生物工程专业核心课程
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
C PCR法
B cDNA法
A 鸟枪法
D 化学合成 法
E 基因文库的构建
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
基因工程或 DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组
中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和
生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌
（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回
细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣
的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建
立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另
一类是利用 PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然
后将之克隆表达。
A 鸟枪法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
鸟枪法操作的改进
鸟枪法克隆目的基因的局限性
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组 DNA
片段，然后通过快速有效的筛选程序从
众多克隆中分离出含有目的基因的 目的
重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适
用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体 DNA的切断
超声波处理,片段长度均一，大小可控，平头末端
全酶切,片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开,
大小不可控
部分酶切,片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载
体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作
为
转化受体细胞
受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达
的受体细胞
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
鸟枪法操作的改进
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。
如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体 DNA，
然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高
重组子中 目的重组子 的出现频率
使用特征性限制性内切酶切开染色体 DNA
鸟枪法操作的改进
例如，已知某目的基因位于 1.8 kb的 SalI
片段中，将染色体 DNA用 SalI切开，琼
脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于
1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此
凝胶块中回收 DNA片段，然后与载体进
行拼接
在连接前将 DNA片段进行分级分离
2.0 kb
1.6 kb 1.8 kb
鸟枪法操作的改进
冻融法
滤纸法
吸附法
低融点凝胶法
溶解法
凝胶 DNA片段回收技术
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大, 需要了解目的基因的背景知识
不能获得的最小长度的目的基因
不能除去真核生物目的基因的内含子结构
B cDNA法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA法分离目的基因的基本程序
cDNA法法克隆目的基因的局限性
cDNA法克隆目的基因的基本战略
mDNA
cDNA第一链的合成
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
cDNA第一链
引物 退火
逆转录酶 dNTPs
cDNA第二链的合成
煮沸 NaOH
自身引导法,获得的双链 cDNA 5’端会有几对碱基缺
失
AAAAAAAAAAAAAA
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTT
OH 3’ Klenow dNTPs
S1
cDNA第二链的合成
DNApol dNTPs RNaesH
置换合成法,获得的双链 cDNA 5’端也会有几对碱基缺
失 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
AAAAAAAAAAAAAAp 5’
5’
S1
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
T4-DNA ligase
cDNA第二链的合成
dCTP TdT
引导合成法,获得的双链 cDNA 能保留完整的 5’端序列
5‘ ppp’5 G G AAAAAOH 3’
TTTTTp 5’ 3‘ HO
5‘ ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
5‘ pGGGGGGG
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’
NaOH
退火
Klenow dNTPs
cDNA法克隆目的基因的基本战略
双链 cDNA的克隆
双链平头的 cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中,
平头末端直接与载体连接,但插入的片段无法回收
平头两端分别接同聚物尾,最好是 AT同聚物尾，这样重组
分子可通过加热局部变性和 S1核酸酶处理回收插入片段
加装人工接头引入酶切口,以便插入片段回收
cDNA法分离目的基因的基本程序
完备分离程序
提取细胞总 mRNA,合成总 cDNA,将之全部克隆, 然后
借助于合适的筛选手段找到 目的重组子
筛选时, 若使用的是多拷贝载体, 则采用菌落原位杂交法
筛选；若使用的是表达型载体, 则采用菌落免疫杂交法筛选
完备分离程序适用于 mRNA分子数少的目的基因的克隆，
如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子 VIII基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序
特异分离程序
提取细胞总 mRNA,琼脂糖凝胶电泳分离, 回收目标
mRNA,由此合成双链 cDNA,然后进行克隆
