第 7章 蛋白质的分离、纯化和表征
一、蛋白质的酸碱性质
二、蛋白质分子的大小与形状
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
四、蛋白质分离纯化的一般原则
五、蛋白质的分离纯化方法
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(Isolation,purification and characteristics of proteins)
表征：事物显露在外的征象
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质的等电点和等离子点
对某一种蛋白质来说, 在某一 pH下, 它所
带的正电荷与负电荷刚好相等, 这个 pH叫该蛋
白质的等电点, 蛋白质的等电点受介质中盐浓
度的影响 。 在没有其它盐类干扰时, 蛋白质质
子供体解离出的质子数与质子受体接受的质子
数相等时的 pH叫该蛋白质的等离子点 。 等离子
点是蛋白质的一个特征常数 。
二、蛋白质分子的
大小与形状
根据化学组成测定最低分子量
用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质
（ 原子 ） 或某一含量很低的氨基酸残基的含量,
并假设蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子,
则可以计算出该蛋白质的最低分子量 。 例如, 肌
红蛋白含铁量为 0.335%,其最低分子量可按下式
算出,
1 6 7 0 0100
335.0
8.55100
335.0
????? 铁的原子量蛋白质的分子量
%335.0%100
铁的原子量蛋白质的分子量 ?
根据化学组成测定最低分子量
若蛋白质中含有 n个被测原子, 则分子量
等于最低分子量 × n,
若某蛋白质中某种氨基酸的含量特别低,
通过测定这种氨基酸的含量, 也可用此法计
算出蛋白质的分子量 。
渗
透
压
测
定
的
示
意
图
Van’t Hoff 公式
在理想溶液中, 溶液的渗透压与溶质浓度的
关系可用 Van’t Hoff公式表示,
V
RT
M
g
V
n R T
r
????
rr M
c RT
M
RT
V
g ????
式中 π是渗透压 （ N/m2,即 Pa）, V是溶液
的体积 （ m3）, n是溶液中溶质的摩尔数, g是溶
质的质量 （ g）, C是溶质的浓度 （ g /m3）, T是
绝 对 温 度 （ K ）, R 是 气 体 常 数
（ 8.314J/(K·mol)）, Mr为溶质的分子量或摩尔
质量 （ g /mol） 。
渗透压法测定蛋白质 的分子量
蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差 。 在
溶质浓度不大时, 它们的关系可用下式表示,
?
?
?
?
?
? ?? 2Kc
M
c
RT
r
? RT K cM
RT
c r
???
c
RT
M
c
r
?
0
lim
?
?
R T K c
c
RT
M r
?
?
?
当 c 趋向于 0时, RTKc 趋向于 0,但 π/c 不趋向于 0，
而是趋向于一定值 。
渗透压法测定蛋白质 的分子量
测定几个不同浓度下的渗透压, 以 π/c对 c作
图, 并外推至 c为 0时的 π/c,再代入上式求得 Mr。
为了避免溶液中其它无机离子的影响, 在溶
解度许可的范围内, 尽量采用等电点或接近于等
电点的缓冲液作膜内外的溶剂, 并增加缓冲液中
无机盐的浓度 。
沉降分析法测定蛋白质 的分子量
用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量
需要超速离心机, 超速离心机的转速可以达到每
分钟 6万～ 8万转, 这样高的转速使得被离心的分
子受到的离心力达到 40万～ 70万 g。
超速离心机工作原理
制备型超速离心机
分析型超速离心机
被离心分子的受力情况分析
沉降速度法 Ⅰ
在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时, 它将受
到三种力的作用,
xmF pc 2)( ??离心力
xvmxVF ppb 22)( ???? ??浮力
dt
dxfvfF
f ??)( 摩擦力
离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力,
)1(222 ????? vxmxvmxmFF pppbc ?????
沉降速度法 Ⅱ
fFFF bc ??
dt
dxfvxm
p ?? )1(
2 ??
f
vm
x
dt
dx
p )1(
2
?
?
?
?
当分子颗粒以恒定速度移动时, 净离心力
与摩擦力大小相等, 方向相反,
即
整理得
等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定
值，可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将此
定值称为沉降系数（ sedimentation coefficient），
用 s（小写）表示。
沉降速度法 Ⅲ
dt
xd
dt
xd
dt
x
dx
x
dt
dx
s
2222
l o g3 0 3.2ln
????
????
是 logx对 t作图所得直线的斜率, 因此测得
在 t1,t2,t3,… 时间相应的 x1,x2,x3,…, 作图求出斜
率, 代入上式即可求出沉降系数 s,沉降系数的单
位是秒 。
dt
xd log
3 0 3.2
lo g 2?s
dt
xd ?
沉降速度法 Ⅳ
蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数
介于 1× 10－ 13到 200× 10－ 13秒之间。为了使用方
便，以 10－ 13秒为一个沉降系数的单位，称为斯维
得贝格单位（ Svedberg unit），或称沉降系数单
位，用 S （大写）表示。如人血红蛋白的 s为
4.46× 10－ 13秒，即 4.46S。
沉降速度法 Ⅴ
?
