Enzyme Engineering
酶工程
第七章 酶的定向进化与稳定性探究
? 第一节 定向进化简介
? 第二节 定向进化的应用
? 第三节 蛋白质的稳定性
? 第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理
第一节 定向进化简介
? 一．理论来源
? 二．概念
? 三．定向进化的选择策略
? 四．杂合酶
一．理论来源
? 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生
物进化过程
– 化学进化
– 生物进化
二．概念
? 酶分子改造
– 化学修饰，定点突变
? 定向进化
定向进化示意图
随机突变 +定向选择＝目标突变体
细菌
诱发突变的
因素
50 0C培养
突变体库 选择压力（温度） 温度耐受型突
变体
最适生长温度为
370C
最适生长温度提高了！
Strategies for the development of effective enzymes
定向进化
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解
酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的
进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基
因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并
定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
澄清一个事实：定向进化 不是 定点突变
? 定向进化：突变 筛选
突变位点是随机的，不确定的；
突变位点的数目也是不确定的；
突变的效应更是不可预知的；
理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的,
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
? 定点突变,
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；
突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；
定点突变的方法一般是以 PCR技术为基础的。
三．定向进化的选择策略
– 关键突变和筛选
– 突变 ——采用回交法
– 筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和 X
光片消化分析
DNA shuffling
体
外
定
向
进
化
Increasing the ee-value of the lipase-
catalyed hydrolysis of the chiral ester
2%
31%
57%
75%
81%
0%
0 1 2 3 4
mutant generations
%ee
成功实例
Lipase genes (lipB52,lipB68) isolated from Pseudomonas
fluorescens B52,B68
Genbank Accssion number AY623009,AY694785
成功实例
Lipase gene (lipB52） expressed in Pichia pastoris KM71
Zhengbing Jiang,Yitao zheng,Yu Luo,Gang Wang,Hongping Wang,Yushu Ma
and Dongzhi Wei*,Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From
Pseudomonas fluorescens B52,Molecular Biotechnology,2005 ( 31),095-102,
SDS-PAGE analysis of
lipase on expression and
purification
? functional lipase
secreted by
Recombinants
screened with BMMY
plates
Enantioselective esterification of R-phenylethanol,
S-phenylethnol remained at its original form
eep＞ 98.7% and conversion ＞ 48.1% at 40oC for 48
hours,
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
Transesterification between soybean oil and methanol,
Conversion ＞ 90% at 40oC for 35 hours
Production of Biodiesel via Transesterification
Catalyzed by Lipase B52
Characterization of a psychrophilic lipase from Pseudomonas
fluorescens strain B68
? p-nitrophenyl caprate as substrate,
? Optimal temperature as 20?C, 50% activity at 0?C。
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
0 10 20 30 40 50 60 70
T e mp e ra t u re ( ゜ C)
R
e
l
a
t
i
ve
Act
i
vi
t
y
(%
)
Hydrolyzation activity of lipase lipB68
Chiral selectivity of lipB68
R
O H
O
O
R
O H
R
O
O
+
l i p a s e l i p B 6 8
R = C H
3
,a n d C H
2
CH
3
Model Reaction,Chiral resolution of ?-phenylethanol
and ?-phenylpropanol via esterification,
Reaction system contained,0.5mmol of racemic ?-phenylethanol or ?-phenylpropanol dissolved in 10ml
toluene containing 1mmol of vinyl acetate,with 0.5g immobilized enzyme added,Samples taken at 120hour
and subjected to GC analysis,
Production of Biodiesel via Transesterification
Catalyzed by Lipase B68
?Yield to 92% at 20?C and 24
hours with immobilized
lipB68,
?The lowest temperature
reported previously,
Production of biodiesel from
soybean oil by immobilized lipB68
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02,lipJ03) isolated from environmental sample
