医 学 遗 传 学遗传病的治疗本章节重点
药物治疗和饮食控制疗法的原则
基因治疗的概念
目的基因转移的方法
基因治疗的应用手术治疗
矫正畸形
器官和组织移植羊水中甲基丙二酸含量增高,胎儿可能患甲基丙二酸症,会引起新生儿发育迟缓和酸中毒,应在出生前和出生后给母体和患儿注射大量 VB12。
羊水中 T3增高,胎儿可能患甲状腺功能低下,
给孕妇服用甲状腺素 。
药物治疗原则,补其所缺 去其所余
出生前治疗患儿甲状腺功能低下,应给予甲状腺素终生服用,以防患儿智能和体格发育障碍 。
症状前治疗原则,补其所缺 去其所余药物治疗
出生前治疗
现症病人治疗
症状前治疗原则,补其所缺 去其所余药物治疗
出生前治疗饮食疗法原则,禁其所忌
产前治疗
现症病人治疗
“She was an idiot and unable to stand,
walk,or talk; she showed no interest in her
food or surroundings,and spent her time
groaning,crying,and banging her head”.
Bickel H,Exp Med Surg,1954; 12(1),114-117
基因治疗基因治疗 (gene therapy)：运用 DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的 。
基因治疗的策略基因修正 (gene correction)：定点导入外源正常基因,代替有缺陷的基因,对靶细胞基因组无任何改变 。 属于直接治疗 。
基因添加 (gene augmentation)：非定点导入外源正常基因,而没有去除或修复有缺陷的基因 。 属于间接治疗 。
体细胞基因治疗：使患者症状消失或得到缓解,但有害基因仍能传给后代 。
基因治疗的基本方式
生殖细胞基因治疗：可根治遗传病,使有害基因不再在人群中散布 。
体细胞基因治疗：使患者症状消失或得到缓解,但有害基因仍能传给后代 。
基因治疗的基本方式
外源基因高效正确的表达 。
外源基因的安全导入；
基因治疗的关键
疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚基因治疗的条件
已克隆正常基因,且明确该基因表达与调控机制
导入基因具有合适的受体细胞,并能有效表达
具有安全有效的转运载体和方法
直接注射法目的基因的转移方法
物理方法
直接注射法目的基因的转移方法
物理方法
电穿孔法
微粒子轰击法
CaCl2共沉淀法目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
物理方法
化学方法
膜融合法
人工脂质体
红细胞影泡
微细胞
原生质球目的基因的转移方法目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
膜融合法
受体载体转移法
优点
稳定
可携带大片段外源 DNA
可选择特异的靶细胞
无免疫原性
缺点
转染效率较低
瞬时表达
血清抑制膜融合法 & 受体载体转移法目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
膜融合法
受体载体转移法
同源重组法 (homologous recombination)
同源重组法
Xba I Bst I
neo
13.1 Kb
Xba I Xba IBst I
11.1 Kb
neo?