?
?
?
?
?
?
?
?
)(
)(
,,20
,20,
,,20
btpw
wpbt
btw ss
???
???
由于测定时温度和溶剂性质对 s值都有影响,
需要校正成标准条件下的 s值, 这样才便于比较 。
标准条件是 20℃, 溶剂是水 。 标准条件下的 s值记
为 。 校正公式如下,
由于蛋白质浓度增加, 分子间可能彼此干扰,
使得 s值减小 。 为排除因蛋白质浓度造成的测定误
差, 可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的 s值,
然后外推至浓度为 0时的 。
? ws,20
ws,20
蛋白质分子颗粒的质量, 爱因斯
坦－萨德兰德方程,。 式中 Mr 是蛋白质
的分子量, N为阿伏加德罗常数, f为摩擦系数,
R为气体常数, T为绝对温度, D为扩散系数 。
将上述两式代入 得
沉降速度法 Ⅵ
N
Mm r
p ?
ND
RTf ?
f
vm
s p
)1( ??
?
)1( ?v
RT
ND
N
Ms r ???
)1( ?vD
sRTM
r
?
?
此式称为 Svedberg方程, 代入各种数据可
计算出蛋白质的分子量 。
氨基酸残基的偏微分比容
氨基酸 偏微分比容 氨基酸 偏微分比容
Gly 0.64 Cys 0.61
Ala 0.74 Trp 0.74
Ser 0.63 Tyr 0.71
Thr 0.70 His 0.67
Val 0.86 Arg 0.70
Leu,Ile 0.90 Lys 0.82
Pro 0.76 Asp 0.60
Met 0.75 Glu 0.66
Phe 0.77 Gln 0.67
沉降平衡法测蛋白质 的分子量
沉降平衡法 Ⅰ
利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较
低离心转速下进行的 （ 8000～ 20000r/min）,
离心开始时, 分子颗粒发生沉降, 一段时间以
后, 沉降的结果造成了浓度梯度, 因而产生了
蛋白质分子反向扩散运动, 当反向扩散与离心
沉降达到平衡时, 浓度梯度就固定不变了 。
沉降平衡法 Ⅱ
在离心力作用下, 蛋白质颗粒的沉降速度
为 dx/dt,在此沉降速度下, 时间 t内浓度为 c的
溶液越过横截面 A的溶质量为
dt
dt
dxcAdm ?
因扩散作用沿相反方向越过横 截面 A的溶
质量为
dt
dx
dcDAmd ???
沉降平衡法 Ⅲ
当达到平衡时, 0??? mddm
dt
dx
dcDAdt
dt
dxcA ?
dx
dcD
dt
dxc ?
将 和 代入上式得
xv
f
m
dt
dx p 2)1( ????
Nf
RTD ?
dx
dc
Nf
RTxv
f
m
c p ??? 2)1( ??
x d x
c
dc
RTvNm p ?? 2)1( ??
2
2
2
1
ln
)1(
dx
cd
RTvM r ?? ??
,
,
22
ln
)1(
2
dx
cd
v
RTM
r ????
沉降平衡法 Ⅳ
积分并代入积分限得
)(
)/l n (
)1(
2
2
1
2
2
12
2 xx
cc
v
RTM
r ??? ??
式中, c1,c2是距离旋转轴心 x1,x2处的蛋白质
浓度, 通过离心机上的光学系统可以测出这
两个数据 。 将各种数据代入上式可计算出蛋
白质的分子量 。
三、蛋白质的胶体性质与
蛋白质的沉淀
蛋白质的胶体性质 Ⅰ
蛋白质溶液是一种分散系统, 蛋白质颗粒是
分散相, 水是分散介质 。 根据分散相的分散程度
可以把分散系统分为 3类：分散相质点小于 1nm的
为真溶液；大于 100nm的为悬浊液；介于 1～
100nm之间的为胶体溶液 。
蛋白质的胶体性质 Ⅱ
胶体溶液要维持稳定要满足 3个条件：质点
大小在 1～ 100nm之间；质点带有同种电荷, 互
相排斥；质点能与溶剂形成溶剂化层, 质点之
间不易聚集 。 一般情况下, 蛋白质溶液满足这
