生物工程专业核心课程
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
4 基因工程的操作过程
C 转化子的筛选和鉴定（检）
B 重组 DNA分子的转化和扩增（转、增）
A DNA的体外重组（切、接）
4 基因工程的操作过程
切 接 转
增
检
A DNA的体外重组（切与接）
4 基因工程的操作过程
同种内切酶生产的粘性末端的连接
同尾酶生产的粘性末端的连接
不同粘性末端的连接
粘性末端的更换
人工粘性末端的连接
重组率
同种内切酶生产的粘性末端的连接
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
5'
G
CTTAA
AATTC
G
5' 5' G
CTTAA 5' 5'
AATTC
G
5'
退火
G
CTTAA
AATTC
G
5' G
CTTAA 5'
AATTC
G
G
CTTAA
AATTC
G
5' G
CTTAA 5'
AATTC
G
T4-DNA ligase
GAATTC
CTTAAG
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
同尾酶生产的粘性末端的连接
BamHI
5'
5'
GGATCC
CCTAGG
GGATCC
CCTAGG
5'
G
CCTAG
GATCC
G
5' 5' T
ACTAG 5' 5'
GATCA
T
5'
退火
G
CCTAG
GATCC
G
5' T
ACTAG 5'
GATCA
T
T4-DNA ligase
TGATCC
ACTAGG
5'
5'
GGATCA
CCTAGT
5' TGATCA
ACTAGT 5'
BclI
G
CCTAG
GATCC
G
5' T
ACTAG 5'
GATCA
T
TGATCC
ACTAGG
5'
5'
GGATCA
CCTAGT
不同粘性末端的连接
BamHI
5'
5'
GGATCC
CCTAGG
GGATCC
CCTAGG
5'
G
CCTAG
GATCC
G
5' 5' CTGCA
G 5'
G
ACGTC
3'
T4-DNA ligase
CGATCC
GCTAGG
5'
5'
GGATCG
CCTAGC
5' CTGCAG
GACGTC 5'
PstI
3'
T4-DNA pol 切平
5' C
G 5'
G
C
Klenow 补平
5'
GGATC
CCTAG
GATCC 5'
CTAGG
CGATCC
GCTAGG
5'
5'
GGATCG
CCTAGC
人工粘性末端的连接 5‘突出末端
5'
G
CCTAG
GATCC
G
5' 5' G
CTTAA 5' 5'
5' AATTC
G
T4-DNA ligase
5'
5'
Klenow 补平 Klenow 补平
5'
GGATC
CCTAG
GATCC 5'
CTAGG
5' GAATT
CTTAA 5' 5'
5' AATTC
TTAAG
TdT TdT dGTP dCTP
GAATTGGGGGG
CTTAA
AATTC
GGGGGGTTAAG
GGATCCCCCCC
CCTAG
GATCC
CCCCCCCTAGG
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
5'
5'
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
退火
BamH I
BamH I EcoR I
BamH I
人工粘性末端的连接 3‘突出末端
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5' GCATG 3'
C 5'
C
3' GTACG
T4-DNA ligase
TdT TdT dCTP dGTP
GCATGCCCCCC 3'
C
退火
Pst I Pst I
C
3' CCCCCCGTACG
CTGCAGGGGGG 3'
G
G
3' GGGGGGACGTC
5'
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
Klenow
Pst I
Sph I
人工粘性末端的连接 平头末端
C 3'
G
G 5' G 3'
C 5'
C
3' G
T4-DNA ligase
TdT TdT dTTP dATP
GTTTTTTTTTT 3'
C
退火
C
3' TTTTTTTTTTG
CAAAAAAAAAA 3'
G
G
3' AAAAAAAAAAC
5'
5'
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC
GTTTTTTTTTTG
S1
C 3'
5'
5'
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC
GTTTTTTTTTTG
加热
GT CA T T T T T T T T TG
A A AAAA A A AC
CA GT A A A A A A A A AC
T T TTTT T T TG
TG
AC
CA
GT
粘性末端的更换
BamHI
5'
5'
GGATCC
CCTAGG
T4-DNA ligase
Klenow 补平
GATCC 5'
G 5'
G
CCTAG 5'
5'
5'
GGATC
CCTAG
5' GATCC
CTAGG
5'
5'
GGATCGGAATTCCGATCC
CCTAGCCTTAAGGCTAGG
5'
5'
EcoR I
GGAATTCC
CCTTAAGG EcoR I linker
重组率
重组率的定义
重组率 = 含有外源 DNA的重组分子数 / 载体分子总数
在常规实验条件下, 重组率一般为 25 - 75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标, 较高的重组率可以
大大简化 DNA重组的后续操作 。
重组率
提高重组率的方法
提高外源 DNA片段与载体的分子比, 5, 1 - 10, 1
载体 DNA分子在连接前先除去磷酸基团,
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
5'
G
CTTAA p
AATTC
G
5' p 5' G
CTTAA OH 5' 5'
AATTC
G
5' HO
退火
5' G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A G 5'
G A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
OH HO
OH HO
碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸单酯酶
重组率
提高重组率的方法
加装同聚尾末端,
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5' GCATG 3'
C 5'
C
3' GTACG
T4-DNA ligase
TdT TdT dCTP dGTP
GCATGCCCCCC 3'
C
退火
C
3' CCCCCCGTACG
CTGCAGGGGGG 3'
G
G
3' GGGGGGACGTC
5'
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
Klenow
B 重组 DNA分子 的转化和扩增（转与增）
4 基因工程的操作过程
转化的原理与技术
转化率
转化细胞的扩增
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如
大肠杆菌等）,1970年建立此技术，其原理是 Ca2+与细菌外
膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，
使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做 感受态
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞 的制备,
100 ml 菌体培养至 OD600 = 0.5,离心收集菌体
用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心
用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液悬浮菌体
