第 10章 酶的作用机制和酶的调节
一、酶的活性部位
二,酶催化反应的独特性质
三、影响酶催化效率的有关因素
四、酶催化反应机制的实例
五、酶活性的调节控制
六、同工酶
(mechanisms of enzyme action and
regulation of enzyme activity)
一、酶的活性部位
酶活性部位的特点 Ⅰ
在酶分子中, 只有少数几个氨基酸残基
直接参与结合底物和催化反应, 这些氨基酸
残基在一级结构上可以相距很远, 但通过肽
链的折叠, 盘绕, 使它们在空间上相互接近 。
这些残基在空间上所在的部位称为活性部位
或活性中心, 酶的活性部位往往有一个裂缝
或口袋状的区域, 其形状与底物类似 。
酶活性部位的特点 Ⅱ
当底物与酶通过次级键结合时, 底物和酶都
可能发生形变, 诱导契合, 使得底物与酶的活性
部位的形状恰好吻合, 而且负责催化反应的残基
也正好接近将发生反应的基团或键 。 当酶蛋白变
性时, 构象发生变化, 失去上述结构特点, 同时
也失去了活性 。 虽然酶蛋白中其它残基不直接参
与活性部位的组成, 但这些残基中的大多数为整
个酶蛋白的构象作出了不可缺少的贡献 。
研究酶活性部位的方法
1,酶分子侧链基团的化学修饰法
( 1) 非特异性共价修饰
( 2) 特异性共价修饰
( 3) 亲和标记法
2,动力学参数测定法
3,X射线晶体结构分析法
4,定点突变法
酶分子侧链基团的化学修饰法
用一种小分子化合物与酶反应, 这种化合物与
酶的某个或某种残基侧链反应, 形成共价结合, 这
叫化学修饰或共价修饰, 这种化合物称为修饰剂 。
酶分子中可以被化学修饰的基团有:巯基, 羟基,
咪唑基, 氨基, 羧基和胍基等 。 当酶活性部位的残
基侧链被修饰后, 会使酶失去活力 。 将经修饰后失
去活力的酶水解, 鉴定出被修饰的氨基酸, 可以得
到哪些残基参与组成活性部位的信息 。
非特异性共价修饰
此 类修饰剂可以修饰活性部位 内 或 外 的残基
侧链基团 。 若修饰程度与酶活力丧失成正比, 则
说明被修饰的基团位于活性部位 。 当发现修饰程
度与酶活力丧失成正比时, 可在加入底物或竞争
性抑制剂的条件下进行修饰, 若可阻遏修饰剂对
酶活力的破坏作用, 则进一步证明被修饰的基团
位于活性部位 。
特异性共价修饰
此类修饰剂特异性地修饰酶活性部位的残基,
同时使酶失活 。 此类修饰剂与酶的活性部位特异
性结合, 同时修饰酶活性部位的基团 。 例如二异
丙基氟磷酸 ( DFP) 能特异性地与许多酶的活性部
位的 Ser残基共价结合, 使酶活力丧失, 而不修饰
非活性部位的 Ser残基 。 当用 DFP修饰酶后, 部分
水解酶蛋白, 得到含有二异丙基磷酰基的肽段,
分析此肽段的氨基酸序列, 可得到活性部位 Ser附
近的肽链序列 。
DFP修饰酶的 Ser残基的反应
一些酶活性部位的氨基酸序列
酶 氨基酸序列
牛胰蛋白酶 …… Ser-Cys-Gly- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro-Val……
牛胰凝乳蛋白酶 …… Ser-Cys-Met- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro-Leu……
猪弹性蛋白酶 …… Gly-Cys-Gln- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro-Leu……
猪凝血酶 …… Asp-Ala-Cys-Glu- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro……
亲和标记法
能特异性地修饰酶的活性部位的修饰剂很
少, 并且专一性差, 经常出现也修饰活性部位
之外的残基的情况 。 为了解决此问题, 人们合
成了一些底物类似物, 其上带有高反应性基团,
它们特异地与相应的酶的活性部位结合, 然后
与活性部位的残基反应, 这样就大大提高了修
饰的专一性, 这种方法叫亲和标记法 。
TPCK对胰凝乳蛋白酶
的亲和标记
最典型的例子就是用来修饰胰凝乳蛋白酶
的亲和标记物对甲苯磺酰 -L-苯丙氨酰氯甲基酮
( TPCK), 胰凝乳蛋白酶的人工底物是对甲苯
磺酰 -L-苯丙氨酸乙酯 ( TPE) 。 当将 TPDK与
胰凝乳蛋白酶一起保温后, 酶失去活性, 氨基
酸分析表明, TPDK修饰了 His57。 TPCK不与
胰凝乳蛋白酶原, 变性的胰凝乳蛋白酶, DIP-
胰凝乳蛋白酶反应 。 这些证据说明 His57是组成
酶活性部位的残基之一 。
TPE和 TPCK的结构
动力学参数测定法
在不同 pH下测定酶活力,可以得到与酶
活力直接相关的可解离基团的 pKa值,从而推
测出是些什么残基。
X射线晶体结构分析法
使底物与酶结合, 制成晶体, 再进行 X光
晶体衍射分析, 可得到底物附近有哪些残基 。
定点突变法
从基因的水平上对特定位点的核苷酸进行
突变, 使得蛋白产物特定的氨基酸残基转变成
另一种氨基酸残基, 观察突变对酶活力的影响 。
例如, 1987年 Claik将胰蛋白酶 Asp102突变成
Asn102,突变的胰蛋白酶的 kcat只有野生型酶的
五千分之一, 突变酶水解酯底物的活力仅是野
生型酶的万分之一, 可见 Asp102对胰蛋白酶的
活力是必需的 。
三、影响酶催化效率 的有关因素
底物和酶的邻近效应 与定向效应
( proximity and orientation)
对于双底物反应或三底物反应来说, 由
于酶活性部位对底物有高亲和力, 增加了参
与反应的底物碰撞的几率, 这就是邻近效应 。
在酶活性部位, 底物之间参与反应的基团或
键靠近, 使反应易于进行, 这就是定向效应 。
底物的形变和诱导契合
底物与酶结合后, 发生构象变化, 相应的
键变得对反应更敏感, 降低了反应的活化能 。
( distortion and induced-fit)
酸碱催化
酶活性部位的催化基团可以通过向底物提
供质子或从底物上夺取质子, 而催化反应 。 若
提供质子和夺取质子的是反应液中的 H
+和 OH
-,
称为专一酸碱催化或狭义酸碱催化;若提供质
子和夺取质子的是酶活性部位的残基, 称为总
酸碱催化或广义酸碱催化 。
( acid-base catalysis)
共价催化
共价催化分为亲电催化和亲核催化两种类型 。
亲电催化指的是酶活性部位的催化基团在催化反
应过程中汲取底物的电子, 产生底物与酶共价结
合的过渡态中间物;亲核催化是酶活性部位的催
化基团在反应过程中向底物供给电子, 产生底物
与酶共价结合的过渡态中间物 。
( covalent catalysis)
金属离子催化
金属离子带正电荷, 它可以稳定底物过
渡态中间物中的负电荷, 还可以通过吸引电
子, 造成电子畸变, 使得反应容易进行 。
活性部位微环境的影响
在实际催化中,上述多种因素可以同时起作用。
多元催化和协同效应
活性部位是一个疏水环境,介电常数较低,
带电基团之间的作用力较强,有助于催化基团
与底物的作用。
四、酶催化反应机制的实例
溶菌酶 Ⅰ
溶菌酶能够水解细菌细胞壁的多糖, 从而
溶解这些细菌的细胞壁 。 细胞壁多糖是 N-乙酰
