荧光分光光度法
F l o u r e s c e n c e
一, 简介,
二, 荧光发光的原理,
三, 量子效率,
四, 荧光发光光谱仪的构造,
五, 荧光的定量分析,
六, 荧光光度计的发展
简介
1.和 UV异同点
2.荧光分析法主要
应用范围与常用方法
3.优势
1.与 UV异同点
1)构造与 UV很相似,
属于分光光度法,光源,单色器等
2)组件的布置稍有不同
荧光采用激发光和发射光
成直角的直角光路,,
3)原理也不一样,这在后面介绍
2.荧光分析法主要应用范围
1） 生物技术的分析,免疫技术的分
析,如 DNA,抗体, 抗原等 ;
2） 痕量元素的分析, 如 70多种无
机元素；
3） 间接测定众多的有机物, 包括
药物 。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（ X射线）
2.原子荧光分析（激光）
3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1） 灵敏度高：比 UV高 2~~3个
数量级,
2） 信息多, 激发分光光谱 （ 信
息同于 UV）, 发射光光谱的发
光强度, 发光寿命, 量子效率,
荧光偏振等多种信息,定性更好 ;
3）工作曲线的线性范围宽（定量
更准） 应用范围也广微量元素的
分析、医药、环境,石油工业等能
直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采
用间接法,
伯乐公司的 Labeled DNA的荧光标
记物 Labeling kits.
荧光发光的原理,
激发和发射过程
1.激发过程：
① 基态：能量最低状态 S0
② 激发态,电子处于反键轨道上为激
发态
最有意义的为 π?π *和 n?π *过程
电子激发过程很快, 10-15 S，
不稳定 。
2.发射过程
当激发态在返回基态时, 伴有光子
的辐射称为发光过程, 又称发射过
程 。
荧光和磷光均为此种光致发光
过程 。 (又称冷光 )
实际从激发态回到基态过程充
满竞争 。
(jablonskii)杰不朗斯基的图解
S,基态 S*激发态
S0,基态 F,荧光 P:磷光
S1:为单一态的低能级
T,三重态 Three
VR:振动驰豫 Vibratory Relaxation
内转换, Inter Crossing
系内转换：
Inter System Crossing
1） 单一态
激发过程中,当 S=0时为单一态,
① S原子光谱谱项符号量子数 S 的
2S+1表示谱项的多重性,
② 自旋量子数 ms（ 电子 ）
可取值只有 ± 1/2（ 即顺旋或反旋 ）
③ 自旋的两种状态,
当自旋配对时,S=0,不配对则 S=1
2） 三重态, S=1则 2S+1=3
A.跃迁时通常自旋不变, 即单一态 ?单
一态；
B.激发过程中自旋方向被倒转或改变了,
则为三重态；
C.三重态的能量比相应的单一态高, 但
能量差要低,应该到三重态,
D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒,
跃迁几率为单重态向单一态的 10-6。
3） 振动驰豫 Vibratory Relaxation
溶质分子向溶剂转移过剩的振动能
吸收跃迁所需的时间很短 (10-15S)，
分子具有的几何形状及所处的环境还
来不及改变, 可能发生两种变化
① 直接从激发回到基态 （ 发射光子 ）
10-9~10-7S
② 发射辐射前改变振动能级,
10-11~10-13S
溶质分子向溶剂转移过剩的振动能
而发生的分子驰豫是相当快的, 在
10-11~10-13S就能无辐射而降落到
受激态最低振动能级, 因为快, 所
以溶液中分子快速振动驰豫后, 光
子发射总是由受激态的最低振动能
级发生的 。
4） 荧光 Fluorescence
分子处于受激态的最低振动能
级后, 变化之一发射光子回到基态
---荧光
波长：荧光光谱 >吸收光谱
量子效率 φ, 受激单一态的寿命在
10-9~10-7, 若无其他竞争, 则全部
