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第三章 高效液相色谱法
第一节 概 述
高效液相色谱法是继气相色谱之后,70年代初期发展起
来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起
来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同
点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的 效率 和实
现了 自动化 操作。经典的液相色谱法,流动相在常压下输
送,所用的固定相柱效低,分析周期长。而现代液相色谱法
引用了气相色谱的理论,流动相改为高压输送(最高输送压
力可达 4.9?107Pa) ;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料
填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数
可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可
对流
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第一节 概 述
出物进行连续检测。因此,高效液相色谱具有分析速度快、
分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、
高效或现代液相色谱法。
二、液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样,液相色谱分离系统也由两相 —— 固定
相和流动相组成。 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键
合固定相(或在惰性载体表面涂上一层液膜)、离子交换树
脂或多孔性凝胶;流动相是各种溶剂 。被分离混合物由流动
相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的
吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异
进行分离。色谱分离的实质是样品分子(以下称溶质)与溶
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第一节 概 述
剂(即流动相或洗脱液)以及固定相分子间的作用,作用力
的大小,决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同,液相色谱可分为:液固吸附色谱、
液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻
色谱等类型。
三、液相色谱与气相色谱的比较
液相色谱所用基本概念:保留值、塔板数、塔板高度、
分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论:
塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相
色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相,而液体和
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第一节 概 述
气体的性质不相同;此外,液相色谱所用的仪器设备和操作
条件也与气相色谱不同,所以,液相色谱与气相色谱有一定
差别,主要有以下几方面,
( 1)应用范围不同
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物
质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离
子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受
到一定程度的限制,据统计只有大约 20%的有机物能用气
相色谱分析 ;而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限
制,它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感
的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析,大约 占有机物
5
第一节 概 述
的 70 ~ 80%。
( 2)液相色谱能完成难度较高的分离工作
因为,
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的,不参与分配平衡
过程,与样品分子无亲和作用,样品分子只与固定相相
互作用。 而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样
品分子,为提高选择性增加了一个因素 。也可选用不同
比例的两种或两种以上的液体作流动相,增大分离的选
择性。
②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色谱。
6
第一节 概 述
等,作为分析时选择余地大;而气相色谱并不可能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作,较低的温度,一般有利
于色谱分离条件的选择。
( 3)由于液体的扩散性比气体的小 105倍,因此,溶质在液
相中的传质速率慢,柱外效应就显得特别重要;而在
气相色谱中,柱外区域扩张可以忽略不计。
( 4)液相色谱中制备样品简单,回收样品也比较容易,而
且回收是定量的,适合于大量制备。但液相色谱尚缺
乏通用的检测器,仪器比较复杂,价格昂贵。在实际
应用中,这两种色谱技术是互相补充的。
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第一节 概 述
综上所述,高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分
析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法
已成为现代分析技术的重要手段之一,目前在化学、化工、
医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。
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第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系
统、检测系统、记录系统 等五大部分组成(图 14-2)。
分析前,选择适当的色谱柱和流动相,开泵,冲洗柱子,
待柱子达到平衡而且基线平直后,用微量注射器把样品注入
进样口,流动相把试样带入色谱柱进行分离,分离后的组分
依次流入检测器的流通池,最后和洗脱液一起排入流出物收
集器。当有样品组分流过流通池时,检测器把组分浓度转变
成电信号,经过放大,用记录器记录下来就得到色谱图。色
谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
一、高压输液系统
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置
和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑
料制成,容量为 1到 2 L,用来贮存足够数量、符合要求的流
动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部
件之一,其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连