氨基葡糖 ( NAG) -N-乙酰氨基葡糖乳酸
( NAM) 的共聚物, 其中的 NAG和 NAM通过
β- 1,4-糖苷键交替排列 。
细
菌
细
胞
壁
多
糖
溶菌酶 Ⅱ
溶 菌 酶 是 单 链 肽 蛋 白 质, 分 子 量 为
14.6× 103,由 129个氨基酸残基组成 。 含有 4对
二硫键 。 它能够水解 NAM的 C1与 NAG的 C4之
间的糖苷键, 但不能水解 NAG的 C1与 NAM的
C4之间的糖苷键 。 几丁质是甲壳类动物甲壳中
所含的多糖, 仅由 NAG残基通过 β- 1,4-糖苷键
相连, 溶菌酶也可以水解几丁质 。
溶菌酶的一级结构
红箭头所
指为活性
部位残基
溶菌酶催化水解的糖苷键
溶菌酶的有效底物
酶的活性部位有一条沟, 正好能容纳 6个多
糖残基形成的链 。 当用含不同残基数的寡聚 NAG
作实验, 发现当残基数达到 6个时就可以作为有
效的底物 。
底物(浓度为 10- 4mol/L) 相对水解速率
(NAG)2 0
(NAG)3 1
(NAG)4 8
(NAG)5 4000
(NAG)6 30000
(NAG)8 30000
溶菌酶活性部位的催化位点
通过研究 发现, 若将 6残基寡聚糖作为溶
菌酶的底物, 将这 6个残基分别称为 A,B,C,
D,E和 F,则水解发生在 D和 E之间的糖苷键上 。
其中 D糖的吡喃环因空间构象的原因, 必须由
正常的椅式构象转变成能量较高的半椅式构象,
其 C1参与的糖苷键稳定性降低, 易于断裂 。
溶
菌
酶
活
性
部
位
的
催
化
位
点
糖苷键的断裂位点
在 H218O中反应, 可以发现 D糖的 C1上含有
18O,而 E糖的 C4羟基只含普通 O。 由此可知这个
键断裂在 D糖的 C1和糖苷键的 O之间 。
溶菌酶的催化基团
分析 D-E键周围的微环境, 最活泼的基团是
Asp52和 Glu35,它们分别位于被断裂的糖苷键
的两侧 。 Asp52在一个极性环境中, 而 Glu35位
于非极性区 。 在溶菌酶水解几丁质的最适 pH下
( pH5), Asp52的侧链羧基为解离状态 COO-,
而 Glu的侧链羧基为非质子化的 COOH形式 。
溶菌酶的催化机制 Ⅰ
( 1) Glu35的侧链 COOH提供一个 H+ 到被断裂
糖苷键的 O原子上 。 H+ 的转移使 D环的 C1键与
糖苷键 O原子间的键断开, 并形成正碳离子过渡
态中间产物 。
Glu35酸催化
溶菌酶的催化机制 Ⅱ
( 2) 含有 E及 F残基的 NAG二聚体离开酶分子 。
( 3) 正碳离子中间产物进一步与来自溶剂的
OH- 发生反应 。 Glu35质子化, 由 A,B,C和 D
残基组成的 NAG四聚体通过扩散离开酶分子 。
Asp52 的负电荷
稳定正碳离子
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族, 这个家族
包 括 胰 蛋 白 酶 ( trypsin ), 胰 凝 乳 蛋 白 酶
( chymotrypsin), 弹性蛋白酶 ( elastase), 凝
血酶 ( thrombin ), 枯草杆菌蛋白酶
( subtilisin), 纤溶酶 ( plasmin), 组织纤溶
酶原激活剂 ( tissue plasminogen activator,tPA)
等 。 它们的共同特征是活性部位有一个必需的丝
氨酸残基 。
消化作用的丝氨酸蛋白酶
胰蛋白酶, 胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶虽然
都是裂解肽键的, 但它们的专一性明显不同 。 胰
蛋白酶裂解碱性氨基酸的羧基形成的肽键, 胰凝
乳蛋白酶裂解芳香氨基酸的羧基形成的肽键, 弹
性蛋白酶专一性较弱, 它主要裂解小的中性氨基
酸的羧基侧肽键 。 这 3种蛋白酶有相似的一级结
构和三级结构 。
三
种
消
化
蛋
白
酶
的
一
级
结
构
比
较
胰凝乳蛋白酶的三维结构
胰凝乳蛋白酶分子是一个紧密的椭球体, 大
小为 5.1× 4.0× 4.0nm。 多数芳香和疏水残基包埋
在蛋白质内部, 而多数带电的或亲水的残基分布
在分子表面 。 3 个极性残基 His57, Asp102 和
Ser195在活性部位形成催化三联体 ( catalytic
triad) 。 这三个残基在胰蛋白酶和弹性蛋白酶中
也存在, 但这三种蛋白酶的底物结合部位形状不
同, 导致它们裂解不同氨基酸羧基侧的肽键 。
胰
凝
乳
蛋
白
酶
与
egl
in
C
的
结
合
蓝色带状物
为 eglin C
蓝色
His57
红色
Asp102
黄色
Ser195
胰
凝
乳
蛋
白
酶
的
催
化
三
联
体
胰、胰凝乳、弹性蛋白酶的
底物结合口袋
人工底物
对一些底物是大分子聚合物的酶研究其动
力学时, 一般使用小分子的人工底物 。 乙酸 -p-
硝基苯酯是一种特别有用的模式底物, 因为其
水解产物硝基苯酚在 400nm有强的光吸收, 便
于监测其变化 。
研究胰凝乳蛋白酶的
人工底物
乙酰苯丙氨酸甲酯
苯甲酰丙氨酸甲酯
甲酰苯丙氨酸甲酯
乙酸 -p-硝基苯酯
胰凝乳蛋白酶催化机制的
动力学研究
当大量胰凝乳蛋白酶用该底物进行动力学研
究时, 反应分两个不同的阶段, 反应开始时以突
发的速率 生成 p-硝基苯酚, 随后出现一个较慢的
稳态速率 。 这是因为反应的第一步是底物与酶结
合后, 反应释放出 p-硝基苯酚, 另一个产物乙酸
以乙酰基的形式结合在酶活性部位的 Ser195上 。
第二步是水分子攻击乙酰 -酶复合物, 释放出乙
酸根离子 。 第二步较缓慢, 是限速步骤 。
胰凝乳蛋白酶同底物反应的
动力学曲线
酰基-酶中间物的迅速形成
后缓慢释放产物
胰凝乳蛋白酶中催化
三联体的作用
在没有底 物时, His57是未质子化的, 当
Ser195羟基氧原子对底物进行亲核攻击时,
His57从 Ser195接受一个质子 。 Asp102的 COO-
的作用是稳定过渡态中 His57的正电荷形式 。 此
外, Asp定向 His57,保证从 Ser195接受一个质子
后的 His57处于适当的互变异构形式 。
His57的互变异构
胰凝乳蛋白酶的催化机制 Ⅰ
胰凝乳蛋白酶的催化机制 Ⅱ
五、酶活性的调节控制
别构调控
( allosteric regulation)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非
共价结合后发生构象的改变, 进而改变酶活性状
态, 称为酶的别构调节 。 具有这种调节作用的酶
称为别构酶 ( allosteric enzyme) 。 凡能使酶
分子发生别构作用的物质称为效应剂或别构剂,
能增加酶活性的别构剂为别构激活剂, 能抑制酶
活性的别构剂为别构抑制剂 。
天冬氨酸转氨甲酰酶
( aspartate transcarbamylase,ATCase)
ATCase是嘧啶生物合成途径的第一个酶,
底物对酶的结合有正协同性 。 该反应途径的
终 产物 CTP是 ATCase的反馈抑制剂, 抑制程
度可达 90%,这种抑制是降低酶对底物的亲
和力, 但不影响最大反应速度 。 而 ATP是