受激分子发射荧光, φ =1；
实际有竞争, 0---1之间
5） 内转换,
(IC)Inter Crossing
A.全部激发能转变为热,而本身
回到基态,即 受激单一态与基态
间转换, 为 低效率过程 ;
B.受激单一态间 (能量不同的单
一态 )的内转换则为多得多的几
率过程,(主要 ）
6） 系内转换 (ISC)
ISC:单一态与 三重态 间的转换
对 三重态布居粒子的高效途径
是与 回到基态发生争夺 。
状态的改变是禁戒的, 但发射
光子回到基态需要 10-9--10-7S,
而内交换只需 10-13S,比发射光
子的时间更短,所以系内交换可
与荧光发射进行竞争 。
?一般来说系内交换的几率愈
大 小取决于：
?最低能量受激单一态与三重
态的能量间隔愈小 ;
?最低能量受激单一态的寿命
愈长,(即发射光子愈 慢 ) 几
率愈大 。
7） 磷光 phosphorescence
受激三重态上的粒子回到单一态
基态的形式是被禁戒的,但还是可
发生的
原因：寿命很长 (10-3S)及 Δ E小,
总结,原理 2步
① 激发 λ ex,
② 发射 λ em,发时竞争
(jablonskii)杰不朗斯基的图解
三,量子效率,(在定量计算先讨论 Ф)
? 影响发生的因素总的是内交换,(IC
和 ISC)。衡量发生的效率如何前已
提到，以量子效率 Ф来判断；数值
在 0— 1。其公式为
? 公式 Ф=
? k：为速率常数,竞争由时间的快慢
起重要作用,因此以其各影响因素的
速率常数体现,
?
xcf
f
kkk
k
??
Ф=
Kf:荧光发生过程
Kx,系内交联的 ISC过程
Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失
过程或讲将其激发能转变为热能过程的
IC过程。
Kf>>Kc和 Kx Фf-?1，
Kc或 Kx>> Kf 则 Фf-?0 无荧光
Kf大小影响 Фf的大小
xcf
f
kkk
k
??
3.影响 k的因素,
1） Kf为最低受激单一态与基态之间
跃迁几率大小的量度。
Δεmax(摩尔吸光系数 )
当 ε max变小时,可预期 Kf也相应变小；
π?π*吸收带的 ε max大于 n?π *,
大约大 10倍,
∴ π?π *的 Kf远比后者大
2） Kx ISC的几率的大小强烈依赖单
一态和三重态之间的能量大小。能量
差愈小，则 ISC几率大,Kx变大
3） Kc受环境因素的影响最为强烈，
主要影响是 T。
∴ 随 T变大碰撞变多，无辐射去激活
的几率增大。 Kc增大。
大量实验证实：大多数分子，随 T升
高。 Фf会变小。
四．荧光发光光谱仪的构造：
待测的化学物系盛在玻璃或石英容
器中 。 和 UV类似 。 样品由激光光源发生
的紫外或可见光激发 。 光源通常是高压
氙弧灯 。 或高压汞弧灯 。 再用单色器,
选择合适的激发光波长区 。 荧光的发射
是向所有方向的, 现放在与激发光轴成
直角放置的发射光单色器只能收集到所
发冷光的一小部分 。 由发射光单色器选
出要进行测量的发光波电区 。 检测由光
电倍增管, 再将所得信号放大, 并显示
描绘出 。
五．荧光的定量分析,
公式,I f=ФfIa Ia:所吸收的光的强度 ;
I0:入射光的强度 It:透射光的强度
UV中 T= It/ I0=10-ε bc It= I0·10-ε bc
Ia= I0- It= I0（ 1- 10-ε bc）
若将指数项展开为级数。当吸光物质视为稀溶液
即 C?0则可忽略幂次高于 1的所有项，则上式 为
I f =2.303ФfI0-ε bc
I f =2.303ФfI0-ε bc
? 同时 在 c浓度小时,I f~C成 线 性关系,I f
跟 I0成正比 ∴ I0增大可提高灵敏度。
此定量分析，除多了个量子效率，
跟紫外定量一致，又对于同一种物
质时,在同一条件，仪器,T.溶剂均一
致则 Фf应一致。
2,实例,I f~C
经上公式推算, 实质和紫外
一致 。 在实际测量中 。 在找准
λ em波长带,找到 λ ex(max).