Cloned with Genome-Walking,Genbank Accssion number AY673674,AY700013
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02,lipJ03) expressed in Pichia pastoris KM71
Zhengbing Jiang,Dongzhi Wei* et al.,Applied Microbiology and
Biotechnology,2006,Online First,
Functional lipase secreted by Recombinants
screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression
and purified
Prodrugs of ibuprofen
N
H
H
N
H C lO
O
O
O
O M e
O
O ON
O
H O
H O
N H A c
O H
O
H
N
O
O
H O
H O
O H
O H
O
OO
H OH O
O H O
O H
O
H
N O
R
O
OO
A c OA c O
O A c O
O A c
O
H O
Synthesis of ibuprofen glucopyranside derivative
O
H O
H O
O
O H
O H
O H
O
a
b
O
O
H O
H O
O
O H
O
O
O
H O
H O
O
O H
O
H
2
O
c
d
E n z y m e
S o l v e n t
(a) methyl α-D-glucopyranoside,(b) ibuprofen,(c) 6-O-(2'R -(4'-
isobutylphenyl) propionyl) α-D-glucopyranoside (d) 6-O-(2'S--(4'-
isobutylphenyl) propionyl) α-D-glucopyranoside
Xiang-Guo Zhao,Dong-Zhi Wei*,A facile enzymatic process for the
preparation of ibuprofen ester prodrug in organic media J,Molecular
Catalysis B,Enzymatic,2005,36:47-53,
Dongzhi Wei*,Ping Zou,J,Molecular
Catalysis B,Enzymatic,2002,18:273-278,
Biosynthesis of Ethylglucoside Lactate
Wei Dongzhi*,Yu ying,Biocatalysis and Biotransformation,
2003,21(3)135-139,
Enzymatic Synthesis of Ethyl-glucoside
Monooleate with Lipase in Solvent-free Medium
Qingxun Song,Dongzhi Wei*,J,Molecular Catalysis B,
Enzymatic,2002,18:261-266,
Qing-Xun Song,Dong-Zhi Wei*,et al.,Biotechnology Letters,
2004,26(23),1777 - 1780,
Qingxun Song,Dongzhi Wei*,et al.,Bioprocess and Biosystems
Engineering,2006,Online first,
Studies of Vitamin ester synthesis by
immobilized lipase from Candida sp,
四．杂合酶
? 来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶
分子进行组合或交换，以产生具有所需性
质的优化酶杂合体。
第一节结束
? 点击返回
第二节 定向进化的应用
? 一．提高酶分子的催化活力
? 二．提高酶分子的稳定性
? 三．提高底物的专一性和增加对新底
物．催化活力的进化
? 五．对映体选择性的定向进化
? 六．变换催化反应专一性
一．提高酶分子的催化活力
? L—天冬氨酸酶定向进化研究
– 进行 4轮易错 PCR，筛选了 3000个菌落。
– 得到酶活力提高 28倍的突变体，该酶的 pH稳定
性和热稳定性均优于天然酶
二．提高酶分子的稳定性
? T4溶菌酶 11个不同的单点突变株将 Tm提高
0.8-1.4℃,
? 8株大肠杆菌核酸酶 HI单点突变中,7株 Tm
提高了 0.7-4.2℃
三．提高底物的专一性和增加对新
底物催化活力的进化
? Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于
癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了 9倍
? Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱
苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功
四．对映体选择性的定向进化
? S型选择性的转氨酶转化 ?-丁酮，仅有 65%
的手性专一性。
? 通过 10 000个随机突变的菌株的筛选，获
得 10个手性专一性在 80%-94%之间的酶
五．变换催化反应专一性
? 来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物 p-硝
基 -苯基 -2-甲基葵酸盐的 S构型的选择性 2%。
? 经过 4轮易错 PCR突变和筛选后，它对底物
的 S型的选择性达到 81%
第二节结束
? 点击返回
第三节 蛋白质的稳定性
? 蛋白质稳定性的分子原因
? 测定蛋白质稳定性的方法
蛋白质稳定性的分子原因
? 金属离子、底物、辅因子和其他相对分子
质量配体的结合作用
? 蛋白质 -蛋白质 和蛋白质 -脂的作用
? 盐桥和氢键
? 二硫键 图一 图二
? 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低
? 氨基酸残基的坚实装配
? 疏水相互作用
? 点击返回
Disulfide bond
? 点击返回
Disulfide bond
? 点击返回
Protein protein interation
? 点击返回
测定蛋白质稳定性的方法
参数 度量 如何测定
Tm 熔化温度 实验
变性剂浓度 50%变性所需的变性剂浓
度
实验
ΔG(H2O) 构象稳定性 变性剂伸展曲线
ΔG(25℃ ) 构象稳定性 热变性曲线
Ts 最大稳定性温度 稳定性曲线
相对活力 /% 时间 t时保留的活力 实验
加速降解试验 预测温度 T时的寿命 阿伦尼乌斯图
第三节结束
? 点击返回
第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理
第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理
1,蛋白水解酶和自溶作用
2,聚合作用
3,极端 pH
4,氧化作用
5,表面活性剂和去污剂
6,变性剂
7,重金属离子和巯基试剂
8,热
9,机械力
10,冷冻和脱水
11,辐射作用
proteasome
? 点击返回
第四节结束
? 点击返回
酶工程
第七章 酶的定向进化与稳定性探究
? 第一节 定向进化简介
? 第二节 定向进化的应用
? 第三节 蛋白质的稳定性
? 第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理