特异分离程序较适用于 mRNA丰度极高的目的基因克隆
如血红蛋白基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序
差异分离程序
利用两组细胞 mRNA种类的差异，分离克隆差异 mRNA所对
应的 cDNA,因而这种程序较适用于分离克隆新基因
例如：正常的大鼠 FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能
自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克
隆这些新基因，进而研究其生物学功能
差异分离程序 多瘤病毒感染的 FR3T3细胞
正常的 FR3T3细胞
总 mRNA
总 mRNA
cDNA
双链 cDNA
单链 cDNA
提取 mRNA
合成 cDNA
合成第二链
克隆
提取 mRNA
共价交联
上柱
原位杂交
病毒诱导表达的基因
cDNA克隆
cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的 mRNA分子都具有 polyA结构
细菌或原核生物的 mRNA半衰期很短
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感,
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编码基因
C PCR法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
PCR（ Polymerase Chain Reaction） 法，又称为 聚合酶
链反应 或 PCR扩增技术,是一种高效快速的体外 DNA聚合程序
使用 PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或 DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
5
‘
5
‘
目的基因
5
‘
变性 加热
5
‘ 5
‘ 引物 退火
5
‘ 5
‘ 底物 聚合 5
‘ 5
‘ 5
‘ 5
‘ 加热 变性 5
‘
5
‘ 5
‘ 5
‘ 5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘
5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
退火 引物 底物 聚合
加热 变性
引物 退火
底物 聚合
1
2
3
由 Taq DNA聚合酶扩增的 PCR产物中，其 3’ 末端总是会带
有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是 A,因
为 Taq DNA聚合酶对 dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基
的存在，克隆时即可以采取 TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接
，也可以使用专门的 T载体 克隆
PCR克隆目的基因的基本程序
5’
5’
A
A
T
T 5’
5’
PCR扩增产物
T 载体
T7 lacZ MCS ori Apr
D 化学合成法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
化学合成法的基本战略
化学合成的单元操作
DNA化学合成的用途
化学合成法的基本战略
全基因合成
化学合成目的基因的前提条件是基因的 DNA序列已知，有三种战略,
小片段粘接法,
混合退火
根据目的基因全序列，分别合成 12-15碱基长的单链 DNA小片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
化学合成法的基本战略
全基因合成
补钉延长法,
混合退火
根据目的基因 两条互补链 全序列，分别合成 12-15碱基长的单链
DNA小片段以及 20-30碱基长的单链 DNA中片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
大片段酶促法,
混合退火
根据目的基因 的 全序列，分别合成 40-50碱基长的单链 DNA片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成 DNA的 单片段愈短，收率就
愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合
成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片
段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为 95%
则合成 50个碱基长的 DNA单链大片段的总收率只有 7.7%
化学合成法的基本战略
探针等寡聚核苷酸合成
在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸
序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其
编码的 DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或 cDNA法得到
的重组子，最终获得含有目的基因的 目的重组子
由于大多数氨基酸拥有 简并密码子,故在探针序列的设计时
必须考虑下列问题,
生物体对简并密码子的 偏爱性, 合成系列探针
探针应具有足够的长度，通常在 17-20个核苷酸之间
探针内部不应出现可能的互补区域
化学合成法的基本战略
探针等寡聚核苷酸合成
某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile
所有可能的 DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA
C T GATG G G T T
C
CGA
CGG
CGT
CGC
设计的简并探针序列
TGTATGGACGAIATGA
TGTATGGATGAIATGA
TGCATGGACGAIATGA
TGCATGGATGAIATGA
A
G
此外还可以参考各种生物体的 EST数据库进行倾向性简并序列设计
expressed sequence tag
化学合成的单元操作
化学合成 DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个
个接上去, 每接一个单体就是一个循环反应, 包括,基团保护,
分离, 缩合, 分离, 去保护 五大操作单元 。
从反应机理上来讲,DNA化学合成有 磷酸二酯法, 磷酸三酯
法, 亚磷酸液三酯法 ；具体操作过程又有 液相合成 和 固相合成 两
种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离
程序简便,DNA合成仪就是根据 固相亚磷酸液三酯法 原理设计的
化学合成的单元操作
O
H
G
H
H H
HO
CH
2
OD M T
POMe
N
CH
Me
Me
CH
Me
Me
O
H
G
H H H
H O
CH 2
O DMT
P O Me
N
CH
Me
Me
CH
Me