即可以 UV类似方法定量,如
不同在于弛豫后波长 -?红移
1.药物（西药类）
A.采用荧光分光光度法测定奥沙普
嗪肠溶胶囊的含量, 测定波长为
Ex=287.0nm,Em=368.0nm。
B,SMZ λ ex=400nm,λ em=510nm
C.替硝唑 λ ex=360nm,λ em=420nm
D,氟 康 矬 λ ex=261nm,
λ em=284nm
2.药物（中药）
A.测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚，
通过选取适当的光谱校正点可扣除厚
朴酚与和厚朴酚的光谱干扰和背景干
扰,方法用于生药厚朴中厚朴酚与和厚
朴酚的测定．
B.香内酯荧光分光法定量分析，其发射
光谱 λem=(385± 1)nm,λex=301nm或
激发光谱 λex,(328± 1)nm,λem：
425nm
3.无机元素
A.测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨
梅黄素在磷酸介质中形成配合物，此配合
物在乙醇溶液中具有较强的荧光强度，
λEx=446nm,λEm=506nm。
B.海藻产品中的硒，采用荧光分光光度法测
定海藻产品中的硒含量。
C.探讨耐药逆转剂对耐药细胞 K562／ A02内
游离钙离子 ([Ca^2+]i)浓度的影响 。
4.医学上
A.探讨谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX)模拟物．环糊精
(2-Se-CD)对中波紫外线损伤的防护作用。以小鼠
成纤维细胞 (NIH3T3)制备紫外线损伤模型，采用
荧光分光光度法测定 DNA裂解率，改良硫代巴比
妥酸荧光法测定细胞脂质过氧化作用，流式细胞
术测定 H2O2。
B.采用最新合成的荧光试剂与大白鼠组织及食物中 α
－二羧基类化合物生成荧光诱导体，然后用以相
ＨＰＬＣ－荧光对大白鼠组织及食物中的乙二醛，
甲基乙二醛,二乙酰和２，３－二酰丙酮４种 α
－二羧基类化合物同时进行分离定量检出，荧光
检出波长为 λEx=350nm,λEm=390nm,
5.药代动力学
A.建立测定大鼠血浆中环丙沙星的
RP-HPLC荧光检测法和研究其体
内的药物动力学。荧光检测，
λEX=276nm,λEM=448nm。
B.测定血液中左氧氟沙星的 HPLC
荧光检测法和研究其体内的药物
动力学。荧光检测,λEX=315nm,
λEM=440nm。
测血清中心律平含量,以往有用
HPLC法测,此法,a.前处理麻烦,b.
成批测量较好, 而改用荧光衍生
化薄层色谱测时, 用丹磺酰肼对
心律平中的羰基衍生化,则可克
服以上缺点,在后面讲到最新的
荧光测定可进行薄层色谱测定,
六,荧光光度计的发展
发展,1928年第一台光电荧光计问
世以来,经过三阶段,
1.手动式,
2.自动扫描
3.微机化
随科技发展,激光,微机,电子学等
新技术引进,推动了理论上的发展,
1,分辨率提高：
① 48000S可测荧光寿命范围
15μ s ～ 5ps,分辨率达
± 2.5ps.
② 48000SGH2型可测荧光寿命
范围 5.2μ s～ 1ps,分辨率达
± 0.5ps.
2.扫描速度加快
日立的 F-4500型其中三维荧
光测定为固有装置,扫描速度
达 30000nm/min∴ 三维荧光测
量只需 2～ 3 min.
