生物工程专业核心课程
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
E 酵母菌的表达系统
7 酵母基因工程
C 酵母菌的载体系统
B 酵母菌的宿主系统
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
F 利用重组 酵母生产乙肝疫苗
D 酵母菌的转化系统
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
7 酵母基因工程
酵母菌的分类学特征
酵母菌（ Yeast） 是一群以 芽殖 或 裂殖 方式进行 无性繁殖 的单细
胞 真核生物,分属于 子囊菌纲 （子囊酵母菌）,担子菌纲 （担子酵母
菌）,半知菌类 （半知酵母菌），共由 56个属和 500多个种组成。如
果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最
成熟的真核生物表达系统。
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
7 酵母基因工程
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 FDA认定为安全的
基因工程受体系统（ Generally Recognized As Safe GRAS）
酵母菌是最简单的真核模式生物
B 酵母菌的宿主系统
7 酵母基因工程
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括,
酵母属 如 酿酒酵母 （ Saccharomyces cerevisiae）
克鲁维酵母属 如 乳酸克鲁维酵母 （ Kluyveromyces lactis）
毕赤酵母属 如 巴斯德毕赤酵母 （ Pichia pastoris）
裂殖酵母属 如 非洲酒裂殖酵母 （ Schizosaccharomyces pombe）
汉逊酵母属 如 多态汉逊酵母 （ Hansenula polymorpha）
其中 酿酒酵母 的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但 巴斯德毕赤酵母
表达外源基因最理想。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的 ATP酶
ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工
rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平
ose1 提高重组蛋白表达 转录水平
ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶 Y
rho- 提高重组蛋白表达 转录水平
突变类型 生物效应 作用位点
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
能抑制超糖基化的突变类型
mnn 甘露糖生物合成缺陷型
alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型
och 外侧糖链添加缺陷型
突变类型 生物效应
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由 糖基核心 和 外侧糖
链 两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白
质的糖基化系统，但野生
型酿酒酵母对异源蛋白的
糖基化反应很难控制，呈
超糖基化倾向，因此超糖
基化缺陷株非常重要。
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
蛋白酶体
Lys HOOC Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3
Lys
ubiquitin ligase E3
Lys
靶蛋白
靶蛋白
靶蛋白
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因,
UBI 1 编码 泛素 -羧基延伸蛋白 52（ CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 2 编码 泛素 -羧基延伸蛋白 52（ CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 3 编码 泛素 -羧基延伸蛋白 76（ CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 4 编码 泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因,
UBC 1,UBC 2,UBC 3,UBC 4,UBC 5,UBC 6,UBC 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
在酿酒酵母菌中，泛素主要由 UBI 4基因表达,UBI 4-突变株能
UBI 4缺陷型,
正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多,
因此 UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型,
UBA1编码 泛素激活酶 E1,UBA1突变株是致死性的，但其等位
基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
Ubc4 - ubc5 双突变型,
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
C 酵母菌的载体系统
7 酵母基因工程
酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的 2m环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有 2m双链
同源重组
REP1
RAF
STB ori
REP2
FLP
IR
IR
A
B
环状质粒，拷贝数达 50至 100个。
IRs 反向重复序列,600 bp,重组
FLP 编码产物驱动 IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性
STB REP的结合位点
接合酵母属中的 pSR1和 pSB1,以及
克鲁维酵母属中的 pKD1等均与 2m质
粒类似。
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线 状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同
pGKL1 8.9 kb
DNA聚合酶 毒素蛋白 ab 免疫蛋白 g 亚基
的双链线状质粒 pGKL1和 pGKL1
拷贝数为 50-100个，分别携带 K1
K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
素蛋白编码基因（ a b g）,同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有 ARS的 YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列,0.8-1.5kb,染色体上每 30-40kb
就有一个 ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括 复制子, 标
记基因,提供克隆位点的大肠杆菌 质粒 DNA。
以 ARS为复制子的质粒称为 YRp
上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达 200个，但培养几代
以 2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为 YEp
后，质粒的丢失率高达 50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有 CEN的 YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体 DNA上与染色体均匀分配有关的序列
将 CEN DNA插入含 ARS的质粒中，获得的新载体称为 YCp
YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有 1 - 5个
含有 TEL的 YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体 DNA同源序列的 YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体 DNA特定序列和标记基因,
构建出来的质粒称为 Yip。 目的基因表达盒通常插在染色体 DNA特定
序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体 DNA区域
D 酵母菌的转化系统
7 酵母基因工程
转化质粒在酵母细胞中的命运
酵母菌的转化程序
用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化
法，在 Ca2+和 PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的 1-2%。
