生物工程专业核心课程
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
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基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
D 高等哺乳动物的基因转移
8 哺乳动物基因工程
C 高等哺乳动物的载体系统
B 高等哺乳动物的受体系统
A 高等哺乳动物基因工程的基本概念
E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
A 高等哺乳动物基因工程的基本概念
8 哺乳动物基因工程
高等哺乳动物基因工程
高等哺乳动物细胞基因表达技术 高等哺乳动物转基因技术
转基因动物个体 动物工程细胞
哺乳动物遗传性状改良
药物筛选研究评价模型
人体基因治疗
蛋白多肽物质大规模生产
药物筛选研究评价模型
B 高等哺乳动物的受体系统
8 哺乳动物基因工程
高等哺乳动物细胞的生长特性
高等哺乳动物受体细胞的条件
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
常用的高等哺乳动物受体细胞
高等哺乳动物细胞的生长特性
正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征,
锚地依赖性,细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂
血清依赖性,细胞必须具有生长因子才能生长
接触抑制性,细胞与细胞接触后,生长便受到抑制
形态依赖性,细胞称扁平状,并有长纤维网状结构
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中,一般只能存活 50代
且在培养皿上以平面的形式生长,即单层细胞生长。有时,正常细胞
会改变某些特征而越过生理临界点,继续增殖并无限制分裂,这种状
态称为 细胞系形成,此时的细胞成为 细胞系 。
高等哺乳动物受体细胞的条件
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件
细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征,便于大
遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失,易于长期保存
合适的标记 便于转化株的筛选和维持
生长快且齐 分裂周期短,生长均一,便于控制
规模培养
大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件,癌细胞能
安全性能好 不合成分泌致病物质,不致癌
满足上述前四项要求,但在安全性能上有欠缺。
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
5-磷酸核糖 -1-焦磷酸( PRPP)
次黄嘌呤核苷一磷酸( HMP)
次黄嘌呤核苷( HR)
GMP AMP
尿嘧啶核苷一磷酸( UMP)
胸腺嘧啶核苷一磷酸( TMP)
胸腺嘧啶核苷( TR)
嘌呤核苷酸生物合成途径 嘧啶核苷酸生物合成途径
次黄嘌呤磷酸
核糖转移酶 ( HPRT) ( TK)
胸腺嘧啶
核苷激酶
氨基喋呤( AP)
氨基喋呤( AP)
从头合成途径
补救合成途径
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
含有胸腺嘧啶核苷激酶( TK) 编码基因缺陷的受体细胞( tk -)
不能在含有 次黄嘌呤核苷, 氨基喋呤, 胸腺嘧啶核苷 的培养基
上( HAT培养基 )生长,载体上的标记基因 tk能与之遗传互补
含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶( HPRT) 编码基因缺陷的受体细胞
不能在含有 次黄嘌呤核苷, 氨基喋呤, 胸腺嘧啶核苷 的培养基
上( HAT培养基 )生长,载体上的标记基因 hprt与之遗传互补
( hprt -)
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记
遗传标记 编码产物 筛选药物 作用机理
APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活 G418
DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤
HPH- 潮霉素 B磷酸转移酶 潮霉素 B HPH灭活潮霉素 B
TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK合成 TMP
XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成 GMP
ADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活 Xyl-A
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止,用于医疗用品(药物、抗体、诊断试剂)大规模生产
的高等哺乳动物受体细胞主要还是 中国仓鼠卵巢细胞 ( CHO),其优
势有如下几个方面,
遗传背景清楚,生理代谢稳定
与人的亲缘关系接近,外源蛋白修饰准确
基因转移和载体表达系统完善
耐受剪切力,便于大规模培养
被美国 FDA确认为安全的基因工程受体细胞( GRAS)
C 高等哺乳动物的载体系统
8 哺乳动物基因工程
人腺病毒 DNA
猴空泡病毒 DNA( SV40)
人乳多瘤病毒 DNA( BKV)
人牛痘病毒 DNA
