第 4章 蛋白质的共价结构
一、蛋白质通论
二、肽
三、蛋白质一级结构的测定
四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能
五、肽和蛋白质的人工合成
一、蛋白质通论
蛋白质的化学组成
碳 50% 氢 7%
氧 23% 氮 16%
硫 0～ 3%
其它（ P,Fe,Cu,I,Zn,
Mo,Mn,Ca等）
定氮法测定蛋白质含量
氮为蛋白质的特征元素, 将提取并纯
化的蛋白质用凯氏定氮法测定氮的含量,
然后通过下列公式可以计算蛋白质的含量,
蛋白质含量（ mg/ml） = 蛋白氮（ mg/ml） × 6.25
（或 = 蛋白氮（ mg/ml） ÷ 16%）
蛋白质的分类 Ⅰ
仅由氨基酸缩合而成, 不含其它成分
的 蛋 白 质 叫 单 纯 蛋 白 质 （ simple
protein） ；还含有其它成分的蛋白质叫缀
合蛋白质 （ conjugated protein）, 缀合
蛋 白 质 中 的 非 蛋 白 质 成 分 叫 配 体
（ ligand）, 有些配体与蛋白质通过共价
键结合, 有些通过非共价键结合 。
蛋白质的分类 Ⅱ
蛋白质还可以,
按溶解性质分类 （ 见 P158表 4-1）
按所含配体种类分类 （ 见 P158表 4-2）
按生物学功能分类 （ 见 P158表 4-3）
蛋白质的形状
纤维状蛋白质 球状蛋白质 膜结合蛋白质
蛋白质的大小 Ⅰ
蛋白质 Mr 残基数目 /链 亚基组织方式
细胞色素 c（马） 12500 104 α1
己糖激酶（酵母） 96000 200 α4
胰岛素 5733 21（ A） 30（ B） αβ
血红蛋白（人） 64500 141（ α） 146（ β） α2β2
糜蛋白酶（牛胰） 22600
13（ α）
132（ β）
97（ γ）
αβγ
蛋白质的大小 Ⅱ
蛋白质的分子量很大，并且分布范围
也很大，一般在大约 6000～ 1× 106道尔顿。
蛋白质的分子量主要由组成蛋白质的氨基
酸残基的数目决定，对于缀合蛋白质来说，
有些配体也在蛋白质的分子量中占有很大
的比重。蛋白质的分子量范围是人为规定
的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。
蛋白质氨基酸残基数的估计
对于简单蛋白质, 用 110除它的相对分子量
即可约略估计出其氨基酸残基数目 。
20种常见氨基酸的平均分子量为 138
组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为 128
每个氨基酸残基的平均分子量为 110
蛋白质结构的组织层次
?一级结构指的是多肽链的氨基酸序列
?二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规
律的、局部的结构
?三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、
折叠成具有特定走向的紧密球状构象
?四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚
基间不同的排列方式会形成不同的构象。
蛋白质的一级结构
Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu
｜ ｜ ———— ——— S— S
N端 C端
蛋
白
质
的
二
级
结
构
蛋白质的三级结构
蛋白质的四级结构
蛋白质的一级结构
决定高级结构
在肽链内或肽链间有时也有 两个半胱
氨酸之间形成二硫键的连接。
蛋白质功能的多样性
1．催化； 2．调节；
3．转运； 4．贮存；
5．运动； 6．结构成分；
7．支架作用； 8．防御和进攻；
9．异常功能。
二、肽
肽的命名 Ⅰ
肽是两个至数百个氨基酸之间由肽键连接而成
的线状聚合物。根据形成肽的氨基酸数目，一般氨
基酸数目在 12个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；
13个至 20个时称为寡肽（ oligopeptide）； 20个以
上称为多肽（ polypeptide）。当分子量大到一定程
度时，就称为蛋白质。这些名称完全是人为规定的，
其间的界限并不严格。
肽链中的氨基酸因缺少了一分子水，叫做氨基
酸残基。
肽的两端
一条肽链是有方向性的, 肽链的一
端具有游离的 α －氨基, 称其为 N端；
另一端具有游离的 α －羧基, 称其为 C