ATCase的激活剂, 可增加酶对底物的亲和力,
也不影响最大反应速度 。
ATCase催化的反应式
ATP和 CTP对 ATCase活性的
影响曲线
ATP可阻遏 CTP
的抑制作用, 它
们 竞争同一结合
位点 。
脱敏反应
ATCase由催化亚基和调节亚基组成 。 当用
汞化物处理该酶时, 则 ATCase失去调节活性 。
用汞化物处理过的 ATCase,ATP和 CTP不再影
响其催化活性, 而且底物结合 变为无协同性 。
但并不影响酶的最大反应速率 。
p-羟汞苯甲酸对巯基的修饰
ATCase的亚基分离
当用汞化物 p-羟苯甲酸处理 ATCase时, p-羟
苯甲酸与巯基反应, 使酶失去了受 ATP或 CTP调
节的能力 。 利用超离心分析, 天然酶的沉降系数
为 11.6S,分子量为 310× 103,而受 p-羟苯甲酸处
理后的酶出现两条带, 一个是 2.8S,分子量
34× 103,另一个是 5.8S,分子量 100× 103。 这是
两种不同的亚基, 这两种亚基也可以利用离子交
换层析或蔗糖密度梯度离心分开 。
ATCase的沉降速率模式
ATCase的亚基组成
大的亚基叫催化亚基, 单独的大亚基有催化
反应的能力, 但不与 ATP或 CTP结合 。 小亚基叫
调节亚基, 单独的小亚基可以与 ATP或 CTP结合,
但无催化能力 。 催化亚基 ( c3) 含 3条 c链, 每条
链的分子量为 34× 103,所以催化亚基的分子量是
102× 103;调节亚基 ( r2) 含 2条 r链, 每条链的
分子量为 17× 103,所以调节亚基的分子量是
34× 103。 全酶含有 2个催化亚基和 3个调节亚基,
记为 c6r6,即 2c3+ 3 r2 → c6 r6。
ATCase是别构酶的模式对象
用过量的巯基乙醇可除去汞苯甲酸基 。 将除
去汞苯甲酸基的催化亚基和调节亚基混合, 可重
组得到天然酶 。 因 ATCase的催化亚基和调节亚基
容易分开, 又容易重组, 所以它成为研究别构酶
的模式对象 。
ATCase的三维结构
利用 X光衍射, 得出了 ATCase的三维结构 。 通
过使酶与竞争性抑制剂 N-( 膦乙酰基 ) -L-天冬氨
酸 ( PALA) 结合, 找到了底物的结合位点, 它位
于两条催化链的界面处, 由两条 c链的残基共同组
成 。 每条 r链分两个结构域, 外侧的结构域是 CTP
的结合位点, 里侧的结构域与催化亚基相互作用 。
每条 c链也分为两个结构域, N端为氨甲酰磷酸结
合结构域, C端为天冬氨酸结合结构域 。
ATCase的亚基结合方式
AT
Ca
se
半
分
子
的
三
维
结
构
AT
Ca
se
的
过
渡
态
底
物
及
竞
争
性
抑
制
剂
PALA结合在 ATCase
催化部位上的方式
酶与底物结合后的构象变化
底物与酶结合后, 导致酶的沉降系数降低
3%,说明酶与底物结合后膨胀了 。 伴随着酶与
PALA的结合, 酶的四级结构发生了大的变化,
两个催化三聚体分开了 1.2nm,并转动了 10° 。
此外, 每一调节亚基也绕其对称轴旋转了 15° 。
c链上的两个底物结合结构域靠近了 0.2nm,酶
由 T型变成了 R型 。
酶与底物结合后的构象变化
硝基甲烷修饰 ATCase
酶与硝基甲烷反应, 在酶的每个催化链中生
成一种有颜色的硝基酪氨酸残基 ( λmax =
430nm), 在每个催化链上一个必需的 Lys也被
修饰, 这样就人工引进了报告基团 。 这种被修饰
的催化亚基不能与底物结合 。
底物结合到 ATCase上引起
高度协同的别构转变
用被修饰的催化亚基与正常的催化亚基及正
常的调节亚基重组成全酶 ( 杂交酶 ), 当加入天
冬氨酸的类似物琥珀酸时, 琥珀酸结合到正常的
催化亚基上, 改变了被修饰催化亚基上硝基酪氨
酸的吸收光谱 。 说明一个催化亚基与底物结合能
引起另一个催化亚基构象发生变化 。
琥珀酸与杂交酶结合后硝基
Tyr吸收光谱的变化
别构剂对酶构象的影响
给杂交酶加 ATP,硝基酪氨酸 430nm的光吸
收增加, 与加琥珀酸情况相同;而给杂交酶加
CTP,430nm的光吸收减少 。 此实验说明别构激
活剂和别构抑制剂都能引起构象变化, 但变化的
结果不同 。 ATP的结合使酶的构象平衡向 R型转
变, 而 CTP的结合使酶的构象平衡向 T型转变 。
ATP和 CTP与酶结合后酶的构象
及硝基 Tyr吸收光谱的变化
酶原的激活
有些酶在刚合成出来时没有活性, 称为酶原
( zymogen或 proenzyme) 。 酶原经蛋白水解酶
在特定位点切割后, 产生有活性的酶, 这种方式
称为酶原的激活 。 有一些不是酶的蛋白质, 也需
要经特定的蛋白酶水解才有功能, 这些蛋白质在
没有活化之前称为前体 ( precursor) 。
酶原或蛋白质前体激活举例
?使蛋白质水解的消化酶, 在胃和胰脏中刚合成时是
以酶原的形式存在, 分泌到肠胃中被切割后才成为有
活性的酶 。
?血液凝固系统中许多酶都是以酶原的形式存在, 到
需要血液凝固时才被激活 。
?胰岛素刚合成出来是前胰岛素原 ( preproinsulin),
经蛋白酶切割后成为有活性的胰岛素 。
?不溶性的胶原, 是由可溶性的前胶原激活而成的 。
?在需要时, 前胶原酶转变成活性的胶原酶, 降解胶
原 。 如蝌蚪尾巴的消失 。
胰凝乳蛋白酶原的激活
胰凝乳蛋白酶原是胰腺分泌的, 由 245个氨
基酸残基组成的单链肽, 有 5对二硫键 。 经胰蛋
白酶作用, Arg15与 Ile16之间的肽键断裂, 才具
有酶活性, 这种酶称为 π-胰凝乳蛋白酶 。 π型
酶活性最高, 但不稳定, 它再作用于其它 π型酶
分子上, 使之失去两个二肽 ( Ser14-Arg15和
Thr147-Asn148) 后成为稳定形式 α-胰凝乳蛋
白酶 。 α型酶有 3条肽链, AB间和 BC间各有一对
二硫键连接 。
胰凝乳蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原的激活
胃旦白酶原是由胃壁细胞分泌的, 分子量为
38.9× 103,由 392个氨基酸残基组成 。 在胃酸 H+的
作用下, 低于 pH5时, 酶原自动激活, 从氨基端失
去 44个残基的碱性片段, 成为有活性的胃蛋白酶 。
胃旦白酶的最适反应 pH为 2,其活性部位含有 2个
天冬氨酸残基, 一个处于解离状态, 一个处于质
子化状态 。 酶原碱性片段中的 Lys与活性部位的天
冬氨酸残基有静电相互作用, 使酶不能表现出活
性 。 去除碱性片段后, 暴露出催化基团, 酶才表
现出活性 。 胃蛋白酶还可以催化其它胃旦白酶原
分子活化 。
胰蛋白酶原的激活
胰蛋白酶原由胰脏分泌, 进入小肠后, 在有
Ca2+的环境中受到肠激酶的激活, Lys6- Ile7之
间的肽键被裂解, 从氨基端去除一个 6肽, 成为
有活性的胰蛋白酶 。 活性的胰蛋白酶还可以激活
其它胰蛋白酶原, 胰凝乳蛋白酶原, 弹性蛋白酶
原及羧肽酶原等 。
胰蛋白酶原的激活
胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶原
的激活作用
生理止血过程 Ⅰ
