅拌转速和通风比发酵罐容积m3
0.05
0.5
5
10
20
50
搅拌转速r/min
550
300
185
160
140
110
通风比（m3/ m3,Min）
1:0.5-0.6
1:0.3
1:0.18-0.2
1:0.16-0.17
1:0.15
1:0.12
泡沫的消除
泡沫给发酵造成的影响
a） 过多，升到罐顶从轴封渗出，造成染菌；
b） 使发酵罐装填系数减少，设备利用率下降；
c） 影响通风搅拌正常进行，影响氧的传递，妨碍菌的呼吸；
d ）增加菌群的非均一性，微生物随泡沫漂浮。
泡沫形成的规律
泡沫的多少，一方面与搅拌、通风有关；另一方面，与培养基性质有关。蛋白质原料，如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要发泡剂。
泡沫的消除机械消泡：利用机械力将泡沫打破，或借压力变化使泡沫破裂。最常用的是耙式消沫浆。
化学消泡：破泡作用——当消泡剂加入到发泡体系中，由于消泡剂的表面张力低（相对于发泡体系），在消泡剂接触液膜面时，成为泡膜的一部分，使液膜面扩大，变薄，同时使泡膜局部表面张大降低，力的平衡破坏，在力的作用下气泡破裂、合并，最后导致泡沫破灭。
消泡剂选用原则：
消泡剂必须是表面活性剂，具有较低的表面张力。
对气液界面的铺展系数必须足够大，以便能迅速发挥其消泡活性，这就要求消泡剂具有一定的亲水性。
在水中的溶液解度极小，保持持久的消泡或抑泡作用。
无毒，不影响发酵。
常用消泡剂：
天然油脂类，包括豆油、菜子油、花生油、玉米油等。由于油脂分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性差，用量大，一般为发酵液的0.1-0.2%
聚醚类
GP亲水性差，溶液解度小，抑泡性能比消泡性能好；
GPE10亲水性好，易铺展，消泡性能强；但相应溶解度大，消泡活性维持时间短。用量一般为发酵液的0.01-0.03%
(3)硅酮主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，分子式为：
是无色液体，不溶于水，表面张力低达21dyn/cm（泡敌为33，向日葵油40，青霉素发酵液60-68 dyn/cm）。纯的聚二甲基硅氧烷的消泡能力奶低，因此常加分散剂来提高消泡活性，或乳化剂成乳状液。
硅酮消泡剂适用于微碱性发酵，对于微酸性发酵较差。
（4）醇类 十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。
发酵过程主要变化及中间代谢
中间分析菌体形态和浓度 菌体形态的改变是代谢变化的反映，抗生素生产中以菌丝形态作为衡量种子质量，区分不同发酵阶段、控制代谢变化及决定发酵周期的依据之一。
目的产物含量的测定 控制发酵生产以及决定放罐时间的重要参数。
pH 反映营养物质消耗、产物形成的综合指标基质浓度 糖、氮、磷含量。控制这些物质的供给和消耗是提高产量的重要手段。
中间补料
菌体生长代谢需要一个合适的浓度，过高的浓度对菌体生长有抑制作用，过低，不能满足产物合成的需要。
中间补料主产生菌在分泌期有足够多而不过多的养料，使代谢活动朝着有利于合成产物的方向发展，延长分泌期，提高抗生素产量。
补糖：
开始补糖的时间 过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料；
补糖方式 连续流加，少量多次间歇补入和大量少次补入三种方式。
注意要避免环境突然变化对代谢带来影响。
补糖量：以维持稳定的糖浓度；如，四环素发酵还糖维持在0.8-1.2%
例子：谷氨酸追加糖液发酵在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖果液，维持2%左右的糖浓度。
优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵
总糖浓度达20%，产酸高。
补氮：
流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮谷氨酸发酵时，初尿用量和补尿多少取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力；
As1.299 脲酶活力低，耐尿强，初尿用量多2%，流加次数少
T6-13 脲酶活力强，耐尿低，初尿用量少0.6%，流加以少量多次好
As1.524 1-1.4%
第六节：谷氨酸的提取（2～3学时）
发酵液的性质和发酵废液的综合利用发酵液性质发酵呈浅黄色浆状，温度34～36℃，pH7左右谷氨酸以铵盐形式存在含无机盐，有K，Na,NH4+,Mg,Ca,Fe,Cl,SO4,PO4等，还有残糖、色素、尿素等。此外，还有消泡剂。
大量菌体、蛋白质等固形物悬浮在发酵液中，湿菌体约占发酵液的5-8%