端 。 有少数小分子量的肽, 其首尾也缩
合成肽键, 成为环肽 。
肽的命名 Ⅱ
对于小分子量的肽的命名, 是从其 N端开始,
称为某氨酰某氨酰某氨酰 …… 某氨基酸, 下例写成
Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu,左边是 N端, 右边是 C端 。
肽基的 C,O和 N原子间
的共振相互作用
肽键共振的结果 Ⅰ
① 限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨
基酸残基只保留两个自由度。
② 组成肽基的 4 个原子和 2个相邻的 Cα 原子倾
向于共平面，形成所谓的多肽主链的酰胺平面
（ amide plane）或称肽平面（ peptide plane）
肽键共振的结果 Ⅱ
③ C－ N 键的长度为 0.133nm,比正常的 C－ N
单键 （ 0.145nm） 短, 但 比 典 型 的 C=N 键
（ 0.125nm） 长 。 估计肽基中的 C－ N 键具有约
40%的双键性质, 而 C=O 键具有 40%的单键性质,
在室温下足以防止 C－ N 键旋转 。
④ 杂化的中间态酰胺带有 0.28个净正电荷, 羰
基带有 0.28个净负电荷, 肽键具有永久偶极 。
肽基的顺、反构型
肽平面内, 两个 Cα 可以处于顺式或反式构
型 。 因为顺式构型两个 R基有空间位阻, 所以反
式构型比顺式构型稳定, 因此肽链中肽键都是反
式构型 。
肽平面
脯氨酸的亚氨基形成的肽键
肽的物理化学性质 Ⅰ
?由于 短肽晶体的熔点都很高, 说明短肽的晶体
是离子晶格, 在水溶液中以偶极离子存在 。
?在 pH0～ 14范围内, 肽键中的酰胺氢不解离,
所以肽的酸碱性主要决定于肽链末端的 α－羧基,
α－氨基以及 R基团上的可解离基团 。
?因为肽链末端的 α－羧基和 α－氨基相距很远,
它们之间的静电引力较弱, 所以它们的酸碱性比
氨基酸的 α－羧基和 α－氨基弱 。 R基上可解离基
团的解离常数也有所变化 。
?在某一 pH下, 肽中各可解离基团解离得到的净
电荷为 0,这个 pH就是该肽的等电点 。
肽的物理化学性质 Ⅱ
?肽的化学反应和氨基酸的一致 。 N端的氨基酸
残基也可以与茚三酮反应, 这一反应可用于肽的
定性和定量测定 。
?双缩脲反应是肽和蛋白质特有的, 氨基酸没有
此反应 。 一般含有两个或两个以上肽键的化合物
与 CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应, 生成紫
红色或蓝紫色的复合物, 利用这个反应可以用分
光光度法 （ 540nm） 测定蛋白质的含量 。
双缩脲与肽的结构比较
三、蛋白质一级结构的测定
蛋白质测序的策略 Ⅰ
?首先要得到较纯的蛋白质样品, 纯度应
在 97%以上 。
?测出它的分子量 。
?分析蛋白质中是否有非肽成分 。
?测定蛋白质分子中的多肽链的数目 。
?拆分多肽链 。
?测定肽链的氨基酸组成 。
?鉴定肽链的 C末端氨基酸及 N末端氨基酸 。
蛋白质测序的策略 Ⅱ
?酶水解肽链成短的肽段 。 采用两套以上
的酶水解方法, 得到互相重叠的肽段 。 分
离纯化这些肽段, 并鉴定各肽段的 C末端
氨基酸及 N末端氨基酸 。
?测定各肽段的序列 。
?确定天冬酰胺, 谷氨酰胺以及链内或链
间二硫键的位置 。
?拼出完整肽链的序列 。
N末端 分析 Ⅰ
?二硝基氟苯法 （ DNFB法 ）,用 DNFB（ Sanger
试剂 ） 与肽链 N末端的氨基反应, 生成 DNP－多
肽或 DNP－蛋白质 。 然后水解肽链, 分离得到
DNP－氨基酸, 纸层析, 薄层层析或 HPLC分离
鉴定 。
?丹磺酰氯法 （ DNS法 ）,与 DNFB法类似, 由于
丹磺酰氯有强烈荧光, 灵敏度比 DNFB法高 100
倍 。
N末端 分析 Ⅱ
?苯异硫氰酸酯法 （ Edman降解法 ）,肽链与 PITC
（ Edman试剂 ） 反应生成 PTC－多肽 （ 苯氨基硫甲
酰多肽 ） 或 PTC－蛋白质, 在酸性有机溶剂中加热
时, N末端的 PTC－氨基酸发生环化, 生成苯乙内
酰硫脲的衍生物 （ PTH－氨基酸 ） 并从肽链上脱落
下来, 除去 N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整
的 。 分离 PTH－氨基酸并鉴定 。 肽链可用于鉴定下
一个氨基酸, 所以此法可以用于测序 。
?氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析 N
末端氨基酸 。 值得注意是不同的 N末端氨基酸水解
的速度不同, 有时难以分析 。
C末端 分析 Ⅰ
?肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解 。
反应中除 C末端氨基酸以游离形式存在外, 其它氨
基酸都转变成相应的氨基酸酰肼 。 反应中生成的
氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯
基衍生物而沉淀 。 上清液中游离的 C末端氨基酸借
助 DNFB法或 DNS法鉴定 。 肼解过程中, 天冬酰胺,
谷氨酰胺, 半胱氨酸被破坏不易测出, 精氨酸转
变成鸟氨酸 。
肼解法反应式
C末端 分析 Ⅱ
?还原法：肽链 C末端的氨基酸可用硼氢化
锂还原成相应的 α －氨基醇, 层析法鉴定 。
C末端 分析 Ⅲ
?羧肽酶法：目前常用的有 4种羧肽酶,A,B,C
和 Y。 羧肽酶 A能释放除 Pro,Arg和 Lys之外的任
何一种 C末端氨基酸；羧肽酶 B只能水解以碱性氨
基酸 Arg和 Lys为 C末端的氨基酸；羧肽酶 Y可以释
放任何一种 C末端氨基酸 。
二硫桥的断裂
先加 8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍使
蛋白质变性, 再用氧化法或还原法断裂
二硫键 。 还原法产生的巯基要用烷基试
剂如碘乙酸保护起来, 以免重新形成二
硫键 。
还原法断裂二硫桥
氧化法断裂二硫桥
过甲酸
氨基酸组成的分析
?酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸, 碱
水解分析色氨酸 。
?为了准确分析酸水解中被部分破坏的 Ser、
Thr,Tyr,Cys的量, 酸水解 24,48,72小
时后, 分析这些氨基酸的量, 然后外推至 0时
得到这些氨基酸不被破坏时的量 。
?分析酸水解液中 NH3的量, 得出有多少个
Asn + Gln。
?氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚
三酮染色，比色定量。
氨基酸分析仪示意图
氨
基
酸
分
析
仪
示
意
图
长柱用于分离酸性
和中性氨基酸,
短柱用于分离碱性
氨基酸和氨
柱中填料为细粒聚苯乙烯
磺酸型阳离子交换树脂
氨基酸的离子交换柱层析图谱
多肽链的部分裂解
?酶裂解法：胰蛋白酶, 糜蛋白酶 （ 胰凝乳蛋白
酶 ）, 嗜热菌蛋白酶, 胃蛋白酶, 木瓜蛋白酶,
葡萄球菌蛋白酶, 梭菌蛋白酶等, 它们各自有自
己的水解专一性 。 蛋白酶分为内肽酶和外肽酶
（ 羧肽酶, 氨肽酶 ） 。
?化学裂解法：溴化氰 （ 只裂解由甲硫氨酸的羧
基形成的肽键 ）, 羟胺 （ 裂解 Asn-Gly之间的肽
键, 也能部分裂解 Asn-Leu及 Asn-Ala之间的肽
键 ） 。
蛋白酶的专一性
溴化氰裂解法
肽段的分离纯化
凝胶过滤
凝胶电泳
高效液相色谱
氨基酸序列测定 Ⅰ
?质谱法：两台质谱仪联用, 第一台质谱仪通
过电喷射电离使肽段带上电荷, 将不同大小的
肽段分离 。 第二台质谱仪分析肽段的序列 。 在
第二台质谱仪上, 小肽段在碰撞池中与氮气分
子或氩气分子碰撞, 碎裂成依次少一个氨基酸
残基的碎片, 分析这些碎片的质量差, 可得出
序列 。
串联质谱仪
串联质谱测序工作原理
氨基酸序列测定 Ⅱ
?Edman降解法：由 N端向 C端逐步降解 。 先将
被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上, 便于
分离切下的氨基酸和剩余的肽段 。
?酶降解法：用外肽酶逐个切下氨基酸分析 。 只
能分析很少的几个氨基酸 。
?根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基
因, 从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序
列 。
肽段在多肽链中次序的决定
二硫桥位置的确定 Ⅰ
在保留二硫桥的情况下对蛋白质部分水解,
利用对角线电泳可以鉴定出哪些肽段带有二硫
桥 。 对角线电泳是双向电泳, 把水解后的肽段
混合物点到滤纸的中央, 第一向将肽段按大小
和带电荷情况分离, 然后把滤纸暴露的过甲酸