冰浴放置 12 - 24小时，备用
收集菌体
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞 的质粒转化,
取 100 ml 感受态细胞，加入相当于 50 ng 载体的重组
冰浴放置半小时
在 42℃ 保温 2 分钟（热脉冲）
快速将转化细胞转移至冰浴中放置 1 - 2分钟
DNA连接液，混匀
加入 1 ml 新鲜培养基,于 37℃ 培养 1 小时（扩增）
涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源 DNA
的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用 原生质体 （细胞
去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组 DNA分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用 原生质体法进行转化
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：
细菌需生长在高渗培养基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨
酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体
应始终悬浮在 10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所
有器皿应保持无水无去污剂
细菌原生质体 的制备,
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
取 0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（ 108-109个原生质体），加
入 10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有 PEG1000和 Ca2+
的等渗溶液，混匀
细菌原生质体 的转化,
细菌原生质体 的再生,
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生
在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
转化的原理与技术
l噬菌体 DNA的转染
感受态细胞的培养,
将大肠杆菌在含有麦芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培养基
中培养至 OD600 = 0.5
吸附,
加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液, 30℃ 保温 10分钟
转染裂解,
加入 20倍体积的新鲜培养基,30℃ 培养 2小时，直至培养液
中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选
转化的原理与技术
电穿孔转化
将待转化的质粒或 DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品
池中, 两极施加高压电场 。 在强大电场的作用下, 细菌细胞壁和
细胞膜产生缝隙, 质粒或 DNA重组分子便可进入细胞内
电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受
体细胞均有效，但转化效率差别很大
同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验
转化率
转化率的定义
转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体
DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转
化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此
转化率的定义也可以表征为：每微克载体 DNA转化后，受体细胞
接纳 DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的
受体细胞不长）
转化率
转化率的定义
例如, pUC18对大肠杆菌的转化率为 108,即每微克 pUC18
中只有 108个分子能进入受体细胞 。 一 微克 pUC18共有 3.4X1011个
分子 （ 6.02X1017 / 2686X660）, 也就是说, 每 3400个 pUC18分
子才有 一 个分子进入受体细胞
另一方面, 在实际操作过程中, 转化 一 微克 pUC18共需 2ml
感受态细胞, 大约含有 2X1010个大肠杆菌细胞, 也就是说, 每
200个细胞只有一个细胞能接纳 pUC18 DNA
转化率
转化率的用途
利用转化率和重组率等参数可以帮助设计 DNA重组实验规模
例如,某一 DNA重组实验的重组率为 20%，转化率为 107/mg载体,
经切接处理后的载体转化率比天然的载体低 100倍，欲获得 104个
重组克隆，需投入多少载体 DNA进行重组实验？
若重组率为 100%，则转化后产生 104个重组克隆需要,
104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体 DNA
考虑到实验系统的重组率为 20%，所以实际投入载体应为,
0.1 / 20% = 0.5 mg 载体 DNA
载体投入量确定后，外源 DNA的投入量即可按 10∶ 1的要求算
出（ 5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选
转化率
转化率的影响因素
载体及 DNA重组分子方面,
载体本身的性质,
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
载体的空间构象,
质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载
体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的
超螺旋质粒低两个数量级
插入片段的大小,
对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低
转化率
转化率的影响因素
受体细胞方面,
受体细胞必须与载体相匹配，例如,pBR322转化大
肠杆菌 JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌 ED8767株的
转化率则较高
转化率
转化率的影响因素
转化方法方面,
受体细胞的预处理,影响最大
供受体的比例,
Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态 细胞 50 ng DNA
转化方法,
Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA
原生质体转化 109 个 原生质体 50 ng DNA
原生质体转化 105 - 106 / mg DNA
l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA
电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA
转化细胞的扩增
扩增操作
转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培
养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如,
Ca2+诱导转化后的 37℃ 培养一个小时
原生质体转化后的再生过程
l噬菌体转染后的 30℃ 培养等，均属扩增操作
转化细胞的扩增
扩增操作的目的
增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序
扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选
表达外源基因，便于筛选和鉴定
C 转化子的筛选和鉴定（检）
4 基因工程的操作过程
载体遗传标记检测
克隆 DNA序列检测