3.多功能：
PE公司的 LS-50B发光分析仪,可同机
进行荧光, 磷光和化学发光测量,
利用光纤传感的平板扫描仪附件还
可进行薄层色谱分离斑点的扫描测
定；采用 8.3W的脉冲氙灯, 同机可
测磷光；相应的软件能获得三维方
式或文件轮廓显示的谱图,
4.促使应用技术的扩展
① 时间分辨 (相分辨 )
② 荧光偏振 (荧光免疫 )
③ 同步荧光
④ 三维荧光和
⑤ (美 SLM亚明科公司,)荧光光纤化
学传感器等分析新方法相继出现
10-6S级荧光寿命的测定 。
荧光测量新技术及应用,
荧光偏振及各向异性,
1.在偏振光的激发下,荧光体所发射的荧
光在空间不同取向的强度不同,亦是偏振
光,
2.荧光偏振值 P和各向异性 r的公式
P=I1-I2/ I1+I2 r= I1-I2/ I1+2I2
式中 I1和 I2分别为检偏器的取向平行或垂
直于起偏器取向时所观察到的荧光强度,
3.荧光偏振不仅与荧光体分子形状大小,
荧光体吸光对偏振激光的取向, 光选择性
以及许多外界因素都有关, 用处很大,比
如环境的粘度等都会影响和改变其偏振度,
从而在生化领域中获得广泛的应用,
应用
?① 大小,可用于确定生物分子间的缔合反应
量 (缔合量大,则转速小,偏振度加大 )
?② 粘度,膜内微粘度对偏振影响
?③ 对蛋白质的衰变和转动速度的研究,在荧
光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比,
此用于荧光免疫分析,
?如,当小分子荧光体联接到大分子蛋白质或
抗体上以后,由于体积变大,分子转动速度
变慢,偏振度增大 ;若样品中存在小分子的
抗原,则就有可能抗原把联在抗体大分子上
的荧光体夺走,结果偏振度又下降,从而可
用于抗原或抗体的测定,
时间分辨荧光光谱
时间 分辨荧光光谱技术是基
于不同发光体发光衰减速度不
同,寿命不同,在进行这种测量
时要求带有时间延迟设备的脉
冲光源和带有门控时间电路的
检测器件,从而可在固定延迟
时间 td和门控时间 tg,用发射
单色器进行扫描,可得到时间
分辨发射光谱 。
作用,
A.可对发射光谱重叠但寿命有差异的组
分进行分辨和分别测定,
B.固定发射波长对门控时间进行扫描,
从而可得到荧光强度随时间的衰变曲
线和给定时间处的荧光发射谱,可用于
荧光寿命得测量和 relaxafion时间的
测量等,
C.时间分辨荧光技术还能利用不同光体
形成速率的不同进行选择性测定, 排
干扰 。
如 Th,Zr,Al络和物荧光时间分辨率图时间分辨荧光技术还能利用不同发光体形成速率
的不同进行选择性测定,钍 -桑色素 -ToPo-SLS体系,利用时间分辨荧光法消除铝,皓等的
干扰,测定水中痕量钍的荧光时间分辨图,从图可见,在 12 S内测定荧光信号可消除铝,皓
等的影响,近年国内药物分析杂志存在以桑色素 -锗去测其含量
同步扫描,
根据激发光和发射单色器在扫描过
程中彼此间所保持的关系
同步扫描技术分类,① 固定波长差
② 固定能量差 ③ 可变角三类,
优点,① 使光谱简化 ② 谱带窄化,提
高分辨率,③ 减少光谱重叠 ④ 提高
选择性,减少散射光的影响等
应用
例如 ;酪安酸和色氨酸的荧光光激发
谱很相似,发射光谱又严重重叠,但
△ λ <15nm时的同步光谱只显示酪
氨酸的光谱特征,△ λ,60nm的同
步光谱只呈现色氨酸的光谱特征,
从而实现分别测定,
谢谢大家！
F l o u r e s c e n c e
一, 简介,
二, 荧光发光的原理,
三, 量子效率,
四, 荧光发光光谱仪的构造,
五, 荧光的定量分析,
六, 荧光光度计的发展
简介
1.和 UV异同点
2.荧光分析法主要
应用范围与常用方法
3.优势
1.与 UV异同点
1)构造与 UV很相似,
属于分光光度法,光源,单色器等
2)组件的布置稍有不同
荧光采用激发光和发射光