些条件 。 蛋白质溶液也和其它胶体系统一样,
具有丁达尔效应, 布朗运动以及不能透过半透
膜等性质 。
蛋白质的沉淀 Ⅰ
当破坏蛋白质溶液的稳定条件时, 蛋白质
会发生沉淀 。 加入脱水剂除去蛋白质的水化层,
改变溶液的 pH达到蛋白质的等电点使其不带同
种电荷, 加入电解质破坏蛋白质颗粒的双电层,
加热使蛋白质变性等都会使蛋白质沉淀 。
蛋白质的沉淀 Ⅱ
1,盐析法
2,有机溶剂沉淀法
3,重金属盐沉淀法
4,生物碱试剂和某些酸类沉淀法
5,加热变性沉淀
四、蛋白质分离纯化
的一般原则
1,前处理：先尽量除去不必要组织和部分, 破
碎细胞使蛋白质释放出来, 加提取液溶解出蛋
白质, 离心得到粗提液 。 也可通过差速离心得
到细胞器, 再提取 。
2,粗分级分离：沉淀法, 超滤法 。
3,纯化：运用各种方法除去杂质 。
不同离心场下沉降 的细胞组分
相对离心场 (g) 时间 (min) 沉降的组分
1,000 5 真核细胞
4,000 10 叶绿体、细胞碎片、细胞核
15,000 20 线粒体、细菌
30,000 30 溶酶体、细菌细胞碎片
100,000 3~10h 核糖体
五、蛋白质的分离纯化方法
根据分子大小不同的纯化方法
（透析和超滤）
透析 超滤
根据分子大小不同的纯化方法
（密度梯度离心）
常用于生成密度梯度
的介质是蔗糖, 聚蔗
糖 （ Ficoll）, 分离核
酸时还常用 CsCl。
根据分子大小不同的纯化方法
（凝胶过滤）
凝胶过滤的介质：目前常用的介质有交联葡
聚糖 （ Sephadex G）, 聚丙烯酰胺凝胶 （ Bio-
Gel P）, 琼脂糖 （ Sepharose或 Bio-Gel A） 等 。
它们都是化学惰性较强的凝胶珠, 内部是网孔,
不同规格的介质有不同大小的网孔, 用于分离不
同分子量范围的蛋白质 。
凝胶过滤层析的原理
凝
胶
过
滤
法
测
蛋
白
质
的
分
子
量
利用溶解度差别的纯化方法
(等电点沉淀 )
当把 pH调到目的蛋白的等电点时，目的蛋
白就会沉淀出来。这样沉淀出来的蛋白质保持
着天然构象，能重新溶解于适当 pH和一定浓度
的缓冲液中。
pH和离子强度对 β乳球蛋白
溶解度的影响
随着离子强
度的增加, 溶
解度增加 。
（ 盐溶作用 ）
在 pH5.2～ 5.4
溶解度最小 。
利用溶解度差别的纯化方法
(盐溶和盐析 )
盐溶作用主要是蛋白质分子吸附了盐离子
后, 带电层使蛋白质分子互相排斥, 而蛋白质
分子与水的相互作用增加, 因而溶解度增加 。
当盐浓度更高时，盐离子夺取蛋白质的水
化层中的水，破坏蛋白质分子的水化层，使蛋
白质分子聚集沉淀。
同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用比
单价离子更强。
在等电点时中性盐对一氧化碳
血红蛋白溶解度的影响
K2SO4
??
i
ii ZcI
2
2
1
利用溶解度差别的纯化方法
（有机溶剂分级分离法）
常用丙酮作为沉淀蛋白质的溶剂, 不同
浓度的有机溶剂可以沉淀不同种类的蛋白质,
沉淀某种蛋白质所需的有机溶剂浓度受温度,
pH,离子强度的影响 。
根据电荷不同的纯化方法
(电泳 )
带电颗粒在电场中将向与其电性相反的电
极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒在电场
中泳动时，将受到两种方向相反的力的作用。
S
UqqEF ??)( 电场力 vfF f ?)( 摩擦力
式中, q为颗粒所带的电量, E为电场强
度, U为两极间的电势差 （ V）, S为两极间的
距离 （ cm）, f为摩擦系数, v为颗粒的泳动
速度 （ cm/s） 。 其中摩擦系数与颗粒的形状,
大小及介质的粘度有关 。
根据电荷不同的纯化方法
(电泳）
当颗粒以恒定速度泳动时, 受到的电场力
与摩擦力大小相等, 方向相反 。 即
vfqE ?
f
q
E
v ?