外源基因产物检测
C 转化子的筛选和鉴定（检）
4 基因工程的操作过程
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借
助各种筛选和鉴定方法区分 转化子 与非转化子,重组子 与非
重组子,目的重组子 与非目的重组子
转化子 重组子 目的重组子
载体遗传标记检测
抗药性筛选法
ROP
ROI
Sal I
BamH I
Tc r
Pvu I
Pst I
Pst I
EcoR I
Cla I
Hind III
Hind II
Bal I
Ap r
抗药性筛选法的基本原理,
pBR322
4363 bp
ori
抗药性筛选法可区分 转化子 与非
转化子,重组子 与非重组子
将外源 DNA片段插在 EcoRI位点,
非重组子呈 Apr,Tcr
重组子呈 Apr,Tcr
将外源 DNA片段插在 BamHI位点,
非重组子呈 Apr,Tcr
重组子呈 Apr,Tcs
载体遗传标记检测
抗药性筛选法
抗药性筛选法的基本操作,
先将转化液涂布含有 Ap的平板
再将 Ap平板上的转化子影印至
含有 Ap和 Tc的平板上
在 Ap平板上生长、但在 Ap和 Tc
平板上 不长的转化子即为
Ap
Ap + Tc
影印 挑选
重组子
载体遗传标记检测
营养缺陷型筛选法
营养缺陷型筛选法的基本原理,
营养缺陷型筛选法可以区分 转化子 与非转化子，一般不
能区分 重组子 与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种
营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组
份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的
便是转化子
载体遗传标记检测
营养缺陷型筛选法
常见的营养缺陷型筛选标记,
哺乳动物细胞中存在两条 dTTP的合成途径,
用于 大肠杆菌 的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因 trp+
用于高等 哺乳动物细胞 的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激
酶基因 tk,相应的受体细胞则选择 tk-缺陷型
dCDP dTDP dTTP
TR dTMP dTDP dTTP
AP
TK
AP 氨基喋呤
TK 胸腺嘧啶核苷激酶
载体遗传标记检测
显色筛选法
显色筛选法的基本原理,
显色筛选法可以区分 转化子 与非转化子，也可区分 重组子
与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其
表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大
肠杆菌质粒 pUC18携带的 lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒
pIJ702携带的 melC基因（黑色反应）等
载体遗传标记检测
显色筛选法
显色筛选法的基本操作,
pUC18
Ap r
lacZ'
ori
Ap + X-gal
重组子（ Apr + lacZ-）
将外源基因克隆在 pUC18的 lacZ’标
记 基因内部, 使之灭活, 此时重组
子呈 Apr,lacZ-,淡黄色菌落；而非
重组子则呈 Apr,lacZ+,蓝色菌落
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片
段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因
此利用这种方法不仅能区分 重组子 与非重组子，而且还能鉴定
目的重组子 。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工
作量极大，实验成本也高。
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
B B E P
4.0 kb
1.0 kb 0.8 kb
区分重组子与非重组子
用 BamHI酶切转化子质粒 DNA
电泳观察酶解产物片段
重组子,2.7 kb + 4.0 kb
非重组子,2.7 kb
如果外源 DNA片段也是 2.7 kb,最好
选用单一切口的酶将质粒线型化，然
后通过其长度来鉴定其是否为重组子
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
S S B P
4.0 kb
1.0 kb 0.8 kb
区分重组子与非重组子
如果外源 DNA片段插在 pUC18的
SphI位点处，原则上也可用 SphI
酶解鉴定，但这样做很不经济，
因为 SphI非常昂贵（每 100单位
50美元）。用 HindIII和 EcoRI联
合酶解同样可以达到目的，但这
两种酶的价格只及 SphI的 1 / 50
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
B B E P
4.0 kb
1.0 kb 0.8 kb
区分目的重组子与非目的重组子
用 EcoRI酶切转化子质粒 DNA
目的重组子,3.0 kb + 3.7 kb
或者,1.0 kb + 5.7 kb
用 PstI酶切转化子质粒 DNA
目的重组子,3.2 kb + 3.5 kb
或者,0.8 kb + 5.9 kb
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
B B E
4.0 kb
2.0 kb 2.0 kb
区分目的重组子与非目的重组子
对图示的克隆片段，转化子质粒
DNA用 EcoRI酶切开后，只出现
2.0 kb和 2.7 kb两条带子，实际上
2.0 kb的条带中含有两种不同的
分子
2.7 kb
2.0 kb
E
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
部分酶解图谱法,
2.2 kb
PstI EcoRI BamHI
B B E
4.4 kb
1.2 1.8 kb
E B
0.6 0.8
该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据,
BamHI全酶解,0.6 0.8 1.8 3.4 kb
BamHI+EcoRI全酶解,0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb
其中, 1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端
BamHI部分酶解,1.4 2.6 4.0 kb
其中, 1.4 kb的片段必为 0.6 kb和 0.8 kb两片段, 表
明两者是连在一起的；同理, 2.6 kb的片段必为 0.8
kb和 1.8 kb两片段, 表明两者是连在一起的；最后,
4.0 kb的片段必为 0.6 kb和 3.4 kb两片段, 表明两者
是连在一起的
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基
因或 DNA片段的 同源序列 设计并合成 探针,以此搜寻筛选含有
目的基因的 目的重组子 。其中,DNA同源序列之间的特异性互
补杂交是该技术的基本理论依据
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落原位杂交法的基本操作,影印
用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板
洗涤
杂交
感光
用 0.4N的 NaOH溶液浸泡影印薄膜
用 SSC溶液浸泡清洗影印薄膜
80℃ 烘干固定影印薄膜
薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温
用 SSC-SDS液洗涤杂交薄膜
用 X光胶片覆盖薄膜感光
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的制备,
用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件,
单链结构 （ 双链 DNA可用碱变性 ）
足够长度 （ 至少 12个 碱基 ）
内部不含互补区
探针的制备方法或来源包括,
人工合成
cDNA合成
同源序列
mRNA