蒸气中, 使二硫桥断裂, 再在同样的条件下进
行第二向电泳 。
对角线电泳
二硫桥位置的确定 Ⅱ
二硫桥连接的两个肽段在第一向时是一个
斑点, 第二向时成了两个斑点, 并离开对角线 。
对这两个斑点相对应的肽段进行测序, 如果两
个肽段中各只有一个 Cys,它们就是参与二硫
桥的 Cys。 根据这两个肽 段的序列, 可知它们
在整个肽链中的位置 。
酰胺位置的确定
对肽链进行各种部分水解,
直到测得一个肽段中只有 1个天冬
酰胺或谷氨酰胺为止 。
四、蛋白质的氨基酸序列
与生物功能
同源蛋白质
在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白
质称为同源蛋白质, 例如各种脊椎动物体内的血
红蛋白就属于同源蛋白质 。 同源蛋白质的氨基酸
序列具有明显的相似性, 这种序列上的相似性叫
做同源性 。 同源蛋白质中有许多氨基酸残基是相
同的, 称为不变残基, 而在不同物种的同源蛋白
质中发生了变化的氨基酸残基称为可变残基 。
亲缘关系越近的同源蛋白质的同源性越强 。
细胞色素 C
细胞色素 C是一种含血红素的蛋白质, 在
线粒体中起电子传递的作用 。 大多数细胞色
素 C含一百零几个氨基酸残基, 40多个物种的
细胞色素 C氨基酸序列分析表明, 有 28个残基
是不变的, 所有细胞色素 C在第 17位上都是一
个 Cys残基, 这个残基是血红素结合的部位 。
细胞色素 C的不变残基
不同物种细胞色素 C的差异残基数
黑猩猩 绵羊 响尾蛇 鲤鱼 蜗牛 天蛾 酵母 花椰菜 欧防风
人 0 10 14 18 29 31 44 44 43
黑猩猩 10 14 18 29 31 44 44 43
绵羊 20 11 24 27 44 46 46
响尾蛇 26 28 33 47 45 43
鲤鱼 26 26 44 47 46
蜗牛 28 48 51 50
天蛾 44 44 41
酵母 47 47
花椰菜 13
根
据
细
胞
色
素C
建
立
的
系
统
树
哺乳类
鸟和爬虫类
硬骨鱼类 软骨鱼类
真菌
昆虫
两栖类
植物
氧合血红素蛋白质
肌肉中的氧合血红素蛋白质 —— 肌红蛋白由
一条肽链组成, 含 153个氨基酸残基, 红细胞中
的血红蛋白是一个由两条 α 链 （ 每条 141个氨基
酸残基 ）, 两条 β 链 （ 每条 146个氨基酸残基 ）
组成的四聚体蛋白 。 肌红蛋白, 血红蛋白的 α 链
和 β 链都是珠蛋白 （ globin）, 它们有很高的序
列同源性, 通过血红素结合氧的能力都被这 3种
多肽链保留下来了 。
氧合血红素蛋白的进化树
丝氨酸蛋白酶类
胰蛋白酶, 胰凝乳蛋白酶, 弹性蛋白酶,
凝血酶以及纤溶酶都是丝氨酸蛋白酶, 它们有
足够的序列同源性, 在它们的活性中心都有丝
氨酸, 说明它们可能是由祖先丝氨酸蛋白酶进
化而来 。
生物活性和来源差异
很大的蛋白质
卵清中的溶菌酶 （ 含 129个残基, 水解细菌
细胞壁的多糖成分 ） 和人乳汁中的 α -乳清蛋白
（ 含 123个残基, 调节乳糖合成 ） 功能和来源都
很不相同, 但它们有 48个残基是相同的, 三级结
构也很相似, 说明它们具有共同的蛋白质祖先 。
五、肽和蛋白质的人工合成
肽的人工合成
（氨基的保护）
最广泛应用的氨基保护基是苄氧甲酰基,
它可以用催化加氢或用金属钠在液氨中处理
去除 。 其它可以用作氨基保护基的还有三苯
甲基, 叔丁氧甲酰基, 对甲苯磺酰基等, 这
些基团可以用 HBr/CH3COOH在室温下除去 。
肽的人工合成
（羧基的保护）
羧基一般用盐或酯的形式保护 。 盐是
对羧基临时性的保护 。 酯有甲酯, 乙酯,
苄酯和叔丁酯等 。 甲酯和乙酯可用皂化法
除去, 但易引起消旋 。 苄酯可用 H2/Pd法或
金属钠－液氨法除去 。 叔丁酯可在温和条
件下用酸除去 。
肽的人工合成
（ 侧链 上活泼基团的保护）
侧链上需要保护的的活泼 基团有,Asp
和 Glu的 β和 γ羧基, Ser,Thr和 Tyr的羟基,
Cys的巯基, Lys的 ε氨基, Arg的胍基等 。
这些保护基团有苄基, 对甲苯磺 酰基, 甲
基等 。
各种保护基团
羧基的叠氮法活化
羧基的活化酯法活化
羧基的混合酸酐法活化
氯甲酸乙酯
碳二亚胺缩合剂
缩合剂催化的肽键形成
固相肽合成
将待合成肽链 C端的第一个氨基酸
的羧基连接到氯甲基聚苯乙烯树脂上,
然后向 N端方向依次将后续的氨基酸缩
合上去 。 此法便于自动化操作 。
固
相
肽
合
成
图Ⅰ
固
相
肽
