医 学 遗 传 学基因操作本章节重点
重组 DNA技术
分子杂交 技术
PCR技术及应用重组 DNA技术 (recombination DNA technique)：将目的 DNA片段或人工合成的基因,通过运载体在体外重组,转移并插入到另一种生物的基因组中,使其表达为新的性状或用于进一步的研究 。 也称 基因工程
(genetic engineering),是基因操作的核心技术 。 包括 DNA克隆 (DNA cloning)
和 分子杂交 (molecular hybridization)。
重组 DNA
构建
转化
扩增 (克隆 )
分离和检测重组 DNA
重组 DNA技术流程简图
foreign DNA bacterial cell
重组 DNA技术流程简图
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
重组 DNA技术流程简图
ligase
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
重组 DNA技术流程简图
ligase
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
限制性内切核酸酶限制酶,能够识别 DNA链的特定部位并能进行切割 。
TypeⅠ
TypeⅡ
TypeⅢ
平末端 (Blunt end) & 粘性末端 (Sticky end)
限制性内切核酸酶
HaeⅢ 5’ 3’3’ 5’G G C CC C G G 5’ 3’3’ 5’G GC C C CG G
MboⅠ 5’ 3’3’ 5’G A T CC T A G 5’ 3’3’ 5’G A T CC T A G
BamHⅠ 5’ 3’3’ 5’G G A T C CC C T A G G 5’ 3’3’ 5’GC C T A GG A T C CG
PstⅠ 5’ 3’3’ 5’C T G C A GG A C G T C 5’ 3’3’ 5’C T G C AG GA C G T C
进行 DNA重组,需要载体 DNA和外源 DNA
具有相同序列的粘性末端 。
使用相同的限制酶
使用识别相同靶序列的不同限制酶
使用识别不同序列,但能产生一致粘性末端的限制酶限制性内切核酸酶重组 DNA技术流程简图
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
ligase
DNA连接酶一种封闭 DNA链上缺口的酶，借助 ATP水解提供的能量催化 DNA链的 5’-PO4与另一 DNA
链的 3’-OH生成磷酸二酯键。
ligase
重组 DNA技术流程简图
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
vector
运载体运载体 (Vector)是能将外源目的 DNA导入受体细胞,并可自我复制和增殖的工具 。
分子量小 。
有多种限制酶切位点 。
有可供选择的标记基因或报道基因 。
克隆载体有复制起点，表达载体有启动子。
插入型 & 置换型
克隆载体 & 表达载体运载体运载体 (Vector)是能将外源目的 DNA导入受体细胞,并可自我复制和增殖的工具 。
质粒是存在于许多细菌中,独立于染色体外的 双链闭合环状 DNA分子 。
质粒 (plasmid)
质粒 (plasmid)
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat
pUC19
2686 bp Ori
ApR
LacZ
EcoRⅠ
SacⅠ
KpnⅠ
SmaⅠ XbaⅠ
BamHⅠ SalⅠ SphⅠ
PstⅠ HindⅢ
λ噬菌体是一种可在体外包装的细胞病毒,能高效感染细菌细胞并在其中克隆中等长度的 DNA片段的载体 。
λ噬菌体 (Lambda phage)
Cos site
裂解 & 溶源
λ噬菌体置换载体
λ噬菌体插入载体粘粒 是将 质粒 和 λ噬菌体 改建的一种人工载体 。
cosmid只含有 λ噬菌体的复制起点,抗性标记 (来自质粒 )以及 cos粘性末端,多用于构建高等生物的基因文库 。
粘粒 (cosmid)
可环化,不会裂解宿主细胞 (λphage )
可自我复制 (plasmid)
45 kb外源 DNA
可与同源序列质粒重组粘粒 是将 质粒 和 λ噬菌体 改建的一种人工载体 。
粘粒 (cosmid)
粘粒 (cosmid)
pJB8
5.4 kb
Sal Ⅰ
P1噬菌体 & PAC
BAC,细菌人工染色体
YAC,酵母人工染色体
着丝粒
端粒
自主复制元件,ARS
大片段 DNA克隆载体运载体载体 插入片段大小
Plasmid 0~10 kb
Insertion λ vector 0~10 kb
Replacement λ vector 9~23 kb
Cosmid 33~44 kb
P1 phage 70~100 kb
PAC 130~150 kb
BAC 300 kb
YAC 0.2~2.0 Mb
细胞克隆 (Cell clone)
细胞克隆 (Cell clone)
重组 DNA克隆的分离
Amp
蓝白筛选重组 DNA克隆的分离
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat
pUC19
2686 bp Ori
ApR
LacZ
EcoRⅠ
SacⅠ
KpnⅠ
SmaⅠ XbaⅠ
BamHⅠ SalⅠ SphⅠ
PstⅠ HindⅢ
重组 DNA克隆的分离
Amp＋ X-galAmp
蓝白筛选基因文库
基因组文库 (genomic library)
染色体特异的基因文库
cDNA文库 (cDNA library)
胚胎干细胞 (embryonic stem cell,ES cell)
