生物工程专业核心课程
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
3 基因工程的基本条件
C 用于基因转移的受体菌或细胞
B 用于 基因克隆的载体
A 用于核酸操作的工具酶
A 用于核酸操作的工具酶
3 基因工程的基本条件
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
核酸酶
核酸修饰酶
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
识别双链 DNA分子中的特定序列，并切割 DNA双链
主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 DNA的入侵
细菌的限制与修饰作用
hsd R,编码限制性核酸内切酶
hsd M,编码限制性甲基化酶
hsd S,编码限制性酶和甲基化酶的协同表达
1968年,Smith等人首先从 流感嗜血杆菌 d株中分离出
Hind II和 Hind III
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的类型
主要特性 I 型 II 型 III 型
限制修饰 多功能 单功能 双功能
蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+ SAM ATP Mg2+ SAM Mg2+
识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC
AACN6GTGC CAGCAG
切割位点 距识别序列 1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割 特异性切割 24-26bp处
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名
H i n d III H i n d III
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链 DNA分子中 4 - 8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
识别切割序列呈典型的旋转对称型 回文结构
5‘ … G C T G A A T T C G A G …
3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C …
5’
EcoR I的识别序列 EcoR I的切割位点
EcoRI等产生的 5‘粘性末
端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
OH P
OH P
PstI等产生的 3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ 退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OH P
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
大部分 II 型核酸内切酶需要相似的反应条件,
Tris-HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl 0 - 150 mM
DTT 1 mM
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
150 mM 高盐酶
Volume 20 - 100 ml
T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全
水解 1 mg 标准 DNA所需的酶量
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解,
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意,
5‘
… GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘
… CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’
BamHI SmaI
5‘ … GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’
5‘ … GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解,
对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法,
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解
低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4
2.5倍体积的冰冷乙醇
冰浴 5 分钟、高速冷冻离心 10分钟、干燥
限制性核酸内切酶
影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的纯度,
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇,EDTA,SDS,NaCl等
加大酶的用量,1 mg DNA 用 10U 酶
加大反应总体积
延长反应时间
限制性核酸内切酶
影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的甲基化程度,
大肠杆菌中的 dam甲基化酶在 5‘ GATC3’序列中的腺 嘌呤 N6位
引入甲基，受其影响的酶有 Bcl I,MboI等，但 BamH I,
Bgl II,Sau3A I不受影响
大肠杆菌中的 dcm甲基化酶在 5‘ CCAGG3’或 5‘ CCTGG3’序
列 中的 胞嘧啶 C5位 上引入甲基,受其影响的酶有 EcoR II等
哺乳动物中的甲基化酶在 5‘ CG3’序列中的 C5位 上引入甲基
限制性核酸内切酶
影响限制性核酸内切酶活性的因素
核酸内切酶的缓冲液性质,
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH值 等,
会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即
所谓的 Star activity现象
EcoR I在正常条件下识别并切割 5‘ GAATTC3’序列，但在
甘 油浓度超过 5%（ v/v） 时，也可切割 5‘ PuPuATPyPy3’或
者 5‘ AATT3’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链 DNA上缺口处的磷酸二酯键
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
nick
nick
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复与 RNA链结合的 DNA链上缺口处的磷酸二酯键
T4-DNA连接酶
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C …
5’ OH P nick
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C …
5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
连接多个平头双链 DNA分子,
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
T4-DNA连接酶
DNA连接酶
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
ATP 0.5 - 1 mM
DTT 5 mM
Volume 10 - 20 ml
T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 ℃ 反应 1 小时,
完全连接 1 mg l-DNA（ Hind III片段）所需的酶量
DNA连接酶
平头双链 DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的
连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连
接，因此后者反应速度要慢得多
提高平头末端连接效率的方法包括,
加大连接酶用量（ 10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会
加入 10% PEG8000,促进大分子之间的有效作用
加入单价阳离子（ NaCl）,最终浓度 150-200 mM
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活
性 5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶
活性 3‘ →5 ‘ 的核酸外切酶活
性
大肠杆菌 DNA聚合酶 I的基本性质,
3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-OH
5‘ ppp dN
Mg2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA pol I
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
缺口前移标记法
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的基本用途,
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a-32P-dATP
）
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Nick translation
制备 32P标记的探针 DNase I
DNA pol I
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本性质,
大肠杆菌 DNA聚合酶 I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得 N端
三分之二的大肽段，即为 Klenow酶
Klenow酶仍拥有 5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性 和 3‘ →5 ‘
的核 核酸外切酶活性,但失去了 5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶活性
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,
补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
DNA片段的同位素末端标记
cDNA第二链的合成
双脱氧末端终止法测定 DNA序列
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow a-32P-pppdA dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA酶的基本特性,
在无 dNTP时，可以从任何 3‘ -OH端外切
在只有一种 dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止
在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性和 3‘ →5 ‘ 的核酸外切
酶活性
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,切平由核酸内切酶产生的 3’粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ T4-DNA聚合酶
5‘ … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C …
5’ 注意：该酶也能降解双链 DNA,只是其活性比单链降解活性低很多
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（ a-32P-
dATP）
5‘ G-C-T-C A-G-C-T-G-OH
HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘
T4-DNA pol
T4-DNA pol
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