在一定的介质中, 对于某一种蛋白质来说,
q和 f都是定值, 因此 v/E也是定值, 它被称为电
泳迁移率 。 也就是说, 对于某一种蛋白质来说,
电场越强, 泳动速度越快 。 另一方面, 不同的
蛋白质因 q和 f不同, 在同样的电场下泳动速度
不同, 经过一段时间的电泳就互相分开了 。
电泳的介质
?自由界面电泳：在溶液中进行
?区带电泳：有支持物，支持物可分为 4类。
? 滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、
聚酰胺薄膜）；
? 粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉
末与适当溶剂调和，铺板）；
? 细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，
这是一类微量电泳；
? 凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰
胺和琼脂糖。
移动界面电泳
移动界面电泳结果图
人血浆蛋白质的电泳图谱
聚丙烯酰胺凝胶电泳
以丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的
凝胶作为介质, 凝胶中有网孔, 通过改变配方
可以控制网孔的大小 。 蛋白质分子除了根据其
带电荷情况分离外, 还有分子筛效应, 使得分
辨率大大提高 。
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺
N,N’-甲叉双
丙烯酰胺 聚丙烯酰胺
电泳装置 Ⅰ
水平式和垂直式平板凝胶电泳装置
电泳装置 Ⅱ
圆盘电泳装置原理图
电泳装置 Ⅲ
毛细管电泳原理图
等电聚焦
根据蛋白质的等电点不同而把它们分开 。 介
质中形成一个 pH梯度, 不同等电点的蛋白质最后
都停留在相应 pH处 。 pH梯度的形成有固定梯度和
电泳时产生梯度两种, 后者要在介质中加两性电
解质 。
两性电解质商品名为 ampholine,它是脂肪
族多胺和多羧基类的同系物, 它们具有相近但不
相同的 pKa和 pI值 。
双向电泳
第一向 等电聚焦
第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（ 或无 SDS）
双
向
电
泳
层析聚焦
用特种多缓冲液 （ polybuffer）淋洗层析柱中
的特种多缓冲交换剂（ polybuffer exchanger），
就会在柱中产生一个由上而下的 pH梯度。随着 pH
梯度 向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗
脱下来。
离子交换层析 Ⅰ
离子交换剂的基质有纤维素, 交联葡聚糖,
琼脂糖, 交联琼脂糖等 。 离子交换基团有阳离
子和阴离子两种类型 （ 见 P310 表 7-6） 。 蛋白
质分子上具有各种阴阳离子基团, 在一定的 pH
下, 蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷, 它
们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换,
使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂
上 。
离子交换层析 Ⅱ
改变 pH和 （ 或 ） 离子强度又可将这些吸
附的蛋白质洗脱下来 。 在一定的上样和洗脱条
件下, 因不同的蛋白质分子所带的净电荷和电
荷密度不同, 分子大小也不同, 它们与离子交
换剂的结合力不同, 结合力较弱的先洗脱下来,
结合力较强的后洗脱下来, 从而达到分离的目
的 。 洗脱可分单一溶液洗脱, 阶段洗脱和梯度
洗脱, 既可以改变洗脱液的离子强度, 也可以
改变 pH,也可以两者同时改变 。
梯度混合器
K=VM / VR
利用选择性吸附的纯化方法
1,羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷
酸钙 （ Ca10(PO4)6(OH)2）, 它能吸附蛋白质,
加大离子强度可将蛋白质洗脱下来 。
2,疏水作用层析：疏水层析介质有苯基琼
脂糖, 辛基琼脂糖等, 蛋白质分子通过疏水
作用与层析介质结合, 通过能减弱疏水作用
的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来 。
利用对配体的特异生物学
亲和力的纯化方法
将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基
质上, 在适当的条件下, 将蛋白质混合物上样,
目的蛋白结合在柱中, 而杂蛋白直接流出 。 经
洗柱后, 改变洗脱液的成分, 将目的蛋白洗脱 。
（亲和层析）
亲和层析原理
高效液相层析和快速
蛋白质液相层析
分离纯化的原理与柱层析相同, 只是用
全自动的仪器操作, 它们有更高的效率, 更
高的分辨率和更快的过柱速度 。
六、蛋白质的含量测定
与纯度鉴定
蛋白质含量测定 Ⅰ
1,双缩脲法
双缩脲试剂：称取 1.5g CuSO4· 5H2O和 6g酒
石酸钾钠溶于 500ml水中, 在不断搅拌下, 加
入 300ml 10% NaOH,稀释至 1000ml。
3ml蛋白质溶液加 2ml双缩脲试剂, 540nm
比色 。
2,紫外吸收法
280nm比色, 测定后蛋白质溶液还能回收 。
蛋白质含量测定 Ⅱ
3,Folin-酚法 （ Lowry法 ）
蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸, 能与 Folin-酚
试剂起氧化还原反应, 生成蓝色化合物, 500nm
比色测定 。
Folin-酚试剂的配制比较复杂 。
4,BCA法
蛋白质还原 Cu2 +成 Cu+,与 4,4’-二羧基 -2,2’-二
喹啉 （ BCA） 形成配合物, 显紫色, 比色测定 。
蛋白质含量测定 Ⅲ
5,染料结合法
蛋白质能结合考马斯亮兰 G250,显蓝色,
595nm比色 。
染色液的配制：考马斯亮兰 G250 100mg,加
50ml 95%乙醇 （ 或甲醇 ） 和 100ml 85%磷酸, 加
水至 1000ml。
6,胶体金测定法
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体, 呈洋红
色, 遇蛋白质转变成蓝色 。
蛋白质纯度鉴定
各种层析单峰, 电泳单带, 双向电泳单点,
末端氨基酸测定一种, 溶解度曲线单转折 。
一、蛋白质的酸碱性质
二、蛋白质分子的大小与形状
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
四、蛋白质分离纯化的一般原则
五、蛋白质的分离纯化方法
六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
(Isolation,purification and characteristics of proteins)
表征：事物显露在外的征象
一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质的等电点和等离子点
对某一种蛋白质来说, 在某一 pH下, 它所
带的正电荷与负电荷刚好相等, 这个 pH叫该蛋
白质的等电点, 蛋白质的等电点受介质中盐浓
度的影响 。 在没有其它盐类干扰时, 蛋白质质
子供体解离出的质子数与质子受体接受的质子
数相等时的 pH叫该蛋白质的等离子点 。 等离子
点是蛋白质的一个特征常数 。
二、蛋白质分子的
大小与形状
根据化学组成测定最低分子量
用化学分析的方法测出蛋白质中某一物质
（ 原子 ） 或某一含量很低的氨基酸残基的含量,
并假设蛋白质分子中只有一个该物质分子或原子,
则可以计算出该蛋白质的最低分子量 。 例如, 肌
红蛋白含铁量为 0.335%,其最低分子量可按下式
算出,
1 6 7 0 0100
335.0
8.55100
335.0
????? 铁的原子量蛋白质的分子量
%335.0%100
铁的原子量蛋白质的分子量 ?