Me
H
DMT,二甲氧基三苯甲基
激活
缩合 氧化 脱取代基
玻璃珠
连接臂
DNA化学合成的用途
合成天然基因
修饰改造基因
设计新型基因
制备探针、引物、接头
如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素
如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等
基因等
E 基因文库的构建
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
基因文库的基本概念
基因文库的构建程序
基因组文库重组克隆的排序
基因文库的基本概念
基因库与基因文库
基因库（ gene pool）
特定生物体全基因组的集合（天然存在）
基因文库（ gene library or gene bank）
从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式
基因组文库 （含有全部基因）
存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为,
cDNA文库 （含有全部蛋白质编码的结构基因）
基因文库的基本概念
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体 DNA
用 cDNA法构建 cDNA文库,材料来自 mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的 mRNA
种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的 cDNA文库
一般还有组织细胞的界定，如肝组织 cDNA文库或胚胎组织 cDNA
文库等。很显然,cDNA文库的信息量远小于基因组文库
基因文库的基本概念
基因文库的完备性
基因文库的 完备性 是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概
率，它与基因文库最低所含克隆数 N之间的关系可用下式表示,
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中,P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率
f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小
例如，人的单倍体 DNA总长为 2.9 x 109 bp,基因文库中克隆片段
的平均大小为 15 kb,则构建一个完备性为 0.9的 基因文库至少需要
45万个克隆；而当完备性提高到 0.9999时，基因文库至少需要 180
万个克隆
基因文库的基本概念
基因文库的质量标准
除了尽可能高的 完备性外,一个理想的基因文库应具备下列条件,
重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力
载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆
克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序
克隆片段易于从载体分子上完整卸下
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
基因文库的构建程序
基因组 DNA的制备
为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性,用于基因组
文库构建的 DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的
DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的 DNA片段
的比率就越低，重组率和完备性也就越高
A A
A A
用常规方法制备的染色体
DNA的长度一般在 100 kb左右
如果先将细胞固定在低融点凝
胶中，然后置入含有 SDS,蛋
白酶 K,RNase的缓冲液中浸泡，可获得 1000 kb大小的 DNA片段
基因文库的构建程序
基因组 DNA的切割
用于基因组 文库构建的 DNA片段的切割一般采用 超声波处理 和
限制性内切酶 部分酶切 两种方法，其目的是,
第一，保证 DNA片段之间存在部分重叠区
第二，保证 DNA片段大小均一
超声波处理 后的 DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
部分酶切法 一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶, 如,
Sau3AI或 MboI等，这样 DNA酶解片段的大小可控
连接前，上述处理的 DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的 DNA片段随机连为一体！
基因文库的构建程序
载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于 基因组 文库 构建的 载体通常选 装载量较大的
l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和 人类）需使用 YAC或 BAC载体
l-DNA
由于绝大多数真核生物的 mRNA小于 10 kb,因此用于 cDNA文库 构 建的载体
通常选质粒
上述几种 载体的最大装载量如下,
质粒
考斯质粒
15 kb
25 kb
45 kb
BAC 300 kb
YAC 400 kb
用于基因 文库构 建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌
基因文库的构建程序
从基因文库中筛选目的基因
大型基因组 文库 一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除
了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白
编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选 程序（如 抗药性筛选法,
酵母双杂交技术 等）直接筛选外，一般的基因组 文库筛选均需多轮
操作步骤
基因文库的构建程序
从基因文库中筛选目的基因
密集铺板（ 1-10万）
杂
交
挖
取
铺
板
铺
板
目的重组克隆
基因文库的构建程序
基因文库构建的技术性问题
在基因组 文库的构建过程中,最应引起重视的问题是,
严禁外源 DNA片段之间的连接！！！
为了避免上述情况的发生,可采取下列措施的组合,
将待连接的 DNA片段根据载体的装载量分级分离
用碱性磷酸单酯酶除去 DNA片段的末端磷酸基团
用 TdT酶在 DNA片段的末端上增补同聚尾末端
基因组文库重组克隆的排序
大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不
十分困难，如果一个 YAC基因文库的插入片段总和为整个基因
组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段 DNA序