DNA聚合酶
依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,以 RNA为模板聚合 cDNA链
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
反转录酶 Mg2+ dNTP
5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA
DNA聚合酶
依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,双向外切 DNA-RNA杂合链中的 RNA链
反转录酶
3’ RNA
5’ DNA 3’
5’
3’ RNA
5’ DNA 3’
5’
反转录酶
5’ DNA 3’
核酸酶
单链核酸外切酶：核酸外切酶 VII（ ExoVII）
大肠杆菌的核酸外切酶 VII不需要 Mg2+
ExoVII
3’
5’ 3’
5’
3’
5’ 3’
5’
核酸酶
双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ ExoIII）
ExoVII
3’
5’ 3’
5’
Mg2+
3’
5’ 3’
5’
大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从 3‘ 端外切
核酸酶
双链核酸外切酶,l 核酸外切酶 （ lExo）
lExo
3’
5’ 3’
5’
Mg2+
l核酸外切酶特异性地从 5‘ 端外切
3’
5’ 3’
5’
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（ Aspergillus oryzae）
Zn2+必需
最适 pH范围为 4.0 - 4.3
需要 NaCl 10 - 300 mM
降解单链 DNA的速度比降解双链 DNA快 75000倍
降解单链 DNA的速度比降解单链 RNA快 7倍
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切单链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’
S1 Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T…
3’
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切带缺口或缺刻的双链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T…
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A…
5‘
nick
gap
S1
Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-
G 3‘ … C-G-A-G-T-
C
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A…
5‘
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的重要用途,在 DNA上定位 RNA（ S1 mapping）
DNA
mRNA
杂交
S1
EcoRI
核酸酶
单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（ A.espejiana）
Ca2+
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
ssDNA or RNA
Ca2+
Ca2+
核酸酶
单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的基本用途：诱发 DNA突变
EcoRI A
B C
EcoRI EcoRI
B C A
Bal31
B C A
环化
A
C
核酸修饰酶
末端脱氧核苷酰转移酶（ TdT）
TdT的基本特性：来自小牛胸腺
不需要模板的 DNA聚合酶,随机掺入 dNTPs
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Mg2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘
TdT的基本特性,
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO AAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘ AAAAAAAAAAA
核酸修饰酶
碱性磷酸单酯酶
来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（ CIP）
来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（ BAP）
5‘ p OH 3‘
DNA or RNA
5‘ ppp dN
5‘ pppN
BAP / CIP
OH 3‘ 5‘ HO
5‘ HO dN
5‘ HO N
核酸修饰酶
T4-多核苷酸磷酸激酶（ T4-PNP）
T4-PNP的基本特性：在 DNA,RNA,dNR,NR的 5‘ -OH上加
磷
5‘ HO
3‘ HO
OH 3‘
OH 5‘
T4-PNP Mg2+ pppATP（ g-32P-ATP）
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
用于探针的末端同位素标记,
B 用于基因克隆的载体
3 基因工程的基本条件
质粒（ plasmid）
噬菌体或病毒 DNA
考斯质粒（ cosmid） 与噬菌粒
人造染色体载体
载体的功能及特征
载体的功能及特征
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体的功能及特征
载体应具备的条件
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有合适的筛选标记
具有较 高的外源 DNA的载装能力
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
质粒
质粒的基本特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并
被稳定遗传的一类核酸分子
质粒常见于原核细菌和真菌中
绝大多数的质粒是 DNA型的
绝大多数的天然 DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构,
即 cccDNA
质粒 DNA的分子量范围,1 - 300 kb
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自主复制
质粒 DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为
两大复制类型,
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
rop
（ +）
Rop
RNA II
RNA I
3’
5’
5’
3’
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制
控制复制起始因子与复制起始位点（ ori） 的结合
Pcop cop P/Orep rep ori
Cop Rep
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于
一个细胞中，这种现象称为 质粒的不相容性,不相容性的质
以大肠杆菌的质粒为例,
ColE1,pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101,F,RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
粒组成 不相容性群
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性,分子机制
两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种
拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同,
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的
拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定,
因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一
细胞内
其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒
质粒的基本特征
质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类,
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到
另一个细胞（接合作用），如 F,Col,R质粒等
如 Col,R的其它成员
非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用
值得注意的是，某些非接合型质粒（ ColE1） 在接合型质粒
的存在和协助下，也能发生 DNA转移，这个过程由 bom 和
mob 基因决定
质粒
质粒的基本特征
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒 DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括,
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对 DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒
质粒的构建
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点
少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往
往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构
建的,
pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr
ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1
RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr
质粒
质粒的分类
人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类,
高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数 1000-3000 扩增基因
低拷贝质粒 来自 pSC101 拷贝数小于 10 表达某些毒性基因
温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质
测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头 polylinker
整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合
穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆
表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件
探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
松弛型复制
pBR3 2 2
4 3 6 3 b p
Or ig in o f Rep lic a t io n
ROP
ROI
S a l I
Bam H I
Tc
r
P v u I
P s t I
P s t I
E c o R I
Cla I
Hin d II I
Hin d II
Bal I
Ap
r
pBR322,
氯霉素可扩增
拷贝数 50 - 100 / cell
用于基因克隆
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19,
拷贝数 2000 - 3000 / cell
用于基因克隆和测序
装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