转基因动物 (transgenic animal)
基因剔除小鼠 (gene knockout mouse)
基因转移同源双链 (homoduplex)
异源双链 (heteroduplex)
分子杂交探针 (probe)：分子杂交检测其互补序列的标记 DNA或 RNA序列,能在许多
DNA或 RNA序列的复杂混合物中识别所需克隆的分子 。
DNA探针 (DNA probe)
RNA探针 (RNA probe)
寡核苷酸探针 (oligonucleotide probe)
探针的制备与应用
简并探针 (degenerate probe)
探针的制备与应用
Leu Cys Ile Tyr Met His Gln Asp Ser
CT
T
C
A
G
TG TC AT
T
C
A TA
T
C CA
T
CATG CA
A
G GA
T
C TC
T
C
A
G
TT AG AGTC
单一 EST探针 (unique EST-base probe)
探针的制备与应用探针 (probe)：分子杂交检测其互补序列的标记 DNA或 RNA序列,能在许多
DNA或 RNA序列的复杂混合物中识别所需克隆的分子 。
DNA探针 (DNA probe)
RNA探针 (RNA probe)
寡核苷酸探针 (oligonucleotide probe)
32P,35S,3H
地高辛
生物素
同位素标记
非同位素标记探针的标记及方法
缺口平移法 (nick translation)
探针的标记及方法缺口平移法
p A p C p G p T p T p A p C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
DNaseⅠ DNA PolymeraseⅠ
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
缺口平移法
p A p C p G p Tp Tp A C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
DNaseⅠ
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
缺口平移法
p A p C p G p Tp Tp A C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
OH PDNA PolymeraseⅠ
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
缺口平移法
p A p C p G p T p T p A p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
dCMP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP DNA
PolymeraseⅠ
p A p C p G p T p T p A p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
pC
dATP
dCTP
dGTP
dTTP DNA
PolymeraseⅠ
缺口平移法
p A p C p G p T p T p A p C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
DNA PolymeraseⅠ
缺口平移法
缺口平移法 (nick translation)
随机引物延伸法 (random-primed labeling)
探针的标记及方法随机引物延伸法
5’ 3’
5’3’
dATP dCTP
dGTP dTTP
Klenow
Klenow Klenow
随机引物延伸法
5’ 3’
5’3’
缺口平移法 (nick translation)
随机引物延伸法 (random-primed labeling)
探针的标记及方法
末端标记法 (End labelling)
PCR标记法 (PCR amplification)
分子杂交
点印迹 (dot-blot)法
dot and slot hybridization
allele-specific oligonucleotide,ASO
ASO杂交
His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala
CAT CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC
His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala
CAT CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC
CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT
CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT
ASO杂交
CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT
CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT
Southern印迹 (Southern blot)
分子杂交
点印迹 (dot-blot)法
Southern Blot
-
+
镰状细胞贫血 (HbS),第 5～ 7位密码子
A?A?A?S?S?S
MstⅡ,CCTNAGG
1.2 Kb 0.2Kb
1.40 Kb
1.20 Kb
0.20 Kb
A,CCTGAGGAG