根据化学组成测定最低分子量
若蛋白质中含有 n个被测原子, 则分子量
等于最低分子量 × n,
若某蛋白质中某种氨基酸的含量特别低,
通过测定这种氨基酸的含量, 也可用此法计
算出蛋白质的分子量 。
渗
透
压
测
定
的
示
意
图
Van’t Hoff 公式
在理想溶液中, 溶液的渗透压与溶质浓度的
关系可用 Van’t Hoff公式表示,
V
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M
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n R T
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M
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V
g ????
式中 π是渗透压 （ N/m2,即 Pa）, V是溶液
的体积 （ m3）, n是溶液中溶质的摩尔数, g是溶
质的质量 （ g）, C是溶质的浓度 （ g /m3）, T是
绝 对 温 度 （ K ）, R 是 气 体 常 数
（ 8.314J/(K·mol)）, Mr为溶质的分子量或摩尔
质量 （ g /mol） 。
渗透压法测定蛋白质 的分子量
蛋白质溶液与理想溶液有较大的偏差 。 在
溶质浓度不大时, 它们的关系可用下式表示,
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当 c 趋向于 0时, RTKc 趋向于 0,但 π/c 不趋向于 0，
而是趋向于一定值 。
渗透压法测定蛋白质 的分子量
测定几个不同浓度下的渗透压, 以 π/c对 c作
图, 并外推至 c为 0时的 π/c,再代入上式求得 Mr。
为了避免溶液中其它无机离子的影响, 在溶
解度许可的范围内, 尽量采用等电点或接近于等
电点的缓冲液作膜内外的溶剂, 并增加缓冲液中
无机盐的浓度 。
沉降分析法测定蛋白质 的分子量
用沉降分析法测定蛋白质分子的相对分子量
需要超速离心机, 超速离心机的转速可以达到每
分钟 6万～ 8万转, 这样高的转速使得被离心的分
子受到的离心力达到 40万～ 70万 g。
超速离心机工作原理
制备型超速离心机
分析型超速离心机
被离心分子的受力情况分析
沉降速度法 Ⅰ
在离心场中蛋白质分子颗粒发生沉降时, 它将受
到三种力的作用,
xmF pc 2)( ??离心力
xvmxVF ppb 22)( ???? ??浮力
dt
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f ??)( 摩擦力
离心力减去浮力为分子颗粒受到的净离心力,
)1(222 ????? vxmxvmxmFF pppbc ?????
沉降速度法 Ⅱ
fFFF bc ??
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当分子颗粒以恒定速度移动时, 净离心力
与摩擦力大小相等, 方向相反,
即
整理得
等号左边为单位离心场的沉降速度，右边为定
值，可见单位离心场的沉降速度是一个定值。将此
定值称为沉降系数（ sedimentation coefficient），
用 s（小写）表示。
沉降速度法 Ⅲ
dt
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是 logx对 t作图所得直线的斜率, 因此测得
在 t1,t2,t3,… 时间相应的 x1,x2,x3,…, 作图求出斜
率, 代入上式即可求出沉降系数 s,沉降系数的单
位是秒 。
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沉降速度法 Ⅳ
蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数
介于 1× 10－ 13到 200× 10－ 13秒之间。为了使用方
便，以 10－ 13秒为一个沉降系数的单位，称为斯维
得贝格单位（ Svedberg unit），或称沉降系数单
位，用 S （大写）表示。如人血红蛋白的 s为
4.46× 10－ 13秒，即 4.46S。
沉降速度法 Ⅴ
?
?
?
?
?
?
?
?
?
)(
)(
,,20
,20,
,,20
btpw
wpbt
btw ss
???
???