Xba I Bst I Xba I Bst I Xba I
16.5 Kb 7.7 Kb
Bst I
目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
膜融合法
受体载体转移法
同源重组法 (homologous recombination)
病毒介导转移法病毒介导转移法病 毒介导 基因转 移 (virus mediated
gene transfer)是指以病毒为载体,将外源性目的基因通过基因重组技术,组装到病毒载体上,并使重组病毒感染受体宿主细胞,
完成基因转移 。
逆转录病毒 (retrovirus)
优点
能高效转染宿主细胞，转染率可达 100％
宿主范围广泛
可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所载的外源基因都能表达
缺点
病毒容量有限 (7 kb)
随机插入
有致癌作用
5’ LTR LTR 3’
U3 R U5 U3 R U5ψ
小鼠白血病病毒 (Mo-MLV)
gag pol env
病毒核心 逆转录酶 外壳蛋白抗原基因 基因 基因逆转录病毒 (retrovirus)
逆转录病毒载体的构建 (缺陷型病毒 )
5’ LTR LTR 3’
U3 R U5 U3 R U5ψ
小鼠白血病病毒 (Mo-MLV)
外源目的基因逆转录病毒 (retrovirus)
逆转录病毒载体的构建 (缺陷型病毒 )
逆转录病毒 (retrovirus)
逆转录病毒载体的包装
RNA
ψ-Helper virus
Packaging cell RNA
Packaging
protein
Virus Recombinant virus
ψ+
DNA病毒
优点
插入 DNA片段较长
宿主范围广，不需要正在分裂的细胞
不整合，减少插入突变的潜在危险
缺点
需反复给药
具有免疫原性
腺病毒 (adenovirus)载体的包装
E1 E3
DNA
Cell 293
DNA病毒
腺病毒 (adenovirus)载体的包装
DNA E3 Cell 293
DNA病毒
复制缺陷型病毒
可感染分裂和非分裂细胞
病毒颗粒稳定,易于浓缩和纯化
可导入多种靶细胞,并持续表达
无致癌性
DNA病毒
腺病毒 (adenovirus)载体的优点靶细胞的选择
易于取材
便于体外培养
便于进行遗传技术操作
安全回输
皮肤成纤维细胞应用 DNA和 RNA的碱基互补可形成同源或异源双链的原理,人工合成反义 RNA(或
DNA),和 mRNA互补,使其灭活,阻止其翻译成蛋白质,达到治疗疾病的目的 。
反义 RNA表达载体
反义 RNA(或 DNA)的体外显微注射
用脂质体运送反义 RNA
其它方法,CaCl2法；细胞打孔法；逆转录病毒介导反义核酸在基因治疗中的作用
“自杀基因” 疗法
T d R d T M P d T D P d T T P1 TKH S V 1 TKH S Vc y t o s o l T K c y t o s o l d T M P - K
c y t o s o l d N D P - K
G C V G C V M P G C V D P G C V T P1 TKH S V 1 TKH S V
c y t o s o l d N D P - K
“自杀基因,(suicide gene)的产物可将一种无害的药物 (前药物 )转化成有毒性的底物 。
单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶 (HSV1TK)
“自杀基因” 疗法
“自杀基因,(suicide gene)的产物可将一种无害的药物 (前药物 )转化成有毒性的底物 。
旁观者效应 (by-stander effect)
“自杀基因” 疗法
“自杀基因” 疗法
“自杀基因” 疗法
“自杀基因” 疗法多抗药性基因疗法
多抗药性 (MDR)基因
野生型抑癌基因的失活和肿瘤的发生密切相关,将野生型抑癌基因导入肿瘤细胞,替代和补偿有缺陷的抑癌基因,以抑制肿瘤的生长或逆转其表型,称为,基因替代疗法,。
抑癌基因疗法
基因替代疗法抑癌基因疗法抑癌基因疗法程序化死亡基因治疗的临床应用
ADA缺乏症
French Anderson (NIH)
LTR ADA SV40 neo LTR
September 14,1990
Retrovirus (Mo-MLV)
地方伦理小组 地方生物安全小组
NIH
RAC
HGTS
FDA 考虑治疗程序的特点,用于基因转移的生物制品的产品质量控制和鉴定考虑治疗方案对受治患者和大众的安全性,对患者预期疗效和潜在危险相比较临床基因治疗方案基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用
Ashanti de Silva
Ashanti was the first
patient to be treated with
gene therapy.