S,CCTGTGGAG
Southern Blot
Northern印迹 (Northern blot)
Western印迹 (Western blot)
免疫印迹 (immunoblotting)
Southern印迹 (Southern blot)
分子杂交
点印迹 (dot-blot)法生物素
HRP
组织抗原抗生物素一抗生物素化二抗抗 HRP
Western Blot
Western Blot
Polymerase Chain Reaction,PCR
聚合酶链式反应 (PCR),是一种在体外
(in vitro)短时间内大量,迅速的选择扩增特定的靶 DNA序列的核酸扩增方法 。
1971,Dr,Kjell Kleppe
1983,Dr,Mullis
Mullis F
The Nobel Prize in Chemistry 1993
"for his invention of the
polymerase chain reaction
(PCR) method"
Polymerase Chain Reaction,PCR
Template DNA
Primers
Tag DNA polymerase
Mg＋＋
dNTPs
DMSO
Anneal temperature
Polymerase Chain Reaction,PCR
Polymerase Chain Reaction,PCR
Denaturing step,94~95℃
Denatures the double stranded DNA into
single strands
95℃
72℃
55℃
Polymerase Chain Reaction,PCR
Polymerase Chain Reaction,PCR
Annealing step,45~60℃
Denaturing step,94~95℃
Allows the primers to attach to complementary
strand of DNA
95℃
72℃
55℃
Polymerase Chain Reaction,PCR
Extension step,72℃
Annealing step,45~60℃
Denaturing step,94~95℃
Optimal temperature for Taq polymerase to attach
to and extend the new strand of DNA
95℃
72℃
55℃
Polymerase Chain Reaction,PCR
Polymerase Chain Reaction,PCR
优点
迅速
灵敏
稳定
缺点
需要靶序列的信息
PCR产物长度有限
DNA复制的不确定性本章节重点
重组 DNA技术
分子杂交 技术
PCR技术及应用
重组 DNA技术
分子杂交 技术
PCR技术及应用重组 DNA技术 (recombination DNA technique)：将目的 DNA片段或人工合成的基因,通过运载体在体外重组,转移并插入到另一种生物的基因组中,使其表达为新的性状或用于进一步的研究 。 也称 基因工程
(genetic engineering),是基因操作的核心技术 。 包括 DNA克隆 (DNA cloning)
和 分子杂交 (molecular hybridization)。
重组 DNA
构建
转化
扩增 (克隆 )
分离和检测重组 DNA
重组 DNA技术流程简图
foreign DNA bacterial cell
重组 DNA技术流程简图
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
重组 DNA技术流程简图
ligase
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
重组 DNA技术流程简图
ligase
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
限制性内切核酸酶限制酶,能够识别 DNA链的特定部位并能进行切割 。
TypeⅠ
TypeⅡ
TypeⅢ
平末端 (Blunt end) & 粘性末端 (Sticky end)
限制性内切核酸酶
HaeⅢ 5’ 3’3’ 5’G G C CC C G G 5’ 3’3’ 5’G GC C C CG G
MboⅠ 5’ 3’3’ 5’G A T CC T A G 5’ 3’3’ 5’G A T CC T A G
BamHⅠ 5’ 3’3’ 5’G G A T C CC C T A G G 5’ 3’3’ 5’GC C T A GG A T C CG
PstⅠ 5’ 3’3’ 5’C T G C A GG A C G T C 5’ 3’3’ 5’C T G C AG GA C G T C
进行 DNA重组,需要载体 DNA和外源 DNA
具有相同序列的粘性末端 。
使用相同的限制酶
使用识别相同靶序列的不同限制酶
使用识别不同序列,但能产生一致粘性末端的限制酶限制性内切核酸酶重组 DNA技术流程简图
vector
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
ligase
DNA连接酶一种封闭 DNA链上缺口的酶，借助 ATP水解提供的能量催化 DNA链的 5’-PO4与另一 DNA
链的 3’-OH生成磷酸二酯键。
ligase
重组 DNA技术流程简图
restriction
endonuclease
foreign DNA bacterial cell
host
vector
运载体运载体 (Vector)是能将外源目的 DNA导入受体细胞,并可自我复制和增殖的工具 。
分子量小 。
有多种限制酶切位点 。
有可供选择的标记基因或报道基因 。