成直角的直角光路,,
3)原理也不一样,这在后面介绍
2.荧光分析法主要应用范围
1） 生物技术的分析,免疫技术的分
析,如 DNA,抗体, 抗原等 ;
2） 痕量元素的分析, 如 70多种无
机元素；
3） 间接测定众多的有机物, 包括
药物 。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（ X射线）
2.原子荧光分析（激光）
3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1） 灵敏度高：比 UV高 2~~3个
数量级,
2） 信息多, 激发分光光谱 （ 信
息同于 UV）, 发射光光谱的发
光强度, 发光寿命, 量子效率,
荧光偏振等多种信息,定性更好 ;
3）工作曲线的线性范围宽（定量
更准） 应用范围也广微量元素的
分析、医药、环境,石油工业等能
直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采
用间接法,
伯乐公司的 Labeled DNA的荧光标
记物 Labeling kits.
荧光发光的原理,
激发和发射过程
1.激发过程：
① 基态：能量最低状态 S0
② 激发态,电子处于反键轨道上为激
发态
最有意义的为 π?π *和 n?π *过程
电子激发过程很快, 10-15 S，
不稳定 。
2.发射过程
当激发态在返回基态时, 伴有光子
的辐射称为发光过程, 又称发射过
程 。
荧光和磷光均为此种光致发光
过程 。 (又称冷光 )
实际从激发态回到基态过程充
满竞争 。
(jablonskii)杰不朗斯基的图解
S,基态 S*激发态
S0,基态 F,荧光 P:磷光
S1:为单一态的低能级
T,三重态 Three
VR:振动驰豫 Vibratory Relaxation
内转换, Inter Crossing
系内转换：
Inter System Crossing
1） 单一态
激发过程中,当 S=0时为单一态,
① S原子光谱谱项符号量子数 S 的
2S+1表示谱项的多重性,
② 自旋量子数 ms（ 电子 ）
可取值只有 ± 1/2（ 即顺旋或反旋 ）
③ 自旋的两种状态,
当自旋配对时,S=0,不配对则 S=1
2） 三重态, S=1则 2S+1=3
A.跃迁时通常自旋不变, 即单一态 ?单
一态；
B.激发过程中自旋方向被倒转或改变了,
则为三重态；
C.三重态的能量比相应的单一态高, 但
能量差要低,应该到三重态,
D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒,
跃迁几率为单重态向单一态的 10-6。
3） 振动驰豫 Vibratory Relaxation
溶质分子向溶剂转移过剩的振动能
吸收跃迁所需的时间很短 (10-15S)，
分子具有的几何形状及所处的环境还
来不及改变, 可能发生两种变化
① 直接从激发回到基态 （ 发射光子 ）
10-9~10-7S
② 发射辐射前改变振动能级,
10-11~10-13S
溶质分子向溶剂转移过剩的振动能
而发生的分子驰豫是相当快的, 在
10-11~10-13S就能无辐射而降落到
受激态最低振动能级, 因为快, 所
以溶液中分子快速振动驰豫后, 光
子发射总是由受激态的最低振动能
级发生的 。
4） 荧光 Fluorescence
分子处于受激态的最低振动能
级后, 变化之一发射光子回到基态
---荧光
波长：荧光光谱 >吸收光谱
量子效率 φ, 受激单一态的寿命在
10-9~10-7, 若无其他竞争, 则全部
受激分子发射荧光, φ =1；
实际有竞争, 0---1之间
5） 内转换,
(IC)Inter Crossing
A.全部激发能转变为热,而本身
回到基态,即 受激单一态与基态