人腺病毒 DNA
腺病毒科为线状双链 DNA病毒,无包膜,呈二十面体,共有 93个
成员,分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒
腺病毒的生物学特性
有 6个亚属,其中常用来构建载体的主要是 C亚属的 2型( Ad2) 和 5型
( Ad5) 病毒。
腺病毒感染人细胞时呈裂解型,不致癌;但对啮齿目动物来说,
绝大多数的腺病毒成员均能致癌。
人腺病毒 DNA
腺病毒的基因组 DNA
ITR ITR
E1 E2 E3 E4
IVa2 VA L1 L2 L3 L4 L5
腺病毒基因组 DNA全长 36 kb,其包装上限为原基因组的 105%,DNA两端各有
一个反向重复序列( ITR); E1-E4为早期基因,与病毒基因组的复制及晚期基因的
表达调控有关,其中 E3编码晚期基因的调控因子,L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期
基因; IVa2和 VA均为病毒 RNA聚合酶的亚基编码基因。 E3区缺失只会影响病毒颗粒
的成熟,不影响基因组的复制功能,因而在构建载体时往往除去这个 2.2 kb的片段,
使得载体的装载量提高到 4 kb以上。
人腺病毒 DNA
基因重排低 外源基因与病毒 DNA重组后能稳定复制几个周期
腺病毒 DNA载体的特点
安全性能好 不整合人的染色体 DNA,不会导致恶性肿瘤
宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格
使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达
猴多瘤病毒 DNA( SV40)
SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属,呈小型二十面体,由 VP1,
VP2,VP3三种衣壳蛋白包装而成,基因组为 5224bp的双链环状 DNA
SV40的生物学特性
SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白 H2,H3,H4结合,从
而使其 DNA形成类似核小体的 微型染色体 结构。
SV40感染猴细胞时呈裂解型,不致癌;但感染啮齿类动物后,
便发生 非同源整合 而致癌。
猴多瘤病毒 DNA( SV40)
SV40的基因组 DNA
t / T基因编码病毒的小抗原和大
SV40 DNA
ori VP2
T
VP3
VP1
t
抗原与病毒的致癌作用密切相关
SV40在裂解宿主细胞前的晚期
状态时,每个 宿主细胞含有 105个病
毒 DNA拷贝,因此十分适合用于高效
表达外源蛋白
猴多瘤病毒 DNA( SV40)
SV40 DNA-质粒 DNA杂合载体的构建
重组的 SV40 DNA分子必须经过
包装后才具有感染能力,因此插入的
外源 DNA片段不能太大。为了尽量提
高 SV40的装载量,必须删除一些基因
片段,因此重组的 SV40分子必须与野
生型病毒共感染受体细胞,才能形成
有感染力的重组病毒颗粒。
Apr
ori
viral gene
gpt
SV40 ori
pV2-GPT
pBR322
pBR322
SV40
pV2-GPT是一种 SV40 DNA与大肠杆菌质粒 DNA杂合的载体,其
中 gpt为细菌来源的 谷氨酸 -丙氨酸转氨酶基因,用于筛选重组子。该
载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔 b-珠蛋白,
猴多瘤病毒 DNA( SV40)
利用 SV40 DNA载体表达外源基因的程序
SV40 载体
病毒晚期基因启动子
筛选标记
ori
缺陷的 SV40 辅助病毒
去除细菌序列
插入外源基因
重组分子
分离病毒 DNA
转化
筛选 增殖
感染
猴多瘤病毒 DNA( SV40)
基因表达好 外源基因能高效表达
SV40 DNA载体的特点
基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象
宿主范围窄 只能转染猴细胞
装载量较小
人乳多瘤病毒 DNA( BKV)
人乳多瘤 病毒( BKV) 属于 乳多瘤 病毒科乳头瘤病毒属,其基因
组为双链 DNA,感染宿主细胞后基因不发生整合,独立于染色体而自
人乳多瘤病毒的生物学特性
主复制,每个宿主细胞最高可达 500个拷贝
人乳多瘤病毒 DNA( BKV)
人乳多瘤病毒表达载体的构建
BKV - E.coli
穿梭载体
BKV ori
BKV gene
DRE
MMTP
Ap r
E.coli ori
SV40 P
Neo r
删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的
基因,并与大肠杆菌质粒拼接,构成
穿梭载体,它不能整合,同时也不能
形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。
安装细胞色素 P450 dioxin介导的增强
子 DRE,控制小鼠乳腺癌启动子 MMTP,由其带动外源基因的表达。
SV40来源的启动子控制 Neor 标记基因,以 G418筛选重组子。
以此载体在人细胞系中表达 b1-干扰素和单纯疱疹病毒 B蛋白获得成功。
人牛痘病毒 DNA
人牛痘 病毒是一个大型 DNA病毒,基因组长 185 kb,能在宿主细
胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内,构建
人牛痘病毒的生物学特性
出的重组病毒具有感染力,而且一经转染,外源基因即可在最邻近的
病毒启动子的控制下高效表达。然而由于 牛痘 病毒基因组较大,体外
DNA重组很困难,因此通常采用体内重组的方式进行。
人牛痘病毒 DNA