发酵液中尚有其他副产物。有机酸类有乳酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等；氨基酸类有Asp、Ala、Val、Pro、Ile、Leu、Gly、His、Gln等。各种氨基酸量小于1%
铵离子0.6-0.8%，残糖0.5%
腺嘌呤0.02-0.05%，而尿嘧啶约占001-0.03%
菌体分离菌体很轻很小，大小为0.7~1.0×1.0~3微米机械分离添加凝聚剂
等电点法提取谷氨酸
p220-223
谷氨酸结晶性质：
α型：晶体粗壮，呈颗粒状，质量重，易沉降，与母液分离容易
β型：晶轴长短不一，呈针状或鳞片状，晶粒微细，纯度低，难沉降。
影响结晶析出的主要因素
温度：（a）影响溶解度；
温度℃
0
5
10
15
20
25
30
35
溶解度%
0.341
0.411
0.495
0.596
0.717
0.864
1.040
1.250
（b）影响晶型
30℃以下，α型为主；30℃以上，β型为主
在中和调等电点过程中，发酵液的温度应缓慢下降，结晶颗粒大。若温度下降过于迅速，晶核小而多。
加酸：
缓慢加酸，使谷氨酸溶解度逐渐降低，可控制一定数量的晶核，即晶核不会形成太多，经养晶育晶后成长壮大，析出的结晶颗粒大。加酸过快，容易形成局部过饱和，晶核过多，结晶细小，不易沉降分离。
晶种：
晶核形成以前，适时投放一定量的晶种，有利于收率的提高，投放晶种条件一定要准确，过早，晶种化掉；过迟，刺激更多晶核形成。
投放目的：控制一定数量的晶核，并以晶核为核心，使其不断长大。
国外的提取技术：
发酵液 菌体过滤（加助滤剂或超速离心） 四效浓缩10倍
冷却到室温调pH3.2 谷氨酸析出90%，纯度86-90%
优点：1 吨水产生0.25吨蒸汽，二次蒸汽利用，很经济
废水量减少为国内的1/10，盐酸用量减少
菌体回用，提取核苷酸等贵重药品，或作为饲料；菌体存在于发酵液中,不利于谷氨酸的结晶分离。
清洁生产工艺
由谷氨酸制成味精p336
第六章 抗生素生产第一节：总论抗生素的定义
——是生物在其生命活动过程中产生的（或得用化学、生物或生化方法所衍生的），在低微浓度下能选择性抑制他种生物机能的化学物质。
作用：抗菌、抗肿瘤、杀虫除草、抑制生物体中某些酶类，有些还具有某些药理活性，如强力霉素——镇咳。新霉素——降胆固醇生产方法：
①微生物发酵法：为主
②少数如氯霉素、磷霉素亦可用化学合成法生产
③半合成抗生素对抗生素分子结构改造而制成的各种衍生物
发展我国自1953年设计制造了4个5吨发酵罐，建立上海第三制药厂，开始生产青霉素，1957年建立华北制药厂，经40多年来发展，国外有的基本抗生素品种我国都有生产，并已研制出国外没有的抗生素——创新霉素等。截止1996年上半年，总计127个品种生产，总产量近几年3万吨，约占世界抗生素产量的1/4。农用抗生素研究生产也获得了可喜的成绩，灭瘟素、春日霉素和有效霉素等。
分类从自然界发现4000多种抗生素，包括半合成的有3万多种，不同领域的科学家提出了不同的分类方法。
应用
（1）抗生素剂量表示法使用剂量不足，达不到抑菌能力使用剂量过高，会产生毒副作用，且引起病原菌的耐药性。
故常用效价单位作为衡量抗生素的一尺度。
▲一个青霉素效价单位——在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标 准菌株发育的最小青霉素剂量。
一个链霉素效价单位——1ml肉汤培养基中完全抑制E.Coli……
一个制霉霉素效价单位——1ml肉汤培养基中完全抑制某种酵母……
（2）在医疗上应用青霉素钾、钠等可控制敏金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等引起的严重感染（败血症、肺炎、脑膜炎等），半合成青霉素和头孢菌素用于对付耐药性金黄色葡萄球菌。
链霉素——抗G-和结核杆菌广谱抗生素有四环素、金霉素、强力霉素
第二节：主要抗生素工业生产过程（2学时）
土霉素生产结构生物合成机制发酵工艺菌种 龟裂链霉菌（Streptomyces Rimosus）菌落灰白色，后期生皱褶，呈龟裂状。菌丝呈树枝状分枝，白色，孢子灰白色、柱形。
生产流程
砂土管孢子 斜面孢子 一级种子 二级种子 发酵
32℃—31+0.5—32℃
提取
砂土管 黄沙：土 = 1：1（沙和土都经处理，水洗至中性，烘干，研细，过筛）
每管装一定量的砂土，塞好棉塞包好，121℃高压蒸汽灭菌后再用160 ℃ 干热灭菌2h
每支砂土管加0.3mL孢子悬浮液，包好，放入装有干燥剂的真空干燥剂内抽干6-12 h，轻轻敲打使其均匀。完后，放入装有干燥剂的密闭瓶内，0-4℃贮藏。
斜面 250 mL茄子瓶 麸皮4%，麦粉2%，琼脂2%，
一级种子 400-500L夹套二级种子 4m3与上不同的是二级罐带搅拌发酵 15%接种量培养基：碳源：淀粉 经α-淀粉酶液化