生理止血过程包括三部分功能活动 。 首先
是小血管于受伤后立即收缩, 若破损不大即可
使血管封闭 。 其次, 更重要的是血管内膜损伤,
内膜下组织暴露, 可以激活血小板和血浆中的
凝血系统;由于血管收缩使血流暂停或减缓,
有利于激活的血小板粘附于内膜下组织并聚集
成团, 成为一个松软的止血栓以填塞伤口 。
生理止血过程 Ⅱ
接着, 在局部又迅速出现血凝块, 即血浆
中可溶的纤维蛋白源转变成不溶的纤维蛋白分
子多聚体, 并形成了由血纤维与血小板一道构
成的牢固的止血栓, 有效地制止了出血 。 与此
同时, 血浆中也出现了生理的抗凝血活动与纤
维蛋白溶解活性, 以防止血凝块不断增大和凝
血过程漫延到这一局部以外 。 显然, 生理止血
主要由血小板和某些血浆成分共同完成 。
凝血因子
( blood clotting factors)
编号 同义名
因子 Ⅰ 纤维蛋白原( fibrinogen)
因子 Ⅱ 凝血酶原 (prothrombin)
因子 Ⅲ 组织凝血激素 (tissue thromboplastin)
因子 Ⅳ Ca2+
因子 Ⅴ 前加速素 (proaccelerin)
因子 Ⅶ 前转变素 (proconvertin)
因子 Ⅷ 抗血友病因子 (antihemophilic factor,AHF)
因子 Ⅸ 血浆凝血激酶 (plasma thromboplastin component,PTC)
因子 Ⅹ Stuart-Prower因子
因子 Ⅺ 血浆凝血激酶前质 (plasma thromboplastin antecedent,PTA)
因子 Ⅻ 接触因子 (contact factor)
因子 ⅩⅢ 纤维蛋白稳定因子 (fibrin-stabilizing factor)
凝血机制
因子 X激活的两种途径
因子 Ⅹ 的激活可以通过两种途径 。 如果只是
损伤血管内膜或抽出血液置于玻璃管内, 完全依
靠血浆内的凝血因子逐步使因子 Ⅹ 激活从而发生
凝血的, 称为内源性激活途径 ( intrinsic route) ;
如果是依靠血管外组织释放的因子 Ⅲ 来参与因子
Ⅹ 的激活的, 称为外源性激活途径 ( extrinxic
route), 如创伤出血后发生凝血的情况 。
内源性途径
从因子 Ⅻ 的激活开始 。 血管内膜下组织,
特别是胶原纤维, 与因子 Ⅻ 接触, 可使因子 Ⅻ
激活成 Ⅻ a。 Ⅻ a可激活前激肽释放酶使之成为
激肽释放酶;后者反过来又能激活因子 Ⅻ, 这
是一种正反馈, 可使因子 Ⅻ a大量生成 。 Ⅻ a又
激活因子 Ⅺ 成为 Ⅺ a。
外源性途径
由因子 Ⅶ 与因子 Ⅲ 组成复合物, 在有 Ca2+存
在的情况下, 激活因子 Ⅹ 生成 Ⅹ a。 因子 Ⅲ, 原名
组织凝血激酶, 广泛存在于血管外组织中, 但在
脑, 肺和胎盘组织中特别丰富 。 因子 Ⅲ 为磷脂蛋
白质 。 Ca2+的作用就是将因子 Ⅶ 与因子 Ⅹ 都结合
于因子 Ⅲ 所提供的磷脂上, 以便因子 Ⅶ 催化因子
Ⅹ 的有限水解, 形成 Ⅹ a。
可逆的共价修饰
有一些酶属于共价调节酶 ( covalently
modulated enzyme), 通过其它酶对它进行可
逆的共价修饰而在活性与非活性之间互变 。 这
种酶常是一些对代谢流量起调节作用的关键酶,
或是需要迅速产生酶活性的酶, 并且可以级联
放大, 对输入的信息产生迅速的反应 。
有些酶以修饰状态为活性形式, 有些酶以
脱修饰状态为活性形式 。
酶修饰反应的例子
蛋白质的磷酸化
蛋白质磷酸化是最主要的共价修饰方式 。 通
过蛋白激酶的催化作用消耗 NTP使共价调节酶磷
酸化, 磷酸化的共价调节酶也可以通过蛋白磷酸
酶的水解作用脱磷酸化 。 共价调节酶上被磷酸化
的基团有 Thr,Ser,Tyr,Asp,Glu的羟基或羧
基, 或 Lys,Arg,His上的氨基或亚氨基, 其中
主要的被磷酸化基团是 Ser和 Thr的羟基 。
蛋白质的可逆磷酸化反应
蛋白激酶对底物序列的要求
蛋白激酶
蛋白激酶种类繁多, 是一个庞大的家族 。
各种蛋白激酶在结构上有很大的相似性, 很可
能有共同的祖先基因 。 根据底物被磷酸化的基
团可以分为 Ser/Thr型, 目前发现的蛋白激酶多
属于这一类; Tyr型, 数目相对较少 。 还可以根
据它们是否有调节物来分, 一类叫做信使依赖
性蛋白激酶, 另一类为非信使依赖蛋白激酶 。
蛋白激酶的分类
蛋白激酶
信使依赖性
蛋白激酶
非信使依赖
性蛋白激酶
胞内信使依赖
性蛋白激酶
激素或生长因子依
赖性蛋白激酶
几种重要的蛋白激酶
( 蛋白激酶 A)
蛋 白 激 酶 A
( protein kinase
A, PKA ) 也称
为 cAMP依赖性蛋
白激酶, 它与
cAMP结合后有活
性 。
蛋白激酶 C
蛋白激酶 C( protein kinase C,PKC) 是一
组 ( 大约有 10种 ) 蛋白激酶的总称 。 它们受 Ca2+、
二酰基甘油 ( DAG), 佛波酯 ( phorbol ester,
大戟二萜醇酯, 大戟二萜醇上有 5个羟基, 可被
不同的酸在不同的羟基上酯化 ) 的调节 。 PKC含
一条多肽链, 其中的调节部分以某种方式抑制了
催化部位的活性, 而 Ca2+,磷脂, DAG可以解除
这种抑制作用 。
磷酸化酶激酶
磷酸化酶激酶
( phosphorylase,
PhK) 是糖原代谢
中一个关键的调节
酶, 它通过磷酸化
使无活性的磷酸化
酶 b转变成有活性
的磷酸化酶 a。
PhK的亚基组成和调控
Phk由 4个不同的亚基组成, 一般认为全酶以
[αβγδ]四聚体的形式存在, 其中 γ为催化亚基, δ亚
基是钙调蛋白, β亚基被 PKA磷酸化后可以使 γ亚基
活化, 而 α亚基也可被 PKA缓慢磷酸化, 使得 β亚基
对蛋白磷酸酶敏感而脱磷酸化, 导致 γ亚基失去活
性 。 所以这个酶一方面受 Ca2+浓度的调节, 另一方
面受 PKA活性的影响 。
磷酸化酶激酶的亚基组成
蛋白酪氨酸激酶
蛋白酪氨酸激酶 ( protein tyrosine kinase,
PTK) 是专一性很强的, 专门磷酸化蛋白质中
酪氨酸残基的蛋白激酶 。 目前已发现 3种类型的
PTK,第一类是由病毒癌基因和正常细胞癌基
因编码的 PTK,第二类本身是某些生长因子和
激素的受体, 第三类为其它类型 。
六、同工酶
同工酶就是催化同一反应, 但酶分子形式不同
的一组酶 。 酶分子不同可以表现为肽链的氨基酸序
列不同或寡聚酶的亚基组成不同 。 最典型的同工酶
是动物体内的乳酸脱氢酶 ( lactate dehydrogenase,
LDH), 它是亚基组成不同的一组酶 。
同工酶中的不同成员可在不同的组织中表达,
或在不同的发育阶段表达 。 可用于遗传分析 。 虽然
它们催化相同的反应, 但它们的酶学性质可以不同,
在代谢中发挥着不同的作用 。
乳酸脱氢酶同工酶
从 各 种 组 织 中 得 到 的 LDH 分 子 量 都 是
140× 103,由 4个亚基组成, 亚基有两种, 一种
为肌肉型 ( M), 一种为心肌型 ( H), 这两种
亚基在氨基酸组成上有较大差别, H型富含酸性
氨基酸, M型富含碱性氨基酸, 因此很容易利用
电泳分开 。