GACCTA AAGCGGATCG TAGGTC
GACCTA
CTGGAT
A A
G C
T
G
GG
C A
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,T4-PNP介导的末端标记
5‘ HO
3‘ HO
OH 3‘
OH 5‘
T4-PNP Mg2+ pppATP（ g-32P-ATP）
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,逆转录酶 介导的反转录标记
3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT 5’mRNA
反转录酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（ a-32P-dATP）
5’TTTTTTTTTTT
5’mRNA
3’cDNA
3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT
5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,DNA聚合酶 介导的缺刻前移标记
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a-32P-dATP
）
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
DNase I
DNA pol I
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,ABC荧光标记
GCTTGAGCAGTAACCTG
荧光胺
Biotin 生物素
Avidin
生物素结合蛋白
烷烃连接臂
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,ABC显色酶标记
GCTTGAGCAGTAACCTG
显色酶 Biotin 生物素
Avidin 生物素结合蛋白
烷烃连接臂
生色底物
颜色产物
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,地高辛系统标记
dUTP-连接臂 -甾醇半抗原
digoxigenin DIG
抗体 -显色酶 交联复合物
克隆 DNA序列检测
DNA序列分析法
双脱氧末端终止测序法的基本原理,
DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段, 目前国际上流行
采用 Sanger发明的 双脱氧末端终止法 测定 DNA序列, 其工作原理
是在 DNA聚合反应的进程中, 通过位点特异性终止测定 DNA序列
其关键技术有,
DNA链聚合反应时的定点随机中断（ ddNTP）
聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（ 600 bp / 601 bp）
电脑自动检测、记录、编辑程序
用于 DNA测序的专一性试剂盒（ Kit）
克隆 DNA序列检测
DNA序列分析法
双脱氧末端终止测序法的基本操作,
A C G T
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
Primer Primer Primer Primer
Klenow Klenow Klenow Klenow
dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
A G T C
DNA聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶电泳
克隆 DNA序列检测
DNA序列分析法
双脱氧末端终止测序法的基本反应,
Klenow
OH 3' 5' P
T
dNTP + ddATP
T T T T T OH 3' 5' P
A G T C
GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
淀粉酶目的基因的鉴定,
淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶
淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水
的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将
待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的 目的重组子 可
其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性
的多糖或单糖。因此,目的重组子 菌落周围会形成透明圈。如果透
明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底,
易于辨认。
蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
抗菌素抗性基因的鉴定,
抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素
的抗性 。 据此, 只需往培养板中加入适量抗生素, 理论上长出的
菌落即是含有目的基因的目的重组子
在实际操作过程中, 由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗
性, 因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒, 二次转化受体细
胞 。 如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落, 即可认为这种抗
性确由目的基因的编码产物产生
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
抗菌素抗性基因的鉴定,
目的重组子
诱导抗性
抽取重组质粒
再次转化
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
DNA结合蛋白编码基因的鉴定,
影印
用 聚乙烯薄膜 影印裂解平板
洗涤
杂交
感光
轻轻漂洗影印薄膜, 干燥固定
80℃ 烘干固定影印薄膜
与探针溶液中杂交
洗涤, 干燥, 感光
用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌体喷洒 克隆平板
聚乙烯膜
探针选用能与
目标蛋白特异
性结合的 DNA
片段
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
杂交释放转译 鉴定,
合
并
变
性
挂
柱
制
备
上
样
淋
洗
洗
脱
翻
译
测
活
重组 DNA 单链 DNA mRNA 杂交的 mDNA 蛋白质 蛋白质
无细胞体外翻译系统,麦胚提取物、网织红细胞提取物
外源基因产物检测
蛋白质生物结构鉴定法
放射免疫原位杂交 鉴定
,
影印
用固定了特异性抗体的 聚乙烯薄膜 影印
洗涤 与 I125标记的 IgG保温
感光
轻轻漂洗影印薄膜, 干燥固定
与 I125标记的 IgG保温
洗涤, 干燥, 感光
用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌体喷洒 克隆平板
含抗体的聚乙烯膜
裂解平板
外源基因产物检测
蛋白质生物结构鉴定法
免疫沉淀 鉴定,
在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体
然后涂布转化液
37℃ 培养 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标
蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀
反应，在菌落周围形成白色的圆斑
此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋白既不
能测定生物活性，又无现成的抗
体使用，则可采用 聚丙烯酰胺凝
胶电泳进行粗略的筛选
基 因 工 程
华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
