Outline of Genetic Engineering
基因工程概论鲁耀邦湖南中医药大学
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第一讲 绪论教学目的与要求基因工程 总 论教学大纲参考书目
◆ 教学目的与要求
基因工程学自 20世纪 70年代初期诞生以来,在短短的 30
多年间已经取得了许多令世人瞩目的成就,成为当代生命科学研究领域中最具生命力,最引人关注的前沿学科之一,是现代分子生物学与生物技术的核心内容 。
本课程充分考虑到我院研究生的来源及其知识结构的特点,着重加强有关 基因工程原理部分 的讲授,并努力将基因工程学同分子生物学,分子遗传学以及生物化学等基础学科有机地联系起来进行讨论 。 在内容安排上,强调基础性,先进性,系统性和实用性,同时也努力反映国内外有关学者的最新研究成果 。
◆ 教学目的与要求
本课程为分子生物学,分子遗传学,发育生物学,细胞生物学,生物化学等有关专业研究生的学科基础课,同时也是植物学,动物学以及微生物学等专业研究生的重点选修课
。 我们期望不同专业的研究生在修完本课程之后,能够较为系统,全面地掌握基因工程的基础知识和最新进展,并能跟上该专业学科的发展进程 。
◆ 教材与参考书
吴乃虎,基因工程原理 (第二版,上册 )，
科学出版社,1998
吴乃虎,基因工程原理 (第二版,下册 )，
科学出版社,2001
楼士林等,基因工程 (第一版 ),科学出版社,2002
吴乃虎,张方,黄美娟,基因工程术语,
科学出版社,2005
GENE VII或 VIII
分子克隆实验指南 (第三版 )
基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定
克隆基因的表达与产物纯化
基因表达的调控基因工程概论
1、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
1,基因研究的发展基因工程 或称 基因操作,是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上世纪 70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。其创立与发展，直接依赖于基因分子生物学的进步。可以说，基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，而基因工程技术的发展与应用，又深刻有力地影响着基因的研究，使我们对基因本质的认识提高到了空前的高度。
1,基因研究的发展
20世纪以来，基因研究一直是影响整个遗传学发展的主线。根据不同历史时期的水平和特点，可分 3阶段：
20世纪 50年代前,基因的染色体遗传学阶段,主要从细胞染色体水平上进行研究；
20世纪 50年代 —70年代,基因的分子生物学阶段,主要从 DNA大分子水平上进行研究；
20世纪 80年代以来,重组 DNA技术不断完善，人们能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其与表型间的关系，使基因研究进入了 反向生物学阶段 。
1,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 1）基因学说的创立
基因的最基本性质是在一个多世纪前由 孟德尔 (G,Mendel)定义的
。 由他提出的两大定律 ——分离律与独立分配律可总结出,A,基因是一种由亲代传到子代的特殊因子 —— 遗 传 因 子 (hereditary
factor)； B,基因可能存在变异的形式 。 (1857-1864,豌豆杂交 )
G,J,Mendel
奥地利原天主教神父
1822-1884
孟德尔碗豆杂交实验
◆ （ 1）基因学说的创立
1909年,丹麦生物学家 W,Johannsen根据希腊文,
给予生命,之义,创造了 基因 (gene)一词,替代了孟德尔的,遗传因子,。 遗传性状的符号,尚未具体涉及基因的物质概念 。
1910年左右,摩尔根 (T,H,Morgan)学派对基因学说的建立作出了卓越的贡献 。 他们通过果蝇突变体的研究第一次将代表某一特定性状的基因同某一特定的染色体联系了起来,创立了 遗传的染色体理论,
使基因学说得到了普遍的承认 。 (1910-1915)
T H Morgan（ 1866-1945）
美国遗传学家从 1910年到 30年代他在果蝇遗传实验中进一步证实了孟德尔分离定律和自由组合定律。
他的两大重要发现：一是发现基因在染色体上，二是发现遗传的基因链锁和互换定律。建立了摩尔根基因学说。
他的格言：,实验方法的本质在于每一种见解和假说都必须通过实验的检验，然后才被承认其科学地位。
摩尔根“果蝇的伴性实验”
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 2）基因与 DNA分子
在人们认识核酸的过程中,1928年发现的,转化,
现象具有重要作用 。 肺炎双球菌能够通过引起肺炎杀死老鼠 。 这种细菌的有毒物质被认为是它的 外壳多糖,是一种细菌表面的物质,能够避免细菌被宿主破坏掉 。 不同类型的肺炎双球杆菌有不同的外壳多糖 。 但它们都有平滑的表面 。
已死亡的病菌中的参与转化的那一部分物质称之为转化物 。 1944年 Avery和他的同事们的实验表明转移物的化学组成实际上就是 脱氧核糖核酸 （ DNA） 。
图 1.1 转化过程的核心是 DNA
这个结果说明了原核生物的遗传物质也是 DNA，
还为细菌和高等生物的遗传提供了一种独特的观点。
（ SIII 菌）
（ RII 菌）
原文对图 1.1的结果是这样分析的：这种引入的物质
,就它的化学和物理性质而言,看起来是高度聚合且有粘性的 DNA。 另一方面,III 型外壳多糖的合成是由可转移的物质激发的,它是由不含氮的多糖组成 。 因此我们认为,引入的物质以及反过来产生的产物在化学上是不同的,在功能上有生物特异性,
两者对于决定它们所在细胞的特异性是必须的 。
这个讨论描述了遗传物质及表达产物之间的区别,
为后来的研究奠定了重要的理论基础 。
当可转移分子被发现由 DNA组成之后,下一步需要证明的就是 DNA可在一个完全不同的体系中提供遗传物质 。
1952 年,Hershey和 Chase用放射性标记 T2噬菌体感染细菌 (32P 标记 DNA,35S标记蛋白质 ) 的实验进一步说明了不管是在细胞基因组中还是病毒中,
遗传物质就是 DNA这一结论 。
图 1.2 说明了这个试验的结果 。
图 1.2 T2 噬菌体的遗传物质被证明是 DNA(捣碎实验 )。
本实验直接表明父代噬菌体的
DNA进入到细菌中,变成了子代噬菌体的一部分
,恰好符合是遗传物质的遗传特性 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
证明了 DNA是遗传物质和基因的载体之后,遗传学家和分子生物学家进而着手研究维系生命现象的基础 ——DNA分子的 自我复制过程,以揭示遗传信息是怎样从亲代准确地传递到子代的本质 。
这个问题是在 1953年 J,Watson和 F,Crick创立
DNA双螺旋结构模型 之后才逐步得到解决的 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
DNA双螺旋模型的提出基于以下三个方面的发现：
X光衍射实验数据表明 DNA是一种规则螺旋结构：
每 3.4nm旋转一周,直径约为 2nm。 因为相邻核苷酸距离为 0.34nm,因此每圈有 10个核苷酸单位 。
DNA密度测量说明这种螺旋结构应有两条链 。 而且如果两条链间的碱基都是朝里而且严格的按嘌呤对嘧啶排列,那么就可以阻止嘌呤对嘌呤 (太粗 ),嘧啶对嘧啶 (太细 )的形成 。
不论碱基数目多少,G的含量总是与 C一样,而 A与
T也是一样 。 因此通常以 G+C的含量来描述 DNA的组成 。 不同物种 G+C的含量一般在 26~74%。
图 1.3 多核糖键是由一系列
5’—3’ 糖 - 磷酸键作为主链和含有碱基突出组成的 。
图 1.4 由于嘌呤碱基总是与嘧啶碱基配对,因此双螺旋的宽度是恒定的,图中序列为 T-A,
C-G,A-T
,G-C。 两条核苷酸链反向 平行 。 沿着螺旋旋转方向,一条是 5’-3’方向,而另一条是 3’-5’方向 。
图 1.5 DNA的双链构成双螺旋? 每个碱基相对于其相邻的碱基对都绕螺旋轴旋转约 36度 。 这样约 10个碱基对就能旋转一周 。
双螺旋体中的两条链彼此环绕形成一条 窄沟 (约
12nm)和一条 宽沟 ( 约
22nm),这两条沟在电镜下形状见 图 1.5。 双链是沿 右手 方向的；即顺时针方向转动 。 所有这些都是 B-DNA所具有的特征
图 1.6 碱基配对是 DNA复制原理的基础 。
图上部是一对父本链
，下部是通过碱基对互补产生的子代链。
未复制的亲本双链由两条原始的亲本链组成。复制要求两条链分开，从而为互补提供模板。每一个子代双链与原始亲本的序列相同，并且包括一条亲本链和一条新合成的链。 如此 DNA的结构使得它的序列能稳定的遗传。
图 1.7 DNA 的复制是以半保留方式进行的 。
亲本双螺旋复制形成两个子代双螺旋,每一个携带一条亲本链和新合成的子代链,这种组合在代与代之间非常保守
,两条链之中总是有一条亲本链 。 这种复制方式 称 为 半 保 留 复 制
( S e m ic o n s e r v a t i v e
replication)。
不管是杂合双体还是纯合双体,其中任何一条链要么是含重原子的要么是含轻原子的 。
1958年的 Meselson-Stahl实验 证实了这一观点,在这个实验中观察了三代酵母菌的 DNA
复制 。 从细胞中提取出 DNA,离心测量其密度,则 DNA按密度分成三带：最重的是母体
,杂合体是第一代,第二代中一半是杂合体一半是纯合双体 。 (图 1.7)
图 1.8 复制叉是指从未解旋的母链向新复制的子链过度的区域。
DNA 分子在复制过程中
,非复制区保持着亲本双链结构,复制区分开
,从此处形成两个代双链 (图 1.8)。 这两个相接区域称为 复制叉,此处双螺旋的结构被破坏 。
复制涉及到复制叉沿着亲本双链移动,因此存在亲本双链连续解螺旋以及重新螺旋形成子代双链 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
DNA分子是基因的载体,是否每一段 DNA都是基因呢？
经典的基因概念,在染色体或 DNA分子上,基因都是成串珠似的一个挨一个排列,它们之间由非遗传的物质连接起来 。 交换只是在基因之间进行,而不在基因内部发生 。 基因既是遗传的功能单位,也是交换单位和突变单位 。
以 T4噬菌体为材料的研究工作表明,事实并非如此 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
1955年,S,Benzer正式使用,顺反子,(cistron)这个术语,将 T4噬菌体导致寄主快速溶菌的 rII区的两个亚区分别称为 rIIA顺反子和 rIIB顺反子 (即 rIIA基因和
rIIB基因 )。
每一个顺反子就是一段核苷酸序列,或曰相当于一个基因的 DNA或 RNA单元,它编码一种完整的多肽链
。 这种多肽链既可以是一种具有生物活性的蛋白质,