克隆载体有复制起点，表达载体有启动子。
插入型 & 置换型
克隆载体 & 表达载体运载体运载体 (Vector)是能将外源目的 DNA导入受体细胞,并可自我复制和增殖的工具 。
质粒是存在于许多细菌中,独立于染色体外的 双链闭合环状 DNA分子 。
质粒 (plasmid)
质粒 (plasmid)
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat
pUC19
2686 bp Ori
ApR
LacZ
EcoRⅠ
SacⅠ
KpnⅠ
SmaⅠ XbaⅠ
BamHⅠ SalⅠ SphⅠ
PstⅠ HindⅢ
λ噬菌体是一种可在体外包装的细胞病毒,能高效感染细菌细胞并在其中克隆中等长度的 DNA片段的载体 。
λ噬菌体 (Lambda phage)
Cos site
裂解 & 溶源
λ噬菌体置换载体
λ噬菌体插入载体粘粒 是将 质粒 和 λ噬菌体 改建的一种人工载体 。
cosmid只含有 λ噬菌体的复制起点,抗性标记 (来自质粒 )以及 cos粘性末端,多用于构建高等生物的基因文库 。
粘粒 (cosmid)
可环化,不会裂解宿主细胞 (λphage )
可自我复制 (plasmid)
45 kb外源 DNA
可与同源序列质粒重组粘粒 是将 质粒 和 λ噬菌体 改建的一种人工载体 。
粘粒 (cosmid)
粘粒 (cosmid)
pJB8
5.4 kb
Sal Ⅰ
P1噬菌体 & PAC
BAC,细菌人工染色体
YAC,酵母人工染色体
着丝粒
端粒
自主复制元件,ARS
大片段 DNA克隆载体运载体载体 插入片段大小
Plasmid 0~10 kb
Insertion λ vector 0~10 kb
Replacement λ vector 9~23 kb
Cosmid 33~44 kb
P1 phage 70~100 kb
PAC 130~150 kb
BAC 300 kb
YAC 0.2~2.0 Mb
细胞克隆 (Cell clone)
细胞克隆 (Cell clone)
重组 DNA克隆的分离
Amp
蓝白筛选重组 DNA克隆的分离
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat
pUC19
2686 bp Ori
ApR
LacZ
EcoRⅠ
SacⅠ
KpnⅠ
SmaⅠ XbaⅠ
BamHⅠ SalⅠ SphⅠ
PstⅠ HindⅢ
重组 DNA克隆的分离
Amp＋ X-galAmp
蓝白筛选基因文库
基因组文库 (genomic library)
染色体特异的基因文库
cDNA文库 (cDNA library)
胚胎干细胞 (embryonic stem cell,ES cell)
转基因动物 (transgenic animal)
基因剔除小鼠 (gene knockout mouse)
基因转移同源双链 (homoduplex)
异源双链 (heteroduplex)
分子杂交探针 (probe)：分子杂交检测其互补序列的标记 DNA或 RNA序列,能在许多
DNA或 RNA序列的复杂混合物中识别所需克隆的分子 。
DNA探针 (DNA probe)
RNA探针 (RNA probe)
寡核苷酸探针 (oligonucleotide probe)
探针的制备与应用
简并探针 (degenerate probe)
探针的制备与应用
Leu Cys Ile Tyr Met His Gln Asp Ser
CT
T
C
A
G
TG TC AT
T
C
A TA
T
C CA
T
CATG CA
A
G GA
T
C TC
T
C
A
G
TT AG AGTC
单一 EST探针 (unique EST-base probe)
探针的制备与应用探针 (probe)：分子杂交检测其互补序列的标记 DNA或 RNA序列,能在许多
DNA或 RNA序列的复杂混合物中识别所需克隆的分子 。
DNA探针 (DNA probe)
RNA探针 (RNA probe)
寡核苷酸探针 (oligonucleotide probe)
32P,35S,3H
地高辛
生物素
同位素标记
非同位素标记探针的标记及方法
缺口平移法 (nick translation)
探针的标记及方法缺口平移法
p A p C p G p T p T p A p C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
DNaseⅠ DNA PolymeraseⅠ
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
缺口平移法
p A p C p G p Tp Tp A C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
DNaseⅠ
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
缺口平移法
p A p C p G p Tp Tp A C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
OH PDNA PolymeraseⅠ
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
缺口平移法
p A p C p G p T p T p A p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
dCMP
dATP
dCTP
dGTP
dTTP DNA
PolymeraseⅠ
p A p C p G p T p T p A p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