乳酸脱氢酶催化的反应
乳酸脱氢酶同工酶酶谱
一、酶的活性部位
二,酶催化反应的独特性质
三、影响酶催化效率的有关因素
四、酶催化反应机制的实例
五、酶活性的调节控制
六、同工酶
(mechanisms of enzyme action and
regulation of enzyme activity)
一、酶的活性部位
酶活性部位的特点 Ⅰ
在酶分子中, 只有少数几个氨基酸残基
直接参与结合底物和催化反应, 这些氨基酸
残基在一级结构上可以相距很远, 但通过肽
链的折叠, 盘绕, 使它们在空间上相互接近 。
这些残基在空间上所在的部位称为活性部位
或活性中心, 酶的活性部位往往有一个裂缝
或口袋状的区域, 其形状与底物类似 。
酶活性部位的特点 Ⅱ
当底物与酶通过次级键结合时, 底物和酶都
可能发生形变, 诱导契合, 使得底物与酶的活性
部位的形状恰好吻合, 而且负责催化反应的残基
也正好接近将发生反应的基团或键 。 当酶蛋白变
性时, 构象发生变化, 失去上述结构特点, 同时
也失去了活性 。 虽然酶蛋白中其它残基不直接参
与活性部位的组成, 但这些残基中的大多数为整
个酶蛋白的构象作出了不可缺少的贡献 。
研究酶活性部位的方法
1,酶分子侧链基团的化学修饰法
( 1) 非特异性共价修饰
( 2) 特异性共价修饰
( 3) 亲和标记法
2,动力学参数测定法
3,X射线晶体结构分析法
4,定点突变法
酶分子侧链基团的化学修饰法
用一种小分子化合物与酶反应, 这种化合物与
酶的某个或某种残基侧链反应, 形成共价结合, 这
叫化学修饰或共价修饰, 这种化合物称为修饰剂 。
酶分子中可以被化学修饰的基团有:巯基, 羟基,
咪唑基, 氨基, 羧基和胍基等 。 当酶活性部位的残
基侧链被修饰后, 会使酶失去活力 。 将经修饰后失
去活力的酶水解, 鉴定出被修饰的氨基酸, 可以得
到哪些残基参与组成活性部位的信息 。
非特异性共价修饰
此 类修饰剂可以修饰活性部位 内 或 外 的残基
侧链基团 。 若修饰程度与酶活力丧失成正比, 则
说明被修饰的基团位于活性部位 。 当发现修饰程
度与酶活力丧失成正比时, 可在加入底物或竞争
性抑制剂的条件下进行修饰, 若可阻遏修饰剂对
酶活力的破坏作用, 则进一步证明被修饰的基团
位于活性部位 。
特异性共价修饰
此类修饰剂特异性地修饰酶活性部位的残基,
同时使酶失活 。 此类修饰剂与酶的活性部位特异
性结合, 同时修饰酶活性部位的基团 。 例如二异
丙基氟磷酸 ( DFP) 能特异性地与许多酶的活性部
位的 Ser残基共价结合, 使酶活力丧失, 而不修饰
非活性部位的 Ser残基 。 当用 DFP修饰酶后, 部分
水解酶蛋白, 得到含有二异丙基磷酰基的肽段,
分析此肽段的氨基酸序列, 可得到活性部位 Ser附
近的肽链序列 。
DFP修饰酶的 Ser残基的反应
一些酶活性部位的氨基酸序列
酶 氨基酸序列
牛胰蛋白酶 …… Ser-Cys-Gly- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro-Val……
牛胰凝乳蛋白酶 …… Ser-Cys-Met- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro-Leu……
猪弹性蛋白酶 …… Gly-Cys-Gln- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro-Leu……
猪凝血酶 …… Asp-Ala-Cys-Glu- Gly- Asp-Ser-Gly- Gly- Pro……
亲和标记法
能特异性地修饰酶的活性部位的修饰剂很
少, 并且专一性差, 经常出现也修饰活性部位
之外的残基的情况 。 为了解决此问题, 人们合
成了一些底物类似物, 其上带有高反应性基团,
它们特异地与相应的酶的活性部位结合, 然后
与活性部位的残基反应, 这样就大大提高了修
饰的专一性, 这种方法叫亲和标记法 。
TPCK对胰凝乳蛋白酶
的亲和标记
最典型的例子就是用来修饰胰凝乳蛋白酶
的亲和标记物对甲苯磺酰 -L-苯丙氨酰氯甲基酮
( TPCK), 胰凝乳蛋白酶的人工底物是对甲苯
磺酰 -L-苯丙氨酸乙酯 ( TPE) 。 当将 TPDK与
胰凝乳蛋白酶一起保温后, 酶失去活性, 氨基
酸分析表明, TPDK修饰了 His57。 TPCK不与
胰凝乳蛋白酶原, 变性的胰凝乳蛋白酶, DIP-
胰凝乳蛋白酶反应 。 这些证据说明 His57是组成
酶活性部位的残基之一 。
TPE和 TPCK的结构
动力学参数测定法
在不同 pH下测定酶活力,可以得到与酶
活力直接相关的可解离基团的 pKa值,从而推
测出是些什么残基。
X射线晶体结构分析法
使底物与酶结合, 制成晶体, 再进行 X光
晶体衍射分析, 可得到底物附近有哪些残基 。
定点突变法
从基因的水平上对特定位点的核苷酸进行
突变, 使得蛋白产物特定的氨基酸残基转变成
另一种氨基酸残基, 观察突变对酶活力的影响 。
例如, 1987年 Claik将胰蛋白酶 Asp102突变成
Asn102,突变的胰蛋白酶的 kcat只有野生型酶的
五千分之一, 突变酶水解酯底物的活力仅是野
生型酶的万分之一, 可见 Asp102对胰蛋白酶的
活力是必需的 。
三、影响酶催化效率 的有关因素
底物和酶的邻近效应 与定向效应
( proximity and orientation)
对于双底物反应或三底物反应来说, 由
于酶活性部位对底物有高亲和力, 增加了参
与反应的底物碰撞的几率, 这就是邻近效应 。
在酶活性部位, 底物之间参与反应的基团或
键靠近, 使反应易于进行, 这就是定向效应 。
底物的形变和诱导契合
底物与酶结合后, 发生构象变化, 相应的
键变得对反应更敏感, 降低了反应的活化能 。
( distortion and induced-fit)
酸碱催化
酶活性部位的催化基团可以通过向底物提
供质子或从底物上夺取质子, 而催化反应 。 若
提供质子和夺取质子的是反应液中的 H
+和 OH
-,
称为专一酸碱催化或狭义酸碱催化;若提供质
子和夺取质子的是酶活性部位的残基, 称为总
酸碱催化或广义酸碱催化 。
( acid-base catalysis)
共价催化
共价催化分为亲电催化和亲核催化两种类型 。
亲电催化指的是酶活性部位的催化基团在催化反
应过程中汲取底物的电子, 产生底物与酶共价结
合的过渡态中间物;亲核催化是酶活性部位的催
化基团在反应过程中向底物供给电子, 产生底物
与酶共价结合的过渡态中间物 。
( covalent catalysis)
金属离子催化
金属离子带正电荷, 它可以稳定底物过
渡态中间物中的负电荷, 还可以通过吸引电
子, 造成电子畸变, 使得反应容易进行 。
活性部位微环境的影响
在实际催化中,上述多种因素可以同时起作用。
多元催化和协同效应
活性部位是一个疏水环境,介电常数较低,
带电基团之间的作用力较强,有助于催化基团
与底物的作用。
四、酶催化反应机制的实例
溶菌酶 Ⅰ
溶菌酶能够水解细菌细胞壁的多糖, 从而
溶解这些细菌的细胞壁 。 细胞壁多糖是 N-乙酰
氨基葡糖 ( NAG) -N-乙酰氨基葡糖乳酸