但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳
多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的 25-33%
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如 Li+等）,PEG,热休克
处理后，也可高效吸收质粒 DNA,而且具有下列特性,
吸收线型 DNA的能力明显大于环状 DNA,两者相差 80倍
共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒 DNA,
但在此过程中应避免使用 PEG,它对受电击的细胞具有较很大的负
作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件
适用范围广,而且转化率可高达 105 / mg DNA。
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链 DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的 10-30倍
含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制
不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体
这对于体内定点突变酵母基因组极为有利
克隆在 YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体
DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总
数的 50-80%
用于转化子筛选的标记基因
用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有 营养缺陷型互补基因 和
显性基因 两大类
营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如,
LEU,TRP,HIS,LYS,URA,ADE
但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难
营养缺陷型的互补基因
用于转化子筛选的标记基因
显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白
显性标记基因
aph 氨基糖苷转移酶 抗 G418
cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素
dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺
cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子
suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖
ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂
标记基因 编码产物 遗传表型
E 酵母菌的表达系统
7 酵母基因工程
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
酵母菌启动子的可控性
酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
pho4TS-PHO5启动子,
酿酒酵母 PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开
PHO4基因编码产物是 PHO5启动子的正调控因子
因此，装在 pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在 35℃ 时关闭
23℃ 诱导表达
温度控制型启动子
PHO4温度敏感型突变基因 pho4TS的编码产物在 35℃ 时失活
酵母菌启动子的可控性
a – a 型启动子,
酿酒酵母有 a和 a两种单倍
体，分别由 MATa和 MATa
两个等位基因决定。
a1因子决定 a细胞特征表达
a2因子阻遏 a细胞 特征表达
a1-a2阻遏 a细胞特征表达
编码 a2因子的基因突变型
hmla2-102能产生 a2变体,
它能灭活 a1,同时阻遏 a型
温度控制型启动子
a 型启动子
hmla2-102 MATa
a1 Sir3-8TS
a 型启动子
受体细胞基因组 重组质粒
a 型启动子
hmla2-102 MATa
a1
Sir3-8TS
a 型启动子
a2
a1
25℃
35℃
酵母菌启动子的可控性
酿酒酵母
超诱导型启动子
GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80
半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达
GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80
半乳糖诱导时,GAL4高效表达,GAL1,GAL1,GAL10超高效表达
GAL10
Promoter
的半乳糖
利用酶系
由 GAL1
GAL7和
GAL10
基因编码
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
外源基因稳态 mRNA的浓度
外源基因 mRNA的翻译活性
酵母菌对密码子的偏爱性
在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛 -3-磷酸脱氢酶
GAPDH,磷酸甘油激酶 PKG,乙醇脱氢酶 ADH） 中 96%
以上的氨基酸是由 25个密码子编码的
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油
醛 -3-磷酸脱氢酶基因 GAPDH,磷酸甘油激酶基因 PKG,乙醇脱氢
酿酒酵母表达系统
酶基因 ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。
酿酒酵母表达系统的最大问题在于其 超糖基化 能力，往往使得
有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能
大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。
酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒 pKD1已被广泛用作重组异源
蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也
乳酸克鲁维酵母表达系统
能稳定遗传 40代以上。
乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优
于酿酒酵母表达系统。
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母是一种 甲基营养菌,能在低廉的甲醇培养基中生
巴斯德毕赤酵母表达系统
长,甲醇 可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长
迅速、乙醇氧化酶基因 AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯
德毕赤酵母表达系统的三大优势。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因
的表达序列一般整合入受体的染色体 DNA上。在此情况下，外源基因
具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。
的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种
酵母菌表达系统的选择
多型汉逊酵母也是一种 甲基营养菌 。其自主复制序列 HARS已被
多型汉逊酵母表达系统
克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载
体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是,HARS质粒
能高频自发地整合在受体的染色体 DNA上，甚至可以连续整合 100多
目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获
个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
得成功表达。
F 利用重组 酵母生产乙肝疫苗
7 酵母基因工程
由 乙型肝炎病毒 （ HBV） 感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重
的传染病，每年约有 200万 病人死亡，并有 3亿 人成为 HBV携带者，其
中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒
还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒
感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其