列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排
列成一个像天然染色体 DNA上所表现出的信息顺序。这项工作
的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期
制作
基因组文库重组克隆的排序
将单一的 YAC克隆插入 DNA片段 用限制性内切酶分布均匀
地水解成若干片段，末端标记同位素
然后再用 Sau3AI或 MboI将末端标记的 DNA片段降解成碎
片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每 10个 YAC克隆走在同一块板上，
形成 10个克隆的特征性 DNA指纹图谱
电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆 DNA的指纹图谱
有部分相同的，则其两个 YAC片段就有互相重叠的可能性，于
是这两个 YAC克隆的 DNA片段克隆在染色体上是排列一起的
酶切片段末端标记法
酶切片段末端标记法
H H H H
S S S S
S S S S S
S S S S S
S S
S S S
单一克隆指纹图谱
十克隆指纹图谱
载体 DNA 克隆 DNA
基因组文库重组克隆的排序
将若干 YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成
20种不同序列的短探针，其序列是随机的
用 20种探针随机定位杂交（一对一） 20份 YAC克隆薄膜
如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则
这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为, 1”
，而阴性结果记为, 0”,可清晰地列成一张表，最终排出上述
YAC克隆的排列顺序
随机探针联合杂交法
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A B C
D E F
G
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
D
A
B
C
E
F
G
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18
D
A
B
C
E
F
G
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
F
C
A
D
G
E
B
基因组文库重组克隆的排序
从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之
两端序列分别亚克隆, 亚克隆片段在 0.5 - 2.0 kb范围内
分别以上述亚克隆 DNA片段为探针，杂交同一基因文库，
杂交阳性克隆中的插入 DNA片段必定与起点克隆所含的 DNA片
段连锁在一起
然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走
读，直至线型染色体 DNA的端点
染色体走读法（ chromosome walking）
染色体走读法（ chromosome walking）
走读的起点克隆片段
亚克隆旁测序列 探针标记
第一轮杂交
阳性克隆 阳性克隆
第二轮杂交 第二轮杂交
染色体走读法（ chromosome walking）
走读的起点克隆片段
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
C PCR法
B cDNA法
A 鸟枪法
D 化学合成 法
E 基因文库的构建
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
基因工程或 DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组
中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和
生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌
（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回
细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣
的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建
立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另
一类是利用 PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然
后将之克隆表达。
A 鸟枪法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
鸟枪法操作的改进
鸟枪法克隆目的基因的局限性
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组 DNA
片段，然后通过快速有效的筛选程序从
众多克隆中分离出含有目的基因的 目的
重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适
用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体 DNA的切断
超声波处理,片段长度均一，大小可控，平头末端
全酶切,片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开,
大小不可控
部分酶切,片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载
体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作
为
转化受体细胞
受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达
的受体细胞
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
鸟枪法操作的改进
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。
如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体 DNA，
然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高
重组子中 目的重组子 的出现频率
使用特征性限制性内切酶切开染色体 DNA
鸟枪法操作的改进
例如，已知某目的基因位于 1.8 kb的 SalI
片段中，将染色体 DNA用 SalI切开，琼
脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于
1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此
凝胶块中回收 DNA片段，然后与载体进
行拼接