B a m HI
pU C 18
2 6 8 6 b p
Ap
r
l a c Z'
ori
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
396 452
E coRI S stI K p n I S m a I X b a I S a lI P stI S p h I Hi n d III
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19,正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/19
Plac lacZ’ MCS
b-半乳糖苷酶的 a-肽段 a b
O
H
H
H
OH
H
O H
H O H
CH 2 OH
O
N
Cl
Br
Cl
Br
Cl
Br
O
N
N
5-溴 -4-氯 -3-吲哚基 -b-D-半乳糖苷
X-gal
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z,
多拷贝
装有两个噬菌体的强启动子
装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
用于外源基因的高效表达
注意,T7和 SP6启动子特异性地由噬菌体 DNA编码的 RNA聚合
2743 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
pGEM-3E PSP6
酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如,
E.coli BL21（ DE3） 等
质粒
质粒 DNA的分离纯化
实验室一般使用下列三种方法制备质粒 DNA,
氯化铯密度梯度离心法
质粒 DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染
碱溶法
质粒 DNA纯度底、快速、操作简便
沸水浴法
质粒 DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间
质粒
质粒 DNA的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法,
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加 CsCl和溴乙锭
超速离心过夜
在紫外灯下吸取 cccDNA
稀释沉淀 cccDNA
proteins
ocDNA
L-DNA
cccDNA
RNAs
质粒
质粒 DNA的分离纯化
碱溶法,
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加 NaOH和 SDS的混合溶液，去膜释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染
色体 DNA及大部分蛋白质
离心取上清液，用苯酚 -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质
乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 DNA
用无 DNase的 RNase去除残余的 RNA
cccDNA
L-DNA ocDNA
D-DNA T-DNA
质粒
质粒 DNA的分离纯化
沸水浴法,
用含有 EDTA和 Triton X-100的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁
沸水浴 40秒钟
离心，用无菌牙签挑去沉淀物
乙醇或异丙醇沉淀质粒 DNA
噬菌体或病毒 DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染
宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏
起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。
噬菌体或病毒的上述特性使得它们的 DNA能被开发成为基因工
程的有用载体，因为,
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞
自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体的生物学特性,生物结构
l 噬菌体是 大肠杆菌的温和型噬菌体
l 噬菌体 由外壳包装蛋白和 l-DNA组成
l-DNA全长 48502个核苷酸
l-DNA上 至少有 61个基因
l 噬菌体生物学特性,生物结构
5’ TCCAGCGGCGGGG 3’
3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS
COS
cos 头部合成基因
尾部合成基因
溶菌控制基因
晚期控制基因
DNA合成控制 基因
阻遏基因
早期控制基因
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
l - DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期
E.coli
吸附 LamB受体
注入 复制
包装
裂解
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期
体内包装
100个左右的拷贝
包装范围为原 DNA的 75 - 105%
即 36 - 51 kb
D
A
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,溶原状态
l噬菌体感染大肠杆菌后, 除能裂解细胞外, 也可能将其
DNA直接整合到宿主细胞的染色体 DNA上, 并不产生子代噬菌
体颗粒, 这种情况为 溶原状态 。 整合主要由 l-DNA上的 cI和 int
两基因的产物所激活, 而这两个基因的开放与关闭又取决于宿
主细胞本身的性质 。 人们可以根据需要改变 l-DNA或宿主细胞
的性质, 使噬菌体或处于 溶菌状态, 或处于溶菌状态
DNA重组技术一般需要 l噬菌体进入溶菌状态
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度
野生型 l-DNA包装的上限为 51kb,本身长度为 48.5kb,只有
当插入的外源 DNA片段不大于 2.5kb时, 才能被包装成有感染
力的噬菌体颗粒 。 因此缩短野生型 l-DNA的长度, 可以提高装
载量 。 其实野生型 l-DNA上约有 40-50%的片段是复制和裂解
所非必需的 。 根据切除的多少, 可将 l-DNA分成两大类载体,
插入型载体
取代型载体
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 插入型载体
体外包装 插入位点
体外包装 插入片段
载体长度 37 kb
插入片段大小,
0 - 14 kb
（ 51 – 37）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 取代型载体
体外包装
体外包装 插入片段
最小装载长度 10 kb
（ 51 – 26）
载体长度 26 kb
插入片段
最大装载长度 25 kb
（ 36 – 26）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,删除重复的酶切位点
野生型的 l-DNA链上有 5个 EcoRI位点和 7个 HindIII位点，不
利于重组操作，必须删除至 1 - 2个
同时，为了便于各种来源的 DNA片段的克隆，还需要增加一
些单一的酶切位点
除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶
位点
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记
与质粒不同，野生型 l-DNA上缺少合适的选择标记，因此
加装 选择标记是 l-DNA克隆载体构建的重要内容
l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类,
免疫功能类标记
颜色反应类标记
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 imm434
imm434基因编码一种阻止 l-噬菌体
进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记
基因的 l-载体进入受体细胞后，建立溶
原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源 DNA插入到标记基因中，基因灭
活,l-重组分子便进入溶菌循环，形成
透明斑
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 lacZ
lacZ基因编码 b-半乳糖苷酶，能催化
无色的 X-gal生成蓝色化合物。当外源基
因插入到 lacZ基因中，基因灭活，不能
合成蓝色化合物；而空载体 l-DNA则产
生蓝色透明斑
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,构建琥珀密码子的突变体
琥珀型突变 （ sup)是指由 CAG（ Gln） 向 UAG（ stop） 的突变 。
大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因, 其编码产物校正
tRNA能专一性地纠正这一突变 。
将野生型 l-DNA上 D和 E两个头部包装蛋白的基因中的 CAG密码
子突变成 UAG。 当这种 l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后, 不
能合成有活性的头部蛋白, 也就不能被包装和裂解细菌, 这样就
可以阻止有害重组体的生物污染及扩散, 而基因工程实验中使用
的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的主要类型,
插入灭活型载体 Charon2,Charon6,lgt11
取代型载体 lEMBL4,lgtlc,lNM762,Charon40
正选择型载体 lEMBL1,lL47,l1059
野生型的 l噬菌体不能在 P2噬菌体溶源性 的细菌中繁殖（ Spi+）,
这种生长抑制表型受 l-DNA上的 red和 gam两个基因控制。若将外
源 DNA取代 red和 gam,重组 噬菌体便拥有 Spi-表型，能在 P2噬菌
体 溶源性 的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA重组分子的体外包装,
l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗
粒, 方可高效导入受体细胞
用于体外包装的蛋白质可直接从感染了 l噬菌体的大肠杆菌中提
取, 现已商品化 。 这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：
一部分缺少 E组份, 另一部分则缺少 D组份 。 包装时, 当且仅当
这两部分包装蛋白与重组 l-DNA分子混合后, 包装才能有效进
行, 任何一种蛋白包装液被重组 l-DNA污染后, 均不能被包装
成有感染力的噬菌体颗粒, 这也是基于安全而设计的
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA及其重组分子的分离纯化,
将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期
加入 l噬菌体或重组 l噬菌体的悬浮液,37℃ 培养 1小时
用新鲜培养基稀释，继续培养 4 -12小时。这时噬菌体颗粒
密度已达 1013 -1014 / L,大肠杆菌细胞已完全裂解
超速离心，沉淀噬菌体
苯酚抽提，释放 l-DNA
乙醇或异丙醇沉淀 l-DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA作为载体的优点,
l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌
l-DNA载体的装载能力为 25 kb,远远大于质粒的装载量
重组 l-DNA分子 的筛选较为方便
重组 l-DNA分子的提取较为简便
l-DNA载体适合克隆和扩增外源 DNA片段，但不适合表达
外源基因
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,生物结构
M13噬菌体的外型呈丝状
M13 噬菌体 由外壳包装蛋白和 正 链 DNA组成
M13 DNA全长 6407个核苷酸
M13 DNA上 至少有 10个基因
2700个外壳蛋白分子
M13 噬菌体 不裂解宿主细胞，但抑制其生长