第一节 定向进化简介
? 一．理论来源
? 二．概念
? 三．定向进化的选择策略
? 四．杂合酶
一．理论来源
? 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生
物进化过程
– 化学进化
– 生物进化
二．概念
? 酶分子改造
– 化学修饰，定点突变
? 定向进化
定向进化示意图
随机突变 +定向选择＝目标突变体
细菌
诱发突变的
因素
50 0C培养
突变体库 选择压力（温度） 温度耐受型突
变体
最适生长温度为
370C
最适生长温度提高了！
Strategies for the development of effective enzymes
定向进化
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解
酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的
进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基
因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并
定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
澄清一个事实：定向进化 不是 定点突变
? 定向进化：突变 筛选
突变位点是随机的，不确定的；
突变位点的数目也是不确定的；
突变的效应更是不可预知的；
理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的,
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
? 定点突变,
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；
突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；
定点突变的方法一般是以 PCR技术为基础的。
三．定向进化的选择策略
– 关键突变和筛选
– 突变 ——采用回交法
– 筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和 X
光片消化分析
DNA shuffling
体
外
定
向
进
化
Increasing the ee-value of the lipase-
catalyed hydrolysis of the chiral ester
2%
31%
57%
75%
81%
0%
0 1 2 3 4
mutant generations
%ee
成功实例
Lipase genes (lipB52,lipB68) isolated from Pseudomonas
fluorescens B52,B68
Genbank Accssion number AY623009,AY694785
成功实例
Lipase gene (lipB52） expressed in Pichia pastoris KM71
Zhengbing Jiang,Yitao zheng,Yu Luo,Gang Wang,Hongping Wang,Yushu Ma
and Dongzhi Wei*,Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From
Pseudomonas fluorescens B52,Molecular Biotechnology,2005 ( 31),095-102,
SDS-PAGE analysis of
lipase on expression and
purification
? functional lipase
secreted by
Recombinants
screened with BMMY
plates
Enantioselective esterification of R-phenylethanol,
S-phenylethnol remained at its original form
eep＞ 98.7% and conversion ＞ 48.1% at 40oC for 48
hours,
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
Transesterification between soybean oil and methanol,
Conversion ＞ 90% at 40oC for 35 hours
Production of Biodiesel via Transesterification
Catalyzed by Lipase B52
Characterization of a psychrophilic lipase from Pseudomonas
fluorescens strain B68
? p-nitrophenyl caprate as substrate,
? Optimal temperature as 20?C, 50% activity at 0?C。
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
0 10 20 30 40 50 60 70
T e mp e ra t u re ( ゜ C)
R
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Hydrolyzation activity of lipase lipB68
Chiral selectivity of lipB68
R
O H
O
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R
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O
+
l i p a s e l i p B 6 8
R = C H
3
,a n d C H
2
CH
3
Model Reaction,Chiral resolution of ?-phenylethanol
and ?-phenylpropanol via esterification,
Reaction system contained,0.5mmol of racemic ?-phenylethanol or ?-phenylpropanol dissolved in 10ml
toluene containing 1mmol of vinyl acetate,with 0.5g immobilized enzyme added,Samples taken at 120hour
and subjected to GC analysis,
Production of Biodiesel via Transesterification
Catalyzed by Lipase B68
?Yield to 92% at 20?C and 24
hours with immobilized
lipB68,
?The lowest temperature
reported previously,
Production of biodiesel from
soybean oil by immobilized lipB68
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02,lipJ03) isolated from environmental sample