间转换, 为 低效率过程 ;
B.受激单一态间 (能量不同的单
一态 )的内转换则为多得多的几
率过程,(主要 ）
6） 系内转换 (ISC)
ISC:单一态与 三重态 间的转换
对 三重态布居粒子的高效途径
是与 回到基态发生争夺 。
状态的改变是禁戒的, 但发射
光子回到基态需要 10-9--10-7S,
而内交换只需 10-13S,比发射光
子的时间更短,所以系内交换可
与荧光发射进行竞争 。
?一般来说系内交换的几率愈
大 小取决于：
?最低能量受激单一态与三重
态的能量间隔愈小 ;
?最低能量受激单一态的寿命
愈长,(即发射光子愈 慢 ) 几
率愈大 。
7） 磷光 phosphorescence
受激三重态上的粒子回到单一态
基态的形式是被禁戒的,但还是可
发生的
原因：寿命很长 (10-3S)及 Δ E小,
总结,原理 2步
① 激发 λ ex,
② 发射 λ em,发时竞争
(jablonskii)杰不朗斯基的图解
三,量子效率,(在定量计算先讨论 Ф)
? 影响发生的因素总的是内交换,(IC
和 ISC)。衡量发生的效率如何前已
提到，以量子效率 Ф来判断；数值
在 0— 1。其公式为
? 公式 Ф=
? k：为速率常数,竞争由时间的快慢
起重要作用,因此以其各影响因素的
速率常数体现,
?
xcf
f
kkk
k
??
Ф=
Kf:荧光发生过程
Kx,系内交联的 ISC过程
Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失
过程或讲将其激发能转变为热能过程的
IC过程。
Kf>>Kc和 Kx Фf-?1，
Kc或 Kx>> Kf 则 Фf-?0 无荧光
Kf大小影响 Фf的大小
xcf
f
kkk
k
??
3.影响 k的因素,
1） Kf为最低受激单一态与基态之间
跃迁几率大小的量度。
Δεmax(摩尔吸光系数 )
当 ε max变小时,可预期 Kf也相应变小；
π?π*吸收带的 ε max大于 n?π *,
大约大 10倍,
∴ π?π *的 Kf远比后者大
2） Kx ISC的几率的大小强烈依赖单
一态和三重态之间的能量大小。能量
差愈小，则 ISC几率大,Kx变大
3） Kc受环境因素的影响最为强烈，
主要影响是 T。
∴ 随 T变大碰撞变多，无辐射去激活
的几率增大。 Kc增大。
大量实验证实：大多数分子，随 T升
高。 Фf会变小。
四．荧光发光光谱仪的构造：
待测的化学物系盛在玻璃或石英容
器中 。 和 UV类似 。 样品由激光光源发生
的紫外或可见光激发 。 光源通常是高压
氙弧灯 。 或高压汞弧灯 。 再用单色器,
选择合适的激发光波长区 。 荧光的发射
是向所有方向的, 现放在与激发光轴成
直角放置的发射光单色器只能收集到所
发冷光的一小部分 。 由发射光单色器选
出要进行测量的发光波电区 。 检测由光
电倍增管, 再将所得信号放大, 并显示
描绘出 。
五．荧光的定量分析,
公式,I f=ФfIa Ia:所吸收的光的强度 ;
I0:入射光的强度 It:透射光的强度
UV中 T= It/ I0=10-ε bc It= I0·10-ε bc
Ia= I0- It= I0（ 1- 10-ε bc）
若将指数项展开为级数。当吸光物质视为稀溶液
即 C?0则可忽略幂次高于 1的所有项，则上式 为
I f =2.303ФfI0-ε bc
I f =2.303ФfI0-ε bc
? 同时 在 c浓度小时,I f~C成 线 性关系,I f
跟 I0成正比 ∴ I0增大可提高灵敏度。
此定量分析，除多了个量子效率，
跟紫外定量一致，又对于同一种物
质时,在同一条件，仪器,T.溶剂均一
致则 Фf应一致。
2,实例,I f~C
经上公式推算, 实质和紫外
一致 。 在实际测量中 。 在找准
λ em波长带,找到 λ ex(max).