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,感染周期
+ DNA
（ +） DNA
RFDNA RFDNA
RFDNA - DNA
II
V
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的构建,
III VI I IV II X V VII IX VIII
野生型 M13RF-DNA
III VI I IV II X V VII IX VIII
M13mp系列载体
lacZ‘ polylinker
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的特点,
使克隆的 DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外
这在 DNA定向突变中非常有用
M13重组分子筛选简便
被 M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混
浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊
斑的混浊度亦越大
但 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 1.5 kb
噬菌体或病毒 DNA
与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病
毒基因组 DNA。
动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病
毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类,
单链 DNA病毒 双链 DNA病毒
单链 RNA病毒 双链 RNA病毒
RNA病毒在自我复制时大多存在相应的 DNA中间反应物,
这些中间体可作为载体进行常规的 DNA重组。
考斯质粒与噬菌粒
l-DNA载体和 M13-DNA载体的装载量最大分别为 25 kb和
1.5 kb,但在很多情况下，往往需要 克隆更大的外源 DNA片段,
考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体 DNA
的装载量。
在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体 DNA的长度,
就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体 DNA与包装有关的序
列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时
又能保证重组 DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这
便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒
和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子在细胞内
不能形成噬菌体颗粒。
考斯质粒与噬菌粒
考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的构建,
考斯质粒是一类人工构建的含有
1978年 Collins和 Hohn发明构建
pHC79
6400 bp
Tcr
l fragment cos
ori
Apr PstI
BamHI
SalI
l-DNA cos序列和 质粒复制子的
特殊类型的载体
cos site - carrying plasmid
1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段
装载范围为 31 - 45 kb
考斯质粒与噬菌粒
考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的特点,
能像 l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞
装载量大（ 45 kb） 且克隆片段具有一定的大小范围
能像质粒那样在受体细胞 中自主复制
重组操作简便，筛选容易
不能体内包装，不裂解 受体细胞
考斯质粒与噬菌粒
噬菌粒（ phagemid or phasmid）
噬菌粒载体的特点,
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体 包装序列、复制子
以及 质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体
能像 M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞
装载量比常规的 M13mp系列要大很多（ 10 kb）
能像质粒那样在受体细胞 中自主复制
重组操作简便，筛选容易
通过克隆双链 DNA能获得同等长度的单一单链 DNA
考斯质粒与噬菌粒
噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pUC118 / 119
pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG
pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG
500 个拷贝
3200 bp
MCS
lacZ’
lacI
ori
Apr
M13-MG
pUC118 / 119
表示 M13辅助噬菌体 DNA
考斯质粒与噬菌粒
噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pBluescript 体外转录载体
pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7
2958 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
f1-ori
pBluescript PT3
噬菌体启动子 PT3和 PT7强化外
源基因的转录
提取出来的单链 DNA重组分子
在噬菌体 RNA聚合酶的存
在下，又可实现外源基因
的体外转录
人造染色体载体
人类、动物、植物的全基因组序列分析往往 需要 克隆数百
甚至上千 kb 的 DNA片段,此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载
量也远远不能满足需要。
将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳
定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外
源 DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体,
它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
目前常用的人造染色体载体包括,
细菌人造染色体（ BAC）
酵母人造染色体（ YAC）
人造染色体载体
细菌人造染色体（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC）
细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子 F质粒的基础上
构建的，其装载量范围在 50 - 300 kb之间
各种类型的 pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝
pBACs主要适用于,
克隆大型基因簇（ gene cluster） 结构
构建动植物基因文库
人造染色体载体
酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
YAC载体应含有下列元件,
酵母染色体的端粒序列
酵母人造染色体的构建,
pYAC4
CEN4
EcoRI
URA3
TEL BamHI TEL
ori
Apr
TRP1
ARS1
酵母染色体的复制子
酵母染色体的中心粒序列
酵母系统的 选择标记
大肠杆菌的复制子
大肠杆菌的 选择标记
YAC载体的装载量为 350 - 400 kb
人造染色体载体
酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
酵母人造染色体的使用,
pYAC4
CEN
EcoRI
URA
TEL BamHI TEL
ori
Apr
TRP
ARS EcoRI EcoRI EcoRI
BamHI 连接
转化酵母菌 重组酵母染色体
C 用于基因转移的受体菌或细胞
3 基因工程的基本条件
各种基因工程受体的特性
实验室常用的基因工程受体
受体细胞应具备的条件
受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷（ recB-,recC-,hsdR-
） 重组整合缺陷型
用于基因扩增或高效表达的受体细胞 （ recA-）
具有较高的转化效率
具有与载体选择标记互补的表型
感染寄生缺陷型
防止重组细菌扩散污染，生物武器除外
各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简
单，重组子稳定
适用于外源 DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表
达、基因文库的构建，是 DNA重组实验和基因工程的主要受
体菌
产结构复杂、种类繁多的内毒素
各种基因工程受体的特性
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全,生长迅速，培
养简单，不产内毒素
适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的
有效分泌
遗传欠稳定，载体受体系统欠完备
各种基因工程受体的特性
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素
主要用于抗生素生产菌株的改良
遗传不稳定，生长相对缓慢
各种基因工程受体的特性
酵母菌
具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养
简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定
适用于外源 DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效
表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是
DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌
内源性蛋白产物种类繁多且含量高
各种基因工程受体的特性
昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较
快，培养成本低廉，遗传稳定
适用于真核生物基因的高效表达
DNA重组操作系统欠完善
各种基因工程受体的特性
哺乳动物细胞（中国 仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适
的糖基化修饰系统
适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物
的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体
细胞培养条件苛刻，生长缓慢
各种基因工程受体的特性
植物细胞（拟南芥菜、烟叶 ）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细
胞培养简单且成本低廉，具有光合作用
适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，
农作物品质的改良
遗传操作繁琐
实验室常用的基因工程受体
大肠杆菌
用于接受质粒,C600,W3110,HB101,JM83,
JM101（ Aps,Tcs,Cms）
用于接受 l-DNA,LE392,ED8654
酵母菌
哺乳动物细胞 CHO
毕赤酵母
啤酒酵母
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
3 基因工程的基本条件
C 用于基因转移的受体菌或细胞
B 用于 基因克隆的载体
A 用于核酸操作的工具酶
A 用于核酸操作的工具酶
3 基因工程的基本条件
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
核酸酶
核酸修饰酶
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的发现及其生物功能