在连接前将 DNA片段进行分级分离
2.0 kb
1.6 kb 1.8 kb
鸟枪法操作的改进
冻融法
滤纸法
吸附法
低融点凝胶法
溶解法
凝胶 DNA片段回收技术
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大, 需要了解目的基因的背景知识
不能获得的最小长度的目的基因
不能除去真核生物目的基因的内含子结构
B cDNA法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA法分离目的基因的基本程序
cDNA法法克隆目的基因的局限性
cDNA法克隆目的基因的基本战略
mDNA
cDNA第一链的合成
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
cDNA第一链
引物 退火
逆转录酶 dNTPs
cDNA第二链的合成
煮沸 NaOH
自身引导法,获得的双链 cDNA 5’端会有几对碱基缺
失
AAAAAAAAAAAAAA
5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTT
OH 3’ Klenow dNTPs
S1
cDNA第二链的合成
DNApol dNTPs RNaesH
置换合成法,获得的双链 cDNA 5’端也会有几对碱基缺
失 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
AAAAAAAAAAAAAAp 5’
5’
S1
AAAATTTOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’
AAAAAAAAAAAAAA 5’
5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’
3’
T4-DNA ligase
cDNA第二链的合成
dCTP TdT
引导合成法,获得的双链 cDNA 能保留完整的 5’端序列
5‘ ppp’5 G G AAAAAOH 3’
TTTTTp 5’ 3‘ HO
5‘ ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
5‘ pGGGGGGG
3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’
5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’
NaOH
退火
Klenow dNTPs
cDNA法克隆目的基因的基本战略
双链 cDNA的克隆
双链平头的 cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中,
平头末端直接与载体连接,但插入的片段无法回收
平头两端分别接同聚物尾,最好是 AT同聚物尾，这样重组
分子可通过加热局部变性和 S1核酸酶处理回收插入片段
加装人工接头引入酶切口,以便插入片段回收
cDNA法分离目的基因的基本程序
完备分离程序
提取细胞总 mRNA,合成总 cDNA,将之全部克隆, 然后
借助于合适的筛选手段找到 目的重组子
筛选时, 若使用的是多拷贝载体, 则采用菌落原位杂交法
筛选；若使用的是表达型载体, 则采用菌落免疫杂交法筛选
完备分离程序适用于 mRNA分子数少的目的基因的克隆，
如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子 VIII基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序
特异分离程序
提取细胞总 mRNA,琼脂糖凝胶电泳分离, 回收目标
mRNA,由此合成双链 cDNA,然后进行克隆
特异分离程序较适用于 mRNA丰度极高的目的基因克隆
如血红蛋白基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序
差异分离程序
利用两组细胞 mRNA种类的差异，分离克隆差异 mRNA所对
应的 cDNA,因而这种程序较适用于分离克隆新基因
例如：正常的大鼠 FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能
自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克
隆这些新基因，进而研究其生物学功能
差异分离程序 多瘤病毒感染的 FR3T3细胞
正常的 FR3T3细胞
总 mRNA
总 mRNA
cDNA
双链 cDNA
单链 cDNA
提取 mRNA
合成 cDNA
合成第二链
克隆
提取 mRNA
共价交联
上柱
原位杂交
病毒诱导表达的基因
cDNA克隆
cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的 mRNA分子都具有 polyA结构
细菌或原核生物的 mRNA半衰期很短
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感,
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编码基因
C PCR法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
PCR（ Polymerase Chain Reaction） 法，又称为 聚合酶
链反应 或 PCR扩增技术,是一种高效快速的体外 DNA聚合程序
使用 PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或 DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
5
‘
5
‘
目的基因
5
‘
变性 加热
5
‘ 5
‘ 引物 退火
5
‘ 5
‘ 底物 聚合 5
‘ 5
‘ 5
‘ 5
‘ 加热 变性 5
‘
5
‘ 5
‘ 5
‘ 5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘
5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘ 5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
5
‘
退火 引物 底物 聚合
加热 变性
引物 退火
底物 聚合
1
2
3
由 Taq DNA聚合酶扩增的 PCR产物中，其 3’ 末端总是会带
有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是 A,因
为 Taq DNA聚合酶对 dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基
的存在，克隆时即可以采取 TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接
，也可以使用专门的 T载体 克隆
PCR克隆目的基因的基本程序
5’
5’
A
A
T
T 5’
5’
PCR扩增产物
T 载体
T7 lacZ MCS ori Apr
D 化学合成法
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