也可以同别的多肽聚合形成多功能的蛋白质 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
顺反子是 功能单位,由许多可以突变的位点组成 。 这些位点之间又可以发生交换 。
据 Benzer计算,在功能 DNA中,最小交换单位约为
1~3个核苷酸对,这同理论上的最低值一个核苷酸对极为接近 。 所以,顺反子中的最小交换单位 (又称 交换子 )和最小突变单位 (又称 突变子 ),都应是 DNA分子中的一个核苷酸对 。 也只有在这种情况下,交换子才等于突变子 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
一般说来,一个顺反子即是一个基因,大约含有
1500个核苷酸对,是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构 。
顺反子的概念表明,基因不是最小单位,它仍然是可分的；并非所有的 DNA序列都是基因,而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区 。
由于所有生物的 DNA的基本结构都是一致的,因此,
来自两种生命形态的基因 (DNA)可以融为一体,这是进行基因工程的重要理论基础之一 。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 3）基因与多肽链
基因是细胞中所有的 RNA及蛋白质分子的,蓝图,。
20世纪 40年代,G,W,Beadle和 E,L,Tatum提出,一种基因一种酶,假说 (“one-gene-one-enzyme hypothesis”)
。 (X-射线诱导红色面包霉,营养缺陷突变体,1941年 )
1957年,英国剑桥 V,M,Ingram在对镰形细胞贫血症的血红蛋白和正常血红蛋白的氨基酸序列作了对比研究之后,
才第一次用实验证实了基因同蛋白质之间的直接联系 。
(Glu→Val) 表明基因的突变会直接影响到它编码的蛋白质多肽链成份的改变 。
多体蛋白质的发现 。 假说修正为,一种基因一种多肽链,
。
◆ 基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序对应关系？
1958年,F,Crick在综合分析了 50年代末期有关遗传信息流转向的各种资料的基础上,提出了描述
DNA,RNA和蛋白质三者关系的中心法则 (central
dogma) ；
1970年,D,Baltimore和 H,M,Temin在一些 RNA
肿瘤病毒中,发现了一种依赖 RNA的 DNA多聚酶
—— 逆转录酶 。
1971年,F,Crick根据新的进展修改了中心法则：
RNA
DogmaCentral
DNA
Protein
转 录翻 译
Transcription
Translation
Replication
复 制逆 转录 ReverseTranscription
在生命的初始阶段,中心法则是,
RNA自我复制并翻译 （ 生产 ） 蛋白质
RNA只由四种核苷组成,有的结构非常简单,把核苷链片段放在一起就可能组成有自我复制能力的
RNA,这已经被实验证明 。
但是有一个困难,RNA的自我复制和翻译蛋白质这两个过程都需要酶的催化,而酶是一种蛋白质 。 究竟是先有 RNA还是先有蛋白质呢？
1981年,美国生物学家 切赫 (T,Cech)等发现四膜虫
26S rRNA前体的自我剪接作用,随后又证明前体中的居间序列 (intervening sequence,IVS)有五种酶的活力 。 几乎在同时,Altman从纯化的 RNase P中,证明催化 tRNA前体成熟的催化剂是 RNase P中的 RNA。
以后又发现 RNA自己不需要蛋白质的帮助,就可以用氨基酸合成肽链 。
切赫 (T.R.Cech) (1947-)
1989年的诺贝尔化学奖授予了美国耶鲁大学的悉尼 ·奥尔特曼与科罗拉多大学的托马斯 ·切赫
mRNA分子上从 5′至 3′方向,由 AUG开始,每三个相邻的核苷酸为一组,在蛋白质合成中代表某种氨基酸或其他信息,称为 密码子 或 三联体密码 (Triplet Code),统称为 遗传密码
（ genetic codon)。
反密码子,转运 RNA能与信使 RNA的碱基相互配对的 三个相邻碱基 。
◆ （ 3）基因与多肽链（遗传密码）
密码比 (coding ratio)问题
密码是否同叠？
三联体之间是否存在,逗号,？
三联密码子编码的破译
◆ （ 3）基因与多肽链（遗传密码）
1954年,物理学家 George Gamov根据在 DNA中存在 4种核苷酸,在蛋白质中存在 20种氨基酸的对应关系,做出数学推理,认为只有 43=64这种关系是理想的 。
1961年,Brenner和 Crick根据 DNA链与蛋白质链的共线性 (colinearity),首先肯定了 3个核苷酸的推理
。 随后的遗传学实验证实,是由 3个碱基编码一种氨基酸,人们称这种碱基三联体为 密码子 (codon)。
◆ （ 3）基因与多肽链（遗传密码）
在 1962年,用大肠杆菌提取液进行 体外合成试验,加入细菌病毒 f2的 RNA,结果合成了一个与天然的
f2外壳蛋白完全相同的蛋白质,其氨基酸顺序完全一样 。 这便证明在体外条件下,
可 以 准 确 地 按 照
mRNA的遗传信息合成相应的蛋白质 。
1) 在体外无细胞蛋白质合成体系中加入人工合成的
polyＵ 开创了破译遗传密码的先河。
1961 年发现 mRNA 后,美国 NIH 的 Nirenberg 和
Mathaei合成了 polyU作为模板,以观察无细胞系统中蛋白质合成速率 。 当把翻译产物分离,纯化和做序列分析后,结果出乎意料,合成的肽链中的氨基酸残基全部是苯丙氨酸,即 polyPhe。 于是第一次确认了
UUU是 Phe的密码子 。 这样,就在一个偶然的机会开创了破译密码的工作 。
◆ 生物化学方法破译遗传密码
2) 以两种不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸来推测密码子的核苷酸组成。
1963年,Speyer和 Ochoa等发展了 用两个碱基的共聚物破译密码 的方法 。 例如,以 A和 C原料,合成 polyAC。
polyAC含有 8种不同的密码子,CCC,CCA,CAA、
AAA,AAC,ACC,ACA和 CAC。 各种密码子占的比例随着 A和 C的不同而不同,例如当 A和 C的比例等于 5,
1时,AAA,AAC的比例 =5× 5× 5,5× 5× 1=125,25。
实验显示 AC共聚物作模板翻译出的肽链由六种氨基酸组成 ——Asp,His,Thr,Pro,Glu和 Lys,其中 Pro和
Lys的密码子早先已证明分别是 CCC和 AAA。
2) 以两种不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸来推测密码子的核苷酸组成 (续 )。
根据共聚物成份不同的比例和翻译产物中氨基酸比例亦不同的关系,Speyer等确定了 Asp,Glu和 Thr的密码子含 2A1C; His的密码子含 1A2C; Thr的密码子也可以含 1A2C; Pro为 3C或 1A2C; Lys为 3A。 但上述方法不能确定 A和 C的排列方式,而只能显示密码子中碱基组成及组成比例 。 Asp,Glu和 Thr的 2A1C可能有三种排列方式,即 AAC,ACA,CAA。 此外,通过反复改变共聚物成份比例的方法亦十分麻烦和费时 。
3) 核糖体结合试验破译密码子的核苷酸顺序
Nirenberg和 Leder于 1964年 建立了破译密码的新方法,即
tRNA与确定密码子结合实验：在缺乏蛋白质合成所需因子的条件下,特异氨基酸 -tRNA也能与核糖体 -mRNA复合物结合 。 这种结合并不一定需要长的 mRNA分子,三核苷酸就可 。 例如,当 polyU与核糖体混合时,仅有 Phe-tRNA
与之结合；相应地 Pro-tRNA特异地与 polyC结合 。 还有
GUU可促进 Val-tRNA结合,UUG促进 Leu-tRNA结合等 。
虽然所有 64个三核苷酸 (密码子 )都可按设想的序列合成,
但并不是全部密码子均能以这种方法决定,因为有一些三核苷酸序列与核糖体结合并不象 UUU或 GUU等那样有效,
以致不能确定它们是否能为特异的氨基酸编码 。
图 1.9 核糖体结合实验人工合成的三核苷酸与对应的氨酰 -tRNA分子及核糖体复合物可以保留在硝酸纤维膜上。
4) 用重复共聚物 (repeating copolymers)破译密码
1966年,H,G,Khorana等发明了利用重复的共聚体,
例如 GUGGUG…,AAGAAG…,来破译密码子的途径,并因此发现了 3个终止密码子,UAA,UAG，
UGA。 蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始,并把特异的氨基酸掺入肽链 。
由 Poly(GUA)或 Poly(GAU)只获得两种均聚肽。
——UAG和 UGA为终止密码子
1966年，尼伦伯格 (Nirenberg)和科拉纳 (Khorana)等人完成了对全部遗传密码的破译,2人共同获得 1968年的诺贝尔奖。
密码表遗传密码 (genetic codon)的特点
连续性
简并性
摆动性
通用性
不重叠遗传密码 (genetic codon)的特点
＊连续性 (commaless)
mRNA分子的 ORF中，组成遗传密码的三联体没有间断，须 3个一组连续读下去，
直至出现终止密码子为止。
mRNA链上碱基的插入或缺失，就会改变密码阅读的顺序，造成框移，使下游翻译出的氨基酸完全改变，即 移码突变 。
遗传密码 (genetic codon)的特点
＊简并性 (degeneracy)
一种氨基酸可有几个意义相同的密码子,
即 同义密码子 。 除 Trp,Met外,其余氨基酸均有
2~4个最多达 6个密码子 。 同义密码子之间,前两个碱基均相同,只是第三个碱基不同 。 若头两个碱基发生点突变,可译出不同氨基酸,而第三个碱基的突变,不会影响氨基酸的翻译 。
遗传密码 (genetic codon)的特点
＊摆动性 (wobble)
反密码子和密码子配对时,有时会出现不遵从碱基配对规律的情况,称为遗传密码的摆动现象 。 这一现象常见于反密码子的 第一位碱基 与密码子的 第三位碱基 之间 。
按照 Wobble假说密码子与反密码子配对遗传密码 (genetic codon)的特点
＊通用性 (universal)
不同种属的生物都使用同一套遗传密码 。
但近年发现 线粒体 和 叶绿体 使用的遗传密码稍有差别 。
如线粒体,叶绿体以 AUG,AUU,AUA为起始密码子,而 AUA兼有 Met密码子功能 。 终止密码子是 AGA,AGG,Trp密码子是 UGA等 。
遗传密码 (genetic codon)的特点
＊不重叠通常说来,密码子是不重叠的,每个三联体中的三个核苷酸只编码一个氨基酸,核苷酸不重叠使用 。
噬菌体?x174中某些基因之间有重叠现象
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 4）基因的结构
最早试图揭示基因内部精细结构的研究工作是 S.