识别双链 DNA分子中的特定序列，并切割 DNA双链
主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来 DNA的入侵
细菌的限制与修饰作用
hsd R,编码限制性核酸内切酶
hsd M,编码限制性甲基化酶
hsd S,编码限制性酶和甲基化酶的协同表达
1968年,Smith等人首先从 流感嗜血杆菌 d株中分离出
Hind II和 Hind III
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的类型
主要特性 I 型 II 型 III 型
限制修饰 多功能 单功能 双功能
蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+ SAM ATP Mg2+ SAM Mg2+
识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC
AACN6GTGC CAGCAG
切割位点 距识别序列 1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割 特异性切割 24-26bp处
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的命名
属名 种名 株名
H i n d III H i n d III
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶的基本特性
识别双链 DNA分子中 4 - 8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
识别切割序列呈典型的旋转对称型 回文结构
5‘ … G C T G A A T T C G A G …
3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C …
5’
EcoR I的识别序列 EcoR I的切割位点
EcoRI等产生的 5‘粘性末
端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
OH P
OH P
PstI等产生的 3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ 退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OH P
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
大部分 II 型核酸内切酶需要相似的反应条件,
Tris-HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl 0 - 150 mM
DTT 1 mM
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
150 mM 高盐酶
Volume 20 - 100 ml
T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全
水解 1 mg 标准 DNA所需的酶量
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解,
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意,
5‘
… GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘
… CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’
BamHI SmaI
5‘ … GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’
5‘ … GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解,
对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法,
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解
低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4
2.5倍体积的冰冷乙醇
冰浴 5 分钟、高速冷冻离心 10分钟、干燥
限制性核酸内切酶
影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的纯度,
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇,EDTA,SDS,NaCl等
加大酶的用量,1 mg DNA 用 10U 酶
加大反应总体积
延长反应时间
限制性核酸内切酶
影响限制性核酸内切酶活性的因素
DNA样品的甲基化程度,
大肠杆菌中的 dam甲基化酶在 5‘ GATC3’序列中的腺 嘌呤 N6位
引入甲基，受其影响的酶有 Bcl I,MboI等，但 BamH I,
Bgl II,Sau3A I不受影响
大肠杆菌中的 dcm甲基化酶在 5‘ CCAGG3’或 5‘ CCTGG3’序
列 中的 胞嘧啶 C5位 上引入甲基,受其影响的酶有 EcoR II等
哺乳动物中的甲基化酶在 5‘ CG3’序列中的 C5位 上引入甲基
限制性核酸内切酶
影响限制性核酸内切酶活性的因素
核酸内切酶的缓冲液性质,
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH值 等,
会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即
所谓的 Star activity现象
EcoR I在正常条件下识别并切割 5‘ GAATTC3’序列，但在
甘 油浓度超过 5%（ v/v） 时，也可切割 5‘ PuPuATPyPy3’或
者 5‘ AATT3’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链 DNA上缺口处的磷酸二酯键
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
nick
nick
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复与 RNA链结合的 DNA链上缺口处的磷酸二酯键
T4-DNA连接酶
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C …
5’ OH P nick
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C …
5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
连接多个平头双链 DNA分子,
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
T4-DNA连接酶
DNA连接酶
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
ATP 0.5 - 1 mM
DTT 5 mM
Volume 10 - 20 ml
T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 ℃ 反应 1 小时,
完全连接 1 mg l-DNA（ Hind III片段）所需的酶量
DNA连接酶
平头双链 DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的
连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连
接，因此后者反应速度要慢得多
提高平头末端连接效率的方法包括,
加大连接酶用量（ 10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会
加入 10% PEG8000,促进大分子之间的有效作用
加入单价阳离子（ NaCl）,最终浓度 150-200 mM
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活
性 5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶
活性 3‘ →5 ‘ 的核酸外切酶活
性
大肠杆菌 DNA聚合酶 I的基本性质,
3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-OH
5‘ ppp dN
Mg2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA pol I
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）
缺口前移标记法
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的基本用途,
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a-32P-dATP
）
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Nick translation
制备 32P标记的探针 DNase I
DNA pol I
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本性质,
大肠杆菌 DNA聚合酶 I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得 N端
三分之二的大肽段，即为 Klenow酶
Klenow酶仍拥有 5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性 和 3‘ →5 ‘
的核 核酸外切酶活性,但失去了 5‘ →3 ‘ 的核酸外切酶活性
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,
补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
DNA片段的同位素末端标记
cDNA第二链的合成
双脱氧末端终止法测定 DNA序列
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,补平由核酸内切酶产生的 5‘ 粘性末端
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow dATP dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）
Klenow酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C …
5’ Klenow a-32P-pppdA dTTP
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA酶的基本特性,
在无 dNTP时，可以从任何 3‘ -OH端外切
在只有一种 dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止
在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
5‘ →3 ‘ 的 DNA聚合酶活性和 3‘ →5 ‘ 的核酸外切
酶活性
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,切平由核酸内切酶产生的 3’粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ T4-DNA聚合酶
5‘ … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G …
3’ 3‘ … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C …
5’ 注意：该酶也能降解双链 DNA,只是其活性比单链降解活性低很多
DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶的基本用途,DNA片段的同位素末端标记
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（ a-32P-
dATP）
5‘ G-C-T-C A-G-C-T-G-OH
HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘
T4-DNA pol
T4-DNA pol
5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T
3’ 3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
5‘
DNA聚合酶
依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,以 RNA为模板聚合 cDNA链
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
反转录酶 Mg2+ dNTP
5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18
3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA
5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA
DNA聚合酶
依赖于 RNA的 DNA聚合酶（反转录酶）
反转录酶的基本特性,双向外切 DNA-RNA杂合链中的 RNA链
反转录酶
3’ RNA
5’ DNA 3’
5’
3’ RNA
5’ DNA 3’
5’
反转录酶
5’ DNA 3’
核酸酶
单链核酸外切酶：核酸外切酶 VII（ ExoVII）
大肠杆菌的核酸外切酶 VII不需要 Mg2+
ExoVII
3’
5’ 3’
5’
3’
5’ 3’
5’
核酸酶
双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ ExoIII）
ExoVII
3’
5’ 3’
5’
Mg2+
3’
5’ 3’
5’
大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从 3‘ 端外切
核酸酶
双链核酸外切酶,l 核酸外切酶 （ lExo）
lExo
3’
5’ 3’
5’
Mg2+
l核酸外切酶特异性地从 5‘ 端外切
3’
5’ 3’
5’
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（ Aspergillus oryzae）
Zn2+必需
最适 pH范围为 4.0 - 4.3
需要 NaCl 10 - 300 mM
降解单链 DNA的速度比降解双链 DNA快 75000倍
降解单链 DNA的速度比降解单链 RNA快 7倍
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切单链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’
S1 Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T…
3’
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的基本反应,内切带缺口或缺刻的双链 DNA或 RNA
5‘ … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T…
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…
3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A…
5‘
nick
gap
S1
Zn2+
5‘ … G-C-T-C-A-
G 3‘ … C-G-A-G-T-
C
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A…
5‘
核酸酶
单链核酸内切酶,S1核酸酶
S1核酸酶的重要用途,在 DNA上定位 RNA（ S1 mapping）
DNA
mRNA
杂交
S1
EcoRI
核酸酶
单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（ A.espejiana）
Ca2+
5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs
ssDNA or RNA
Ca2+
Ca2+
核酸酶
单链内切双链外切的核酸酶,Bal31核酸酶
Bal31核酸酶的基本用途：诱发 DNA突变
EcoRI A
B C
EcoRI EcoRI
B C A
Bal31
B C A
环化
A
C
核酸修饰酶
末端脱氧核苷酰转移酶（ TdT）
TdT的基本特性：来自小牛胸腺
不需要模板的 DNA聚合酶,随机掺入 dNTPs
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Mg2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘
TdT的基本特性,
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO AAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
TdT Co2+ dATP
5‘ p
3‘ HO
AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘
p 5‘ AAAAAAAAAAA
核酸修饰酶
碱性磷酸单酯酶
来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（ CIP）
来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（ BAP）
5‘ p OH 3‘
DNA or RNA
5‘ ppp dN
5‘ pppN
BAP / CIP
OH 3‘ 5‘ HO
5‘ HO dN
5‘ HO N
核酸修饰酶
T4-多核苷酸磷酸激酶（ T4-PNP）
T4-PNP的基本特性：在 DNA,RNA,dNR,NR的 5‘ -OH上加
磷
5‘ HO
3‘ HO
OH 3‘
OH 5‘
T4-PNP Mg2+ pppATP（ g-32P-ATP）
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
用于探针的末端同位素标记,
B 用于基因克隆的载体
3 基因工程的基本条件
质粒（ plasmid）
噬菌体或病毒 DNA
考斯质粒（ cosmid） 与噬菌粒
人造染色体载体
载体的功能及特征
载体的功能及特征
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体的功能及特征
载体应具备的条件
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有合适的筛选标记
具有较 高的外源 DNA的载装能力
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
质粒
质粒的基本特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并
被稳定遗传的一类核酸分子
质粒常见于原核细菌和真菌中
绝大多数的质粒是 DNA型的
绝大多数的天然 DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构,
即 cccDNA
质粒 DNA的分子量范围,1 - 300 kb
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自主复制
质粒 DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为
两大复制类型,
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
rop
（ +）
Rop
RNA II
RNA I
3’
5’
5’
3’
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性,拷贝数的控制机制 – 质粒 DNA复制启动控制
控制复制起始因子与复制起始位点（ ori） 的结合
Pcop cop P/Orep rep ori
Cop Rep
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于
一个细胞中，这种现象称为 质粒的不相容性,不相容性的质
以大肠杆菌的质粒为例,
ColE1,pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101,F,RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
粒组成 不相容性群
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性,分子机制
两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种
拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同,
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的
拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定,
因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一
细胞内
其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒
质粒的基本特征
质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类,
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到
另一个细胞（接合作用），如 F,Col,R质粒等
如 Col,R的其它成员
非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用
值得注意的是，某些非接合型质粒（ ColE1） 在接合型质粒
的存在和协助下，也能发生 DNA转移，这个过程由 bom 和
mob 基因决定
质粒
质粒的基本特征
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒 DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括,
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对 DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒
质粒的构建
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点
少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往
往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构
建的,
pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr
ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1
RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr
质粒
质粒的分类
人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类,
高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数 1000-3000 扩增基因
低拷贝质粒 来自 pSC101 拷贝数小于 10 表达某些毒性基因
温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质
测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头 polylinker
整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合
穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆
表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件
探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
松弛型复制
pBR3 2 2