Cloned with Genome-Walking,Genbank Accssion number AY673674,AY700013
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02,lipJ03) expressed in Pichia pastoris KM71
Zhengbing Jiang,Dongzhi Wei* et al.,Applied Microbiology and
Biotechnology,2006,Online First,
Functional lipase secreted by Recombinants
screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression
and purified
Prodrugs of ibuprofen
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Synthesis of ibuprofen glucopyranside derivative
O
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E n z y m e
S o l v e n t
(a) methyl α-D-glucopyranoside,(b) ibuprofen,(c) 6-O-(2'R -(4'-
isobutylphenyl) propionyl) α-D-glucopyranoside (d) 6-O-(2'S--(4'-
isobutylphenyl) propionyl) α-D-glucopyranoside
Xiang-Guo Zhao,Dong-Zhi Wei*,A facile enzymatic process for the
preparation of ibuprofen ester prodrug in organic media J,Molecular
Catalysis B,Enzymatic,2005,36:47-53,
Dongzhi Wei*,Ping Zou,J,Molecular
Catalysis B,Enzymatic,2002,18:273-278,
Biosynthesis of Ethylglucoside Lactate
Wei Dongzhi*,Yu ying,Biocatalysis and Biotransformation,
2003,21(3)135-139,
Enzymatic Synthesis of Ethyl-glucoside
Monooleate with Lipase in Solvent-free Medium
Qingxun Song,Dongzhi Wei*,J,Molecular Catalysis B,
Enzymatic,2002,18:261-266,
Qing-Xun Song,Dong-Zhi Wei*,et al.,Biotechnology Letters,
2004,26(23),1777 - 1780,
Qingxun Song,Dongzhi Wei*,et al.,Bioprocess and Biosystems
Engineering,2006,Online first,
Studies of Vitamin ester synthesis by
immobilized lipase from Candida sp,
四．杂合酶
? 来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶
分子进行组合或交换，以产生具有所需性
质的优化酶杂合体。
第一节结束
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第二节 定向进化的应用
? 一．提高酶分子的催化活力
? 二．提高酶分子的稳定性
? 三．提高底物的专一性和增加对新底
物．催化活力的进化
? 五．对映体选择性的定向进化
? 六．变换催化反应专一性
一．提高酶分子的催化活力
? L—天冬氨酸酶定向进化研究
– 进行 4轮易错 PCR，筛选了 3000个菌落。
– 得到酶活力提高 28倍的突变体，该酶的 pH稳定
性和热稳定性均优于天然酶
二．提高酶分子的稳定性
? T4溶菌酶 11个不同的单点突变株将 Tm提高
0.8-1.4℃,
? 8株大肠杆菌核酸酶 HI单点突变中,7株 Tm
提高了 0.7-4.2℃
三．提高底物的专一性和增加对新
底物催化活力的进化
? Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于
癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了 9倍
? Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱
苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功
四．对映体选择性的定向进化
? S型选择性的转氨酶转化 ?-丁酮，仅有 65%
的手性专一性。
? 通过 10 000个随机突变的菌株的筛选，获
得 10个手性专一性在 80%-94%之间的酶
五．变换催化反应专一性
? 来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物 p-硝
基 -苯基 -2-甲基葵酸盐的 S构型的选择性 2%。
? 经过 4轮易错 PCR突变和筛选后，它对底物
的 S型的选择性达到 81%
第二节结束
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第三节 蛋白质的稳定性
? 蛋白质稳定性的分子原因
? 测定蛋白质稳定性的方法
蛋白质稳定性的分子原因
? 金属离子、底物、辅因子和其他相对分子
质量配体的结合作用
? 蛋白质 -蛋白质 和蛋白质 -脂的作用
? 盐桥和氢键
? 二硫键 图一 图二
? 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低
? 氨基酸残基的坚实装配
? 疏水相互作用
? 点击返回
Disulfide bond
? 点击返回
Disulfide bond
? 点击返回
Protein protein interation
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测定蛋白质稳定性的方法
参数 度量 如何测定
Tm 熔化温度 实验
变性剂浓度 50%变性所需的变性剂浓
度
实验
ΔG(H2O) 构象稳定性 变性剂伸展曲线
ΔG(25℃ ) 构象稳定性 热变性曲线
Ts 最大稳定性温度 稳定性曲线
相对活力 /% 时间 t时保留的活力 实验
加速降解试验 预测温度 T时的寿命 阿伦尼乌斯图
第三节结束
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第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理
第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理
1,蛋白水解酶和自溶作用
2,聚合作用
3,极端 pH
4,氧化作用
5,表面活性剂和去污剂
6,变性剂
7,重金属离子和巯基试剂
8,热
9,机械力
10,冷冻和脱水
11,辐射作用
proteasome
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