由于测定时温度和溶剂性质对 s值都有影响,
需要校正成标准条件下的 s值, 这样才便于比较 。
标准条件是 20℃, 溶剂是水 。 标准条件下的 s值记
为 。 校正公式如下,
由于蛋白质浓度增加, 分子间可能彼此干扰,
使得 s值减小 。 为排除因蛋白质浓度造成的测定误
差, 可测出一系列在不同浓度蛋白质溶液中的 s值,
然后外推至浓度为 0时的 。
? ws,20
ws,20
蛋白质分子颗粒的质量, 爱因斯
坦－萨德兰德方程,。 式中 Mr 是蛋白质
的分子量, N为阿伏加德罗常数, f为摩擦系数,
R为气体常数, T为绝对温度, D为扩散系数 。
将上述两式代入 得
沉降速度法 Ⅵ
N
Mm r
p ?
ND
RTf ?
f
vm
s p
)1( ??
?
)1( ?v
RT
ND
N
Ms r ???
)1( ?vD
sRTM
r
?
?
此式称为 Svedberg方程, 代入各种数据可
计算出蛋白质的分子量 。
氨基酸残基的偏微分比容
氨基酸 偏微分比容 氨基酸 偏微分比容
Gly 0.64 Cys 0.61
Ala 0.74 Trp 0.74
Ser 0.63 Tyr 0.71
Thr 0.70 His 0.67
Val 0.86 Arg 0.70
Leu,Ile 0.90 Lys 0.82
Pro 0.76 Asp 0.60
Met 0.75 Glu 0.66
Phe 0.77 Gln 0.67
沉降平衡法测蛋白质 的分子量
沉降平衡法 Ⅰ
利用沉降平衡法测蛋白质的分子量是在较
低离心转速下进行的 （ 8000～ 20000r/min）,
离心开始时, 分子颗粒发生沉降, 一段时间以
后, 沉降的结果造成了浓度梯度, 因而产生了
蛋白质分子反向扩散运动, 当反向扩散与离心
沉降达到平衡时, 浓度梯度就固定不变了 。
沉降平衡法 Ⅱ
在离心力作用下, 蛋白质颗粒的沉降速度
为 dx/dt,在此沉降速度下, 时间 t内浓度为 c的
溶液越过横截面 A的溶质量为
dt
dt
dxcAdm ?
因扩散作用沿相反方向越过横 截面 A的溶
质量为
dt
dx
dcDAmd ???
沉降平衡法 Ⅲ
当达到平衡时, 0??? mddm
dt
dx
dcDAdt
dt
dxcA ?
dx
dcD
dt
dxc ?
将 和 代入上式得
xv
f
m
dt
dx p 2)1( ????
Nf
RTD ?
dx
dc
Nf
RTxv
f
m
c p ??? 2)1( ??
x d x
c
dc
RTvNm p ?? 2)1( ??
2
2
2
1
ln
)1(
dx
cd
RTvM r ?? ??
,
,
22
ln
)1(
2
dx
cd
v
RTM
r ????
沉降平衡法 Ⅳ
积分并代入积分限得
)(
)/l n (
)1(
2
2
1
2
2
12
2 xx
cc
v
RTM
r ??? ??
式中, c1,c2是距离旋转轴心 x1,x2处的蛋白质
浓度, 通过离心机上的光学系统可以测出这
两个数据 。 将各种数据代入上式可计算出蛋
白质的分子量 。
三、蛋白质的胶体性质与
蛋白质的沉淀
蛋白质的胶体性质 Ⅰ
蛋白质溶液是一种分散系统, 蛋白质颗粒是
分散相, 水是分散介质 。 根据分散相的分散程度
可以把分散系统分为 3类：分散相质点小于 1nm的
为真溶液；大于 100nm的为悬浊液；介于 1～
100nm之间的为胶体溶液 。
蛋白质的胶体性质 Ⅱ
胶体溶液要维持稳定要满足 3个条件：质点
大小在 1～ 100nm之间；质点带有同种电荷, 互
相排斥；质点能与溶剂形成溶剂化层, 质点之
间不易聚集 。 一般情况下, 蛋白质溶液满足这
些条件 。 蛋白质溶液也和其它胶体系统一样,
具有丁达尔效应, 布朗运动以及不能透过半透
膜等性质 。
蛋白质的沉淀 Ⅰ