4 基因工程的操作过程
C 转化子的筛选和鉴定（检）
B 重组 DNA分子的转化和扩增（转、增）
A DNA的体外重组（切、接）
4 基因工程的操作过程
切 接 转
增
检
A DNA的体外重组（切与接）
4 基因工程的操作过程
同种内切酶生产的粘性末端的连接
同尾酶生产的粘性末端的连接
不同粘性末端的连接
粘性末端的更换
人工粘性末端的连接
重组率
同种内切酶生产的粘性末端的连接
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
5'
G
CTTAA
AATTC
G
5' 5' G
CTTAA 5' 5'
AATTC
G
5'
退火
G
CTTAA
AATTC
G
5' G
CTTAA 5'
AATTC
G
G
CTTAA
AATTC
G
5' G
CTTAA 5'
AATTC
G
T4-DNA ligase
GAATTC
CTTAAG
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
同尾酶生产的粘性末端的连接
BamHI
5'
5'
GGATCC
CCTAGG
GGATCC
CCTAGG
5'
G
CCTAG
GATCC
G
5' 5' T
ACTAG 5' 5'
GATCA
T
5'
退火
G
CCTAG
GATCC
G
5' T
ACTAG 5'
GATCA
T
T4-DNA ligase
TGATCC
ACTAGG
5'
5'
GGATCA
CCTAGT
5' TGATCA
ACTAGT 5'
BclI
G
CCTAG
GATCC
G
5' T
ACTAG 5'
GATCA
T
TGATCC
ACTAGG
5'
5'
GGATCA
CCTAGT
不同粘性末端的连接
BamHI
5'
5'
GGATCC
CCTAGG
GGATCC
CCTAGG
5'
G
CCTAG
GATCC
G
5' 5' CTGCA
G 5'
G
ACGTC
3'
T4-DNA ligase
CGATCC
GCTAGG
5'
5'
GGATCG
CCTAGC
5' CTGCAG
GACGTC 5'
PstI
3'
T4-DNA pol 切平
5' C
G 5'
G
C
Klenow 补平
5'
GGATC
CCTAG
GATCC 5'
CTAGG
CGATCC
GCTAGG
5'
5'
GGATCG
CCTAGC
人工粘性末端的连接 5‘突出末端
5'
G
CCTAG
GATCC
G
5' 5' G
CTTAA 5' 5'
5' AATTC
G
T4-DNA ligase
5'
5'
Klenow 补平 Klenow 补平
5'
GGATC
CCTAG
GATCC 5'
CTAGG
5' GAATT
CTTAA 5' 5'
5' AATTC
TTAAG
TdT TdT dGTP dCTP
GAATTGGGGGG
CTTAA
AATTC
GGGGGGTTAAG
GGATCCCCCCC
CCTAG
GATCC
CCCCCCCTAGG
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
5'
5'
GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG
退火
BamH I
BamH I EcoR I
BamH I
人工粘性末端的连接 3‘突出末端
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5' GCATG 3'
C 5'
C
3' GTACG
T4-DNA ligase
TdT TdT dCTP dGTP
GCATGCCCCCC 3'
C
退火
Pst I Pst I
C
3' CCCCCCGTACG
CTGCAGGGGGG 3'
G
G
3' GGGGGGACGTC
5'
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
Klenow
Pst I
Sph I
人工粘性末端的连接 平头末端
C 3'
G
G 5' G 3'
C 5'
C
3' G
T4-DNA ligase
TdT TdT dTTP dATP
GTTTTTTTTTT 3'
C
退火
C
3' TTTTTTTTTTG
CAAAAAAAAAA 3'
G
G
3' AAAAAAAAAAC
5'
5'
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC
GTTTTTTTTTTG
S1
C 3'
5'
5'
GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC
GTTTTTTTTTTG
加热
GT CA T T T T T T T T TG
A A AAAA A A AC
CA GT A A A A A A A A AC
T T TTTT T T TG
TG
AC
CA
GT
粘性末端的更换
BamHI
5'
5'
GGATCC
CCTAGG
T4-DNA ligase
Klenow 补平
GATCC 5'
G 5'
G
CCTAG 5'
5'
5'
GGATC
CCTAG
5' GATCC
CTAGG
5'
5'
GGATCGGAATTCCGATCC
CCTAGCCTTAAGGCTAGG
5'
5'
EcoR I
GGAATTCC
CCTTAAGG EcoR I linker
重组率
重组率的定义
重组率 = 含有外源 DNA的重组分子数 / 载体分子总数
在常规实验条件下, 重组率一般为 25 - 75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标, 较高的重组率可以
大大简化 DNA重组的后续操作 。
重组率
提高重组率的方法
提高外源 DNA片段与载体的分子比, 5, 1 - 10, 1
载体 DNA分子在连接前先除去磷酸基团,
5'
5'
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
5'
G
CTTAA p
AATTC
G
5' p 5' G
CTTAA OH 5' 5'
AATTC
G
5' HO
退火
5' G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A G 5'
G A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
OH HO
OH HO
碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸单酯酶
重组率
提高重组率的方法
加装同聚尾末端,
CTGCA 3'
G
G
3' ACGTC
5' GCATG 3'
C 5'
C
3' GTACG
T4-DNA ligase
TdT TdT dCTP dGTP
GCATGCCCCCC 3'
C
退火
C
3' CCCCCCGTACG
CTGCAGGGGGG 3'
G
G
3' GGGGGGACGTC
5'
5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
5'
5'
GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG
Klenow
B 重组 DNA分子 的转化和扩增（转与增）
4 基因工程的操作过程
转化的原理与技术
转化率
转化细胞的扩增
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如
大肠杆菌等）,1970年建立此技术，其原理是 Ca2+与细菌外
膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，
使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做 感受态
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞 的制备,
100 ml 菌体培养至 OD600 = 0.5,离心收集菌体
用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心
用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液悬浮菌体
冰浴放置 12 - 24小时，备用
收集菌体
转化的原理与技术