续不断地送入液路系统,使样品在色谱柱中完成分离过程 。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细,所填固定相粒度很小,
因此,对流动相的阻力较大,为了使流动相能较快地流过
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第二节 高效液相色谱仪
色谱柱,就需要高压泵注入流动相。
对泵的要求:输出压力高、流量范围大、流量恒定、无
脉动,流量精度和重复性为 0.5%左右。此外,还应耐腐蚀,
密封性好。
高压输液泵,按其性质可分为 恒压泵 和 恒流泵 两大类。
恒流泵是能给出恒定流量的泵,其流量与流动相粘度和
柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定,而流量随外界阻力变化而
变化,如果系统阻力不发生变化,恒压泵就能提供恒定的流
量。
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第二节 高效液相色谱仪
3,梯度洗脱装置
梯度洗脱 就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性
的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例,从而使流动相
的强度、极性,pH值或离子强度相应地变化,达到提高分离
效果,缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类,
一类是 外梯度装置 (又称低压梯度),流动相在常温常
压下混合,用高压泵压至柱系统,仅需一台泵即可。
另一类是 内梯度装置 (又称高压梯度),将两种溶剂分
别用泵增压后,按电器部件设置的程序,注入梯度混合室混
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第二节 高效液相色谱仪
合,再输至柱系统。
梯度洗脱的实质 是通过不断地变化流动相的强度,来调
整混合样品中各组分的 k值,使所有谱带都以最佳平均 k值通
过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的
程序升温,所不同的是,在梯度洗脱中溶质 k值的变化是通
过溶质的极性,pH值和离子强度来实现的,而不是借改变温
度(温度程序)来达到。
二、进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样阀等,它的作用是
把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
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第二节 高效液相色谱仪
三、分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱
柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为 2 ~ 6mm,柱长
为 10 ~50cm,柱形多为直形,内部充满微粒固定相。柱温一
般为室温或接近室温。
四、检测器
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求
是,灵敏度高,重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温
度和流量的变化不敏感等 。
在液相色谱中,有两种类型的检测器,一类是 溶质性检
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第二节 高效液相色谱仪
测器,它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属
于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等;另一类是
总体检测器,它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。
属于此类检测器有示差折光检测器等。
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第三节 高效液相色谱的固定相
和流动相
一、固定相
高效液相色谱固定相 以承受高压能力 来分类,可分为 刚
性固体和硬胶 两大类。
刚性固体以 二氧化硅 为基质,可承受 7.0?108~1.0?109Pa
的高压,可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二
氧化硅表面键合各种官能团,可扩大应用范围,它是目前最
广泛使用的一种固定相。
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中,它由 聚苯乙
烯与二乙烯苯基交联而成 。可承受压力上限为 3.5?108Pa。 固
定相按 孔隙深度 分类,可分为表面多孔型和全多孔型固定相
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第三节 高效液相色谱的固定相
和流动相
两类。
1,表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球, 在玻璃球外面覆盖一层多孔活
性材料, 如硅胶, 氧化硅, 离子交换剂, 分子筛, 聚酰胺等 。
这类固定相的多孔层厚度小, 孔浅, 相对死体积小, 出峰迅
速, 柱效亦高;颗粒较大, 渗透性好, 装柱容易, 梯度淋洗
时能迅速达到平衡, 较适合做常规分析 。 由于多孔层厚度薄,
最大允许量受到限制 。
2,全多孔型固定相
由直径为 10nm的硅胶微粒凝聚而成 。 这类固定相由于颗
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第三节 高效液相色谱的固定相
和流动相
粒很细( 5~10?m),孔仍然较浅,传质速率快,易实现高
效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
二、流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体,它对组分有亲合力,
并参与固定相对组分的竞争,因此,正确选择流动相直接影
响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是,
( 1)溶剂对于待测样品,必须具有合适的极性和良好的选
择性。
( 2)溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器,应注意选
用检测器波长比 溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
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第三节 高效液相色谱的固定相
和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时,
溶剂对此辐射产生强烈吸收,此时溶剂被看作是光学不
透明的,它严重干扰组分的吸收测量。
对于折光率检测器,要求选择与组分折光率有较
大差别的溶剂作流动相,以达到最高灵敏度。
( 3)高纯度
由于高效液相色谱灵敏度高,对流动相溶剂的纯度也
要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳,或产生“伪
峰”。
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第三节 高效液相色谱的固定相
和流动相
( 4)化学稳定性好
( 5)低粘度(粘度适中)
若使用高粘度溶剂,势必增高压力,不利于分离。常
用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等;但粘度过低