当破坏蛋白质溶液的稳定条件时, 蛋白质
会发生沉淀 。 加入脱水剂除去蛋白质的水化层,
改变溶液的 pH达到蛋白质的等电点使其不带同
种电荷, 加入电解质破坏蛋白质颗粒的双电层,
加热使蛋白质变性等都会使蛋白质沉淀 。
蛋白质的沉淀 Ⅱ
1,盐析法
2,有机溶剂沉淀法
3,重金属盐沉淀法
4,生物碱试剂和某些酸类沉淀法
5,加热变性沉淀
四、蛋白质分离纯化
的一般原则
1,前处理：先尽量除去不必要组织和部分, 破
碎细胞使蛋白质释放出来, 加提取液溶解出蛋
白质, 离心得到粗提液 。 也可通过差速离心得
到细胞器, 再提取 。
2,粗分级分离：沉淀法, 超滤法 。
3,纯化：运用各种方法除去杂质 。
不同离心场下沉降 的细胞组分
相对离心场 (g) 时间 (min) 沉降的组分
1,000 5 真核细胞
4,000 10 叶绿体、细胞碎片、细胞核
15,000 20 线粒体、细菌
30,000 30 溶酶体、细菌细胞碎片
100,000 3~10h 核糖体
五、蛋白质的分离纯化方法
根据分子大小不同的纯化方法
（透析和超滤）
透析 超滤
根据分子大小不同的纯化方法
（密度梯度离心）
常用于生成密度梯度
的介质是蔗糖, 聚蔗
糖 （ Ficoll）, 分离核
酸时还常用 CsCl。
根据分子大小不同的纯化方法
（凝胶过滤）
凝胶过滤的介质：目前常用的介质有交联葡
聚糖 （ Sephadex G）, 聚丙烯酰胺凝胶 （ Bio-
Gel P）, 琼脂糖 （ Sepharose或 Bio-Gel A） 等 。
它们都是化学惰性较强的凝胶珠, 内部是网孔,
不同规格的介质有不同大小的网孔, 用于分离不
同分子量范围的蛋白质 。
凝胶过滤层析的原理
凝
胶
过
滤
法
测
蛋
白
质
的
分
子
量
利用溶解度差别的纯化方法
(等电点沉淀 )
当把 pH调到目的蛋白的等电点时，目的蛋
白就会沉淀出来。这样沉淀出来的蛋白质保持
着天然构象，能重新溶解于适当 pH和一定浓度
的缓冲液中。
pH和离子强度对 β乳球蛋白
溶解度的影响
随着离子强
度的增加, 溶
解度增加 。
（ 盐溶作用 ）
在 pH5.2～ 5.4
溶解度最小 。
利用溶解度差别的纯化方法
(盐溶和盐析 )
盐溶作用主要是蛋白质分子吸附了盐离子
后, 带电层使蛋白质分子互相排斥, 而蛋白质
分子与水的相互作用增加, 因而溶解度增加 。
当盐浓度更高时，盐离子夺取蛋白质的水
化层中的水，破坏蛋白质分子的水化层，使蛋
白质分子聚集沉淀。
同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用比
单价离子更强。
在等电点时中性盐对一氧化碳
血红蛋白溶解度的影响
K2SO4
??
i
ii ZcI
2
2
1
利用溶解度差别的纯化方法
（有机溶剂分级分离法）
常用丙酮作为沉淀蛋白质的溶剂, 不同
浓度的有机溶剂可以沉淀不同种类的蛋白质,
沉淀某种蛋白质所需的有机溶剂浓度受温度,
pH,离子强度的影响 。
根据电荷不同的纯化方法
(电泳 )
带电颗粒在电场中将向与其电性相反的电
极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒在电场
中泳动时，将受到两种方向相反的力的作用。
S
UqqEF ??)( 电场力 vfF f ?)( 摩擦力
式中, q为颗粒所带的电量, E为电场强
度, U为两极间的电势差 （ V）, S为两极间的
距离 （ cm）, f为摩擦系数, v为颗粒的泳动
速度 （ cm/s） 。 其中摩擦系数与颗粒的形状,
大小及介质的粘度有关 。
根据电荷不同的纯化方法
(电泳）
当颗粒以恒定速度泳动时, 受到的电场力
与摩擦力大小相等, 方向相反 。 即
vfqE ?
f
q
E
v ?