Benzer在 20世纪 50年代晚期进行的 。 1955年他发展出了一种应用 T4噬菌体 rII区的不同等位基因绘制 基因内部图谱 (intragenic maps)的方法,为探索产生等位基因的分子机理提供了新的手段 。
1967年 C,Yanofsky等通过对 E.coli色氨酸合成酶基因 (trpA)的研究,首次将基因的精细结构遗传图
(genetic map)同物理图 (physical map)进行比较 。
◆ （ 4）基因的结构
只有到了 70年代中期,随着基因克隆和 DNA序列分析技术的相继发展,人们才真正有可能从单碱基水平上剖析基因的分子结构 。
非编码区 非编码区编码区编码区上游 编码区下游与 RNA聚酶结合位点
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后,RNA聚合酶沿 DNA分子移动，并与 DNA分子的一条链为模板合成 RNA。转录完毕后,RNA链释放出来，紧接着 RNA聚合酶也从 DNA模板链上脱落下来。
◆ 原核基因的结构能够转录为相应的信使 RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质的区域。
位于编码区上游和编码区下游的 DNA序列，虽不能转录为信使 RNA，不能编码蛋白质但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等。
非编码区 (调控序列 )
编码区 (编码序列 )
◆ 原核基因的结构编码区非编码区 非编码区与 RNA聚酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使 RNA
编码区上游 编码区下游内含子外显子
◆ 真核基因的结构原核细胞 真核细胞不同点相同点原核细胞 真核细胞不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、
不连续的相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较：
◆ 非编码区与内含子都是基因结构中不能编码蛋白质的序列,它们有哪些不同?
内含子能转录为信使 RNA
◆ 启动子与起始密码有何不同?
启动子是基因结构中位于编码区上游的核苷酸序列,是
RNA聚合酶结合位点,能够准确地识别转录的起始点并开始转录,有调控遗传信息表达的作用 。 而起始密码则是
mRNA上的三个相邻碱基 。 启动子不止三个碱基 。
◆ 外显子与内含子 的角色是否固定不变?
一般说,真核细胞结构基因都是由外显子和内含子组成,但是,
外显子和内含子的关系并不是完全固定不变的,有时同一条
DNA链上的某一段 DNA序列,当它作为编码某多肽链的基因时是外显子,而作为编码另一多肽链的基因时,则是内含子,结果是同一基因可以同时转录为两种或两种以上的 mRNA。
◆ 终止子和终止密码 有何不同?
终止子是在非编码区内紧靠转录终点,调控遗传信息表达的
DNA序列 。 它特殊的碱基排列顺序能够阻碍 RNA聚合酶的移动,并使其从 DNA模板链上脱离下来,从而使转录工作结束 。
终止密码位于 mRNA上,共有三种,UAA,UAG,UGA。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
基因表达
(gene
expression
),是遗传信息通过转录生 mRNA
再经翻译生成蛋白质的过程 。
◆ （ 5）基因的表达与调控
1961年,F,Jacob和 J,Monod提出大肠杆菌的乳糖操纵子 模型 。
操纵子 (operon)是一种完整的细菌基因表达单位,由若干个 结构基因,一个或数个 调节基因 及控制单元组成 。 控制单元包括一个 操纵基因 和启动区序列 。
结构基因 (structural gene)：细胞中基本看家蛋白质如代谢酶类,转运蛋白质和细胞骨架成份等的编码基因 。
调节基因 (regulatory gene)：编码用以控制其它基因表达的 RNA或蛋白质产物的基因 。
操纵基因 (operator)：接受来自调节基因合成的调节蛋白的作用,使结构基因转录活性得以控制的特定的 DNA区段 。
◆ （ 5）基因的表达与调控
1961年,F,Jacob和 J,Monod提出大肠杆菌的乳糖操纵子模型：
◆ （ 5）基因的表达与调控
操纵子概念指出基因不但在结构上是可分的，在功能上也是有分工的。
◆ （ 5）基因的表达与调控
1969年,R,J,Britten和 E,H,Davidson提出一个假想的 真核细胞的基因调控模型 。 根据这个模型,与调节基因相连的一段 DNA 叫做 传感基因 (sensor
gene),细胞根据需要向它发出信号 。 这种信号可能是由细胞中的化学分子传达,当其到达传感基因后
,调节基因就开始发生作用,制造出激体 RNA
(activator RNA),并由它指示同结构基因相邻的受体基因 (receptor gene),令其发动结构基因行使功能转录出 mRNA,进而转译成相应的蛋白质分子 。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 6）基因的分离
据生物的表现型来研究基因型这种间接的研究法不能满足科学发展的要求,有必要将基因分离出来,在试管中直接研究其结构,功能及调节等一系列问题 。
1969年,美国哈佛大学 R,Beckwith等应用 DNA-
DNA分子杂交技术,分离到了一种特殊的基因 ——
大肠杆菌乳糖操纵子的?-半乳糖苷酶基因,首创了单基因分离的成功先例,激发了人们从不同角度,用不同方法分离基因的积极性,从而加速了基因研究工作的进展 。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 7）基因的合成
1970年 美国 MIT的 H,G,Khorana等首次报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸基因 (77bp)全合成； 1976年,
大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因 (200bp)全合成 。
将之导入 E,coli之后,表现出特有的生物活性,起到了基因的作用 。
1977年,H,W,Boyer等将化学合成的人脑激素基因连接在乳糖操纵子上并导入大肠杆菌细胞,成功实现转录和转译,产生出有生物活性的蛋白质 。 这是第一个以 DNA重组技术完成的基因工程 。
一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 6）重叠基因
◆ （ 1）移动基因
移动基因,又叫 转位因子 。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移另外一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁，因此在文献上有时也形象地称之为 跳跃基因 。
移动基因最早是由美国冷泉港实验室的女科学家
B,McClintock，于本世纪 40年代 晚期在玉米中首次发现的。她因为本项发现，获得了 1983年 的诺贝尔生物医学奖。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 2）断裂基因
过去人们一直认为，基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因实体。但以后通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的 DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的间断基因为 断裂基因 (split gene)。有人认为断裂基因是近二三十年来在生物学上最惊人的发现之一。断裂基因最初是在腺病毒中发现的,1977年 提出科学报告。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 3）假基因
1977年,G,Jacq等人根据对非洲爪蟾 5S rRNA基因簇的研究,首次提出了 假基因 的概念 。 他们的研究发现,这个 5S rRNA基因,与一个基本上相同,
但又不完全相同的 5S rRNA基因的复本序列直接相邻 。 由于在体内从未检出过这段 5S rRNA基因复本序列的 mRNA分子,说明它是没有表达活性的 。 因此,Jacq等人特称之为 假基因 (pseudogene)。 现已在大多数真核生物中发现了假基因,这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同,但却不能合成出功能蛋白质的 失活基因 。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 4）重复序列及重复基因
比较真核和原核的基因结构后发现,几乎所有的真核生物 (除单细胞的酵母以外 )的基因组 DNA中,都具有 重复序列 (repeated sequence)。 而且在有些例子中,重复序列的拷贝数可高达百万份以上 。 在人
DNA中,重复序列 (至少具有 20份拷贝 )的 DNA占总
DNA的 30%左右 。
根据对多种生物 DNA所作的详细分析表明,在真核基因组存在有 四种不同类型 的 DNA序列：
◆ （ 4）重复序列及重复基因
（ 1） 不重复的唯一序列 （ 只有一个拷贝 ） ；
（ 2） 低度重复序列 （ <10个拷贝 ） ；
（ 3） 中度重复序列 （ 10到几百个拷贝 ） ；
（ 4） 高度重复序列 （ 几百个到几百万个拷贝 ） 。
当然,这种分类的界限是人为划分的,所以在作这些类型的一般性概述时,要特别留心它的具体内容 。
此外,由于通常研究的都是二倍体细胞,因此一种不重复的唯一序列,实际上是存在着 2个拷贝 。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 5）重叠基因
英国剑桥分子生物学家 F,Sanger(1977)在分析了一种小的单链 DNA噬菌体 φX174的全序列后,惊奇地发现在 5386个核苷酸中组成了 11个基因,通过对这
11个基因编码的氨基酸总数,按三联体密码子的原则计算,其所需核苷酸数超过 5386个 。 后来 Sanger
实验室的 G,G,Garrell等发现 φX174基因组中有些密码是重读的,从而形成 重叠基因 (overlapping gene)
。 所谓重叠基因是指两个或两个以上的基因共有一段
DNA序列,或是指一段 DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分 。
◆ （ 5）重叠基因
重叠基因的 重叠方式 可以有许多种,如小基因包含在大基因之内,前后两个基因的首尾重叠甚至三个基因重叠,操纵子重叠,或反向重叠 (DNA双链都转录,
密码读框相同,但方向不同 )。 如在噬菌体 φX174中 (
图 1-23),基因 B完全包含在基因 A之内,基因 A与基因 K共用一段序列,基因 D和 E的读码框相差一个碱基 。 虽然这些基因使用的是同样的 DNA序列,但它们表达时使用的读码框不同,因而表达出来的是不同的蛋白质 。 重叠基因现象反映了原核生物利用有限的遗传物质表达更多生物功能的能力 。
◆ （ 5）重叠基因图 1-23 噬菌体 φX174的重叠基因
◆ （ 5）重叠基因
在原核生物中,重叠基因是一种较为普遍的现象 。
1978年 猴病毒 SV40基因组全序列发表后,发现编码病毒外壳蛋白的三个基因 VP1,VP2和 VP3都有重叠部分 。 在真核生物甚至高等真核生物包括人的基因组中也偶尔发现有重叠基因 。 1998年 12月公布的秀丽新小杆线虫 (Caenorhabditis elegans)全基因组序列分析表明,有的 内含子序列中包含了 tRNA基因,且
tRNA基因的转录方向不一定与它所包含的基因的转录方向相同 。
一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
A,DNA是遗传物质
1952年 Alfred Hershy和 Marsha Chase进一步证明 遗传物质是 DNA。
1944年 Avery,确定 了基因的分子载体是
DNA，而不是蛋白质。
（ a） 肺炎双球菌转化实验
（ b） 噬菌体转染实验
◆ （ 1） 基因工程诞生的理论基础
1953年 James D,Watson
和 Francis H,C,Crick揭示了 DNA分子的 双螺旋结构和 半保留复制机制 。
B,DNA双螺旋结构
1958年,Crick提出遗传信息传递的,中心法则,
DNA RNA protein
1964年 Marshall Nirenberg和 Gobind Khorana
等终于 破译了 64个遗传密码
C,中心法则和遗传密码
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
A,限制性内切酶 (restriction enzymes)
1970年 H.O,Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 。
Werner Arber
理论预见限制酶
Daniel Nathans
用限制酶切得
SV40 DNA片断
Hamilton O,Smith
得到第一个限制酶
1978年 Nobel生理或医学奖
◆ （ 2）基因工程诞生的技术突破
B,DNA连接酶 (ligase)
1967年 5个实验室几乎同时发现了 DNA连接酶。
C,载体 (vector)
1972年 前后使用小分子量的细菌 质粒 和?噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。
D,感受态体系
1970年 M,Mandel和 A,Higa发现经过 氯化钙 处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体 DNA 。 1972年 S.
Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒
DNA。
E,琼脂糖凝胶电泳
1960s发明了琼脂糖凝胶电泳,可将不同长度的
DNA分离开 。
F,DNA测序技术
1975年 F,Sanger,A,Maxam和 W,Gilbert发明了
DNA快速测序技术。
1980年 Nobel化学奖
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
1980年 Nobel化学奖
1972年 斯坦福大学的 Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：
A,Berg的开创性实验将 SV40的 DNA片断与?噬菌体的 DNA片断连接起来。
（用 DNA末端转移酶，
而非限制性内切酶）
◆ （ 3）基因工程的诞生
B,Boyer-Cohen实验
1973年 斯坦福大学的 S,Cohen小组将含有 卡那霉素抗性 基因的大肠杆菌 R6-5质粒与含有 四环素抗性 基因的另一种大肠杆菌质粒 pSC101连接成重组质粒,具有 双重抗药性 。
后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同 pSC101质粒重组,转化大肠杆菌,并在菌体内成功转录出相应的 mRNA。 这是 第一次成功的基因克隆实验 。
Boyer-Cohen
实验
Stanley Cohen
1986 Nobel生理或医学奖
Herb Boyer
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
（ 4） 基因工程的基本概念与内容
A 重组 DNA技术的基本定义
B 基因工程的基本定义
C 重组 DNA技术与基因工程的基本用途
D 基因工程的基本形式
E 基因工程的特征
F 基因工程的主要操作内容
A 重组 DNA技术 的基本定义
（ 4） 基因工程的基本概念与内容重组 DNA技术 是指将一种生物体 (供体 )的基因与 载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体 (受体 )
内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的 DNA体外操作程序，也称为 分子克隆技术 。
供体、受体、载体 是重组 DNA技术的三大基本元件。
B 基因工程的基本定义
（ 4） 基因工程的基本概念与内容基因工程 是指重组 DNA技术的产业化设计与应用,包括 上游技术 和 下游技术 两大组成部分 。
上游技术 指的是基因重组,克隆和表达的设计与构建 （ 即重组 DNA技术 ） ；而 下游技术 则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程 。
C 重组 DNA技术 与基因工程的基本用途
（ 4） 基因工程的基本概念与内容分离、扩增、鉴定、研究、整理 生物信息资源大规模生产 生物活性物质设计、构建 生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质生物活性物质
D 基因工程的基本形式
（ 4） 基因工程的基本概念与内容第一代基因工程 (经典基因工程 )
蛋白多肽基因的高效表达第二代基因工程 (蛋白质工程 )
蛋白编码基因的定向诱变第三代基因工程 (途径工程 )
代谢信息途径的修饰重构第四代基因工程 (基因组工程 )
基因组或染色体的转移外源 DNA在寄主细胞内可大量扩增，
和高水平表达。
a,跨物种性
b,无性扩增外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。
（ 4） 基因工程的基本概念与内容
E 基因工程的特征
b,重组体的制备
a,目的基因的获取从复杂的生物基因组中,经过酶切消化或 PCR
扩增等步骤,分离出带有目的基因的 DNA片断 。
将目的基因的 DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记 (抗菌素抗性 )的载体分子上 。
（ 4） 基因工程的基本概念与内容
F 基因工程的主要操作内容将重组体 (载体 )转入 适当的受体细胞中 。
d,克隆鉴定
c,重组体的转化挑选 转化成功的细胞克隆 (含有目的基因 )。
e,目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物 。
F 基因工程的主要操作内容
1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995
1944DNA是遗传物质
1949Hbs贫血
1953双螺旋
1956HbsGlu-Val
1966遗传密码第一个 R酶
1972重组质粒
1975DNA杂交
1977DNA测序
1981转 G小鼠
1983HD病 G定位
1985PCR
1986位置克隆
1987G剔除小鼠
1989位置克隆
1990第一个基因治疗
1995细菌 G组序列
1996酵母基因组序列现代分子遗传学发展重要事件一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
5,基因工程的应用
（ 1）基因工程在农业生产中的应用
（ 2）基因工程在工业中的应用
（ 3）基因工程在医药上的应用
（ 4）基因工程在环境保护中的应用
（ 5）基因工程技术的商业化发展
A,提高植物的光合作用效率改变与光合作用有关的酶的结构和组成
（如二磷酸核酮糖羧化酶）。
（ a）提高 CO2的固定率改变光能交换系统的分子的基因结构。
（ b）提高光能吸收率和转化率
◆ （ 1）基因工程在农业生产中的应用使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。
B,提高豆科植物的固氮效率是农业生物技术的主要内容。
是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些 优质性状 (高产、稳定、优质、抗虫、抗病等 )。
C,转基因植物
◆ （ 1）基因工程在农业生产中的应用转基因番茄转基因胡萝卜世界各国转基因作物大田释放情况（ 1987.1-1998.4）
转基因作物特性 批准项数 所占比例抗除草剂 1297 29.6%
抗虫 1046 23.8%
产品质量高 886 20.2%
抗病毒 436 9.9%
农学性状好 211 4.8%
抗真菌 208 4.7%
其它 303 6.9%
中国已经批准进入大田的转基因植物（ 1998.3）
转基因植物 特性 申请单位 获批准数马铃薯 抗病毒 中科院 4
抗病 中国农科院 1
抗逆 北京大学 1
高营养品质 北京大学 1
水稻 抗虫 中科院 1
抗病毒 北京大学 2
抗病 农科院 2
抗除草剂 水稻所 1
棉花 抗虫 中科院农科院美国孟山都公司
9
玉米 抗虫 美国孟山都公司等 3
大豆 抗除草剂 农科院 1
小麦 抗除草剂 北京农林科学院 1
高营养品质 北京农林科学院 1
番茄 抗病 北京大学 1
耐储存 中科院华中农大
3
甜椒 抗病 北京大学 1
辣椒 抗病毒 中科院 1
烟草 抗病毒 北京大学 2
抗虫 中科院北京大学
2
番木瓜 抗病毒 中国热带作物 1
广藿香 抗病 农业科学学院 1
矮牵牛 改变花色 北京大学 1
杨树 抗虫 中科院 1
微生物 提高固氮效率 中科院农科院华中农大广东微生物所
6
将外源基因导入动物细胞,并在基因组内稳定整合,遗传给后代 。
使动物成为 生物反应器 生产有用的活性蛋白等 。
D,转基因动物在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物 (TPA)和尿激酶的转基因小鼠；
分泌 a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等 。
◆ （ 1）基因工程在农业生产中的应用转基因鱼转基因鱼转基因蚕
20
01
年1
月11
日
，
世界上首例转基因灵长类动物—
转基因猴
“
安迪
”
在美国安全降生
2004 年,
美国科学家研制出世界上第一只转基因蝴蝶 。
克隆各种参与纤维素降解的酶的基因,导入酿酒酵母,就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖,
发酵成酒 。
用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。
A,纤维素的开发利用
B,酿酒工业
◆ （ 2）基因工程在工业中的应用
1976年,27岁的风险投资人 Robert Swanson与
University of California的教授 Herb Boyer共饮了几杯啤酒,讨论了基因工程技术的商业前景 。 讨论结束时,他们决定建立一个公司,并取名为
Genentech (Genetic Engineering Technology)。
第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！
◆ （ 3）基因工程在医药上的应用
Genentech的骄人业绩
1976 Genentech创立
1977 首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素
1978 克隆了人胰岛素基因
1979 克隆了人生长激素素基因
1980 公司上市，募集 $ 35million
1982 第一个基因重组药 (人胰岛素 )上市 (转让给 Lilly公司 )
1984 第一个 VIII因子，转让给 Cutter Biological
1985 第一个自己生产的产品 (人生长激素 )
1987 生产组织纤溶酶原激活剂 (TPA)
1990 生产 interferon?1?