合
成
图Ⅱ
一、蛋白质通论
二、肽
三、蛋白质一级结构的测定
四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能
五、肽和蛋白质的人工合成
一、蛋白质通论
蛋白质的化学组成
碳 50% 氢 7%
氧 23% 氮 16%
硫 0～ 3%
其它（ P,Fe,Cu,I,Zn,
Mo,Mn,Ca等）
定氮法测定蛋白质含量
氮为蛋白质的特征元素, 将提取并纯
化的蛋白质用凯氏定氮法测定氮的含量,
然后通过下列公式可以计算蛋白质的含量,
蛋白质含量（ mg/ml） = 蛋白氮（ mg/ml） × 6.25
（或 = 蛋白氮（ mg/ml） ÷ 16%）
蛋白质的分类 Ⅰ
仅由氨基酸缩合而成, 不含其它成分
的 蛋 白 质 叫 单 纯 蛋 白 质 （ simple
protein） ；还含有其它成分的蛋白质叫缀
合蛋白质 （ conjugated protein）, 缀合
蛋 白 质 中 的 非 蛋 白 质 成 分 叫 配 体
（ ligand）, 有些配体与蛋白质通过共价
键结合, 有些通过非共价键结合 。
蛋白质的分类 Ⅱ
蛋白质还可以,
按溶解性质分类 （ 见 P158表 4-1）
按所含配体种类分类 （ 见 P158表 4-2）
按生物学功能分类 （ 见 P158表 4-3）
蛋白质的形状
纤维状蛋白质 球状蛋白质 膜结合蛋白质
蛋白质的大小 Ⅰ
蛋白质 Mr 残基数目 /链 亚基组织方式
细胞色素 c（马） 12500 104 α1
己糖激酶（酵母） 96000 200 α4
胰岛素 5733 21（ A） 30（ B） αβ
血红蛋白（人） 64500 141（ α） 146（ β） α2β2
糜蛋白酶（牛胰） 22600
13（ α）
132（ β）
97（ γ）
αβγ
蛋白质的大小 Ⅱ
蛋白质的分子量很大，并且分布范围
也很大，一般在大约 6000～ 1× 106道尔顿。
蛋白质的分子量主要由组成蛋白质的氨基
酸残基的数目决定，对于缀合蛋白质来说，
有些配体也在蛋白质的分子量中占有很大
的比重。蛋白质的分子量范围是人为规定
的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。
蛋白质氨基酸残基数的估计
对于简单蛋白质, 用 110除它的相对分子量
即可约略估计出其氨基酸残基数目 。
20种常见氨基酸的平均分子量为 138
组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为 128
每个氨基酸残基的平均分子量为 110
蛋白质结构的组织层次
?一级结构指的是多肽链的氨基酸序列
?二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规
律的、局部的结构
?三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、
折叠成具有特定走向的紧密球状构象
?四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚
基间不同的排列方式会形成不同的构象。
蛋白质的一级结构
Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu
｜ ｜ ———— ——— S— S
N端 C端
蛋
白
质
的
二
级
结
构
蛋白质的三级结构
蛋白质的四级结构
蛋白质的一级结构
决定高级结构
在肽链内或肽链间有时也有 两个半胱
氨酸之间形成二硫键的连接。
蛋白质功能的多样性
1．催化； 2．调节；
3．转运； 4．贮存；
5．运动； 6．结构成分；
7．支架作用； 8．防御和进攻；
9．异常功能。
二、肽
肽的命名 Ⅰ
肽是两个至数百个氨基酸之间由肽键连接而成
的线状聚合物。根据形成肽的氨基酸数目，一般氨
基酸数目在 12个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；
13个至 20个时称为寡肽（ oligopeptide）； 20个以
上称为多肽（ polypeptide）。当分子量大到一定程
度时，就称为蛋白质。这些名称完全是人为规定的，
其间的界限并不严格。
肽链中的氨基酸因缺少了一分子水，叫做氨基
酸残基。
肽的两端
一条肽链是有方向性的, 肽链的一
端具有游离的 α －氨基, 称其为 N端；
另一端具有游离的 α －羧基, 称其为 C