Injections repeated 7 times in first 10.5 months
ADA,1% 25%
基因治疗的临床应用
乙型血友病
薛京伦 (复旦大学 )
1991,腺病毒
皮肤成纤维细胞
Factor IX,5%
2003,rAAV2-hF.IX
细胞因子
1984～ 1987年,淋巴激活的杀伤细胞 (LAK)
基因治疗的临床应用
肿瘤的基因治疗
1986年,肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)结合 IL-2
1991年,肿瘤坏死因子 (TNF)治疗黑色素瘤
1992年,HSV-TK 和 GCV
细胞因子基因治疗的临床应用
肿瘤的基因治疗
,自杀基因,
细胞因子基因治疗的临床应用
肿瘤的基因治疗
,自杀基因,
肿瘤抑制基因
pRB,p53,p16,p21,p27
基因治疗临床实验的载体系统 (1 999,09,10)
临床方案 病例腺相关病毒 4 1,1 % 36 1,1 %
腺病毒 71 1 7,9 % 437 1 3,3 %
电穿孔 2 0,5 % 20 0,6 %
基因枪 4 1,.0 % 35 1,1 %
疱疹病毒 1 0,3 % 0 0
脂质体 73 1 8,4 % 735 2 2,4 %
脂质体 / 腺相关病毒 2 0,5 % 0 0
脂质体 / 腺病毒 1 0,3 % 3 0,1 %
裸 DNA 16 4,0 % 69 2,1 %
Po x v iru s 26 6,6 % 130 4,0 %
逆转录病毒包装细胞 20 5,1 % 408 1 2,4 %
逆转录病毒 158 3 9,9 % 1217 3 7,1 %
逆转录病毒 / 基因枪 1 0,3 % 6 0,2 %
RNA 转移 1 0,3 % 30 0,9 %
其它转染 7 1,8 % 101 3,1 %
总计 387 1 0 0,0 % 3227 1 0 0,0 %
导入基因的持续表达
导入基因的高效表达
安全性问题存在的问题及解决方法
Gelsinger Case
1999,Death of Jesse Gelsinger in Penn
OTCD trial
OTCD,ornithine transcarbamylase (a
urea cycle enzyme) deficiency.
OTCD,X-linked,1/40 000 birth
Jesse Gelsinger,18 yr-old from Arizona,
died on 9/17/1999,4 day after gene
transfer.
导入基因的持续表达
导入基因的高效表达
安全性问题存在的问题及解决方法
组织特异启动子的应用 （ 靶向性 ）
理想载体本章节重点
药物治疗和饮食控制疗法的原则
基因治疗的概念
目的基因转移的方法
基因治疗的应用
药物治疗和饮食控制疗法的原则
基因治疗的概念
目的基因转移的方法
基因治疗的应用手术治疗
矫正畸形
器官和组织移植羊水中甲基丙二酸含量增高,胎儿可能患甲基丙二酸症,会引起新生儿发育迟缓和酸中毒,应在出生前和出生后给母体和患儿注射大量 VB12。
羊水中 T3增高,胎儿可能患甲状腺功能低下,
给孕妇服用甲状腺素 。
药物治疗原则,补其所缺 去其所余
出生前治疗患儿甲状腺功能低下,应给予甲状腺素终生服用,以防患儿智能和体格发育障碍 。
症状前治疗原则,补其所缺 去其所余药物治疗
出生前治疗
现症病人治疗
症状前治疗原则,补其所缺 去其所余药物治疗
出生前治疗饮食疗法原则,禁其所忌
产前治疗
现症病人治疗
“She was an idiot and unable to stand,
walk,or talk; she showed no interest in her
food or surroundings,and spent her time
groaning,crying,and banging her head”.
Bickel H,Exp Med Surg,1954; 12(1),114-117
基因治疗基因治疗 (gene therapy)：运用 DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的 。
基因治疗的策略基因修正 (gene correction)：定点导入外源正常基因,代替有缺陷的基因,对靶细胞基因组无任何改变 。 属于直接治疗 。
基因添加 (gene augmentation)：非定点导入外源正常基因,而没有去除或修复有缺陷的基因 。 属于间接治疗 。
体细胞基因治疗：使患者症状消失或得到缓解,但有害基因仍能传给后代 。
基因治疗的基本方式
生殖细胞基因治疗：可根治遗传病,使有害基因不再在人群中散布 。
体细胞基因治疗：使患者症状消失或得到缓解,但有害基因仍能传给后代 。
基因治疗的基本方式
外源基因高效正确的表达 。
外源基因的安全导入；
基因治疗的关键
疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚基因治疗的条件
已克隆正常基因,且明确该基因表达与调控机制
导入基因具有合适的受体细胞,并能有效表达
具有安全有效的转运载体和方法
直接注射法目的基因的转移方法
物理方法
直接注射法目的基因的转移方法
物理方法
电穿孔法
微粒子轰击法
CaCl2共沉淀法目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
物理方法
化学方法
膜融合法
人工脂质体
红细胞影泡
微细胞
原生质球目的基因的转移方法目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
膜融合法
受体载体转移法
优点
稳定
可携带大片段外源 DNA
可选择特异的靶细胞
无免疫原性
缺点
转染效率较低
瞬时表达
血清抑制膜融合法 & 受体载体转移法目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
膜融合法
受体载体转移法
同源重组法 (homologous recombination)
同源重组法
Xba I Bst I
neo
13.1 Kb
Xba I Xba IBst I
11.1 Kb
neo?