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞 的质粒转化,
取 100 ml 感受态细胞，加入相当于 50 ng 载体的重组
冰浴放置半小时
在 42℃ 保温 2 分钟（热脉冲）
快速将转化细胞转移至冰浴中放置 1 - 2分钟
DNA连接液，混匀
加入 1 ml 新鲜培养基,于 37℃ 培养 1 小时（扩增）
涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源 DNA
的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用 原生质体 （细胞
去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组 DNA分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用 原生质体法进行转化
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：
细菌需生长在高渗培养基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨
酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体
应始终悬浮在 10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所
有器皿应保持无水无去污剂
细菌原生质体 的制备,
转化的原理与技术
细菌原生质体的转化
取 0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（ 108-109个原生质体），加
入 10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有 PEG1000和 Ca2+
的等渗溶液，混匀
细菌原生质体 的转化,
细菌原生质体 的再生,
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生
在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
转化的原理与技术
l噬菌体 DNA的转染
感受态细胞的培养,
将大肠杆菌在含有麦芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培养基
中培养至 OD600 = 0.5
吸附,
加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液, 30℃ 保温 10分钟
转染裂解,
加入 20倍体积的新鲜培养基,30℃ 培养 2小时，直至培养液
中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选
转化的原理与技术
电穿孔转化
将待转化的质粒或 DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品
池中, 两极施加高压电场 。 在强大电场的作用下, 细菌细胞壁和
细胞膜产生缝隙, 质粒或 DNA重组分子便可进入细胞内
电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受
体细胞均有效，但转化效率差别很大
同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验
转化率
转化率的定义
转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体
DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转
化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此
转化率的定义也可以表征为：每微克载体 DNA转化后，受体细胞
接纳 DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的
受体细胞不长）
转化率
转化率的定义
例如, pUC18对大肠杆菌的转化率为 108,即每微克 pUC18
中只有 108个分子能进入受体细胞 。 一 微克 pUC18共有 3.4X1011个
分子 （ 6.02X1017 / 2686X660）, 也就是说, 每 3400个 pUC18分
子才有 一 个分子进入受体细胞
另一方面, 在实际操作过程中, 转化 一 微克 pUC18共需 2ml
感受态细胞, 大约含有 2X1010个大肠杆菌细胞, 也就是说, 每
200个细胞只有一个细胞能接纳 pUC18 DNA
转化率
转化率的用途
利用转化率和重组率等参数可以帮助设计 DNA重组实验规模
例如,某一 DNA重组实验的重组率为 20%，转化率为 107/mg载体,
经切接处理后的载体转化率比天然的载体低 100倍，欲获得 104个
重组克隆，需投入多少载体 DNA进行重组实验？
若重组率为 100%，则转化后产生 104个重组克隆需要,
104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体 DNA
考虑到实验系统的重组率为 20%，所以实际投入载体应为,
0.1 / 20% = 0.5 mg 载体 DNA
载体投入量确定后，外源 DNA的投入量即可按 10∶ 1的要求算
出（ 5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选
转化率
转化率的影响因素
载体及 DNA重组分子方面,
载体本身的性质,
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
载体的空间构象,
质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载
体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的
超螺旋质粒低两个数量级
插入片段的大小,
对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低
转化率
转化率的影响因素
受体细胞方面,
受体细胞必须与载体相匹配，例如,pBR322转化大
肠杆菌 JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌 ED8767株的
转化率则较高
转化率
转化率的影响因素
转化方法方面,
受体细胞的预处理,影响最大
供受体的比例,
Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态 细胞 50 ng DNA
转化方法,
Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA
原生质体转化 109 个 原生质体 50 ng DNA
原生质体转化 105 - 106 / mg DNA
l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA
电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA
转化细胞的扩增
扩增操作
转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培
养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如,
Ca2+诱导转化后的 37℃ 培养一个小时
原生质体转化后的再生过程
l噬菌体转染后的 30℃ 培养等，均属扩增操作
转化细胞的扩增
扩增操作的目的
增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序
扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选
表达外源基因，便于筛选和鉴定
C 转化子的筛选和鉴定（检）
4 基因工程的操作过程
载体遗传标记检测
克隆 DNA序列检测
外源基因产物检测
C 转化子的筛选和鉴定（检）
4 基因工程的操作过程