端 。 有少数小分子量的肽, 其首尾也缩
合成肽键, 成为环肽 。
肽的命名 Ⅱ
对于小分子量的肽的命名, 是从其 N端开始,
称为某氨酰某氨酰某氨酰 …… 某氨基酸, 下例写成
Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu,左边是 N端, 右边是 C端 。
肽基的 C,O和 N原子间
的共振相互作用
肽键共振的结果 Ⅰ
① 限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨
基酸残基只保留两个自由度。
② 组成肽基的 4 个原子和 2个相邻的 Cα 原子倾
向于共平面，形成所谓的多肽主链的酰胺平面
（ amide plane）或称肽平面（ peptide plane）
肽键共振的结果 Ⅱ
③ C－ N 键的长度为 0.133nm,比正常的 C－ N
单键 （ 0.145nm） 短, 但 比 典 型 的 C=N 键
（ 0.125nm） 长 。 估计肽基中的 C－ N 键具有约
40%的双键性质, 而 C=O 键具有 40%的单键性质,
在室温下足以防止 C－ N 键旋转 。
④ 杂化的中间态酰胺带有 0.28个净正电荷, 羰
基带有 0.28个净负电荷, 肽键具有永久偶极 。
肽基的顺、反构型
肽平面内, 两个 Cα 可以处于顺式或反式构
型 。 因为顺式构型两个 R基有空间位阻, 所以反
式构型比顺式构型稳定, 因此肽链中肽键都是反
式构型 。
肽平面
脯氨酸的亚氨基形成的肽键
肽的物理化学性质 Ⅰ
?由于 短肽晶体的熔点都很高, 说明短肽的晶体
是离子晶格, 在水溶液中以偶极离子存在 。
?在 pH0～ 14范围内, 肽键中的酰胺氢不解离,
所以肽的酸碱性主要决定于肽链末端的 α－羧基,
α－氨基以及 R基团上的可解离基团 。
?因为肽链末端的 α－羧基和 α－氨基相距很远,
它们之间的静电引力较弱, 所以它们的酸碱性比
氨基酸的 α－羧基和 α－氨基弱 。 R基上可解离基
团的解离常数也有所变化 。
?在某一 pH下, 肽中各可解离基团解离得到的净
电荷为 0,这个 pH就是该肽的等电点 。
肽的物理化学性质 Ⅱ
?肽的化学反应和氨基酸的一致 。 N端的氨基酸
残基也可以与茚三酮反应, 这一反应可用于肽的
定性和定量测定 。
?双缩脲反应是肽和蛋白质特有的, 氨基酸没有
此反应 。 一般含有两个或两个以上肽键的化合物
与 CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应, 生成紫
红色或蓝紫色的复合物, 利用这个反应可以用分
光光度法 （ 540nm） 测定蛋白质的含量 。
双缩脲与肽的结构比较
三、蛋白质一级结构的测定
蛋白质测序的策略 Ⅰ
?首先要得到较纯的蛋白质样品, 纯度应
在 97%以上 。
?测出它的分子量 。
?分析蛋白质中是否有非肽成分 。
?测定蛋白质分子中的多肽链的数目 。
?拆分多肽链 。
?测定肽链的氨基酸组成 。
?鉴定肽链的 C末端氨基酸及 N末端氨基酸 。
蛋白质测序的策略 Ⅱ
?酶水解肽链成短的肽段 。 采用两套以上
的酶水解方法, 得到互相重叠的肽段 。 分
离纯化这些肽段, 并鉴定各肽段的 C末端
氨基酸及 N末端氨基酸 。
?测定各肽段的序列 。
?确定天冬酰胺, 谷氨酰胺以及链内或链
间二硫键的位置 。
?拼出完整肽链的序列 。
N末端 分析 Ⅰ
?二硝基氟苯法 （ DNFB法 ）,用 DNFB（ Sanger
试剂 ） 与肽链 N末端的氨基反应, 生成 DNP－多
肽或 DNP－蛋白质 。 然后水解肽链, 分离得到
DNP－氨基酸, 纸层析, 薄层层析或 HPLC分离
鉴定 。
?丹磺酰氯法 （ DNS法 ）,与 DNFB法类似, 由于
丹磺酰氯有强烈荧光, 灵敏度比 DNFB法高 100
倍 。
N末端 分析 Ⅱ
?苯异硫氰酸酯法 （ Edman降解法 ）,肽链与 PITC
（ Edman试剂 ） 反应生成 PTC－多肽 （ 苯氨基硫甲
酰多肽 ） 或 PTC－蛋白质, 在酸性有机溶剂中加热
时, N末端的 PTC－氨基酸发生环化, 生成苯乙内
酰硫脲的衍生物 （ PTH－氨基酸 ） 并从肽链上脱落
下来, 除去 N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整
的 。 分离 PTH－氨基酸并鉴定 。 肽链可用于鉴定下
一个氨基酸, 所以此法可以用于测序 。
?氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析 N
末端氨基酸 。 值得注意是不同的 N末端氨基酸水解
的速度不同, 有时难以分析 。
C末端 分析 Ⅰ
?肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解 。
反应中除 C末端氨基酸以游离形式存在外, 其它氨
基酸都转变成相应的氨基酸酰肼 。 反应中生成的
氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯
基衍生物而沉淀 。 上清液中游离的 C末端氨基酸借
助 DNFB法或 DNS法鉴定 。 肼解过程中, 天冬酰胺,
谷氨酰胺, 半胱氨酸被破坏不易测出, 精氨酸转
变成鸟氨酸 。
肼解法反应式
C末端 分析 Ⅱ
?还原法：肽链 C末端的氨基酸可用硼氢化
锂还原成相应的 α －氨基醇, 层析法鉴定 。
C末端 分析 Ⅲ
?羧肽酶法：目前常用的有 4种羧肽酶,A,B,C
和 Y。 羧肽酶 A能释放除 Pro,Arg和 Lys之外的任
何一种 C末端氨基酸；羧肽酶 B只能水解以碱性氨
基酸 Arg和 Lys为 C末端的氨基酸；羧肽酶 Y可以释
放任何一种 C末端氨基酸 。
二硫桥的断裂
先加 8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍使
蛋白质变性, 再用氧化法或还原法断裂
二硫键 。 还原法产生的巯基要用烷基试
剂如碘乙酸保护起来, 以免重新形成二
硫键 。
还原法断裂二硫桥
氧化法断裂二硫桥
过甲酸
氨基酸组成的分析
?酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸, 碱
水解分析色氨酸 。
?为了准确分析酸水解中被部分破坏的 Ser、
Thr,Tyr,Cys的量, 酸水解 24,48,72小
时后, 分析这些氨基酸的量, 然后外推至 0时
得到这些氨基酸不被破坏时的量 。
?分析酸水解液中 NH3的量, 得出有多少个
Asn + Gln。
?氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚
三酮染色，比色定量。
氨基酸分析仪示意图
氨
基
酸
分
析
仪
示
意
图
长柱用于分离酸性
和中性氨基酸,
短柱用于分离碱性
氨基酸和氨
柱中填料为细粒聚苯乙烯
磺酸型阳离子交换树脂
氨基酸的离子交换柱层析图谱
多肽链的部分裂解
?酶裂解法：胰蛋白酶, 糜蛋白酶 （ 胰凝乳蛋白
酶 ）, 嗜热菌蛋白酶, 胃蛋白酶, 木瓜蛋白酶,
葡萄球菌蛋白酶, 梭菌蛋白酶等, 它们各自有自
己的水解专一性 。 蛋白酶分为内肽酶和外肽酶
（ 羧肽酶, 氨肽酶 ） 。
?化学裂解法：溴化氰 （ 只裂解由甲硫氨酸的羧
基形成的肽键 ）, 羟胺 （ 裂解 Asn-Gly之间的肽
键, 也能部分裂解 Asn-Leu及 Asn-Ala之间的肽
键 ） 。
蛋白酶的专一性
溴化氰裂解法
肽段的分离纯化
凝胶过滤
凝胶电泳
高效液相色谱
氨基酸序列测定 Ⅰ
?质谱法：两台质谱仪联用, 第一台质谱仪通
过电喷射电离使肽段带上电荷, 将不同大小的
肽段分离 。 第二台质谱仪分析肽段的序列 。 在
第二台质谱仪上, 小肽段在碰撞池中与氮气分
子或氩气分子碰撞, 碎裂成依次少一个氨基酸
残基的碎片, 分析这些碎片的质量差, 可得出
序列 。
串联质谱仪
串联质谱测序工作原理
氨基酸序列测定 Ⅱ
?Edman降解法：由 N端向 C端逐步降解 。 先将
被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上, 便于
分离切下的氨基酸和剩余的肽段 。
?酶降解法：用外肽酶逐个切下氨基酸分析 。 只
能分析很少的几个氨基酸 。
?根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基
因, 从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序
列 。
肽段在多肽链中次序的决定
二硫桥位置的确定 Ⅰ
在保留二硫桥的情况下对蛋白质部分水解,
利用对角线电泳可以鉴定出哪些肽段带有二硫
桥 。 对角线电泳是双向电泳, 把水解后的肽段
混合物点到滤纸的中央, 第一向将肽段按大小
和带电荷情况分离, 然后把滤纸暴露的过甲酸
蒸气中, 使二硫桥断裂, 再在同样的条件下进