的溶剂也不宜采用,例如戊烷和乙醚等,它们容易在
色谱柱或检测器内形成气泡,影响分离。
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第四节 液 — 固色谱法
液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的
固体颗粒物质,位于其表面的原子、离子或分子的性质是多
少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因
缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此,表层一般处于较高的能
级,存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此,液
固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分
离,故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力,主要取决于吸附剂的比表面积
和理化性质,试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分
与吸附剂的性质相似时,易被吸附,呈现高的保留值;当组
分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时,
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第四节 液 — 固色谱法
易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段;
不同的官能团具有不同的吸附能,因此,吸附色谱可按族分
离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性(即对分子量的选
择性小),不能用该法分离分子量不同的化合物。
一、液固色谱法固定相
液固色谱法采用的固体吸附剂按其 性质 可分为 极性和非
极性 两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅
酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。
极性吸附剂可进一步分为 酸性吸附剂和碱性吸附剂 。酸
性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等,碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液 — 固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱,如脂肪胺和芳香胺。
碱性吸附剂则适于分离酸性溶质,如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中,最常用的吸附剂是硅胶,其次是氧化铝 。
在现代液相色谱中,硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相,还
可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。
三、液 -固吸附色谱流动相
液相色谱的流动相必须符合下列要求,
( 1)能溶解样品,但不能与样品发生反应。
( 2)与固定相不互溶,也不发生不可逆反应。
( 3)粘度要尽可能小,这样才能有较高的渗透性和柱效。
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第四节 液 — 固色谱法
( 4)应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时,溶
剂要不吸收紫外光。
( 5)容易精制、纯化、毒性小,不易着火、价格尽量便宜
等。
在液 -固色谱中,选择流动相的 基本原则 是 极性大的试
样用极性较强的流动相,极性小的则用低极性流动相 。
为了获得合适的溶剂极性,常采用两种、三种或更多种
不同极性的溶剂混合起来使用,如果样品组分的分配比 k值
范围很广则使用梯度洗脱。
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第五节 液液色谱法
液液色谱又称液液分配色谱。
在液液色谱中,一个液相作为流动相,而另一个液相则
涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相
应互不相溶,两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程
与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相
类似。
以气液分配色谱法一样,这种分配平衡的总结果导致各
组分的 差速迁移,从而实现分离。分配系数( K) 或分配比
( k)小的组分,保留值小,先流出柱。然而与气相色谱法
不同的是,流动相的种类对分配系数有较大的影响。
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第五节 液液色谱法
一、固定相
液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有
下列几类,
( 1)表面多孔型载体(薄壳型微珠载体),由直径为 30 ~
40?m的实心玻璃球和厚度约为 1 ~ 2 ?m的多孔性外层所组
成。
( 2)全多孔型载体,由硅胶、硅藻土等材料制成,直径 30
~ 50 ?m的多孔型颗粒。
( 3)全多孔型微粒载体,由 nm级的硅胶微粒堆积而成,又
称堆积硅珠。这种载体粒度为 5 ~ 10 ?m。 由于颗粒小,
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第五节 液液色谱法
所以柱效高,是目前使用最广泛的一种载体。
由于液相色谱中,流动相参与选择作用,流动相极性的
微小变化,都会使组分的保留值出现较大的差异。因此,液
相色谱中,只需几种不同极性的固定液即可。 如 ?,?? — 氧
二丙腈( ODPN),聚乙二醇( PEG),十八烷( ODS) 和
角鲨烷固定液等。
二、流动相
在液液色谱中,除一般要求外,还要求流动相对固定相
的溶解度尽可能小,因此固定液和流动相的性质往往处于两
个极端,例如当选择固定液是极性物质时,所选用的流动相
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第五节 液液色谱法
通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。
以极性物质作为固定相,非极性溶剂作流动相的液液色
谱,称为 正相分配色谱,适合于分离极性化合物;
反之,如选用非极性物质为固定相,而极性溶剂为流动
相的液液色谱称为 反相分配色谱,这种色谱方法适合于分离
芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。
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第六节 化学键合相色谱
将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与
固定液不互溶的溶剂作流动相,但在色谱过程中固定液仍会
有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击,固定相会
不断流失,即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱
前加一个前置柱,使流动相先通过前置柱,再进入色谱柱,
但仍难以完全避免固定液的流失。
70年代初发展了一种新型的固定相 —化学键合固定相。