( NAM) 的共聚物, 其中的 NAG和 NAM通过
β- 1,4-糖苷键交替排列 。
细
菌
细
胞
壁
多
糖
溶菌酶 Ⅱ
溶 菌 酶 是 单 链 肽 蛋 白 质, 分 子 量 为
14.6× 103,由 129个氨基酸残基组成 。 含有 4对
二硫键 。 它能够水解 NAM的 C1与 NAG的 C4之
间的糖苷键, 但不能水解 NAG的 C1与 NAM的
C4之间的糖苷键 。 几丁质是甲壳类动物甲壳中
所含的多糖, 仅由 NAG残基通过 β- 1,4-糖苷键
相连, 溶菌酶也可以水解几丁质 。
溶菌酶的一级结构
红箭头所
指为活性
部位残基
溶菌酶催化水解的糖苷键
溶菌酶的有效底物
酶的活性部位有一条沟, 正好能容纳 6个多
糖残基形成的链 。 当用含不同残基数的寡聚 NAG
作实验, 发现当残基数达到 6个时就可以作为有
效的底物 。
底物(浓度为 10- 4mol/L) 相对水解速率
(NAG)2 0
(NAG)3 1
(NAG)4 8
(NAG)5 4000
(NAG)6 30000
(NAG)8 30000
溶菌酶活性部位的催化位点
通过研究 发现, 若将 6残基寡聚糖作为溶
菌酶的底物, 将这 6个残基分别称为 A,B,C,
D,E和 F,则水解发生在 D和 E之间的糖苷键上 。
其中 D糖的吡喃环因空间构象的原因, 必须由
正常的椅式构象转变成能量较高的半椅式构象,
其 C1参与的糖苷键稳定性降低, 易于断裂 。
溶
菌
酶
活
性
部
位
的
催
化
位
点
糖苷键的断裂位点
在 H218O中反应, 可以发现 D糖的 C1上含有
18O,而 E糖的 C4羟基只含普通 O。 由此可知这个
键断裂在 D糖的 C1和糖苷键的 O之间 。
溶菌酶的催化基团
分析 D-E键周围的微环境, 最活泼的基团是
Asp52和 Glu35,它们分别位于被断裂的糖苷键
的两侧 。 Asp52在一个极性环境中, 而 Glu35位
于非极性区 。 在溶菌酶水解几丁质的最适 pH下
( pH5), Asp52的侧链羧基为解离状态 COO-,
而 Glu的侧链羧基为非质子化的 COOH形式 。
溶菌酶的催化机制 Ⅰ
( 1) Glu35的侧链 COOH提供一个 H+ 到被断裂
糖苷键的 O原子上 。 H+ 的转移使 D环的 C1键与
糖苷键 O原子间的键断开, 并形成正碳离子过渡
态中间产物 。
Glu35酸催化
溶菌酶的催化机制 Ⅱ
( 2) 含有 E及 F残基的 NAG二聚体离开酶分子 。
( 3) 正碳离子中间产物进一步与来自溶剂的
OH- 发生反应 。 Glu35质子化, 由 A,B,C和 D
残基组成的 NAG四聚体通过扩散离开酶分子 。
Asp52 的负电荷
稳定正碳离子
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族, 这个家族
包 括 胰 蛋 白 酶 ( trypsin ), 胰 凝 乳 蛋 白 酶
( chymotrypsin), 弹性蛋白酶 ( elastase), 凝
血酶 ( thrombin ), 枯草杆菌蛋白酶
( subtilisin), 纤溶酶 ( plasmin), 组织纤溶
酶原激活剂 ( tissue plasminogen activator,tPA)
等 。 它们的共同特征是活性部位有一个必需的丝
氨酸残基 。
消化作用的丝氨酸蛋白酶
胰蛋白酶, 胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶虽然
都是裂解肽键的, 但它们的专一性明显不同 。 胰
蛋白酶裂解碱性氨基酸的羧基形成的肽键, 胰凝
乳蛋白酶裂解芳香氨基酸的羧基形成的肽键, 弹
性蛋白酶专一性较弱, 它主要裂解小的中性氨基
酸的羧基侧肽键 。 这 3种蛋白酶有相似的一级结
构和三级结构 。
三
种
消
化
蛋
白
酶
的
一
级
结
构
比
较
胰凝乳蛋白酶的三维结构
胰凝乳蛋白酶分子是一个紧密的椭球体, 大
小为 5.1× 4.0× 4.0nm。 多数芳香和疏水残基包埋
在蛋白质内部, 而多数带电的或亲水的残基分布
在分子表面 。 3 个极性残基 His57, Asp102 和
Ser195在活性部位形成催化三联体 ( catalytic
triad) 。 这三个残基在胰蛋白酶和弹性蛋白酶中
也存在, 但这三种蛋白酶的底物结合部位形状不
同, 导致它们裂解不同氨基酸羧基侧的肽键 。
胰
凝
乳
蛋
白
酶
与
egl
in
C
的
结
合
蓝色带状物
为 eglin C
蓝色
His57
红色
Asp102
黄色
Ser195
胰
凝
乳
蛋
白
酶
的
催
化
三
联
体
胰、胰凝乳、弹性蛋白酶的
底物结合口袋
人工底物
对一些底物是大分子聚合物的酶研究其动
力学时, 一般使用小分子的人工底物 。 乙酸 -p-
硝基苯酯是一种特别有用的模式底物, 因为其
水解产物硝基苯酚在 400nm有强的光吸收, 便
于监测其变化 。
研究胰凝乳蛋白酶的
人工底物
乙酰苯丙氨酸甲酯
苯甲酰丙氨酸甲酯
甲酰苯丙氨酸甲酯
乙酸 -p-硝基苯酯
胰凝乳蛋白酶催化机制的
动力学研究
当大量胰凝乳蛋白酶用该底物进行动力学研
究时, 反应分两个不同的阶段, 反应开始时以突
发的速率 生成 p-硝基苯酚, 随后出现一个较慢的
稳态速率 。 这是因为反应的第一步是底物与酶结
合后, 反应释放出 p-硝基苯酚, 另一个产物乙酸
以乙酰基的形式结合在酶活性部位的 Ser195上 。
第二步是水分子攻击乙酰 -酶复合物, 释放出乙
酸根离子 。 第二步较缓慢, 是限速步骤 。
胰凝乳蛋白酶同底物反应的
动力学曲线
酰基-酶中间物的迅速形成
后缓慢释放产物
胰凝乳蛋白酶中催化
三联体的作用
在没有底 物时, His57是未质子化的, 当
Ser195羟基氧原子对底物进行亲核攻击时,
His57从 Ser195接受一个质子 。 Asp102的 COO-
的作用是稳定过渡态中 His57的正电荷形式 。 此
外, Asp定向 His57,保证从 Ser195接受一个质子
后的 His57处于适当的互变异构形式 。
His57的互变异构
胰凝乳蛋白酶的催化机制 Ⅰ
胰凝乳蛋白酶的催化机制 Ⅱ
五、酶活性的调节控制
别构调控
( allosteric regulation)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非
共价结合后发生构象的改变, 进而改变酶活性状
态, 称为酶的别构调节 。 具有这种调节作用的酶
称为别构酶 ( allosteric enzyme) 。 凡能使酶
分子发生别构作用的物质称为效应剂或别构剂,
能增加酶活性的别构剂为别构激活剂, 能抑制酶
活性的别构剂为别构抑制剂 。
天冬氨酸转氨甲酰酶
( aspartate transcarbamylase,ATCase)
ATCase是嘧啶生物合成途径的第一个酶,
底物对酶的结合有正协同性 。 该反应途径的
终 产物 CTP是 ATCase的反馈抑制剂, 抑制程
度可达 90%,这种抑制是降低酶对底物的亲
和力, 但不影响最大反应速度 。 而 ATP是
ATCase的激活剂, 可增加酶对底物的亲和力,