Xba I Bst I Xba I Bst I Xba I
16.5 Kb 7.7 Kb
Bst I
目的基因的转移方法
物理方法
化学方法
膜融合法
受体载体转移法
同源重组法 (homologous recombination)
病毒介导转移法病毒介导转移法病 毒介导 基因转 移 (virus mediated
gene transfer)是指以病毒为载体,将外源性目的基因通过基因重组技术,组装到病毒载体上,并使重组病毒感染受体宿主细胞,
完成基因转移 。
逆转录病毒 (retrovirus)
优点
能高效转染宿主细胞，转染率可达 100％
宿主范围广泛
可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所载的外源基因都能表达
缺点
病毒容量有限 (7 kb)
随机插入
有致癌作用
5’ LTR LTR 3’
U3 R U5 U3 R U5ψ
小鼠白血病病毒 (Mo-MLV)
gag pol env
病毒核心 逆转录酶 外壳蛋白抗原基因 基因 基因逆转录病毒 (retrovirus)
逆转录病毒载体的构建 (缺陷型病毒 )
5’ LTR LTR 3’
U3 R U5 U3 R U5ψ
小鼠白血病病毒 (Mo-MLV)
外源目的基因逆转录病毒 (retrovirus)
逆转录病毒载体的构建 (缺陷型病毒 )
逆转录病毒 (retrovirus)
逆转录病毒载体的包装
RNA
ψ-Helper virus
Packaging cell RNA
Packaging
protein
Virus Recombinant virus
ψ+
DNA病毒
优点
插入 DNA片段较长
宿主范围广，不需要正在分裂的细胞
不整合，减少插入突变的潜在危险
缺点
需反复给药
具有免疫原性
腺病毒 (adenovirus)载体的包装
E1 E3
DNA
Cell 293
DNA病毒
腺病毒 (adenovirus)载体的包装
DNA E3 Cell 293
DNA病毒
复制缺陷型病毒
可感染分裂和非分裂细胞
病毒颗粒稳定,易于浓缩和纯化
可导入多种靶细胞,并持续表达
无致癌性
DNA病毒
腺病毒 (adenovirus)载体的优点靶细胞的选择
易于取材
便于体外培养
便于进行遗传技术操作
安全回输
皮肤成纤维细胞应用 DNA和 RNA的碱基互补可形成同源或异源双链的原理,人工合成反义 RNA(或
DNA),和 mRNA互补,使其灭活,阻止其翻译成蛋白质,达到治疗疾病的目的 。
反义 RNA表达载体
反义 RNA(或 DNA)的体外显微注射
用脂质体运送反义 RNA
其它方法,CaCl2法；细胞打孔法；逆转录病毒介导反义核酸在基因治疗中的作用
“自杀基因” 疗法
T d R d T M P d T D P d T T P1 TKH S V 1 TKH S Vc y t o s o l T K c y t o s o l d T M P - K
c y t o s o l d N D P - K
G C V G C V M P G C V D P G C V T P1 TKH S V 1 TKH S V
c y t o s o l d N D P - K
“自杀基因,(suicide gene)的产物可将一种无害的药物 (前药物 )转化成有毒性的底物 。
单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶 (HSV1TK)
“自杀基因” 疗法
“自杀基因,(suicide gene)的产物可将一种无害的药物 (前药物 )转化成有毒性的底物 。
旁观者效应 (by-stander effect)
“自杀基因” 疗法
“自杀基因” 疗法
“自杀基因” 疗法
“自杀基因” 疗法多抗药性基因疗法
多抗药性 (MDR)基因