这种固定相是 通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅
胶(载体)表面的游离羟基上,代替机械涂渍的液体固定相。
这不仅避免了液体固定相流失的困扰,还大大改善了固定相
的功能,提高了分离的选择性,化学键合色谱适用于分离几
29
第六节 化合键合色谱法
乎所有类型的化合物。
根据键合相与流动相之间相对极性的强弱,可将键合相
色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱 。在极性键合
相色谱中,由于流动相的极性比固定相极性要小,所以极性
键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱,
也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合
色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。
一、化学键合固定相法
化学键合固定相一般都采用硅胶(薄壳型或全多孔微粒
型)为基体。在键合反应之前,要对硅胶进行酸洗、中和,
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第六节 化合键合色谱法
干燥活化等处理,然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机
物或有机硅化合物起反应,制备化学键合固定相。键合相可
分为四种键型,
( 1)硅酸酯型( =Si-O-C=) 键合相
将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应,在硅胶表面形
成( =Si-O-C=) 键合相。反应生成单分子层键合相。一般
用极性小的溶剂洗脱,分离极性化合物。
( 2)硅氮型( =Si-N=) 键合相
如果用 SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素(氯化),
再与各种有机胺反应,可以得到各种不同极性基因的键合相。
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第六节 化合键合色谱法
可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。
( 3)硅碳型( =Si-C=) 键合相
将硅胶表面氯化后,使 Si-Cl键转化为 Si-C键。在这类固
定相中,有机基团直接键合在硅胶表面上。
( 4)硅氧烷型( =Si-O-Si-C=) 键合相
将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合
相具有相当的耐热性和化学稳定性,是目前应用最为广泛的
键合相。
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第六节 化合键合色谱法
二、反相键合相色谱法
在反相色谱中,一般采用非极性键合固定相,如硅胶 -
C18H37(简称 O D S或 C18)硅胶 -苯基等,用强极性的溶剂为
流动相,如甲醇 /水,乙腈 /水,水和无机盐的缓冲液等。
目前,对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法,大
致有两种观点:一种认为属于分配色谱,另一种认为属于吸
附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂(水 +有机溶剂)
中极性弱的有机溶剂吸附于 非极性烷基配合 基表面,组分分
子在流动相中与被 非极性烷基配合 基 所吸附的液相中进行分
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第六节 化合键合色谱法
配。
吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相,看作是
在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”,这
种“分子毛”有强的 疏水特性 。当用水与有机溶剂所组成的
极性溶剂为流动相来分离有机化合物时,一方面,非极性组
分分子或组分分子的非极性部分,由于疏溶剂的作用,将会
从水中被“挤”出来,与固定相上的疏水烷基之间产生缔合
作用。另一方面,被分离物的极性部分受到极性流动相的作
用,使它离开固定相,减少保留值,此即解缔过程。显然,
这两种作用力之差,决定了分子在色谱中的保留行为。
一般地,固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分
34
第六节 化合键合色谱法
的表面积越大,或者流动相表面张力及介电常数越大,则缔
合作用越强,分配比也越大,保留值越大。
在反相键合相色谱中,极性大的组分先流出,极性小的
组分后流出。
三、正相键合色谱法
在正相色谱中,一般采用极性键合固定相,硅胶表面键
合的是极性的有机基团,键合相的名称由键合上去的基团而
定 。最常用的有氰基( -C N),氨基( -NH2)、二醇基
( DIOL) 键合相。 流动相一般用比键合相极性小的非极性
或弱极性有机溶剂,如烃类溶剂,或其中加入一定量的极性
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第六节 化合键合色谱法
溶剂(如氯仿、醇、乙腈等),以调节流动相的洗脱强度。
通常用于分离极性化合物。
一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分
配比 K值,随其极性的增加而增大,但随流动相中极性调节
剂的极性增大(或浓度增大)而降低。同时,极性键合相的
极性越大,组分的保留值越大。
该法主要用于分离异构体,极性不同的化合物,特别是
用来分离不同类型的化合物。
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第六节 化合键合色谱法
四、离子性键合相色谱法
当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质化学各种离子
交换基团如 -SO3H,-CH2NH2,-COOH,-CH2N(CH3)Cl
等时,形成了所谓的离子性键合色谱。其分离原理与
离子交换色谱一样,只是填料是一种新型的离子交换
剂而已。
化学键合色谱具有下列优点,
( 1)适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制
化学键合反应,可以把不同的有机基团键合到硅胶表
面上,从而大大提高了分离的选择性;另一方面可以
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第六节 化合键合色谱法
通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、
极性和离子型化合物。
( 2)由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失,这不仅
解决了由于固定液流失所带来的困扰,还特别适合于梯
度洗脱,为复杂体系的分离创造了条件。
( 3)键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好
的化学稳定性和热稳定性。
( 4)固定相柱效高,使用寿命长,分析重现性好。
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第七节 离子交换色谱法
离子交换色谱以离子交换树脂为固定相,树脂上具有固
定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生
成的离子通过固定相时,组分离子与树脂上可交换的离子基