化学合成法的基本战略
化学合成的单元操作
DNA化学合成的用途
化学合成法的基本战略
全基因合成
化学合成目的基因的前提条件是基因的 DNA序列已知，有三种战略,
小片段粘接法,
混合退火
根据目的基因全序列，分别合成 12-15碱基长的单链 DNA小片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
化学合成法的基本战略
全基因合成
补钉延长法,
混合退火
根据目的基因 两条互补链 全序列，分别合成 12-15碱基长的单链
DNA小片段以及 20-30碱基长的单链 DNA中片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
大片段酶促法,
混合退火
根据目的基因 的 全序列，分别合成 40-50碱基长的单链 DNA片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成 DNA的 单片段愈短，收率就
愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合
成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片
段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为 95%
则合成 50个碱基长的 DNA单链大片段的总收率只有 7.7%
化学合成法的基本战略
探针等寡聚核苷酸合成
在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸
序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其
编码的 DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或 cDNA法得到
的重组子，最终获得含有目的基因的 目的重组子
由于大多数氨基酸拥有 简并密码子,故在探针序列的设计时
必须考虑下列问题,
生物体对简并密码子的 偏爱性, 合成系列探针
探针应具有足够的长度，通常在 17-20个核苷酸之间
探针内部不应出现可能的互补区域
化学合成法的基本战略
探针等寡聚核苷酸合成
某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile
所有可能的 DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA
C T GATG G G T T
C
CGA
CGG
CGT
CGC
设计的简并探针序列
TGTATGGACGAIATGA
TGTATGGATGAIATGA
TGCATGGACGAIATGA
TGCATGGATGAIATGA
A
G
此外还可以参考各种生物体的 EST数据库进行倾向性简并序列设计
expressed sequence tag
化学合成的单元操作
化学合成 DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个
个接上去, 每接一个单体就是一个循环反应, 包括,基团保护,
分离, 缩合, 分离, 去保护 五大操作单元 。
从反应机理上来讲,DNA化学合成有 磷酸二酯法, 磷酸三酯
法, 亚磷酸液三酯法 ；具体操作过程又有 液相合成 和 固相合成 两
种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离
程序简便,DNA合成仪就是根据 固相亚磷酸液三酯法 原理设计的
化学合成的单元操作
O
H
G
H
H H
HO
CH
2
OD M T
POMe
N
CH
Me
Me
CH
Me
Me
O
H
G
H H H
H O
CH 2
O DMT
P O Me
N
CH
Me
Me
CH
Me
Me
H
DMT,二甲氧基三苯甲基
激活
缩合 氧化 脱取代基
玻璃珠
连接臂
DNA化学合成的用途
合成天然基因
修饰改造基因
设计新型基因
制备探针、引物、接头
如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素
如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等
基因等
E 基因文库的构建
5 目的基因的克隆与基因文库的构建
基因文库的基本概念
基因文库的构建程序
基因组文库重组克隆的排序
基因文库的基本概念
基因库与基因文库
基因库（ gene pool）
特定生物体全基因组的集合（天然存在）
基因文库（ gene library or gene bank）
从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式
基因组文库 （含有全部基因）
存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为,
cDNA文库 （含有全部蛋白质编码的结构基因）
基因文库的基本概念
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体 DNA
用 cDNA法构建 cDNA文库,材料来自 mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的 mRNA
种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的 cDNA文库
一般还有组织细胞的界定，如肝组织 cDNA文库或胚胎组织 cDNA
文库等。很显然,cDNA文库的信息量远小于基因组文库
基因文库的基本概念
基因文库的完备性
基因文库的 完备性 是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概
率，它与基因文库最低所含克隆数 N之间的关系可用下式表示,
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中,P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率
f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小
例如，人的单倍体 DNA总长为 2.9 x 109 bp,基因文库中克隆片段
的平均大小为 15 kb,则构建一个完备性为 0.9的 基因文库至少需要
45万个克隆；而当完备性提高到 0.9999时，基因文库至少需要 180
万个克隆
基因文库的基本概念
基因文库的质量标准
除了尽可能高的 完备性外,一个理想的基因文库应具备下列条件,
重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力
载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆
克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序
克隆片段易于从载体分子上完整卸下
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
基因文库的构建程序