氮源：黄豆饼粉，硫铵
无机盐：KH2PO4，NaCl,CaCO3，CoCl2
生长因子：酵母粉，玉米浆
采用中间补料，延长抗生素分泌期，是提高抗生素产量的重要方法。土毒素生产过程采用补糖与补氨，以保证其在分泌期有足够多而不过多的养料。
总糖 前期 0-80 h 6.5-8%总糖
中期 80-120 h 5-6.5
后期120-140 h 4-5
末期 140 h后 4%
放罐残糖3%以下，放罐前24 h不补料。
补氨同时为调pH，pH=6.0-6.3，放罐前8 h停止通氨，整个过程通氨水总量350-400升。
提取抗生素提取一般可分为沉淀法，溶媒萃取法，离子交换法。
一、预处理目的 土霉素能和发酵液中钙盐、镁盐,某些有机胺、蛋白质形成不溶性化合物，积聚在体内。预处理目的为：1）使部分土霉素溶液解出来；2）蛋白质（菌丝）沉淀；3）Fe3+沉淀黄血盐使Fe3+沉淀，ZnSO4有利于蛋白质凝固
工艺
发酵液(26000 r/ml) 酸化液+低单位套液
稀释液 净化液
滤液——土霉素草酸滤渣——草酸钙+蛋白质+菌体+铁络合物
纯化液 脱色液
土霉素草酸 土霉素↓ + 草酸
湿晶体 成品
第七章 酶与酶制剂生产
——α-淀粉酶生产工艺生产菌种以芽孢杆菌为主，BF-7658
发酵工艺
斜面 孢子悬浮液 种子罐 发酵罐斜面
马铃薯培养基或淀粉蛋白胨培养基茄子瓶50ml左右，37℃72h
孢子悬浮液用50 ml无菌生理盐水洗下种子及发酵培养工艺配方
种子3m3
发酵30 m3
总配比
基料
补料
豆饼粉
4
5-6.5
4
22.7
玉米粉
3
9-9.5
4
8
Na2HPO4
0.8
0.8
(NH4)2SO4
0.4
0.4
NH4Cl
0.2
0.15-0.2
淀粉酶
10-15万单位
70万单位
CaCl2
-
0.4
体积
8 m3
4 m3
不同阶段通风比为：
种子罐 0-10小时，1,1.3； 10-14小时 1:1.45
发酵罐 0-12小时，1,0.74；12小时以后1:1.46-1.1
中间补料 12小时后，每隔1小时补料一次直至多40小时左右。
pH高于6.5,菌体空泡多，意味着出现衰老，多补一些。补料结束后6-8小时，升至7.5，营养细胞80%不空泡，酶活不增加，放罐。
补料优点：（低浓度发酵和高浓度补料）
有利于菌体生长产酶发酵后残糖、残氮低，便于提取高浓度补料可以保持环境稳定，延长产酶期，增强菌体产酶的诱导作用，增加产酶量。
三、提取工艺 发酵液的预处理见P214-218，P226
酶的提取原理：——蛋白质的沉淀作用利用酒精、丙酮等有机溶剂作为脱水剂因为它们的亲水性大于蛋白质的亲水性，与水分子缔合，破坏蛋白质的水化膜。使蛋白质处于不规则的扩散过程中，颗粒之间互相碰撞，在分子内聚力的影响下，聚合形成大颗粒而沉淀 。
加入电解质或调整到等电点，蛋白质失去电荷。——盐析作用硫酸铵是常用的盐析剂，其优点是即使在较低温度下溶解度仍然很高，盐析时不必加温使盐溶解，其饱和溶液可使大多数酶沉淀，对酶无破坏作用。压滤下来的废液可直接作农肥。
α-淀粉酶食用酶的提取：
发酵液350U/mL
质量指标：5000U/g，保存率85%（半年）
作业：
从生物样品细胞中分离纯化某种酶，首先将该样品制备成粗提液，今选择DEAE层析和盐析二种方法进行分离纯化比较，现测得总蛋白和酶活力的数据列于下表，请将结果填入下列规定的空格中，从中可发现什么?
纯化实验
总蛋白(g)
总活力（U）
比活力
（U/mg蛋白）
纯化倍数
收率（%）
粗提取液
30
21000
/
100
DEAE-层析
0.133
5025
硫酸盐层析
0.048
3467
称取25毫克蛋白酶粉配制成25毫升酶溶液，从中取出0.1毫升酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分种产生1微克酪氨酸的酶量为1个活力单位计算，根据以上数据，求出：
1毫升酶液中所含的蛋白质量及总活力比活力
1克酶制剂的总蛋白含量及总活力。
用1克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取出1毫升测定淀粉酶活力，测知每5分钟分解0.25克淀粉，计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位数。（淀粉酶活力定义：每小时分解1克淀粉的酶量为1个活力单位。）
4、某一酶游离状态下酶活为2000U/g，用卡拉胶固定化后用于酶反应，固定化操作采用如下二种方案：
A、用2g酶粉与200mL 4%卡拉胶溶液混合，得200g固定化酶，每克固定化酶的酶活为12U；
B、用10g酶粉与200mL4%卡拉胶溶液混合，得200g固定化酶，每克固定化酶的酶活为40U。
请计算A和 B酶活力回收率？若该酶很贵，请问选用何方案？若该酶很便宜，又选用何方案？说明理由。