1990 与瑞士 Roche医药公司合并（ $ 2.1billion）
制造新型疫苗（如 HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾,SARS）
大肠杆菌或酵母菌生产激素 (如胰岛素 )、干扰素等应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构,制造出高效高特异性的生物制剂
A,用转基因植物或动物生产药物
B,用微生物生产药物
C,设计高效高特异性的生物制剂
D,研制疫苗
F,法医鉴定
G,基因治疗
E,基因诊断将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。
基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。
(仍在探索阶段 )
医药药物基因组学人工设计 克隆 P450s
疾病的动物模型治疗性小分子植物微生物诊断用蛋白治疗性蛋白微生物 动物疫苗植物微生物治疗性核酸基因治疗基因修复反义药物
DNA疫苗诊断性核酸遗传病传染病美国已批准上市的基因工程药物（ 1997.7）
中文名称 商品名称 英文名缩写 开发公司胰岛素 Humulin
Novolin
Humalog
Insulin
lispoinsulin
Lilly
Novo Nordisk
Lilly
人生长激素 Protropin
Humatrope
NutropinAQ
rhuGH Genentech
Lilly
Genentech
干扰素 IntronA
ReferonA
Avonix
Betaseron
Actimmune
Alferon-N
rhuIFNa2b
rhuIFNa2a
rhuIFN?
rhuIFN?1b
rhuIFN?1b
rhuIFNa3
Schering
Roche
Biogen
Chiron
Genentech
Interferon Science
白细胞介素 2 Proleukin rhuIL2 Chiron
粒细胞集落刺激因子
Neupogen rhuG-CSF Amgen
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
Leukine rhuGM-GSF Immunex
红细胞生成素 Epogen
Procrit
rhuEPO Amgen
Ortho
组织溶纤原激活剂
Activase rhuTPA Genentech
生长激素 Serostin somatotropin Serono
促生长素 Nutropin
Saizen
Genotropin
Norditropin
Bio-Tropin
somatopin Genentech
Serono
Pharma/Upjohn
Novo Nordisk
Biotech General
抗血友病因子 VIII
Kogenate
Recombinat
e
Factor VIII Bayer
Baxter
葡萄脑苷脂酶
Cerezyme glucocerebr
osidase
Genzyml
脱氧核糖核酸酶
Pulmozyme domase Genentech
乙型肝炎疫苗
Recombivax
HB
Engerix B
Comrax
Hepatitis B
vaccine
Merck
Smith Kline
Merck
甲型肝炎疫苗
Havrix Hepatitis B
vaccine
Smith Kline
体内用单克隆抗体
Reopro
Ortho OKT-3
Onco Scint
CR/OV
Onco Scint
OC103
Onco Scint
CR103
Prostascint
MAB,blood
clots
MAB,Kidney
sup
MAB,diag
inject
Centocor
Ortho
Biotech
Cytogen
Cytogen
Cytogen
Cytogen
鼠单克隆抗体
Panorex Murine MAB Glaxo
Welcome
1
中国已经批准上市的基因工程药物（ 1998.5）
药品名缩写 开发生产公司 批准时间 适应症
rhuINFa1b(外用）
rhuINFa1b
rhuINFa2a
长春生研所上海生研所深圳兴科长春生研所长生药业三生药业
1989试
1996正
1996正
1996正
1997正
1997正病毒性角膜炎
HBV,HCV
HBV,HCV
尖锐湿疣，疱疹等
HBV,HCV
HBV,HCV
rhuIFNa2b 新大洲药业里亚哈尔华立达安科华新
1997正
1996正
1997正
1997试
1997试
HBV,HCV
HBV,HCV
HBV,HCV
HBV,HCV
HBV,HCV
rhuINF? 上海生研所克隆丽珠生物工程
1994试
1995试
1995试类风湿类风湿类风湿
rhuIL2 长春生研所长春药业四环制药华新三生药业深圳兴科中华合通金丝利康利制药
1997正
1997正
1997正
1997正
1997正
1997正
1995试
1995试
1995试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗
rhuG-CSF 九源 1997试 化疗生白血病
rhuGM-CSF 特宝 1997试 化疗生白血病
rSK 医大实业 1996试 心梗溶栓
rhuEPO 华欣永铭维沃
1997试
1997试再生障碍性贫血再生障碍性贫血
bFGF（外用） 珠海东大 1996试 创伤，烧伤
2004年中国已批准上市的生物工程药品及疫苗用带有重组质粒的,超级菌,分解油（烷烃类）、有机农药污染。
A,检测水污染
B,生物降解用重组细菌或转基因鱼等检测水污染
◆ （ 4）基因工程在环境保护中的应用生物技术的发展在某种程度上是由商品经济 的发展所推动的。
Genentech公司 1980年上市后 20分钟内由 35$涨到
89$/股。
A,商业投资支持现代生物技术研究
1980-1983年，美国成立了 200多家生物技术公司。
1985年 400多家,1300多家。 现在几乎每个大跨国公司（化学和制药）都投巨资。
◆ （ 5）基因工程技术的商业化发展
B,基因工程商业化特点
a,技术密集型
（ i）产品来源于实验室
Boyer教授是 Genentech的副总裁。
（ ii）科学家往往就是公司的领导人
1994年仅美国的总销售额 40多亿美元。
1992年日本 4000亿日元。
20世纪末 6000亿美元。
b,市场扩张迅速美国 1993年 40多亿美元 。
日本 1997年 5000多亿日元 。
80年代初,加拿大联邦政府出资参与建立的
Allelix生物技术公司,注册资本高达一亿美元 ！
c,投入巨大
d,风险太高前期的资金投入是极其巨大的,非一般企业所能承受 。
我国在,七五,和,八五,计划的 10年间,仅就,基因重组人生长激素,一个项目的研发就先后投入了近 1.5亿元人民币的经费 。 这仅仅是一个仿制型的二类新药,而且又仅仅是制药工艺的研发 。 长达 10余年的研发过程,巨额资金的投入,最终也并未获得高质量的,国产二类新药,。
全世界只有不超过 100家生物技术公司有 自己的产品 。其中真正盈利的公司很少。
制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。
已取得的成果中 60%是医学领域的。
g,医学生物技术产业进展最快
f,研究专一、产品专一
h,专门为基因工程实验提供研发试剂的公司
e,产品不断增加基因工程不是发现，而是创造。
基工的魅力只有想不到的没有办不到的一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
6,基因工程的安全性
（ 1）基因工程的安全隐患
（ 2）重组 DNA研究的安全准则
（ 3）生物工程的人文忧患与讨论制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播 。
A,对环境的影响
B,新型病毒的出现重新组合一种在自然界尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响 。
◆ （ 1）基因工程的安全隐患将肿瘤病毒或其它动物病毒的 DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。
D,人造生物扩散新组成的重组 DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。
C,癌症扩散
A,公众的担忧
1973年 美国的公众第一次公开表示担心应用重组 DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。
◆ （ 2）重组 DNA研究的安全准则
1974年 美国国立卫生研究院 （ NIH） 考虑到重组
DNA的潜在危险,提请 Paul Berg博士组成一个重组
DNA咨询委员会 。
这个由 11名分子生物学和重组 DNA权威学者组成的委员会在同年 7月发表公开信 (science,158,303),要求在没有弄清楚重组 DNA所涉及的危险性范围和程度,以及在采取必要的防护措施之前,暂停两类试验 （ 带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒 ） 。
B,专家的态度
C,制定安全规则
1976年 6月 23日,NIH正式公布了,重组 DNA
研究的安全准则,。
规定了 安全防护 （ 物理防护和生物防护 ） 标准以及 禁止 若干类型的实验 。
1979年,1981年,1989年 NIH又做了多次修改,放宽了许多限制 。
分 4级,P1—P4级。
（ a）实验室的物理安全
D,基因工程的安全措施一般装备良好的普通微生物实验室。
① P1级实验室
② P2 级实验室在 P1级实验室的基础上还装备有 负压 的安全操作柜。
全负压 的实验室，同时装备安全操作柜。
④ P4级实验室专用的实验大楼,周围与其它建筑物应有隔离带。
具有最高安全防护措施。
③ P3 级实验室在自然环境中 无法 存活。
（ b）实验室的生物安全分 3 级（大肠杆菌）,EK1—EK3级。
① EK1级的大肠杆菌在自然环境中 一般 都要死亡。
② EK2-EK3级大肠杆菌第一个“安全”菌株是 K12（ 1976年），
很不实用，已淘汰。
（ c） 载体的安全应该是失去了 自我迁移 的能力。
不会自动从,安全,的菌株转移到,不安全,
的菌株中 。
（ 容易构建 ） 。 如 pMB9,pBR322等 。
（ A） 现代生物技术会打破生物物种间的平衡吗？
目前,自然界存在的生物物种,包括微生物,植物,
动物,当然也包括我们人类 。 这些生物物种是在几千万年,甚至上亿年自然界优胜劣汰的进化中形成的,它们之间丝丝相扣,存在着十分有序,也异常复杂的食物链和生态链,同时这些生物物种也和整个地球的生态环境保持着和谐的关系 。 可是,现代生物技术的出现,它在创造新的生命的同时,是否会给自然界物种间的这种平衡的保持带来威胁？
◆ （ 3）生物工程的人文忧患与讨论
（ B） 吃与不吃的选择 ——对转基因食物的担忧在生物物种的食物链上,人类处于终端的位置,
也就是说,人类是以植物和动物为食物而维持生命的 。 当转基因技术用于植物和动物的基因改造,
改变原来这些生物物种的性状和品质时,就不可避免地给人类带来有关食品安全的问题 。
◆ （ 3）生物工程的人文忧患与讨论
（ C） 克隆一个,你,,你能和,你,和平相处吗？ —
—我们是否要接纳克隆人 。
克隆技术用于一切动物,都还仅仅是一项技术的生产运用,不会从根本上影响人类,威胁人类的社会,但是如果真的有一天这项技术运用于人类生殖领域,问题必然会复杂化 。
有关,克隆人,的讨论也提醒我们,科技进步就是一首悲喜交集的进行曲,生物技术的发展,必定更广泛,更深入地渗透到社会,引起许多伦理,道德和法律等问题 。
◆ （ 3）生物工程的人文忧患与讨论
It’s over for today!