也不影响最大反应速度 。
ATCase催化的反应式
ATP和 CTP对 ATCase活性的
影响曲线
ATP可阻遏 CTP
的抑制作用, 它
们 竞争同一结合
位点 。
脱敏反应
ATCase由催化亚基和调节亚基组成 。 当用
汞化物处理该酶时, 则 ATCase失去调节活性 。
用汞化物处理过的 ATCase,ATP和 CTP不再影
响其催化活性, 而且底物结合 变为无协同性 。
但并不影响酶的最大反应速率 。
p-羟汞苯甲酸对巯基的修饰
ATCase的亚基分离
当用汞化物 p-羟苯甲酸处理 ATCase时, p-羟
苯甲酸与巯基反应, 使酶失去了受 ATP或 CTP调
节的能力 。 利用超离心分析, 天然酶的沉降系数
为 11.6S,分子量为 310× 103,而受 p-羟苯甲酸处
理后的酶出现两条带, 一个是 2.8S,分子量
34× 103,另一个是 5.8S,分子量 100× 103。 这是
两种不同的亚基, 这两种亚基也可以利用离子交
换层析或蔗糖密度梯度离心分开 。
ATCase的沉降速率模式
ATCase的亚基组成
大的亚基叫催化亚基, 单独的大亚基有催化
反应的能力, 但不与 ATP或 CTP结合 。 小亚基叫
调节亚基, 单独的小亚基可以与 ATP或 CTP结合,
但无催化能力 。 催化亚基 ( c3) 含 3条 c链, 每条
链的分子量为 34× 103,所以催化亚基的分子量是
102× 103;调节亚基 ( r2) 含 2条 r链, 每条链的
分子量为 17× 103,所以调节亚基的分子量是
34× 103。 全酶含有 2个催化亚基和 3个调节亚基,
记为 c6r6,即 2c3+ 3 r2 → c6 r6。
ATCase是别构酶的模式对象
用过量的巯基乙醇可除去汞苯甲酸基 。 将除
去汞苯甲酸基的催化亚基和调节亚基混合, 可重
组得到天然酶 。 因 ATCase的催化亚基和调节亚基
容易分开, 又容易重组, 所以它成为研究别构酶
的模式对象 。
ATCase的三维结构
利用 X光衍射, 得出了 ATCase的三维结构 。 通
过使酶与竞争性抑制剂 N-( 膦乙酰基 ) -L-天冬氨
酸 ( PALA) 结合, 找到了底物的结合位点, 它位
于两条催化链的界面处, 由两条 c链的残基共同组
成 。 每条 r链分两个结构域, 外侧的结构域是 CTP
的结合位点, 里侧的结构域与催化亚基相互作用 。
每条 c链也分为两个结构域, N端为氨甲酰磷酸结
合结构域, C端为天冬氨酸结合结构域 。
ATCase的亚基结合方式
AT
Ca
se
半
分
子
的
三
维
结
构
AT
Ca
se
的
过
渡
态
底
物
及
竞
争
性
抑
制
剂
PALA结合在 ATCase
催化部位上的方式
酶与底物结合后的构象变化
底物与酶结合后, 导致酶的沉降系数降低
3%,说明酶与底物结合后膨胀了 。 伴随着酶与
PALA的结合, 酶的四级结构发生了大的变化,
两个催化三聚体分开了 1.2nm,并转动了 10° 。
此外, 每一调节亚基也绕其对称轴旋转了 15° 。
c链上的两个底物结合结构域靠近了 0.2nm,酶
由 T型变成了 R型 。
酶与底物结合后的构象变化
硝基甲烷修饰 ATCase
酶与硝基甲烷反应, 在酶的每个催化链中生
成一种有颜色的硝基酪氨酸残基 ( λmax =
430nm), 在每个催化链上一个必需的 Lys也被
修饰, 这样就人工引进了报告基团 。 这种被修饰
的催化亚基不能与底物结合 。
底物结合到 ATCase上引起
高度协同的别构转变
用被修饰的催化亚基与正常的催化亚基及正
常的调节亚基重组成全酶 ( 杂交酶 ), 当加入天
冬氨酸的类似物琥珀酸时, 琥珀酸结合到正常的
催化亚基上, 改变了被修饰催化亚基上硝基酪氨
酸的吸收光谱 。 说明一个催化亚基与底物结合能
引起另一个催化亚基构象发生变化 。
琥珀酸与杂交酶结合后硝基
Tyr吸收光谱的变化
别构剂对酶构象的影响
给杂交酶加 ATP,硝基酪氨酸 430nm的光吸
收增加, 与加琥珀酸情况相同;而给杂交酶加
CTP,430nm的光吸收减少 。 此实验说明别构激
活剂和别构抑制剂都能引起构象变化, 但变化的
结果不同 。 ATP的结合使酶的构象平衡向 R型转
变, 而 CTP的结合使酶的构象平衡向 T型转变 。
ATP和 CTP与酶结合后酶的构象
及硝基 Tyr吸收光谱的变化
酶原的激活
有些酶在刚合成出来时没有活性, 称为酶原
( zymogen或 proenzyme) 。 酶原经蛋白水解酶
在特定位点切割后, 产生有活性的酶, 这种方式
称为酶原的激活 。 有一些不是酶的蛋白质, 也需
要经特定的蛋白酶水解才有功能, 这些蛋白质在
没有活化之前称为前体 ( precursor) 。
酶原或蛋白质前体激活举例
?使蛋白质水解的消化酶, 在胃和胰脏中刚合成时是
以酶原的形式存在, 分泌到肠胃中被切割后才成为有
活性的酶 。
?血液凝固系统中许多酶都是以酶原的形式存在, 到
需要血液凝固时才被激活 。
?胰岛素刚合成出来是前胰岛素原 ( preproinsulin),
经蛋白酶切割后成为有活性的胰岛素 。
?不溶性的胶原, 是由可溶性的前胶原激活而成的 。
?在需要时, 前胶原酶转变成活性的胶原酶, 降解胶
原 。 如蝌蚪尾巴的消失 。
胰凝乳蛋白酶原的激活
胰凝乳蛋白酶原是胰腺分泌的, 由 245个氨
基酸残基组成的单链肽, 有 5对二硫键 。 经胰蛋
白酶作用, Arg15与 Ile16之间的肽键断裂, 才具
有酶活性, 这种酶称为 π-胰凝乳蛋白酶 。 π型
酶活性最高, 但不稳定, 它再作用于其它 π型酶
分子上, 使之失去两个二肽 ( Ser14-Arg15和
Thr147-Asn148) 后成为稳定形式 α-胰凝乳蛋
白酶 。 α型酶有 3条肽链, AB间和 BC间各有一对
二硫键连接 。
胰凝乳蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原的激活
胃旦白酶原是由胃壁细胞分泌的, 分子量为
38.9× 103,由 392个氨基酸残基组成 。 在胃酸 H+的
作用下, 低于 pH5时, 酶原自动激活, 从氨基端失
去 44个残基的碱性片段, 成为有活性的胃蛋白酶 。
胃旦白酶的最适反应 pH为 2,其活性部位含有 2个
天冬氨酸残基, 一个处于解离状态, 一个处于质
子化状态 。 酶原碱性片段中的 Lys与活性部位的天
冬氨酸残基有静电相互作用, 使酶不能表现出活
性 。 去除碱性片段后, 暴露出催化基团, 酶才表
现出活性 。 胃蛋白酶还可以催化其它胃旦白酶原
分子活化 。
胰蛋白酶原的激活
胰蛋白酶原由胰脏分泌, 进入小肠后, 在有
Ca2+的环境中受到肠激酶的激活, Lys6- Ile7之
间的肽键被裂解, 从氨基端去除一个 6肽, 成为
有活性的胰蛋白酶 。 活性的胰蛋白酶还可以激活
其它胰蛋白酶原, 胰凝乳蛋白酶原, 弹性蛋白酶
原及羧肽酶原等 。
胰蛋白酶原的激活
胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶原
的激活作用
生理止血过程 Ⅰ
生理止血过程包括三部分功能活动 。 首先