团进行可逆交换,根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分
离。
一、固定相
离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用
的离子交换树脂分为三种形式,一是常见的纯离子交换树脂;
第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层
离子交换树脂;第三种为大孔径网络型树脂 。
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第七节 离子交换色谱法
典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而
成。其中,二乙烯苯起到交联和加牢整个结构的作用,其含
量决定了树脂交联度的大小。交联度一般控制在 4 ~ 16%范
围内,高度交联的树脂较硬而且脆,但选择性较好。在基体
网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离子基团。
按结合的基团不同,离子交换树脂可分为阳离子交换树
脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂上具有与阳离子交换的基团。 阳离子交
换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂 。强酸性阳离子交换树
脂所带的基团为 -SO3-H+,其中 -SO3-和有机聚合物牢固结合
形成固定部分,H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子。
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第七节 离子交换色谱法
阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。 阴离
子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。
二、流动相
离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液,有时也使
用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用,以提高特
殊的选择性,并改善样品的溶解度。
41
第八节 排阻色谱法
排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法,是一
种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的色谱柱的 填料是凝胶,它是一种表面惰性,
含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴仅允
许直径小于孔开度的组分分子进入,这些孔对于流动相分子
来说是相当大的,以致流动相分子可以自由地扩散出入。对
不同大小的组分分子,可分别渗入到凝胶孔内的不同深度,
大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内,但进不了小孔甚
至于完全被排斥。小个的组分分子,大孔小孔都可以渗入,
甚至进入很深,一时不易洗脱出来。因此,大的组分分子在
色谱柱中停留时间较短,很快被洗脱出来,它的洗脱体积很
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第八节 排阻色谱法
小,小的组分分子在色谱柱中停留时间较长,洗脱体积较大,
直到所有孔内的最小分子到达柱出口,完成按分子大小而分
离的洗脱过程。
尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级,即用来分析
大分子物质相对分子质量的分布。
排阻色谱的固定相一般可分为 软性、半刚性和刚性凝
胶 三类。
所谓凝胶,指含有大量液体(一般是水)的柔软而富有
弹性的物质,它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚
体。
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第八节 排阻色谱法
( 1) 软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的
交联结构,其微孔能吸入大量的溶剂,并能溶涨到它
干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相,一般用
于小分子质量物质的分析,不适宜在高效液相色谱中。
( 2) 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作
流动相。
( 3) 刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等,它们既可用水溶
性溶剂,又可用有机溶剂作流动相,可在较高压强和
较高流速下操作。
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第九节 色谱分离方法的选择
要正确地选择色谱分离方法,首先必须尽可能多的 了解
样品的有关性质,其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及
其应用范围 。
选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量
的大小,在水中和有机溶剂中的溶解度,极性和稳定程度以
及化学结构等物理、化学性质。
一、相对分子质量
对于相对分子质量较低(一般在 200以下),挥发性比
较好,加热又不易分解的样品,可以选择气相色谱法进行分
析。相对分子质量在 200 ~ 2000的化合物,可用液固吸附、
液 -液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于 2000,则
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第九节 色谱分离方法的选择
可用空间排阻色谱法。
二、溶解度
水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法;
微溶于水,但在酸或碱存在下能很好电离的化合物,也可用
离子交换色谱法;油溶性样品或相对非极性的混合物,可用
液 -固色谱法。
三、化学结构
若样品中包含离子型或可离子化的化合物,或者能与离
子型化合物相互作用的化合物(例如配位体及有机螯合剂),
可首先考虑用离子交换色谱,但空间排阻和液液分配色谱也
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第九节 色谱分离方法的选择
都能顺利地应用于离子化合物;异构体的分离可用液固色谱
法;具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法;
对于高分子聚合物,可用空间排阻色谱法。
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色谱法基本要求
1,掌握色谱法的分类,色谱流出曲线及有关术语;
2,掌握色谱法的基本理论,了解柱效的影响因素;
3,掌握分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间之间
关系;
4,了解定性、定量分析方法;
5,掌握气相色谱流程及气相色谱仪的结构;
6,掌握气相色谱固定相的特性;
7,掌握检测器性能指标的描述方法;
8,掌握液相色谱仪的基本结构及基本概念;
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色谱法基本要求
9,了解液相色谱法的主要类型及固定相、流动相的选择。
10.了解色谱方法选择。