4 3 6 3 b p
Or ig in o f Rep lic a t io n
ROP
ROI
S a l I
Bam H I
Tc
r
P v u I
P s t I
P s t I
E c o R I
Cla I
Hin d II I
Hin d II
Bal I
Ap
r
pBR322,
氯霉素可扩增
拷贝数 50 - 100 / cell
用于基因克隆
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19,
拷贝数 2000 - 3000 / cell
用于基因克隆和测序
装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
B a m HI
pU C 18
2 6 8 6 b p
Ap
r
l a c Z'
ori
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
396 452
E coRI S stI K p n I S m a I X b a I S a lI P stI S p h I Hi n d III
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19,正选择标记 lacZ’ 的显色原理
pUC18/19
Plac lacZ’ MCS
b-半乳糖苷酶的 a-肽段 a b
O
H
H
H
OH
H
O H
H O H
CH 2 OH
O
N
Cl
Br
Cl
Br
Cl
Br
O
N
N
5-溴 -4-氯 -3-吲哚基 -b-D-半乳糖苷
X-gal
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z,
多拷贝
装有两个噬菌体的强启动子
装有多克隆位点（ MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
用于外源基因的高效表达
注意,T7和 SP6启动子特异性地由噬菌体 DNA编码的 RNA聚合
2743 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
pGEM-3E PSP6
酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体 RNA聚合酶，如,
E.coli BL21（ DE3） 等
质粒
质粒 DNA的分离纯化
实验室一般使用下列三种方法制备质粒 DNA,
氯化铯密度梯度离心法
质粒 DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染
碱溶法
质粒 DNA纯度底、快速、操作简便
沸水浴法
质粒 DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间
质粒
质粒 DNA的分离纯化
氯化铯密度梯度离心法,
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加 CsCl和溴乙锭
超速离心过夜
在紫外灯下吸取 cccDNA
稀释沉淀 cccDNA
proteins
ocDNA
L-DNA
cccDNA
RNAs
质粒
质粒 DNA的分离纯化
碱溶法,
用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加 NaOH和 SDS的混合溶液，去膜释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染
色体 DNA及大部分蛋白质
离心取上清液，用苯酚 -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质
乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 DNA
用无 DNase的 RNase去除残余的 RNA
cccDNA
L-DNA ocDNA
D-DNA T-DNA
质粒
质粒 DNA的分离纯化
沸水浴法,
用含有 EDTA和 Triton X-100的缓冲液悬浮菌体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁
沸水浴 40秒钟
离心，用无菌牙签挑去沉淀物
乙醇或异丙醇沉淀质粒 DNA
噬菌体或病毒 DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染
宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏
起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。
噬菌体或病毒的上述特性使得它们的 DNA能被开发成为基因工
程的有用载体，因为,
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞
自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体的生物学特性,生物结构
l 噬菌体是 大肠杆菌的温和型噬菌体
l 噬菌体 由外壳包装蛋白和 l-DNA组成
l-DNA全长 48502个核苷酸
l-DNA上 至少有 61个基因
l 噬菌体生物学特性,生物结构
5’ TCCAGCGGCGGGG 3’
3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS
COS
cos 头部合成基因
尾部合成基因
溶菌控制基因
晚期控制基因
DNA合成控制 基因
阻遏基因
早期控制基因
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
l - DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期
E.coli
吸附 LamB受体
注入 复制
包装
裂解
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,感染周期
体内包装
100个左右的拷贝
包装范围为原 DNA的 75 - 105%
即 36 - 51 kb
D
A
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l 噬菌体生物学特性,溶原状态
l噬菌体感染大肠杆菌后, 除能裂解细胞外, 也可能将其
DNA直接整合到宿主细胞的染色体 DNA上, 并不产生子代噬菌
体颗粒, 这种情况为 溶原状态 。 整合主要由 l-DNA上的 cI和 int
两基因的产物所激活, 而这两个基因的开放与关闭又取决于宿
主细胞本身的性质 。 人们可以根据需要改变 l-DNA或宿主细胞
的性质, 使噬菌体或处于 溶菌状态, 或处于溶菌状态
DNA重组技术一般需要 l噬菌体进入溶菌状态
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度
野生型 l-DNA包装的上限为 51kb,本身长度为 48.5kb,只有
当插入的外源 DNA片段不大于 2.5kb时, 才能被包装成有感染
力的噬菌体颗粒 。 因此缩短野生型 l-DNA的长度, 可以提高装
载量 。 其实野生型 l-DNA上约有 40-50%的片段是复制和裂解
所非必需的 。 根据切除的多少, 可将 l-DNA分成两大类载体,
插入型载体
取代型载体
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 插入型载体
体外包装 插入位点
体外包装 插入片段
载体长度 37 kb
插入片段大小,
0 - 14 kb
（ 51 – 37）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,缩短长度 取代型载体
体外包装
体外包装 插入片段
最小装载长度 10 kb
（ 51 – 26）
载体长度 26 kb
插入片段
最大装载长度 25 kb
（ 36 – 26）
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,删除重复的酶切位点
野生型的 l-DNA链上有 5个 EcoRI位点和 7个 HindIII位点，不
利于重组操作，必须删除至 1 - 2个
同时，为了便于各种来源的 DNA片段的克隆，还需要增加一
些单一的酶切位点
除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶
位点
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记
与质粒不同，野生型 l-DNA上缺少合适的选择标记，因此
加装 选择标记是 l-DNA克隆载体构建的重要内容
l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类,
免疫功能类标记
颜色反应类标记
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 imm434
imm434基因编码一种阻止 l-噬菌体
进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记
基因的 l-载体进入受体细胞后，建立溶
原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源 DNA插入到标记基因中，基因灭
活,l-重组分子便进入溶菌循环，形成
透明斑
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,加装选择标记 lacZ
lacZ基因编码 b-半乳糖苷酶，能催化
无色的 X-gal生成蓝色化合物。当外源基
因插入到 lacZ基因中，基因灭活，不能
合成蓝色化合物；而空载体 l-DNA则产
生蓝色透明斑
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的构建,构建琥珀密码子的突变体
琥珀型突变 （ sup)是指由 CAG（ Gln） 向 UAG（ stop） 的突变 。
大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因, 其编码产物校正
tRNA能专一性地纠正这一突变 。
将野生型 l-DNA上 D和 E两个头部包装蛋白的基因中的 CAG密码
子突变成 UAG。 当这种 l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后, 不
能合成有活性的头部蛋白, 也就不能被包装和裂解细菌, 这样就
可以阻止有害重组体的生物污染及扩散, 而基因工程实验中使用
的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA载体的主要类型,
插入灭活型载体 Charon2,Charon6,lgt11
取代型载体 lEMBL4,lgtlc,lNM762,Charon40
正选择型载体 lEMBL1,lL47,l1059
野生型的 l噬菌体不能在 P2噬菌体溶源性 的细菌中繁殖（ Spi+）,
这种生长抑制表型受 l-DNA上的 red和 gam两个基因控制。若将外
源 DNA取代 red和 gam,重组 噬菌体便拥有 Spi-表型，能在 P2噬菌
体 溶源性 的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA重组分子的体外包装,
l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗
粒, 方可高效导入受体细胞
用于体外包装的蛋白质可直接从感染了 l噬菌体的大肠杆菌中提
取, 现已商品化 。 这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：
一部分缺少 E组份, 另一部分则缺少 D组份 。 包装时, 当且仅当
这两部分包装蛋白与重组 l-DNA分子混合后, 包装才能有效进
行, 任何一种蛋白包装液被重组 l-DNA污染后, 均不能被包装
成有感染力的噬菌体颗粒, 这也是基于安全而设计的
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA及其重组分子的分离纯化,
将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期
加入 l噬菌体或重组 l噬菌体的悬浮液,37℃ 培养 1小时
用新鲜培养基稀释，继续培养 4 -12小时。这时噬菌体颗粒
密度已达 1013 -1014 / L,大肠杆菌细胞已完全裂解
超速离心，沉淀噬菌体
苯酚抽提，释放 l-DNA
乙醇或异丙醇沉淀 l-DNA
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA
l-DNA作为载体的优点,