行第二向电泳 。
对角线电泳
二硫桥位置的确定 Ⅱ
二硫桥连接的两个肽段在第一向时是一个
斑点, 第二向时成了两个斑点, 并离开对角线 。
对这两个斑点相对应的肽段进行测序, 如果两
个肽段中各只有一个 Cys,它们就是参与二硫
桥的 Cys。 根据这两个肽 段的序列, 可知它们
在整个肽链中的位置 。
酰胺位置的确定
对肽链进行各种部分水解,
直到测得一个肽段中只有 1个天冬
酰胺或谷氨酰胺为止 。
四、蛋白质的氨基酸序列
与生物功能
同源蛋白质
在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白
质称为同源蛋白质, 例如各种脊椎动物体内的血
红蛋白就属于同源蛋白质 。 同源蛋白质的氨基酸
序列具有明显的相似性, 这种序列上的相似性叫
做同源性 。 同源蛋白质中有许多氨基酸残基是相
同的, 称为不变残基, 而在不同物种的同源蛋白
质中发生了变化的氨基酸残基称为可变残基 。
亲缘关系越近的同源蛋白质的同源性越强 。
细胞色素 C
细胞色素 C是一种含血红素的蛋白质, 在
线粒体中起电子传递的作用 。 大多数细胞色
素 C含一百零几个氨基酸残基, 40多个物种的
细胞色素 C氨基酸序列分析表明, 有 28个残基
是不变的, 所有细胞色素 C在第 17位上都是一
个 Cys残基, 这个残基是血红素结合的部位 。
细胞色素 C的不变残基
不同物种细胞色素 C的差异残基数
黑猩猩 绵羊 响尾蛇 鲤鱼 蜗牛 天蛾 酵母 花椰菜 欧防风
人 0 10 14 18 29 31 44 44 43
黑猩猩 10 14 18 29 31 44 44 43
绵羊 20 11 24 27 44 46 46
响尾蛇 26 28 33 47 45 43
鲤鱼 26 26 44 47 46
蜗牛 28 48 51 50
天蛾 44 44 41
酵母 47 47
花椰菜 13
根
据
细
胞
色
素C
建
立
的
系
统
树
哺乳类
鸟和爬虫类
硬骨鱼类 软骨鱼类
真菌
昆虫
两栖类
植物
氧合血红素蛋白质
肌肉中的氧合血红素蛋白质 —— 肌红蛋白由
一条肽链组成, 含 153个氨基酸残基, 红细胞中
的血红蛋白是一个由两条 α 链 （ 每条 141个氨基
酸残基 ）, 两条 β 链 （ 每条 146个氨基酸残基 ）
组成的四聚体蛋白 。 肌红蛋白, 血红蛋白的 α 链
和 β 链都是珠蛋白 （ globin）, 它们有很高的序
列同源性, 通过血红素结合氧的能力都被这 3种
多肽链保留下来了 。
氧合血红素蛋白的进化树
丝氨酸蛋白酶类
胰蛋白酶, 胰凝乳蛋白酶, 弹性蛋白酶,
凝血酶以及纤溶酶都是丝氨酸蛋白酶, 它们有
足够的序列同源性, 在它们的活性中心都有丝
氨酸, 说明它们可能是由祖先丝氨酸蛋白酶进
化而来 。
生物活性和来源差异
很大的蛋白质
卵清中的溶菌酶 （ 含 129个残基, 水解细菌
细胞壁的多糖成分 ） 和人乳汁中的 α -乳清蛋白
（ 含 123个残基, 调节乳糖合成 ） 功能和来源都
很不相同, 但它们有 48个残基是相同的, 三级结
构也很相似, 说明它们具有共同的蛋白质祖先 。
五、肽和蛋白质的人工合成
肽的人工合成
（氨基的保护）
最广泛应用的氨基保护基是苄氧甲酰基,
它可以用催化加氢或用金属钠在液氨中处理
去除 。 其它可以用作氨基保护基的还有三苯
甲基, 叔丁氧甲酰基, 对甲苯磺酰基等, 这
些基团可以用 HBr/CH3COOH在室温下除去 。
肽的人工合成
（羧基的保护）
羧基一般用盐或酯的形式保护 。 盐是
对羧基临时性的保护 。 酯有甲酯, 乙酯,
苄酯和叔丁酯等 。 甲酯和乙酯可用皂化法
除去, 但易引起消旋 。 苄酯可用 H2/Pd法或
金属钠－液氨法除去 。 叔丁酯可在温和条
件下用酸除去 。
肽的人工合成
（ 侧链 上活泼基团的保护）
侧链上需要保护的的活泼 基团有,Asp
和 Glu的 β和 γ羧基, Ser,Thr和 Tyr的羟基,
Cys的巯基, Lys的 ε氨基, Arg的胍基等 。
这些保护基团有苄基, 对甲苯磺 酰基, 甲
基等 。
各种保护基团
羧基的叠氮法活化
羧基的活化酯法活化
羧基的混合酸酐法活化
氯甲酸乙酯
碳二亚胺缩合剂
缩合剂催化的肽键形成
固相肽合成
将待合成肽链 C端的第一个氨基酸
的羧基连接到氯甲基聚苯乙烯树脂上,
然后向 N端方向依次将后续的氨基酸缩
合上去 。 此法便于自动化操作 。
固
相
肽
合
成
图Ⅰ
固
相
肽
合
成
图Ⅱ