pC
dATP
dCTP
dGTP
dTTP DNA
PolymeraseⅠ
缺口平移法
p A p C p G p T p T p A p C p G p G p A p C p Tp G p Tp Tp A p C p C p G p A p T
p Tp G p C p A p A p Tp G p C p C p T p G p A p C p A p A p Tp G p G p C p Tp A
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
DNA PolymeraseⅠ
缺口平移法
缺口平移法 (nick translation)
随机引物延伸法 (random-primed labeling)
探针的标记及方法随机引物延伸法
5’ 3’
5’3’
dATP dCTP
dGTP dTTP
Klenow
Klenow Klenow
随机引物延伸法
5’ 3’
5’3’
缺口平移法 (nick translation)
随机引物延伸法 (random-primed labeling)
探针的标记及方法
末端标记法 (End labelling)
PCR标记法 (PCR amplification)
分子杂交
点印迹 (dot-blot)法
dot and slot hybridization
allele-specific oligonucleotide,ASO
ASO杂交
His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala
CAT CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC
His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala
CAT CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC
CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT
CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT
ASO杂交
CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT
CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT
Southern印迹 (Southern blot)
分子杂交
点印迹 (dot-blot)法
Southern Blot
-
+
镰状细胞贫血 (HbS),第 5～ 7位密码子
A?A?A?S?S?S
MstⅡ,CCTNAGG
1.2 Kb 0.2Kb
1.40 Kb
1.20 Kb
0.20 Kb
A,CCTGAGGAG
S,CCTGTGGAG
Southern Blot
Northern印迹 (Northern blot)
Western印迹 (Western blot)
免疫印迹 (immunoblotting)
Southern印迹 (Southern blot)
分子杂交
点印迹 (dot-blot)法生物素
HRP
组织抗原抗生物素一抗生物素化二抗抗 HRP
Western Blot
Western Blot
Polymerase Chain Reaction,PCR
聚合酶链式反应 (PCR),是一种在体外
(in vitro)短时间内大量,迅速的选择扩增特定的靶 DNA序列的核酸扩增方法 。
1971,Dr,Kjell Kleppe
1983,Dr,Mullis
Mullis F
The Nobel Prize in Chemistry 1993
"for his invention of the
polymerase chain reaction
(PCR) method"
Polymerase Chain Reaction,PCR
Template DNA
Primers
Tag DNA polymerase
Mg＋＋
dNTPs
DMSO
Anneal temperature
Polymerase Chain Reaction,PCR
Polymerase Chain Reaction,PCR
Denaturing step,94~95℃
Denatures the double stranded DNA into
single strands
95℃
72℃
55℃
Polymerase Chain Reaction,PCR
Polymerase Chain Reaction,PCR
Annealing step,45~60℃
Denaturing step,94~95℃
Allows the primers to attach to complementary
strand of DNA
95℃
72℃
55℃
Polymerase Chain Reaction,PCR
Extension step,72℃
Annealing step,45~60℃
Denaturing step,94~95℃
Optimal temperature for Taq polymerase to attach
to and extend the new strand of DNA
95℃
72℃
55℃
Polymerase Chain Reaction,PCR
Polymerase Chain Reaction,PCR
优点
迅速
灵敏
稳定
缺点
需要靶序列的信息
PCR产物长度有限
DNA复制的不确定性本章节重点
重组 DNA技术
分子杂交 技术
PCR技术及应用