野生型抑癌基因的失活和肿瘤的发生密切相关,将野生型抑癌基因导入肿瘤细胞,替代和补偿有缺陷的抑癌基因,以抑制肿瘤的生长或逆转其表型,称为,基因替代疗法,。
抑癌基因疗法
基因替代疗法抑癌基因疗法抑癌基因疗法程序化死亡基因治疗的临床应用
ADA缺乏症
French Anderson (NIH)
LTR ADA SV40 neo LTR
September 14,1990
Retrovirus (Mo-MLV)
地方伦理小组 地方生物安全小组
NIH
RAC
HGTS
FDA 考虑治疗程序的特点,用于基因转移的生物制品的产品质量控制和鉴定考虑治疗方案对受治患者和大众的安全性,对患者预期疗效和潜在危险相比较临床基因治疗方案基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用
Ashanti de Silva
Ashanti was the first
patient to be treated with
gene therapy.
Injections repeated 7 times in first 10.5 months
ADA,1% 25%
基因治疗的临床应用
乙型血友病
薛京伦 (复旦大学 )
1991,腺病毒
皮肤成纤维细胞
Factor IX,5%
2003,rAAV2-hF.IX
细胞因子
1984～ 1987年,淋巴激活的杀伤细胞 (LAK)
基因治疗的临床应用
肿瘤的基因治疗
1986年,肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)结合 IL-2
1991年,肿瘤坏死因子 (TNF)治疗黑色素瘤
1992年,HSV-TK 和 GCV
细胞因子基因治疗的临床应用
肿瘤的基因治疗
,自杀基因,
细胞因子基因治疗的临床应用
肿瘤的基因治疗
,自杀基因,
肿瘤抑制基因
pRB,p53,p16,p21,p27
基因治疗临床实验的载体系统 (1 999,09,10)
临床方案 病例腺相关病毒 4 1,1 % 36 1,1 %
腺病毒 71 1 7,9 % 437 1 3,3 %
电穿孔 2 0,5 % 20 0,6 %
基因枪 4 1,.0 % 35 1,1 %
疱疹病毒 1 0,3 % 0 0
脂质体 73 1 8,4 % 735 2 2,4 %
脂质体 / 腺相关病毒 2 0,5 % 0 0
脂质体 / 腺病毒 1 0,3 % 3 0,1 %
裸 DNA 16 4,0 % 69 2,1 %
Po x v iru s 26 6,6 % 130 4,0 %
逆转录病毒包装细胞 20 5,1 % 408 1 2,4 %
逆转录病毒 158 3 9,9 % 1217 3 7,1 %
逆转录病毒 / 基因枪 1 0,3 % 6 0,2 %
RNA 转移 1 0,3 % 30 0,9 %
其它转染 7 1,8 % 101 3,1 %
总计 387 1 0 0,0 % 3227 1 0 0,0 %
导入基因的持续表达
导入基因的高效表达
安全性问题存在的问题及解决方法
Gelsinger Case
1999,Death of Jesse Gelsinger in Penn
OTCD trial
OTCD,ornithine transcarbamylase (a
urea cycle enzyme) deficiency.
OTCD,X-linked,1/40 000 birth
Jesse Gelsinger,18 yr-old from Arizona,
died on 9/17/1999,4 day after gene
transfer.
导入基因的持续表达
导入基因的高效表达
安全性问题存在的问题及解决方法
组织特异启动子的应用 （ 靶向性 ）
理想载体本章节重点
药物治疗和饮食控制疗法的原则
基因治疗的概念
目的基因转移的方法
基因治疗的应用