即可以 UV类似方法定量,如
不同在于弛豫后波长 -?红移
1.药物（西药类）
A.采用荧光分光光度法测定奥沙普
嗪肠溶胶囊的含量, 测定波长为
Ex=287.0nm,Em=368.0nm。
B,SMZ λ ex=400nm,λ em=510nm
C.替硝唑 λ ex=360nm,λ em=420nm
D,氟 康 矬 λ ex=261nm,
λ em=284nm
2.药物（中药）
A.测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚，
通过选取适当的光谱校正点可扣除厚
朴酚与和厚朴酚的光谱干扰和背景干
扰,方法用于生药厚朴中厚朴酚与和厚
朴酚的测定．
B.香内酯荧光分光法定量分析，其发射
光谱 λem=(385± 1)nm,λex=301nm或
激发光谱 λex,(328± 1)nm,λem：
425nm
3.无机元素
A.测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨
梅黄素在磷酸介质中形成配合物，此配合
物在乙醇溶液中具有较强的荧光强度，
λEx=446nm,λEm=506nm。
B.海藻产品中的硒，采用荧光分光光度法测
定海藻产品中的硒含量。
C.探讨耐药逆转剂对耐药细胞 K562／ A02内
游离钙离子 ([Ca^2+]i)浓度的影响 。
4.医学上
A.探讨谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX)模拟物．环糊精
(2-Se-CD)对中波紫外线损伤的防护作用。以小鼠
成纤维细胞 (NIH3T3)制备紫外线损伤模型，采用
荧光分光光度法测定 DNA裂解率，改良硫代巴比
妥酸荧光法测定细胞脂质过氧化作用，流式细胞
术测定 H2O2。
B.采用最新合成的荧光试剂与大白鼠组织及食物中 α
－二羧基类化合物生成荧光诱导体，然后用以相
ＨＰＬＣ－荧光对大白鼠组织及食物中的乙二醛，
甲基乙二醛,二乙酰和２，３－二酰丙酮４种 α
－二羧基类化合物同时进行分离定量检出，荧光
检出波长为 λEx=350nm,λEm=390nm,
5.药代动力学
A.建立测定大鼠血浆中环丙沙星的
RP-HPLC荧光检测法和研究其体
内的药物动力学。荧光检测，
λEX=276nm,λEM=448nm。
B.测定血液中左氧氟沙星的 HPLC
荧光检测法和研究其体内的药物
动力学。荧光检测,λEX=315nm,
λEM=440nm。
测血清中心律平含量,以往有用
HPLC法测,此法,a.前处理麻烦,b.
成批测量较好, 而改用荧光衍生
化薄层色谱测时, 用丹磺酰肼对
心律平中的羰基衍生化,则可克
服以上缺点,在后面讲到最新的
荧光测定可进行薄层色谱测定,
六,荧光光度计的发展
发展,1928年第一台光电荧光计问
世以来,经过三阶段,
1.手动式,
2.自动扫描
3.微机化
随科技发展,激光,微机,电子学等
新技术引进,推动了理论上的发展,
1,分辨率提高：
① 48000S可测荧光寿命范围
15μ s ～ 5ps,分辨率达
± 2.5ps.
② 48000SGH2型可测荧光寿命
范围 5.2μ s～ 1ps,分辨率达
± 0.5ps.
2.扫描速度加快
日立的 F-4500型其中三维荧
光测定为固有装置,扫描速度
达 30000nm/min∴ 三维荧光测
量只需 2～ 3 min.