在一定的介质中, 对于某一种蛋白质来说,
q和 f都是定值, 因此 v/E也是定值, 它被称为电
泳迁移率 。 也就是说, 对于某一种蛋白质来说,
电场越强, 泳动速度越快 。 另一方面, 不同的
蛋白质因 q和 f不同, 在同样的电场下泳动速度
不同, 经过一段时间的电泳就互相分开了 。
电泳的介质
?自由界面电泳：在溶液中进行
?区带电泳：有支持物，支持物可分为 4类。
? 滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维素薄膜、
聚酰胺薄膜）；
? 粉末电泳（淀粉、纤维素粉、硅胶粉，粉
末与适当溶剂调和，铺板）；
? 细丝电泳，如尼龙丝和其它人造丝电泳，
这是一类微量电泳；
? 凝胶电泳，最常用的支持介质是聚丙烯酰
胺和琼脂糖。
移动界面电泳
移动界面电泳结果图
人血浆蛋白质的电泳图谱
聚丙烯酰胺凝胶电泳
以丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成的
凝胶作为介质, 凝胶中有网孔, 通过改变配方
可以控制网孔的大小 。 蛋白质分子除了根据其
带电荷情况分离外, 还有分子筛效应, 使得分
辨率大大提高 。
聚丙烯酰胺凝胶
丙烯酰胺
N,N’-甲叉双
丙烯酰胺 聚丙烯酰胺
电泳装置 Ⅰ
水平式和垂直式平板凝胶电泳装置
电泳装置 Ⅱ
圆盘电泳装置原理图
电泳装置 Ⅲ
毛细管电泳原理图
等电聚焦
根据蛋白质的等电点不同而把它们分开 。 介
质中形成一个 pH梯度, 不同等电点的蛋白质最后
都停留在相应 pH处 。 pH梯度的形成有固定梯度和
电泳时产生梯度两种, 后者要在介质中加两性电
解质 。
两性电解质商品名为 ampholine,它是脂肪
族多胺和多羧基类的同系物, 它们具有相近但不
相同的 pKa和 pI值 。
双向电泳
第一向 等电聚焦
第二向 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（ 或无 SDS）
双
向
电
泳
层析聚焦
用特种多缓冲液 （ polybuffer）淋洗层析柱中
的特种多缓冲交换剂（ polybuffer exchanger），
就会在柱中产生一个由上而下的 pH梯度。随着 pH
梯度 向下移动，达到等电点的蛋白质将顺序被洗
脱下来。
离子交换层析 Ⅰ
离子交换剂的基质有纤维素, 交联葡聚糖,
琼脂糖, 交联琼脂糖等 。 离子交换基团有阳离
子和阴离子两种类型 （ 见 P310 表 7-6） 。 蛋白
质分子上具有各种阴阳离子基团, 在一定的 pH
下, 蛋白质分子带有净正电荷或净负电荷, 它
们可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换,
使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂
上 。
离子交换层析 Ⅱ
改变 pH和 （ 或 ） 离子强度又可将这些吸
附的蛋白质洗脱下来 。 在一定的上样和洗脱条
件下, 因不同的蛋白质分子所带的净电荷和电
荷密度不同, 分子大小也不同, 它们与离子交
换剂的结合力不同, 结合力较弱的先洗脱下来,
结合力较强的后洗脱下来, 从而达到分离的目
的 。 洗脱可分单一溶液洗脱, 阶段洗脱和梯度
洗脱, 既可以改变洗脱液的离子强度, 也可以
改变 pH,也可以两者同时改变 。
梯度混合器
K=VM / VR
利用选择性吸附的纯化方法
1,羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷
酸钙 （ Ca10(PO4)6(OH)2）, 它能吸附蛋白质,
加大离子强度可将蛋白质洗脱下来 。
2,疏水作用层析：疏水层析介质有苯基琼
脂糖, 辛基琼脂糖等, 蛋白质分子通过疏水
作用与层析介质结合, 通过能减弱疏水作用
的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来 。
利用对配体的特异生物学
亲和力的纯化方法
将能与目的蛋白特异结合的配体偶联到基
质上, 在适当的条件下, 将蛋白质混合物上样,
目的蛋白结合在柱中, 而杂蛋白直接流出 。 经
洗柱后, 改变洗脱液的成分, 将目的蛋白洗脱 。
（亲和层析）
亲和层析原理
高效液相层析和快速
蛋白质液相层析
分离纯化的原理与柱层析相同, 只是用
全自动的仪器操作, 它们有更高的效率, 更
高的分辨率和更快的过柱速度 。
六、蛋白质的含量测定
与纯度鉴定
蛋白质含量测定 Ⅰ
1,双缩脲法
双缩脲试剂：称取 1.5g CuSO4· 5H2O和 6g酒
石酸钾钠溶于 500ml水中, 在不断搅拌下, 加
入 300ml 10% NaOH,稀释至 1000ml。
3ml蛋白质溶液加 2ml双缩脲试剂, 540nm
比色 。
2,紫外吸收法
280nm比色, 测定后蛋白质溶液还能回收 。
蛋白质含量测定 Ⅱ
3,Folin-酚法 （ Lowry法 ）
蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸, 能与 Folin-酚
试剂起氧化还原反应, 生成蓝色化合物, 500nm
比色测定 。
Folin-酚试剂的配制比较复杂 。
4,BCA法
蛋白质还原 Cu2 +成 Cu+,与 4,4’-二羧基 -2,2’-二
喹啉 （ BCA） 形成配合物, 显紫色, 比色测定 。
蛋白质含量测定 Ⅲ
5,染料结合法
蛋白质能结合考马斯亮兰 G250,显蓝色,
595nm比色 。
染色液的配制：考马斯亮兰 G250 100mg,加
50ml 95%乙醇 （ 或甲醇 ） 和 100ml 85%磷酸, 加
水至 1000ml。
6,胶体金测定法
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体, 呈洋红
色, 遇蛋白质转变成蓝色 。
蛋白质纯度鉴定
各种层析单峰, 电泳单带, 双向电泳单点,
末端氨基酸测定一种, 溶解度曲线单转折 。