广泛应用提供了可靠的保证。
F 利用重组 酵母生产乙肝疫苗
7 酵母基因工程
产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母
乙型肝炎病毒的结构与性质
产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙肝病毒是一种蛋白包裹型的 双链 DNA病毒,具有感染力的病毒
乙型肝炎病毒的结构
颗粒呈 球面 状，直径为 42 nm,基因组仅为 3.2 kb。 病毒颗粒的主要
结构蛋白是病毒的 表面抗原 多肽（ HBsAg）或 S多肽，它具有糖基化
和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括 核心抗原 （ HBcAg ）
,
除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的 22
病毒 DNA聚合酶, 微量病毒蛋白 。
nm的 空壳亚病毒颗粒,其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的
1000倍 。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白,S,M,L多肽 。
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因
ATG ATG ATG TAA
108 aa 55 aa 226 aa
preS1 preS2 S
S 多肽 226 aa
M 多肽 281 aa
L 多肽 399 aa
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫
传统乙肝疫苗的制备
苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的
疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。
产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母
20世纪 80年代开始选择酿酒酵母表达重组 HBsAg,主要工作包括
将 S多肽的编码置于 ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活
性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平
均颗粒直径为 22 nm,其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中
的病毒颗粒相同。
目前，由酿酒酵母生产的重组 HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化
重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的 1%-2%。
进一步的研究表明,M多肽和 L多肽对 S型疫苗具有显著的增效作
用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对 S抗
原缺乏响应的人群的免疫反应。
产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建
PARS2
Bgl II
5’ AOX1
HBsAg
PHIS4
3’ AOX1
Bgl II
pBSAG151
11 kb
Bgl II
5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1
his+的转化子
重组分子
转化 his-的受体细胞
染色体 DNA
产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
重组巴斯德毕赤酵母的性能
由于巴斯德毕赤酵母染色体 DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因
AOX2,所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。
重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲
醇诱导 HBsAg表达，最终 S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的 3%
在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个 240L的发酵罐
中培养，最终可获得 90克 22nm的 HBsAg颗粒，足够制成 900万份 乙肝
疫苗。
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
E 酵母菌的表达系统
7 酵母基因工程
C 酵母菌的载体系统
B 酵母菌的宿主系统
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
F 利用重组 酵母生产乙肝疫苗
D 酵母菌的转化系统
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
7 酵母基因工程
酵母菌的分类学特征
酵母菌（ Yeast） 是一群以 芽殖 或 裂殖 方式进行 无性繁殖 的单细
胞 真核生物,分属于 子囊菌纲 （子囊酵母菌）,担子菌纲 （担子酵母
菌）,半知菌类 （半知酵母菌），共由 56个属和 500多个种组成。如
果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最
成熟的真核生物表达系统。
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
7 酵母基因工程
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 FDA认定为安全的
基因工程受体系统（ Generally Recognized As Safe GRAS）
酵母菌是最简单的真核模式生物
B 酵母菌的宿主系统
7 酵母基因工程
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括,
酵母属 如 酿酒酵母 （ Saccharomyces cerevisiae）
克鲁维酵母属 如 乳酸克鲁维酵母 （ Kluyveromyces lactis）
毕赤酵母属 如 巴斯德毕赤酵母 （ Pichia pastoris）
裂殖酵母属 如 非洲酒裂殖酵母 （ Schizosaccharomyces pombe）
汉逊酵母属 如 多态汉逊酵母 （ Hansenula polymorpha）
其中 酿酒酵母 的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但 巴斯德毕赤酵母
表达外源基因最理想。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的 ATP酶
ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工
rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平
ose1 提高重组蛋白表达 转录水平
ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶 Y
rho- 提高重组蛋白表达 转录水平
突变类型 生物效应 作用位点
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
能抑制超糖基化的突变类型
mnn 甘露糖生物合成缺陷型
alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型
och 外侧糖链添加缺陷型
突变类型 生物效应
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由 糖基核心 和 外侧糖
链 两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白
质的糖基化系统，但野生
型酿酒酵母对异源蛋白的
糖基化反应很难控制，呈
超糖基化倾向，因此超糖
基化缺陷株非常重要。
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
蛋白酶体
Lys HOOC Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3
Lys
ubiquitin ligase E3
Lys
靶蛋白
靶蛋白
靶蛋白
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因,
UBI 1 编码 泛素 -羧基延伸蛋白 52（ CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 2 编码 泛素 -羧基延伸蛋白 52（ CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 3 编码 泛素 -羧基延伸蛋白 76（ CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 4 编码 泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因,