3.多功能：
PE公司的 LS-50B发光分析仪,可同机
进行荧光, 磷光和化学发光测量,
利用光纤传感的平板扫描仪附件还
可进行薄层色谱分离斑点的扫描测
定；采用 8.3W的脉冲氙灯, 同机可
测磷光；相应的软件能获得三维方
式或文件轮廓显示的谱图,
4.促使应用技术的扩展
① 时间分辨 (相分辨 )
② 荧光偏振 (荧光免疫 )
③ 同步荧光
④ 三维荧光和
⑤ (美 SLM亚明科公司,)荧光光纤化
学传感器等分析新方法相继出现
10-6S级荧光寿命的测定 。
荧光测量新技术及应用,
荧光偏振及各向异性,
1.在偏振光的激发下,荧光体所发射的荧
光在空间不同取向的强度不同,亦是偏振
光,
2.荧光偏振值 P和各向异性 r的公式
P=I1-I2/ I1+I2 r= I1-I2/ I1+2I2
式中 I1和 I2分别为检偏器的取向平行或垂
直于起偏器取向时所观察到的荧光强度,
3.荧光偏振不仅与荧光体分子形状大小,
荧光体吸光对偏振激光的取向, 光选择性
以及许多外界因素都有关, 用处很大,比
如环境的粘度等都会影响和改变其偏振度,
从而在生化领域中获得广泛的应用,
应用
?① 大小,可用于确定生物分子间的缔合反应
量 (缔合量大,则转速小,偏振度加大 )
?② 粘度,膜内微粘度对偏振影响
?③ 对蛋白质的衰变和转动速度的研究,在荧
光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比,
此用于荧光免疫分析,
?如,当小分子荧光体联接到大分子蛋白质或
抗体上以后,由于体积变大,分子转动速度
变慢,偏振度增大 ;若样品中存在小分子的
抗原,则就有可能抗原把联在抗体大分子上
的荧光体夺走,结果偏振度又下降,从而可
用于抗原或抗体的测定,
时间分辨荧光光谱
时间 分辨荧光光谱技术是基
于不同发光体发光衰减速度不
同,寿命不同,在进行这种测量
时要求带有时间延迟设备的脉
冲光源和带有门控时间电路的
检测器件,从而可在固定延迟
时间 td和门控时间 tg,用发射
单色器进行扫描,可得到时间
分辨发射光谱 。
作用,
A.可对发射光谱重叠但寿命有差异的组
分进行分辨和分别测定,
B.固定发射波长对门控时间进行扫描,
从而可得到荧光强度随时间的衰变曲
线和给定时间处的荧光发射谱,可用于
荧光寿命得测量和 relaxafion时间的
测量等,
C.时间分辨荧光技术还能利用不同光体
形成速率的不同进行选择性测定, 排
干扰 。
如 Th,Zr,Al络和物荧光时间分辨率图时间分辨荧光技术还能利用不同发光体形成速率
的不同进行选择性测定,钍 -桑色素 -ToPo-SLS体系,利用时间分辨荧光法消除铝,皓等的
干扰,测定水中痕量钍的荧光时间分辨图,从图可见,在 12 S内测定荧光信号可消除铝,皓
等的影响,近年国内药物分析杂志存在以桑色素 -锗去测其含量
同步扫描,
根据激发光和发射单色器在扫描过
程中彼此间所保持的关系
同步扫描技术分类,① 固定波长差
② 固定能量差 ③ 可变角三类,
优点,① 使光谱简化 ② 谱带窄化,提
高分辨率,③ 减少光谱重叠 ④ 提高
选择性,减少散射光的影响等
应用
例如 ;酪安酸和色氨酸的荧光光激发
谱很相似,发射光谱又严重重叠,但
△ λ <15nm时的同步光谱只显示酪
氨酸的光谱特征,△ λ,60nm的同
步光谱只呈现色氨酸的光谱特征,
从而实现分别测定,
谢谢大家！