基因工程概论鲁耀邦湖南中医药大学
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第一讲 绪论教学目的与要求基因工程 总 论教学大纲参考书目
◆ 教学目的与要求
基因工程学自 20世纪 70年代初期诞生以来,在短短的 30
多年间已经取得了许多令世人瞩目的成就,成为当代生命科学研究领域中最具生命力,最引人关注的前沿学科之一,是现代分子生物学与生物技术的核心内容 。
本课程充分考虑到我院研究生的来源及其知识结构的特点,着重加强有关 基因工程原理部分 的讲授,并努力将基因工程学同分子生物学,分子遗传学以及生物化学等基础学科有机地联系起来进行讨论 。 在内容安排上,强调基础性,先进性,系统性和实用性,同时也努力反映国内外有关学者的最新研究成果 。
◆ 教学目的与要求
本课程为分子生物学,分子遗传学,发育生物学,细胞生物学,生物化学等有关专业研究生的学科基础课,同时也是植物学,动物学以及微生物学等专业研究生的重点选修课
。 我们期望不同专业的研究生在修完本课程之后,能够较为系统,全面地掌握基因工程的基础知识和最新进展,并能跟上该专业学科的发展进程 。
◆ 教材与参考书
吴乃虎,基因工程原理 (第二版,上册 )，
科学出版社,1998
吴乃虎,基因工程原理 (第二版,下册 )，
科学出版社,2001
楼士林等,基因工程 (第一版 ),科学出版社,2002
吴乃虎,张方,黄美娟,基因工程术语,
科学出版社,2005
GENE VII或 VIII
分子克隆实验指南 (第三版 )
基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定
克隆基因的表达与产物纯化
基因表达的调控基因工程概论
1、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
1,基因研究的发展基因工程 或称 基因操作,是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上世纪 70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。其创立与发展，直接依赖于基因分子生物学的进步。可以说，基因的研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础，而基因工程技术的发展与应用，又深刻有力地影响着基因的研究，使我们对基因本质的认识提高到了空前的高度。
1,基因研究的发展
20世纪以来，基因研究一直是影响整个遗传学发展的主线。根据不同历史时期的水平和特点，可分 3阶段：
20世纪 50年代前,基因的染色体遗传学阶段,主要从细胞染色体水平上进行研究；
20世纪 50年代 —70年代,基因的分子生物学阶段,主要从 DNA大分子水平上进行研究；
20世纪 80年代以来,重组 DNA技术不断完善，人们能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其与表型间的关系，使基因研究进入了 反向生物学阶段 。
1,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 1）基因学说的创立
基因的最基本性质是在一个多世纪前由 孟德尔 (G,Mendel)定义的
。 由他提出的两大定律 ——分离律与独立分配律可总结出,A,基因是一种由亲代传到子代的特殊因子 —— 遗 传 因 子 (hereditary
factor)； B,基因可能存在变异的形式 。 (1857-1864,豌豆杂交 )
G,J,Mendel
奥地利原天主教神父
1822-1884
孟德尔碗豆杂交实验
◆ （ 1）基因学说的创立
1909年,丹麦生物学家 W,Johannsen根据希腊文,
给予生命,之义,创造了 基因 (gene)一词,替代了孟德尔的,遗传因子,。 遗传性状的符号,尚未具体涉及基因的物质概念 。
1910年左右,摩尔根 (T,H,Morgan)学派对基因学说的建立作出了卓越的贡献 。 他们通过果蝇突变体的研究第一次将代表某一特定性状的基因同某一特定的染色体联系了起来,创立了 遗传的染色体理论,
使基因学说得到了普遍的承认 。 (1910-1915)
T H Morgan（ 1866-1945）
美国遗传学家从 1910年到 30年代他在果蝇遗传实验中进一步证实了孟德尔分离定律和自由组合定律。
他的两大重要发现：一是发现基因在染色体上，二是发现遗传的基因链锁和互换定律。建立了摩尔根基因学说。
他的格言：,实验方法的本质在于每一种见解和假说都必须通过实验的检验，然后才被承认其科学地位。
摩尔根“果蝇的伴性实验”
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 2）基因与 DNA分子
在人们认识核酸的过程中,1928年发现的,转化,
现象具有重要作用 。 肺炎双球菌能够通过引起肺炎杀死老鼠 。 这种细菌的有毒物质被认为是它的 外壳多糖,是一种细菌表面的物质,能够避免细菌被宿主破坏掉 。 不同类型的肺炎双球杆菌有不同的外壳多糖 。 但它们都有平滑的表面 。
已死亡的病菌中的参与转化的那一部分物质称之为转化物 。 1944年 Avery和他的同事们的实验表明转移物的化学组成实际上就是 脱氧核糖核酸 （ DNA） 。
图 1.1 转化过程的核心是 DNA
这个结果说明了原核生物的遗传物质也是 DNA，
还为细菌和高等生物的遗传提供了一种独特的观点。
（ SIII 菌）
（ RII 菌）
原文对图 1.1的结果是这样分析的：这种引入的物质
,就它的化学和物理性质而言,看起来是高度聚合且有粘性的 DNA。 另一方面,III 型外壳多糖的合成是由可转移的物质激发的,它是由不含氮的多糖组成 。 因此我们认为,引入的物质以及反过来产生的产物在化学上是不同的,在功能上有生物特异性,
两者对于决定它们所在细胞的特异性是必须的 。
这个讨论描述了遗传物质及表达产物之间的区别,
为后来的研究奠定了重要的理论基础 。
当可转移分子被发现由 DNA组成之后,下一步需要证明的就是 DNA可在一个完全不同的体系中提供遗传物质 。
1952 年,Hershey和 Chase用放射性标记 T2噬菌体感染细菌 (32P 标记 DNA,35S标记蛋白质 ) 的实验进一步说明了不管是在细胞基因组中还是病毒中,
遗传物质就是 DNA这一结论 。
图 1.2 说明了这个试验的结果 。
图 1.2 T2 噬菌体的遗传物质被证明是 DNA(捣碎实验 )。
本实验直接表明父代噬菌体的
DNA进入到细菌中,变成了子代噬菌体的一部分
,恰好符合是遗传物质的遗传特性 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
证明了 DNA是遗传物质和基因的载体之后,遗传学家和分子生物学家进而着手研究维系生命现象的基础 ——DNA分子的 自我复制过程,以揭示遗传信息是怎样从亲代准确地传递到子代的本质 。
这个问题是在 1953年 J,Watson和 F,Crick创立
DNA双螺旋结构模型 之后才逐步得到解决的 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
DNA双螺旋模型的提出基于以下三个方面的发现：
X光衍射实验数据表明 DNA是一种规则螺旋结构：
每 3.4nm旋转一周,直径约为 2nm。 因为相邻核苷酸距离为 0.34nm,因此每圈有 10个核苷酸单位 。
DNA密度测量说明这种螺旋结构应有两条链 。 而且如果两条链间的碱基都是朝里而且严格的按嘌呤对嘧啶排列,那么就可以阻止嘌呤对嘌呤 (太粗 ),嘧啶对嘧啶 (太细 )的形成 。
不论碱基数目多少,G的含量总是与 C一样,而 A与
T也是一样 。 因此通常以 G+C的含量来描述 DNA的组成 。 不同物种 G+C的含量一般在 26~74%。
图 1.3 多核糖键是由一系列
5’—3’ 糖 - 磷酸键作为主链和含有碱基突出组成的 。
图 1.4 由于嘌呤碱基总是与嘧啶碱基配对,因此双螺旋的宽度是恒定的,图中序列为 T-A,
C-G,A-T
,G-C。 两条核苷酸链反向 平行 。 沿着螺旋旋转方向,一条是 5’-3’方向,而另一条是 3’-5’方向 。
图 1.5 DNA的双链构成双螺旋? 每个碱基相对于其相邻的碱基对都绕螺旋轴旋转约 36度 。 这样约 10个碱基对就能旋转一周 。
双螺旋体中的两条链彼此环绕形成一条 窄沟 (约
12nm)和一条 宽沟 ( 约
22nm),这两条沟在电镜下形状见 图 1.5。 双链是沿 右手 方向的；即顺时针方向转动 。 所有这些都是 B-DNA所具有的特征
图 1.6 碱基配对是 DNA复制原理的基础 。
图上部是一对父本链
，下部是通过碱基对互补产生的子代链。
未复制的亲本双链由两条原始的亲本链组成。复制要求两条链分开，从而为互补提供模板。每一个子代双链与原始亲本的序列相同，并且包括一条亲本链和一条新合成的链。 如此 DNA的结构使得它的序列能稳定的遗传。
图 1.7 DNA 的复制是以半保留方式进行的 。
亲本双螺旋复制形成两个子代双螺旋,每一个携带一条亲本链和新合成的子代链,这种组合在代与代之间非常保守
,两条链之中总是有一条亲本链 。 这种复制方式 称 为 半 保 留 复 制
( S e m ic o n s e r v a t i v e
replication)。
不管是杂合双体还是纯合双体,其中任何一条链要么是含重原子的要么是含轻原子的 。
1958年的 Meselson-Stahl实验 证实了这一观点,在这个实验中观察了三代酵母菌的 DNA
复制 。 从细胞中提取出 DNA,离心测量其密度,则 DNA按密度分成三带：最重的是母体
,杂合体是第一代,第二代中一半是杂合体一半是纯合双体 。 (图 1.7)
图 1.8 复制叉是指从未解旋的母链向新复制的子链过度的区域。
DNA 分子在复制过程中
,非复制区保持着亲本双链结构,复制区分开
,从此处形成两个代双链 (图 1.8)。 这两个相接区域称为 复制叉,此处双螺旋的结构被破坏 。
复制涉及到复制叉沿着亲本双链移动,因此存在亲本双链连续解螺旋以及重新螺旋形成子代双链 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
DNA分子是基因的载体,是否每一段 DNA都是基因呢？
经典的基因概念,在染色体或 DNA分子上,基因都是成串珠似的一个挨一个排列,它们之间由非遗传的物质连接起来 。 交换只是在基因之间进行,而不在基因内部发生 。 基因既是遗传的功能单位,也是交换单位和突变单位 。
以 T4噬菌体为材料的研究工作表明,事实并非如此 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
1955年,S,Benzer正式使用,顺反子,(cistron)这个术语,将 T4噬菌体导致寄主快速溶菌的 rII区的两个亚区分别称为 rIIA顺反子和 rIIB顺反子 (即 rIIA基因和
rIIB基因 )。
每一个顺反子就是一段核苷酸序列,或曰相当于一个基因的 DNA或 RNA单元,它编码一种完整的多肽链