UBC 1,UBC 2,UBC 3,UBC 4,UBC 5,UBC 6,UBC 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
在酿酒酵母菌中，泛素主要由 UBI 4基因表达,UBI 4-突变株能
UBI 4缺陷型,
正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多,
因此 UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型,
UBA1编码 泛素激活酶 E1,UBA1突变株是致死性的，但其等位
基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
Ubc4 - ubc5 双突变型,
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
C 酵母菌的载体系统
7 酵母基因工程
酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的 2m环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有 2m双链
同源重组
REP1
RAF
STB ori
REP2
FLP
IR
IR
A
B
环状质粒，拷贝数达 50至 100个。
IRs 反向重复序列,600 bp,重组
FLP 编码产物驱动 IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性
STB REP的结合位点
接合酵母属中的 pSR1和 pSB1,以及
克鲁维酵母属中的 pKD1等均与 2m质
粒类似。
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线 状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同
pGKL1 8.9 kb
DNA聚合酶 毒素蛋白 ab 免疫蛋白 g 亚基
的双链线状质粒 pGKL1和 pGKL1
拷贝数为 50-100个，分别携带 K1
K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
素蛋白编码基因（ a b g）,同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有 ARS的 YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列,0.8-1.5kb,染色体上每 30-40kb
就有一个 ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括 复制子, 标
记基因,提供克隆位点的大肠杆菌 质粒 DNA。
以 ARS为复制子的质粒称为 YRp
上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达 200个，但培养几代
以 2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为 YEp
后，质粒的丢失率高达 50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有 CEN的 YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体 DNA上与染色体均匀分配有关的序列
将 CEN DNA插入含 ARS的质粒中，获得的新载体称为 YCp
YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有 1 - 5个
含有 TEL的 YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体 DNA同源序列的 YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体 DNA特定序列和标记基因,
构建出来的质粒称为 Yip。 目的基因表达盒通常插在染色体 DNA特定
序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体 DNA区域
D 酵母菌的转化系统
7 酵母基因工程
转化质粒在酵母细胞中的命运
酵母菌的转化程序
用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化
法，在 Ca2+和 PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的 1-2%。
但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳
多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的 25-33%
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如 Li+等）,PEG,热休克
处理后，也可高效吸收质粒 DNA,而且具有下列特性,
吸收线型 DNA的能力明显大于环状 DNA,两者相差 80倍
共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒 DNA,
但在此过程中应避免使用 PEG,它对受电击的细胞具有较很大的负
作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件
适用范围广,而且转化率可高达 105 / mg DNA。
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链 DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的 10-30倍
含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制
不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体
这对于体内定点突变酵母基因组极为有利
克隆在 YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体
DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总
数的 50-80%
用于转化子筛选的标记基因
用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有 营养缺陷型互补基因 和
显性基因 两大类
营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如,
LEU,TRP,HIS,LYS,URA,ADE
但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难
营养缺陷型的互补基因
用于转化子筛选的标记基因
显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白
显性标记基因
aph 氨基糖苷转移酶 抗 G418
cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素
dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺
cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子
suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖
ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂
标记基因 编码产物 遗传表型
E 酵母菌的表达系统
7 酵母基因工程
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
酵母菌启动子的可控性
酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
pho4TS-PHO5启动子,
酿酒酵母 PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开
PHO4基因编码产物是 PHO5启动子的正调控因子
因此，装在 pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在 35℃ 时关闭
23℃ 诱导表达
温度控制型启动子
PHO4温度敏感型突变基因 pho4TS的编码产物在 35℃ 时失活
酵母菌启动子的可控性
a – a 型启动子,
酿酒酵母有 a和 a两种单倍
体，分别由 MATa和 MATa
两个等位基因决定。
a1因子决定 a细胞特征表达
a2因子阻遏 a细胞 特征表达
a1-a2阻遏 a细胞特征表达
编码 a2因子的基因突变型
hmla2-102能产生 a2变体,
它能灭活 a1,同时阻遏 a型
温度控制型启动子
a 型启动子
hmla2-102 MATa
a1 Sir3-8TS
a 型启动子
受体细胞基因组 重组质粒
a 型启动子
hmla2-102 MATa
a1
Sir3-8TS
a 型启动子
a2
a1