l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌
l-DNA载体的装载能力为 25 kb,远远大于质粒的装载量
重组 l-DNA分子 的筛选较为方便
重组 l-DNA分子的提取较为简便
l-DNA载体适合克隆和扩增外源 DNA片段，但不适合表达
外源基因
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,生物结构
M13噬菌体的外型呈丝状
M13 噬菌体 由外壳包装蛋白和 正 链 DNA组成
M13 DNA全长 6407个核苷酸
M13 DNA上 至少有 10个基因
2700个外壳蛋白分子
M13 噬菌体 不裂解宿主细胞，但抑制其生长
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13噬菌体的生物学特性,感染周期
+ DNA
（ +） DNA
RFDNA RFDNA
RFDNA - DNA
II
V
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的构建,
III VI I IV II X V VII IX VIII
野生型 M13RF-DNA
III VI I IV II X V VII IX VIII
M13mp系列载体
lacZ‘ polylinker
噬菌体或病毒 DNA
大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNA
M13 DNA载体的特点,
使克隆的 DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外
这在 DNA定向突变中非常有用
M13重组分子筛选简便
被 M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混
浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊
斑的混浊度亦越大
但 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 1.5 kb
噬菌体或病毒 DNA
与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病
毒基因组 DNA。
动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病
毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类,
单链 DNA病毒 双链 DNA病毒
单链 RNA病毒 双链 RNA病毒
RNA病毒在自我复制时大多存在相应的 DNA中间反应物,
这些中间体可作为载体进行常规的 DNA重组。
考斯质粒与噬菌粒
l-DNA载体和 M13-DNA载体的装载量最大分别为 25 kb和
1.5 kb,但在很多情况下，往往需要 克隆更大的外源 DNA片段,
考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体 DNA
的装载量。
在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体 DNA的长度,
就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体 DNA与包装有关的序
列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时
又能保证重组 DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这
便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒
和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子在细胞内
不能形成噬菌体颗粒。
考斯质粒与噬菌粒
考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的构建,
考斯质粒是一类人工构建的含有
1978年 Collins和 Hohn发明构建
pHC79
6400 bp
Tcr
l fragment cos
ori
Apr PstI
BamHI
SalI
l-DNA cos序列和 质粒复制子的
特殊类型的载体
cos site - carrying plasmid
1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段
装载范围为 31 - 45 kb
考斯质粒与噬菌粒
考斯质粒（ cosmid）
考斯质粒载体的特点,
能像 l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞
装载量大（ 45 kb） 且克隆片段具有一定的大小范围
能像质粒那样在受体细胞 中自主复制
重组操作简便，筛选容易
不能体内包装，不裂解 受体细胞
考斯质粒与噬菌粒
噬菌粒（ phagemid or phasmid）
噬菌粒载体的特点,
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体 包装序列、复制子
以及 质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体
能像 M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞
装载量比常规的 M13mp系列要大很多（ 10 kb）
能像质粒那样在受体细胞 中自主复制
重组操作简便，筛选容易
通过克隆双链 DNA能获得同等长度的单一单链 DNA
考斯质粒与噬菌粒
噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pUC118 / 119
pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG
pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG
500 个拷贝
3200 bp
MCS
lacZ’
lacI
ori
Apr
M13-MG
pUC118 / 119
表示 M13辅助噬菌体 DNA
考斯质粒与噬菌粒
噬菌粒（ phagemid or phasmid）
重要的噬菌粒载体,pBluescript 体外转录载体
pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7
2958 bp
MCS
lacZ’
PT7
ori
Apr
f1-ori
pBluescript PT3
噬菌体启动子 PT3和 PT7强化外
源基因的转录
提取出来的单链 DNA重组分子
在噬菌体 RNA聚合酶的存
在下，又可实现外源基因
的体外转录
人造染色体载体
人类、动物、植物的全基因组序列分析往往 需要 克隆数百
甚至上千 kb 的 DNA片段,此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载
量也远远不能满足需要。
将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳
定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外
源 DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体,
它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
目前常用的人造染色体载体包括,
细菌人造染色体（ BAC）
酵母人造染色体（ YAC）
人造染色体载体
细菌人造染色体（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC）
细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子 F质粒的基础上
构建的，其装载量范围在 50 - 300 kb之间
各种类型的 pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝
pBACs主要适用于,
克隆大型基因簇（ gene cluster） 结构
构建动植物基因文库
人造染色体载体
酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
YAC载体应含有下列元件,
酵母染色体的端粒序列
酵母人造染色体的构建,
pYAC4
CEN4
EcoRI
URA3
TEL BamHI TEL
ori
Apr
TRP1
ARS1
酵母染色体的复制子
酵母染色体的中心粒序列
酵母系统的 选择标记
大肠杆菌的复制子
大肠杆菌的 选择标记
YAC载体的装载量为 350 - 400 kb
人造染色体载体
酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）
酵母人造染色体的使用,
pYAC4
CEN
EcoRI
URA
TEL BamHI TEL
ori
Apr
TRP
ARS EcoRI EcoRI EcoRI
BamHI 连接
转化酵母菌 重组酵母染色体
C 用于基因转移的受体菌或细胞
3 基因工程的基本条件
各种基因工程受体的特性
实验室常用的基因工程受体
受体细胞应具备的条件
受体细胞应具备的条件
限制性缺陷型
外切酶和内切酶活性缺陷（ recB-,recC-,hsdR-
） 重组整合缺陷型
用于基因扩增或高效表达的受体细胞 （ recA-）
具有较高的转化效率
具有与载体选择标记互补的表型
感染寄生缺陷型
防止重组细菌扩散污染，生物武器除外
各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简
单，重组子稳定
适用于外源 DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表
达、基因文库的构建，是 DNA重组实验和基因工程的主要受
体菌
产结构复杂、种类繁多的内毒素
各种基因工程受体的特性
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全,生长迅速，培
养简单，不产内毒素
适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的
有效分泌
遗传欠稳定，载体受体系统欠完备
各种基因工程受体的特性
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素
主要用于抗生素生产菌株的改良
遗传不稳定，生长相对缓慢
各种基因工程受体的特性
酵母菌
具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养
简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定
适用于外源 DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效
表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是
DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌
内源性蛋白产物种类繁多且含量高
各种基因工程受体的特性
昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较
快，培养成本低廉，遗传稳定
适用于真核生物基因的高效表达
DNA重组操作系统欠完善
各种基因工程受体的特性
哺乳动物细胞（中国 仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适
的糖基化修饰系统
适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物
的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体
细胞培养条件苛刻，生长缓慢
各种基因工程受体的特性
植物细胞（拟南芥菜、烟叶 ）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细
胞培养简单且成本低廉，具有光合作用
适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，
农作物品质的改良
遗传操作繁琐
实验室常用的基因工程受体
大肠杆菌
用于接受质粒,C600,W3110,HB101,JM83,
JM101（ Aps,Tcs,Cms）
用于接受 l-DNA,LE392,ED8654
酵母菌
哺乳动物细胞 CHO
毕赤酵母
啤酒酵母