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借
助各种筛选和鉴定方法区分 转化子 与非转化子,重组子 与非
重组子,目的重组子 与非目的重组子
转化子 重组子 目的重组子
载体遗传标记检测
抗药性筛选法
ROP
ROI
Sal I
BamH I
Tc r
Pvu I
Pst I
Pst I
EcoR I
Cla I
Hind III
Hind II
Bal I
Ap r
抗药性筛选法的基本原理,
pBR322
4363 bp
ori
抗药性筛选法可区分 转化子 与非
转化子,重组子 与非重组子
将外源 DNA片段插在 EcoRI位点,
非重组子呈 Apr,Tcr
重组子呈 Apr,Tcr
将外源 DNA片段插在 BamHI位点,
非重组子呈 Apr,Tcr
重组子呈 Apr,Tcs
载体遗传标记检测
抗药性筛选法
抗药性筛选法的基本操作,
先将转化液涂布含有 Ap的平板
再将 Ap平板上的转化子影印至
含有 Ap和 Tc的平板上
在 Ap平板上生长、但在 Ap和 Tc
平板上 不长的转化子即为
Ap
Ap + Tc
影印 挑选
重组子
载体遗传标记检测
营养缺陷型筛选法
营养缺陷型筛选法的基本原理,
营养缺陷型筛选法可以区分 转化子 与非转化子，一般不
能区分 重组子 与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种
营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组
份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的
便是转化子
载体遗传标记检测
营养缺陷型筛选法
常见的营养缺陷型筛选标记,
哺乳动物细胞中存在两条 dTTP的合成途径,
用于 大肠杆菌 的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因 trp+
用于高等 哺乳动物细胞 的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激
酶基因 tk,相应的受体细胞则选择 tk-缺陷型
dCDP dTDP dTTP
TR dTMP dTDP dTTP
AP
TK
AP 氨基喋呤
TK 胸腺嘧啶核苷激酶
载体遗传标记检测
显色筛选法
显色筛选法的基本原理,
显色筛选法可以区分 转化子 与非转化子，也可区分 重组子
与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其
表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大
肠杆菌质粒 pUC18携带的 lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒
pIJ702携带的 melC基因（黑色反应）等
载体遗传标记检测
显色筛选法
显色筛选法的基本操作,
pUC18
Ap r
lacZ'
ori
Ap + X-gal
重组子（ Apr + lacZ-）
将外源基因克隆在 pUC18的 lacZ’标
记 基因内部, 使之灭活, 此时重组
子呈 Apr,lacZ-,淡黄色菌落；而非
重组子则呈 Apr,lacZ+,蓝色菌落
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片
段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因
此利用这种方法不仅能区分 重组子 与非重组子，而且还能鉴定
目的重组子 。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工
作量极大，实验成本也高。
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
B B E P
4.0 kb
1.0 kb 0.8 kb
区分重组子与非重组子
用 BamHI酶切转化子质粒 DNA
电泳观察酶解产物片段
重组子,2.7 kb + 4.0 kb
非重组子,2.7 kb
如果外源 DNA片段也是 2.7 kb,最好
选用单一切口的酶将质粒线型化，然
后通过其长度来鉴定其是否为重组子
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
S S B P
4.0 kb
1.0 kb 0.8 kb
区分重组子与非重组子
如果外源 DNA片段插在 pUC18的
SphI位点处，原则上也可用 SphI
酶解鉴定，但这样做很不经济，
因为 SphI非常昂贵（每 100单位
50美元）。用 HindIII和 EcoRI联
合酶解同样可以达到目的，但这
两种酶的价格只及 SphI的 1 / 50
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
B B E P
4.0 kb
1.0 kb 0.8 kb
区分目的重组子与非目的重组子
用 EcoRI酶切转化子质粒 DNA
目的重组子,3.0 kb + 3.7 kb
或者,1.0 kb + 5.7 kb
用 PstI酶切转化子质粒 DNA
目的重组子,3.2 kb + 3.5 kb
或者,0.8 kb + 5.9 kb
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法,
pUC18
2.7 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI
Apr
lacZ’
ori
B B E
4.0 kb
2.0 kb 2.0 kb
区分目的重组子与非目的重组子
对图示的克隆片段，转化子质粒
DNA用 EcoRI酶切开后，只出现
2.0 kb和 2.7 kb两条带子，实际上
2.0 kb的条带中含有两种不同的
分子
2.7 kb
2.0 kb
E
克隆 DNA序列检测
限制性酶切图谱法
部分酶解图谱法,
2.2 kb
PstI EcoRI BamHI
B B E
4.4 kb
1.2 1.8 kb
E B
0.6 0.8
该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据,
BamHI全酶解,0.6 0.8 1.8 3.4 kb
BamHI+EcoRI全酶解,0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb
其中, 1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端
BamHI部分酶解,1.4 2.6 4.0 kb
其中, 1.4 kb的片段必为 0.6 kb和 0.8 kb两片段, 表
明两者是连在一起的；同理, 2.6 kb的片段必为 0.8
kb和 1.8 kb两片段, 表明两者是连在一起的；最后,
4.0 kb的片段必为 0.6 kb和 3.4 kb两片段, 表明两者
是连在一起的
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基
因或 DNA片段的 同源序列 设计并合成 探针,以此搜寻筛选含有
目的基因的 目的重组子 。其中,DNA同源序列之间的特异性互
补杂交是该技术的基本理论依据
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落原位杂交法的基本操作,影印
用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板
洗涤
杂交
感光
用 0.4N的 NaOH溶液浸泡影印薄膜
用 SSC溶液浸泡清洗影印薄膜
80℃ 烘干固定影印薄膜
薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温
用 SSC-SDS液洗涤杂交薄膜
用 X光胶片覆盖薄膜感光
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的制备,
用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件,
单链结构 （ 双链 DNA可用碱变性 ）
足够长度 （ 至少 12个 碱基 ）
内部不含互补区
探针的制备方法或来源包括,
人工合成
cDNA合成
同源序列
mRNA