25℃
35℃
酵母菌启动子的可控性
酿酒酵母
超诱导型启动子
GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80
半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达
GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80
半乳糖诱导时,GAL4高效表达,GAL1,GAL1,GAL10超高效表达
GAL10
Promoter
的半乳糖
利用酶系
由 GAL1
GAL7和
GAL10
基因编码
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
外源基因稳态 mRNA的浓度
外源基因 mRNA的翻译活性
酵母菌对密码子的偏爱性
在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛 -3-磷酸脱氢酶
GAPDH,磷酸甘油激酶 PKG,乙醇脱氢酶 ADH） 中 96%
以上的氨基酸是由 25个密码子编码的
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油
醛 -3-磷酸脱氢酶基因 GAPDH,磷酸甘油激酶基因 PKG,乙醇脱氢
酿酒酵母表达系统
酶基因 ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。
酿酒酵母表达系统的最大问题在于其 超糖基化 能力，往往使得
有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能
大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。
酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒 pKD1已被广泛用作重组异源
蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也
乳酸克鲁维酵母表达系统
能稳定遗传 40代以上。
乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优
于酿酒酵母表达系统。
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母是一种 甲基营养菌,能在低廉的甲醇培养基中生
巴斯德毕赤酵母表达系统
长,甲醇 可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长
迅速、乙醇氧化酶基因 AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯
德毕赤酵母表达系统的三大优势。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因
的表达序列一般整合入受体的染色体 DNA上。在此情况下，外源基因
具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。
的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种
酵母菌表达系统的选择
多型汉逊酵母也是一种 甲基营养菌 。其自主复制序列 HARS已被
多型汉逊酵母表达系统
克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载
体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是,HARS质粒
能高频自发地整合在受体的染色体 DNA上，甚至可以连续整合 100多
目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获
个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
得成功表达。
F 利用重组 酵母生产乙肝疫苗
7 酵母基因工程
由 乙型肝炎病毒 （ HBV） 感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重
的传染病，每年约有 200万 病人死亡，并有 3亿 人成为 HBV携带者，其
中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒
还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒
感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其
广泛应用提供了可靠的保证。
F 利用重组 酵母生产乙肝疫苗
7 酵母基因工程
产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母
乙型肝炎病毒的结构与性质
产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙肝病毒是一种蛋白包裹型的 双链 DNA病毒,具有感染力的病毒
乙型肝炎病毒的结构
颗粒呈 球面 状，直径为 42 nm,基因组仅为 3.2 kb。 病毒颗粒的主要
结构蛋白是病毒的 表面抗原 多肽（ HBsAg）或 S多肽，它具有糖基化
和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括 核心抗原 （ HBcAg ）
,
除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的 22
病毒 DNA聚合酶, 微量病毒蛋白 。
nm的 空壳亚病毒颗粒,其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的
1000倍 。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白,S,M,L多肽 。
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因
ATG ATG ATG TAA
108 aa 55 aa 226 aa
preS1 preS2 S
S 多肽 226 aa
M 多肽 281 aa
L 多肽 399 aa
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫
传统乙肝疫苗的制备
苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的
疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。
产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母
20世纪 80年代开始选择酿酒酵母表达重组 HBsAg,主要工作包括
将 S多肽的编码置于 ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活
性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平
均颗粒直径为 22 nm,其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中
的病毒颗粒相同。
目前，由酿酒酵母生产的重组 HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化
重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的 1%-2%。
进一步的研究表明,M多肽和 L多肽对 S型疫苗具有显著的增效作
用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对 S抗
原缺乏响应的人群的免疫反应。
产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建
PARS2
Bgl II
5’ AOX1
HBsAg
PHIS4
3’ AOX1
Bgl II
pBSAG151
11 kb
Bgl II
5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1
his+的转化子
重组分子
转化 his-的受体细胞
染色体 DNA
产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
重组巴斯德毕赤酵母的性能
由于巴斯德毕赤酵母染色体 DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因
AOX2,所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。
重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲
醇诱导 HBsAg表达，最终 S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的 3%
在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个 240L的发酵罐
中培养，最终可获得 90克 22nm的 HBsAg颗粒，足够制成 900万份 乙肝
疫苗。