是小血管于受伤后立即收缩, 若破损不大即可
使血管封闭 。 其次, 更重要的是血管内膜损伤,
内膜下组织暴露, 可以激活血小板和血浆中的
凝血系统;由于血管收缩使血流暂停或减缓,
有利于激活的血小板粘附于内膜下组织并聚集
成团, 成为一个松软的止血栓以填塞伤口 。
生理止血过程 Ⅱ
接着, 在局部又迅速出现血凝块, 即血浆
中可溶的纤维蛋白源转变成不溶的纤维蛋白分
子多聚体, 并形成了由血纤维与血小板一道构
成的牢固的止血栓, 有效地制止了出血 。 与此
同时, 血浆中也出现了生理的抗凝血活动与纤
维蛋白溶解活性, 以防止血凝块不断增大和凝
血过程漫延到这一局部以外 。 显然, 生理止血
主要由血小板和某些血浆成分共同完成 。
凝血因子
( blood clotting factors)
编号 同义名
因子 Ⅰ 纤维蛋白原( fibrinogen)
因子 Ⅱ 凝血酶原 (prothrombin)
因子 Ⅲ 组织凝血激素 (tissue thromboplastin)
因子 Ⅳ Ca2+
因子 Ⅴ 前加速素 (proaccelerin)
因子 Ⅶ 前转变素 (proconvertin)
因子 Ⅷ 抗血友病因子 (antihemophilic factor,AHF)
因子 Ⅸ 血浆凝血激酶 (plasma thromboplastin component,PTC)
因子 Ⅹ Stuart-Prower因子
因子 Ⅺ 血浆凝血激酶前质 (plasma thromboplastin antecedent,PTA)
因子 Ⅻ 接触因子 (contact factor)
因子 ⅩⅢ 纤维蛋白稳定因子 (fibrin-stabilizing factor)
凝血机制
因子 X激活的两种途径
因子 Ⅹ 的激活可以通过两种途径 。 如果只是
损伤血管内膜或抽出血液置于玻璃管内, 完全依
靠血浆内的凝血因子逐步使因子 Ⅹ 激活从而发生
凝血的, 称为内源性激活途径 ( intrinsic route) ;
如果是依靠血管外组织释放的因子 Ⅲ 来参与因子
Ⅹ 的激活的, 称为外源性激活途径 ( extrinxic
route), 如创伤出血后发生凝血的情况 。
内源性途径
从因子 Ⅻ 的激活开始 。 血管内膜下组织,
特别是胶原纤维, 与因子 Ⅻ 接触, 可使因子 Ⅻ
激活成 Ⅻ a。 Ⅻ a可激活前激肽释放酶使之成为
激肽释放酶;后者反过来又能激活因子 Ⅻ, 这
是一种正反馈, 可使因子 Ⅻ a大量生成 。 Ⅻ a又
激活因子 Ⅺ 成为 Ⅺ a。
外源性途径
由因子 Ⅶ 与因子 Ⅲ 组成复合物, 在有 Ca2+存
在的情况下, 激活因子 Ⅹ 生成 Ⅹ a。 因子 Ⅲ, 原名
组织凝血激酶, 广泛存在于血管外组织中, 但在
脑, 肺和胎盘组织中特别丰富 。 因子 Ⅲ 为磷脂蛋
白质 。 Ca2+的作用就是将因子 Ⅶ 与因子 Ⅹ 都结合
于因子 Ⅲ 所提供的磷脂上, 以便因子 Ⅶ 催化因子
Ⅹ 的有限水解, 形成 Ⅹ a。
可逆的共价修饰
有一些酶属于共价调节酶 ( covalently
modulated enzyme), 通过其它酶对它进行可
逆的共价修饰而在活性与非活性之间互变 。 这
种酶常是一些对代谢流量起调节作用的关键酶,
或是需要迅速产生酶活性的酶, 并且可以级联
放大, 对输入的信息产生迅速的反应 。
有些酶以修饰状态为活性形式, 有些酶以
脱修饰状态为活性形式 。
酶修饰反应的例子
蛋白质的磷酸化
蛋白质磷酸化是最主要的共价修饰方式 。 通
过蛋白激酶的催化作用消耗 NTP使共价调节酶磷
酸化, 磷酸化的共价调节酶也可以通过蛋白磷酸
酶的水解作用脱磷酸化 。 共价调节酶上被磷酸化
的基团有 Thr,Ser,Tyr,Asp,Glu的羟基或羧
基, 或 Lys,Arg,His上的氨基或亚氨基, 其中
主要的被磷酸化基团是 Ser和 Thr的羟基 。
蛋白质的可逆磷酸化反应
蛋白激酶对底物序列的要求
蛋白激酶
蛋白激酶种类繁多, 是一个庞大的家族 。
各种蛋白激酶在结构上有很大的相似性, 很可
能有共同的祖先基因 。 根据底物被磷酸化的基
团可以分为 Ser/Thr型, 目前发现的蛋白激酶多
属于这一类; Tyr型, 数目相对较少 。 还可以根
据它们是否有调节物来分, 一类叫做信使依赖
性蛋白激酶, 另一类为非信使依赖蛋白激酶 。
蛋白激酶的分类
蛋白激酶
信使依赖性
蛋白激酶
非信使依赖
性蛋白激酶
胞内信使依赖
性蛋白激酶
激素或生长因子依
赖性蛋白激酶
几种重要的蛋白激酶
( 蛋白激酶 A)
蛋 白 激 酶 A
( protein kinase
A, PKA ) 也称
为 cAMP依赖性蛋
白激酶, 它与
cAMP结合后有活
性 。
蛋白激酶 C
蛋白激酶 C( protein kinase C,PKC) 是一
组 ( 大约有 10种 ) 蛋白激酶的总称 。 它们受 Ca2+、
二酰基甘油 ( DAG), 佛波酯 ( phorbol ester,
大戟二萜醇酯, 大戟二萜醇上有 5个羟基, 可被
不同的酸在不同的羟基上酯化 ) 的调节 。 PKC含
一条多肽链, 其中的调节部分以某种方式抑制了
催化部位的活性, 而 Ca2+,磷脂, DAG可以解除
这种抑制作用 。
磷酸化酶激酶
磷酸化酶激酶
( phosphorylase,
PhK) 是糖原代谢
中一个关键的调节
酶, 它通过磷酸化
使无活性的磷酸化
酶 b转变成有活性
的磷酸化酶 a。
PhK的亚基组成和调控
Phk由 4个不同的亚基组成, 一般认为全酶以
[αβγδ]四聚体的形式存在, 其中 γ为催化亚基, δ亚
基是钙调蛋白, β亚基被 PKA磷酸化后可以使 γ亚基
活化, 而 α亚基也可被 PKA缓慢磷酸化, 使得 β亚基
对蛋白磷酸酶敏感而脱磷酸化, 导致 γ亚基失去活
性 。 所以这个酶一方面受 Ca2+浓度的调节, 另一方
面受 PKA活性的影响 。
磷酸化酶激酶的亚基组成
蛋白酪氨酸激酶
蛋白酪氨酸激酶 ( protein tyrosine kinase,
PTK) 是专一性很强的, 专门磷酸化蛋白质中
酪氨酸残基的蛋白激酶 。 目前已发现 3种类型的
PTK,第一类是由病毒癌基因和正常细胞癌基
因编码的 PTK,第二类本身是某些生长因子和
激素的受体, 第三类为其它类型 。
六、同工酶
同工酶就是催化同一反应, 但酶分子形式不同
的一组酶 。 酶分子不同可以表现为肽链的氨基酸序
列不同或寡聚酶的亚基组成不同 。 最典型的同工酶
是动物体内的乳酸脱氢酶 ( lactate dehydrogenase,
LDH), 它是亚基组成不同的一组酶 。
同工酶中的不同成员可在不同的组织中表达,
或在不同的发育阶段表达 。 可用于遗传分析 。 虽然
它们催化相同的反应, 但它们的酶学性质可以不同,
在代谢中发挥着不同的作用 。
乳酸脱氢酶同工酶
从 各 种 组 织 中 得 到 的 LDH 分 子 量 都 是
140× 103,由 4个亚基组成, 亚基有两种, 一种
为肌肉型 ( M), 一种为心肌型 ( H), 这两种
亚基在氨基酸组成上有较大差别, H型富含酸性
氨基酸, M型富含碱性氨基酸, 因此很容易利用
电泳分开 。
乳酸脱氢酶催化的反应
乳酸脱氢酶同工酶酶谱