GACCTA AAGCGGATCG TAGGTC
GACCTA
CTGGAT
A A
G C
T
G
GG
C A
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,T4-PNP介导的末端标记
5‘ HO
3‘ HO
OH 3‘
OH 5‘
T4-PNP Mg2+ pppATP（ g-32P-ATP）
5‘ p
3‘ HO
OH 3‘
p 5‘
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,逆转录酶 介导的反转录标记
3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT 5’mRNA
反转录酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（ a-32P-dATP）
5’TTTTTTTTTTT
5’mRNA
3’cDNA
3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT
5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,DNA聚合酶 介导的缺刻前移标记
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a-32P-dATP
）
5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…
5‘
DNase I
DNA pol I
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,ABC荧光标记
GCTTGAGCAGTAACCTG
荧光胺
Biotin 生物素
Avidin
生物素结合蛋白
烷烃连接臂
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,ABC显色酶标记
GCTTGAGCAGTAACCTG
显色酶 Biotin 生物素
Avidin 生物素结合蛋白
烷烃连接臂
生色底物
颜色产物
克隆 DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
杂交探针的标记,地高辛系统标记
dUTP-连接臂 -甾醇半抗原
digoxigenin DIG
抗体 -显色酶 交联复合物
克隆 DNA序列检测
DNA序列分析法
双脱氧末端终止测序法的基本原理,
DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段, 目前国际上流行
采用 Sanger发明的 双脱氧末端终止法 测定 DNA序列, 其工作原理
是在 DNA聚合反应的进程中, 通过位点特异性终止测定 DNA序列
其关键技术有,
DNA链聚合反应时的定点随机中断（ ddNTP）
聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（ 600 bp / 601 bp）
电脑自动检测、记录、编辑程序
用于 DNA测序的专一性试剂盒（ Kit）
克隆 DNA序列检测
DNA序列分析法
双脱氧末端终止测序法的基本操作,
A C G T
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
Primer Primer Primer Primer
Klenow Klenow Klenow Klenow
dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
A G T C
DNA聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶电泳
克隆 DNA序列检测
DNA序列分析法
双脱氧末端终止测序法的基本反应,
Klenow
OH 3' 5' P
T
dNTP + ddATP
T T T T T OH 3' 5' P
A G T C
GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
淀粉酶目的基因的鉴定,
淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶
淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水
的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将
待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的 目的重组子 可
其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性
的多糖或单糖。因此,目的重组子 菌落周围会形成透明圈。如果透
明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底,
易于辨认。
蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
抗菌素抗性基因的鉴定,
抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素
的抗性 。 据此, 只需往培养板中加入适量抗生素, 理论上长出的
菌落即是含有目的基因的目的重组子
在实际操作过程中, 由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗
性, 因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒, 二次转化受体细
胞 。 如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落, 即可认为这种抗
性确由目的基因的编码产物产生
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
抗菌素抗性基因的鉴定,
目的重组子
诱导抗性
抽取重组质粒
再次转化
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
DNA结合蛋白编码基因的鉴定,
影印
用 聚乙烯薄膜 影印裂解平板
洗涤
杂交
感光
轻轻漂洗影印薄膜, 干燥固定
80℃ 烘干固定影印薄膜
与探针溶液中杂交
洗涤, 干燥, 感光
用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌体喷洒 克隆平板
聚乙烯膜
探针选用能与
目标蛋白特异
性结合的 DNA
片段
外源基因产物检测
蛋白质生物功能测定法
杂交释放转译 鉴定,
合
并
变
性
挂
柱
制
备
上
样
淋
洗
洗
脱
翻
译
测
活
重组 DNA 单链 DNA mRNA 杂交的 mDNA 蛋白质 蛋白质
无细胞体外翻译系统,麦胚提取物、网织红细胞提取物
外源基因产物检测
蛋白质生物结构鉴定法
放射免疫原位杂交 鉴定
,
影印
用固定了特异性抗体的 聚乙烯薄膜 影印
洗涤 与 I125标记的 IgG保温
感光
轻轻漂洗影印薄膜, 干燥固定
与 I125标记的 IgG保温
洗涤, 干燥, 感光
用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌体喷洒 克隆平板
含抗体的聚乙烯膜
裂解平板
外源基因产物检测
蛋白质生物结构鉴定法
免疫沉淀 鉴定,
在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体
然后涂布转化液
37℃ 培养 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标
蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀
反应，在菌落周围形成白色的圆斑
此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大
外源基因产物检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
如果待筛选鉴定的目标蛋白既不
能测定生物活性，又无现成的抗
体使用，则可采用 聚丙烯酰胺凝
胶电泳进行粗略的筛选