。 这种多肽链既可以是一种具有生物活性的蛋白质,
也可以同别的多肽聚合形成多功能的蛋白质 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
顺反子是 功能单位,由许多可以突变的位点组成 。 这些位点之间又可以发生交换 。
据 Benzer计算,在功能 DNA中,最小交换单位约为
1~3个核苷酸对,这同理论上的最低值一个核苷酸对极为接近 。 所以,顺反子中的最小交换单位 (又称 交换子 )和最小突变单位 (又称 突变子 ),都应是 DNA分子中的一个核苷酸对 。 也只有在这种情况下,交换子才等于突变子 。
◆ （ 2）基因与 DNA分子
一般说来,一个顺反子即是一个基因,大约含有
1500个核苷酸对,是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构 。
顺反子的概念表明,基因不是最小单位,它仍然是可分的；并非所有的 DNA序列都是基因,而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区 。
由于所有生物的 DNA的基本结构都是一致的,因此,
来自两种生命形态的基因 (DNA)可以融为一体,这是进行基因工程的重要理论基础之一 。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 3）基因与多肽链
基因是细胞中所有的 RNA及蛋白质分子的,蓝图,。
20世纪 40年代,G,W,Beadle和 E,L,Tatum提出,一种基因一种酶,假说 (“one-gene-one-enzyme hypothesis”)
。 (X-射线诱导红色面包霉,营养缺陷突变体,1941年 )
1957年,英国剑桥 V,M,Ingram在对镰形细胞贫血症的血红蛋白和正常血红蛋白的氨基酸序列作了对比研究之后,
才第一次用实验证实了基因同蛋白质之间的直接联系 。
(Glu→Val) 表明基因的突变会直接影响到它编码的蛋白质多肽链成份的改变 。
多体蛋白质的发现 。 假说修正为,一种基因一种多肽链,
。
◆ 基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序对应关系？
1958年,F,Crick在综合分析了 50年代末期有关遗传信息流转向的各种资料的基础上,提出了描述
DNA,RNA和蛋白质三者关系的中心法则 (central
dogma) ；
1970年,D,Baltimore和 H,M,Temin在一些 RNA
肿瘤病毒中,发现了一种依赖 RNA的 DNA多聚酶
—— 逆转录酶 。
1971年,F,Crick根据新的进展修改了中心法则：
RNA
DogmaCentral
DNA
Protein
转 录翻 译
Transcription
Translation
Replication
复 制逆 转录 ReverseTranscription
在生命的初始阶段,中心法则是,
RNA自我复制并翻译 （ 生产 ） 蛋白质
RNA只由四种核苷组成,有的结构非常简单,把核苷链片段放在一起就可能组成有自我复制能力的
RNA,这已经被实验证明 。
但是有一个困难,RNA的自我复制和翻译蛋白质这两个过程都需要酶的催化,而酶是一种蛋白质 。 究竟是先有 RNA还是先有蛋白质呢？
1981年,美国生物学家 切赫 (T,Cech)等发现四膜虫
26S rRNA前体的自我剪接作用,随后又证明前体中的居间序列 (intervening sequence,IVS)有五种酶的活力 。 几乎在同时,Altman从纯化的 RNase P中,证明催化 tRNA前体成熟的催化剂是 RNase P中的 RNA。
以后又发现 RNA自己不需要蛋白质的帮助,就可以用氨基酸合成肽链 。
切赫 (T.R.Cech) (1947-)
1989年的诺贝尔化学奖授予了美国耶鲁大学的悉尼 ·奥尔特曼与科罗拉多大学的托马斯 ·切赫
mRNA分子上从 5′至 3′方向,由 AUG开始,每三个相邻的核苷酸为一组,在蛋白质合成中代表某种氨基酸或其他信息,称为 密码子 或 三联体密码 (Triplet Code),统称为 遗传密码
（ genetic codon)。
反密码子,转运 RNA能与信使 RNA的碱基相互配对的 三个相邻碱基 。
◆ （ 3）基因与多肽链（遗传密码）
密码比 (coding ratio)问题
密码是否同叠？
三联体之间是否存在,逗号,？
三联密码子编码的破译
◆ （ 3）基因与多肽链（遗传密码）
1954年,物理学家 George Gamov根据在 DNA中存在 4种核苷酸,在蛋白质中存在 20种氨基酸的对应关系,做出数学推理,认为只有 43=64这种关系是理想的 。
1961年,Brenner和 Crick根据 DNA链与蛋白质链的共线性 (colinearity),首先肯定了 3个核苷酸的推理
。 随后的遗传学实验证实,是由 3个碱基编码一种氨基酸,人们称这种碱基三联体为 密码子 (codon)。
◆ （ 3）基因与多肽链（遗传密码）
在 1962年,用大肠杆菌提取液进行 体外合成试验,加入细菌病毒 f2的 RNA,结果合成了一个与天然的
f2外壳蛋白完全相同的蛋白质,其氨基酸顺序完全一样 。 这便证明在体外条件下,
可 以 准 确 地 按 照
mRNA的遗传信息合成相应的蛋白质 。
1) 在体外无细胞蛋白质合成体系中加入人工合成的
polyＵ 开创了破译遗传密码的先河。
1961 年发现 mRNA 后,美国 NIH 的 Nirenberg 和
Mathaei合成了 polyU作为模板,以观察无细胞系统中蛋白质合成速率 。 当把翻译产物分离,纯化和做序列分析后,结果出乎意料,合成的肽链中的氨基酸残基全部是苯丙氨酸,即 polyPhe。 于是第一次确认了
UUU是 Phe的密码子 。 这样,就在一个偶然的机会开创了破译密码的工作 。
◆ 生物化学方法破译遗传密码
2) 以两种不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸来推测密码子的核苷酸组成。
1963年,Speyer和 Ochoa等发展了 用两个碱基的共聚物破译密码 的方法 。 例如,以 A和 C原料,合成 polyAC。
polyAC含有 8种不同的密码子,CCC,CCA,CAA、
AAA,AAC,ACC,ACA和 CAC。 各种密码子占的比例随着 A和 C的不同而不同,例如当 A和 C的比例等于 5,
1时,AAA,AAC的比例 =5× 5× 5,5× 5× 1=125,25。
实验显示 AC共聚物作模板翻译出的肽链由六种氨基酸组成 ——Asp,His,Thr,Pro,Glu和 Lys,其中 Pro和
Lys的密码子早先已证明分别是 CCC和 AAA。
2) 以两种不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸来推测密码子的核苷酸组成 (续 )。
根据共聚物成份不同的比例和翻译产物中氨基酸比例亦不同的关系,Speyer等确定了 Asp,Glu和 Thr的密码子含 2A1C; His的密码子含 1A2C; Thr的密码子也可以含 1A2C; Pro为 3C或 1A2C; Lys为 3A。 但上述方法不能确定 A和 C的排列方式,而只能显示密码子中碱基组成及组成比例 。 Asp,Glu和 Thr的 2A1C可能有三种排列方式,即 AAC,ACA,CAA。 此外,通过反复改变共聚物成份比例的方法亦十分麻烦和费时 。
3) 核糖体结合试验破译密码子的核苷酸顺序
Nirenberg和 Leder于 1964年 建立了破译密码的新方法,即
tRNA与确定密码子结合实验：在缺乏蛋白质合成所需因子的条件下,特异氨基酸 -tRNA也能与核糖体 -mRNA复合物结合 。 这种结合并不一定需要长的 mRNA分子,三核苷酸就可 。 例如,当 polyU与核糖体混合时,仅有 Phe-tRNA
与之结合；相应地 Pro-tRNA特异地与 polyC结合 。 还有
GUU可促进 Val-tRNA结合,UUG促进 Leu-tRNA结合等 。
虽然所有 64个三核苷酸 (密码子 )都可按设想的序列合成,
但并不是全部密码子均能以这种方法决定,因为有一些三核苷酸序列与核糖体结合并不象 UUU或 GUU等那样有效,
以致不能确定它们是否能为特异的氨基酸编码 。
图 1.9 核糖体结合实验人工合成的三核苷酸与对应的氨酰 -tRNA分子及核糖体复合物可以保留在硝酸纤维膜上。
4) 用重复共聚物 (repeating copolymers)破译密码
1966年,H,G,Khorana等发明了利用重复的共聚体,
例如 GUGGUG…,AAGAAG…,来破译密码子的途径,并因此发现了 3个终止密码子,UAA,UAG，
UGA。 蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始,并把特异的氨基酸掺入肽链 。
由 Poly(GUA)或 Poly(GAU)只获得两种均聚肽。
——UAG和 UGA为终止密码子
1966年，尼伦伯格 (Nirenberg)和科拉纳 (Khorana)等人完成了对全部遗传密码的破译,2人共同获得 1968年的诺贝尔奖。
密码表遗传密码 (genetic codon)的特点
连续性
简并性
摆动性
通用性
不重叠遗传密码 (genetic codon)的特点
＊连续性 (commaless)
mRNA分子的 ORF中，组成遗传密码的三联体没有间断，须 3个一组连续读下去，
直至出现终止密码子为止。
mRNA链上碱基的插入或缺失，就会改变密码阅读的顺序，造成框移，使下游翻译出的氨基酸完全改变，即 移码突变 。
遗传密码 (genetic codon)的特点
＊简并性 (degeneracy)
一种氨基酸可有几个意义相同的密码子,
即 同义密码子 。 除 Trp,Met外,其余氨基酸均有
2~4个最多达 6个密码子 。 同义密码子之间,前两个碱基均相同,只是第三个碱基不同 。 若头两个碱基发生点突变,可译出不同氨基酸,而第三个碱基的突变,不会影响氨基酸的翻译 。
遗传密码 (genetic codon)的特点
＊摆动性 (wobble)
反密码子和密码子配对时,有时会出现不遵从碱基配对规律的情况,称为遗传密码的摆动现象 。 这一现象常见于反密码子的 第一位碱基 与密码子的 第三位碱基 之间 。
按照 Wobble假说密码子与反密码子配对遗传密码 (genetic codon)的特点
＊通用性 (universal)
不同种属的生物都使用同一套遗传密码 。
但近年发现 线粒体 和 叶绿体 使用的遗传密码稍有差别 。
如线粒体,叶绿体以 AUG,AUU,AUA为起始密码子,而 AUA兼有 Met密码子功能 。 终止密码子是 AGA,AGG,Trp密码子是 UGA等 。
遗传密码 (genetic codon)的特点
＊不重叠通常说来,密码子是不重叠的,每个三联体中的三个核苷酸只编码一个氨基酸,核苷酸不重叠使用 。
噬菌体?x174中某些基因之间有重叠现象
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 4）基因的结构
最早试图揭示基因内部精细结构的研究工作是 S.