基因组 DNA的制备
为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性,用于基因组
文库构建的 DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的
DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的 DNA片段
的比率就越低，重组率和完备性也就越高
A A
A A
用常规方法制备的染色体
DNA的长度一般在 100 kb左右
如果先将细胞固定在低融点凝
胶中，然后置入含有 SDS,蛋
白酶 K,RNase的缓冲液中浸泡，可获得 1000 kb大小的 DNA片段
基因文库的构建程序
基因组 DNA的切割
用于基因组 文库构建的 DNA片段的切割一般采用 超声波处理 和
限制性内切酶 部分酶切 两种方法，其目的是,
第一，保证 DNA片段之间存在部分重叠区
第二，保证 DNA片段大小均一
超声波处理 后的 DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
部分酶切法 一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶, 如,
Sau3AI或 MboI等，这样 DNA酶解片段的大小可控
连接前，上述处理的 DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的 DNA片段随机连为一体！
基因文库的构建程序
载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于 基因组 文库 构建的 载体通常选 装载量较大的
l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和 人类）需使用 YAC或 BAC载体
l-DNA
由于绝大多数真核生物的 mRNA小于 10 kb,因此用于 cDNA文库 构 建的载体
通常选质粒
上述几种 载体的最大装载量如下,
质粒
考斯质粒
15 kb
25 kb
45 kb
BAC 300 kb
YAC 400 kb
用于基因 文库构 建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌
基因文库的构建程序
从基因文库中筛选目的基因
大型基因组 文库 一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除
了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白
编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选 程序（如 抗药性筛选法,
酵母双杂交技术 等）直接筛选外，一般的基因组 文库筛选均需多轮
操作步骤
基因文库的构建程序
从基因文库中筛选目的基因
密集铺板（ 1-10万）
杂
交
挖
取
铺
板
铺
板
目的重组克隆
基因文库的构建程序
基因文库构建的技术性问题
在基因组 文库的构建过程中,最应引起重视的问题是,
严禁外源 DNA片段之间的连接！！！
为了避免上述情况的发生,可采取下列措施的组合,
将待连接的 DNA片段根据载体的装载量分级分离
用碱性磷酸单酯酶除去 DNA片段的末端磷酸基团
用 TdT酶在 DNA片段的末端上增补同聚尾末端
基因组文库重组克隆的排序
大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不
十分困难，如果一个 YAC基因文库的插入片段总和为整个基因
组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段 DNA序
列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排
列成一个像天然染色体 DNA上所表现出的信息顺序。这项工作
的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期
制作
基因组文库重组克隆的排序
将单一的 YAC克隆插入 DNA片段 用限制性内切酶分布均匀
地水解成若干片段，末端标记同位素
然后再用 Sau3AI或 MboI将末端标记的 DNA片段降解成碎
片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每 10个 YAC克隆走在同一块板上，
形成 10个克隆的特征性 DNA指纹图谱
电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆 DNA的指纹图谱
有部分相同的，则其两个 YAC片段就有互相重叠的可能性，于
是这两个 YAC克隆的 DNA片段克隆在染色体上是排列一起的
酶切片段末端标记法
酶切片段末端标记法
H H H H
S S S S
S S S S S
S S S S S
S S
S S S
单一克隆指纹图谱
十克隆指纹图谱
载体 DNA 克隆 DNA
基因组文库重组克隆的排序
将若干 YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成
20种不同序列的短探针，其序列是随机的
用 20种探针随机定位杂交（一对一） 20份 YAC克隆薄膜
如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则
这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为, 1”
，而阴性结果记为, 0”,可清晰地列成一张表，最终排出上述
YAC克隆的排列顺序
随机探针联合杂交法
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A B C
D E F
G
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
D
A
B
C
E
F
G
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18
D
A
B
C
E
F
G
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
F
C
A
D
G
E
B
基因组文库重组克隆的排序
从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之
两端序列分别亚克隆, 亚克隆片段在 0.5 - 2.0 kb范围内
分别以上述亚克隆 DNA片段为探针，杂交同一基因文库，
杂交阳性克隆中的插入 DNA片段必定与起点克隆所含的 DNA片
段连锁在一起
然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走
读，直至线型染色体 DNA的端点
染色体走读法（ chromosome walking）
染色体走读法（ chromosome walking）
走读的起点克隆片段
亚克隆旁测序列 探针标记
第一轮杂交
阳性克隆 阳性克隆
第二轮杂交 第二轮杂交
染色体走读法（ chromosome walking）
走读的起点克隆片段