目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒
其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌 T7RNA聚合酶 编码基因。在
人牛痘病毒 DNA表达载体的构建
外源基因导入受体细胞之前,先以上述的重组病毒感染细胞,使其大
量表达 T7RNA聚合酶,然后再将含有外源基因和 T7启动子的细菌型重
组质粒导入哺乳动物受体细胞,此时外源基因整合在受体细胞染色体
DNA上,并在 T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。
人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。
人牛痘病毒 DNA
利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序
牛痘病毒
启动子
T7 RNA
聚合酶基因
T7启动子 外源基因
细菌重组质粒
感染 转化 培养
收集
D 高等哺乳动物的基因转移
8 哺乳动物基因工程
哺乳动物细胞的物理转化法
哺乳动物细胞的病毒转染法
哺乳动物细胞的物理转化法
利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达
盒中不含任何病毒基因序列,这对外源基因表达产物的分离纯化减轻
了负担。但 外源基因表达 盒进入受体细胞后,往往以多拷贝的形式随
机整合在染色体 DNA上,导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。
哺乳动物细胞的物理转化法
将待转化的 DNA溶解在磷酸缓冲液中,加入 CaCl2溶液混匀,此
时 DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内;
此时细胞膜形成吞噬泡,磷酸钙晶体局部溶解膜结构,DNA便进入受
体细胞;
磷酸钙共沉淀法
将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中,37℃ 保温 4-16小时
弃去 DNA溶液,加入新鲜培养基,继续培养 7天即可筛选转化株。
如果在外源 DNA中掺入少量的受体细胞内源性 DNA可以提高转化
效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒 DNA,可使正常细胞转化为
癌细胞,这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。
哺乳动物细胞的物理转化法
将待转化的 DNA溶解受体细胞悬浮液中,然后加入电击转化仪的
样品槽内,两端施加瞬时高压电场,使细胞膜产生细小的缝隙,此时
电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型,如生长在
悬浮液中的淋巴细胞等。
电击转化法
DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。
哺乳动物细胞的物理转化法
将待转化的 DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合,后者在表面
活性剂的存在下形成包埋水相 DNA的 脂质体 结构。
合,DNA随即进入胞质和核内。
利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和 HeLa
脂质体介导法
将这种 脂质体悬浮液加入到细胞培养液中,便会与受体细胞膜融
细胞。
哺乳动物细胞的物理转化法
通过激素疗法使雌鼠超数排卵,并与雄性小鼠交配,然后杀死雌
鼠,从其输卵管内取出受精卵;
性原核内。
上述程序多用于动物个体的转基因过程,由于必须单细胞逐一操
显微注射法
借助于显微镜将纯化的 DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄
作,所以不太适用于基因的克隆和表达。
哺乳动物细胞的物理转化法
血影细胞 是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环
境下发生溶血,血红蛋白大量溢出,最后形成仅被细胞膜包裹的细胞
同时,外源 DNA也容易进入。当上述外界条件消失后,红细胞膜又可
恢复原来的通透性。因此,可先将外源 DNA转入 血影细胞,然后再将
血影细胞介导法
核结构。在 溶血过程中,红细胞膜的通透性大增,在血红蛋白溢出的
血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合,从而将外源 DNA转入受
体细胞。
哺乳动物细胞的病毒转染法
以病毒 DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒
共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导
入效率高等优点,但也存在一定的缺陷,如目前常用的载体宿主范围
有限,往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。
E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
8 哺乳动物基因工程
哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体
利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂
利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子 VIII
哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊
方式。 氨甲喋呤 ( MTX) 是动物细胞中的关键代谢酶 二氢叶酸还原酶
数细胞死亡,但在极少数幸存下来的抗性细胞中,dhfr基因均得以扩
增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶
通过强化基因扩增高效表达外源基因
( DHFR) 的特异性抑制剂,细胞培养物经 氨甲喋呤 处理后,绝大多
的表达水平,从而抵消 氨甲喋呤 的抑制效应。更重要的是,扩增的区
哺乳动物细胞内的基因扩增现象
域远远大于 dhfr基因本身,即与 dhfr基因相邻的 DNA区域同时被扩增。
哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
通过强化基因扩增高效表达外源基因
DHFR-MTX高效表达系统
外源基因 dhfr
转染 dhfr -细胞系
单克隆
培养
转移
0.05 mM MTX
培养
单克隆
转移
培养
单克隆 转移
5 mM MTX 0.25 mM MTX
培养
单克隆
外源基因扩增至 100拷贝
哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
通过强化基因扩增高效表达外源基因
GS-MSX高效表达系统
谷氨酰胺合成酶 ( GS) 能解除 甲硫氨酸亚砜 ( MSX) 对动物细
胞的毒害作用。先将带有 GS编码基因 的载体转入培养的哺乳动物细
中不必使用 GS缺陷型的受体细胞,而且在正常的 MSX浓度下就能筛
选到含有高拷贝外源基因的转染细胞,这是 GS-MSX系统比 DHFR-
胞中,由于只有多拷贝的 GS编码基因才能抗 MSX,所以在转染过程
MTX系统优越之处。
哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
通过强化基因转录高效表达外源基因
在载体上安装病毒或细胞来源的强启
Ap r
M13 ori ColE1 ori
CMVP
Polylinker
Gene Intron
SV40 T
PolyA signal
高效表达载体
mRNA前体
AAAAAAAAA mRNA
动子以及有效的翻译元件,也是使外源基
因高效表达的一种手段,如,
细胞巨化病毒 CMV的启动子
动物珠蛋白基因的 内含子
SV40的 终止子 和 polyA化 信号序列
绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体
上携带内含子结构,因为 mRNA前体的剪
切能促进成熟 mRNA向胞质的运输,有利
于翻译。有的还含有各种信号肽序列。
哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理
利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白
迄今为止,已有大约 300种重组蛋白药物正在进行临床试验,但
在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种,
b 干扰素 g 干扰素
凝血因子 VIII 凝血因子 IX
促红细胞生成素( EPO) 生长因子( hGH)
白介素 2( IL-2) 乙型肝炎表面抗原
单克隆抗体 CD4受体
组织型纤溶酶原激活剂( tPA)
利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体
大多数恶性淋巴
Neor
鼠金属硫蛋白启动子
b 肌动蛋白启动子 抗体轻链 cDNA
b 肌动蛋白终止子 pL
dhfr
SV40启动子
b 肌动蛋白启动子 抗体重链 cDNA
b 肌动蛋白终止子 pH
瘤细胞表面上都
有一种特异性的
糖蛋白 campath
用人源化的小鼠
抗 campath抗体
治疗非霍金淋巴
细胞瘤患者,效
果良好。重组抗
体采用 DHFR-M
TX系统表达。
利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂
第一个由重组哺乳动物
dhfr
启动子
人 tPA cDNA
终止子
细胞规模化生产的医用蛋白
是治疗急性心肌梗塞的溶血
栓药物,人组织纤溶酶原激
活剂 ( tPA)。 同样采用
DHFR-MTX系统表达,受体
细胞选用 CHO系统。目前,
用该工艺路线生产的重组人 tPA已经商品化。
信号肽编码序列
此外,人 tPA也可由重组大肠杆菌生产,但蛋白的重折叠效率低。
利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子 VIII
凝血因子 VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来,血友病
病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子 VIII生物制品进行治疗,然
而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒,数千名使用这种血液制
品的血友病人惨遭感染,其中 10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。
早在上述情况发生之前,人凝血因子 VIII的 cDNA便已被克隆和鉴
定,血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与 tPA
相似,人凝血因子 VIII也是一种结构复杂的大分子,必须通过重组哺乳
动物细胞生产,但目前商品化了的重组人凝血因子 VIII尚不能满足几代
血友病人的大量需求。