Benzer在 20世纪 50年代晚期进行的 。 1955年他发展出了一种应用 T4噬菌体 rII区的不同等位基因绘制 基因内部图谱 (intragenic maps)的方法,为探索产生等位基因的分子机理提供了新的手段 。
1967年 C,Yanofsky等通过对 E.coli色氨酸合成酶基因 (trpA)的研究,首次将基因的精细结构遗传图
(genetic map)同物理图 (physical map)进行比较 。
◆ （ 4）基因的结构
只有到了 70年代中期,随着基因克隆和 DNA序列分析技术的相继发展,人们才真正有可能从单碱基水平上剖析基因的分子结构 。
非编码区 非编码区编码区编码区上游 编码区下游与 RNA聚酶结合位点
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
转录开始后,RNA聚合酶沿 DNA分子移动，并与 DNA分子的一条链为模板合成 RNA。转录完毕后,RNA链释放出来，紧接着 RNA聚合酶也从 DNA模板链上脱落下来。
◆ 原核基因的结构能够转录为相应的信使 RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质的区域。
位于编码区上游和编码区下游的 DNA序列，虽不能转录为信使 RNA，不能编码蛋白质但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等。
非编码区 (调控序列 )
编码区 (编码序列 )
◆ 原核基因的结构编码区非编码区 非编码区与 RNA聚酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使 RNA
编码区上游 编码区下游内含子外显子
◆ 真核基因的结构原核细胞 真核细胞不同点相同点原核细胞 真核细胞不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、
不连续的相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较：
◆ 非编码区与内含子都是基因结构中不能编码蛋白质的序列,它们有哪些不同?
内含子能转录为信使 RNA
◆ 启动子与起始密码有何不同?
启动子是基因结构中位于编码区上游的核苷酸序列,是
RNA聚合酶结合位点,能够准确地识别转录的起始点并开始转录,有调控遗传信息表达的作用 。 而起始密码则是
mRNA上的三个相邻碱基 。 启动子不止三个碱基 。
◆ 外显子与内含子 的角色是否固定不变?
一般说,真核细胞结构基因都是由外显子和内含子组成,但是,
外显子和内含子的关系并不是完全固定不变的,有时同一条
DNA链上的某一段 DNA序列,当它作为编码某多肽链的基因时是外显子,而作为编码另一多肽链的基因时,则是内含子,结果是同一基因可以同时转录为两种或两种以上的 mRNA。
◆ 终止子和终止密码 有何不同?
终止子是在非编码区内紧靠转录终点,调控遗传信息表达的
DNA序列 。 它特殊的碱基排列顺序能够阻碍 RNA聚合酶的移动,并使其从 DNA模板链上脱离下来,从而使转录工作结束 。
终止密码位于 mRNA上,共有三种,UAA,UAG,UGA。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
基因表达
(gene
expression
),是遗传信息通过转录生 mRNA
再经翻译生成蛋白质的过程 。
◆ （ 5）基因的表达与调控
1961年,F,Jacob和 J,Monod提出大肠杆菌的乳糖操纵子 模型 。
操纵子 (operon)是一种完整的细菌基因表达单位,由若干个 结构基因,一个或数个 调节基因 及控制单元组成 。 控制单元包括一个 操纵基因 和启动区序列 。
结构基因 (structural gene)：细胞中基本看家蛋白质如代谢酶类,转运蛋白质和细胞骨架成份等的编码基因 。
调节基因 (regulatory gene)：编码用以控制其它基因表达的 RNA或蛋白质产物的基因 。
操纵基因 (operator)：接受来自调节基因合成的调节蛋白的作用,使结构基因转录活性得以控制的特定的 DNA区段 。
◆ （ 5）基因的表达与调控
1961年,F,Jacob和 J,Monod提出大肠杆菌的乳糖操纵子模型：
◆ （ 5）基因的表达与调控
操纵子概念指出基因不但在结构上是可分的，在功能上也是有分工的。
◆ （ 5）基因的表达与调控
1969年,R,J,Britten和 E,H,Davidson提出一个假想的 真核细胞的基因调控模型 。 根据这个模型,与调节基因相连的一段 DNA 叫做 传感基因 (sensor
gene),细胞根据需要向它发出信号 。 这种信号可能是由细胞中的化学分子传达,当其到达传感基因后
,调节基因就开始发生作用,制造出激体 RNA
(activator RNA),并由它指示同结构基因相邻的受体基因 (receptor gene),令其发动结构基因行使功能转录出 mRNA,进而转译成相应的蛋白质分子 。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 6）基因的分离
据生物的表现型来研究基因型这种间接的研究法不能满足科学发展的要求,有必要将基因分离出来,在试管中直接研究其结构,功能及调节等一系列问题 。
1969年,美国哈佛大学 R,Beckwith等应用 DNA-
DNA分子杂交技术,分离到了一种特殊的基因 ——
大肠杆菌乳糖操纵子的?-半乳糖苷酶基因,首创了单基因分离的成功先例,激发了人们从不同角度,用不同方法分离基因的积极性,从而加速了基因研究工作的进展 。
2,基因研究的发展
（ 1）基因学说的创立
（ 2）基因与 DNA分子
（ 3）基因与多肽链
（ 4）基因的结构
（ 5）基因的表达与调控
（ 6）基因的分离
（ 7）基因的合成
◆ （ 7）基因的合成
1970年 美国 MIT的 H,G,Khorana等首次报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸基因 (77bp)全合成； 1976年,
大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因 (200bp)全合成 。
将之导入 E,coli之后,表现出特有的生物活性,起到了基因的作用 。
1977年,H,W,Boyer等将化学合成的人脑激素基因连接在乳糖操纵子上并导入大肠杆菌细胞,成功实现转录和转译,产生出有生物活性的蛋白质 。 这是第一个以 DNA重组技术完成的基因工程 。
一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 6）重叠基因
◆ （ 1）移动基因
移动基因,又叫 转位因子 。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移另外一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁，因此在文献上有时也形象地称之为 跳跃基因 。
移动基因最早是由美国冷泉港实验室的女科学家
B,McClintock，于本世纪 40年代 晚期在玉米中首次发现的。她因为本项发现，获得了 1983年 的诺贝尔生物医学奖。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 2）断裂基因
过去人们一直认为，基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因实体。但以后通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的 DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的间断基因为 断裂基因 (split gene)。有人认为断裂基因是近二三十年来在生物学上最惊人的发现之一。断裂基因最初是在腺病毒中发现的,1977年 提出科学报告。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 3）假基因
1977年,G,Jacq等人根据对非洲爪蟾 5S rRNA基因簇的研究,首次提出了 假基因 的概念 。 他们的研究发现,这个 5S rRNA基因,与一个基本上相同,
但又不完全相同的 5S rRNA基因的复本序列直接相邻 。 由于在体内从未检出过这段 5S rRNA基因复本序列的 mRNA分子,说明它是没有表达活性的 。 因此,Jacq等人特称之为 假基因 (pseudogene)。 现已在大多数真核生物中发现了假基因,这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同,但却不能合成出功能蛋白质的 失活基因 。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 4）重复序列及重复基因
比较真核和原核的基因结构后发现,几乎所有的真核生物 (除单细胞的酵母以外 )的基因组 DNA中,都具有 重复序列 (repeated sequence)。 而且在有些例子中,重复序列的拷贝数可高达百万份以上 。 在人
DNA中,重复序列 (至少具有 20份拷贝 )的 DNA占总
DNA的 30%左右 。
根据对多种生物 DNA所作的详细分析表明,在真核基因组存在有 四种不同类型 的 DNA序列：
◆ （ 4）重复序列及重复基因
（ 1） 不重复的唯一序列 （ 只有一个拷贝 ） ；
（ 2） 低度重复序列 （ <10个拷贝 ） ；
（ 3） 中度重复序列 （ 10到几百个拷贝 ） ；
（ 4） 高度重复序列 （ 几百个到几百万个拷贝 ） 。
当然,这种分类的界限是人为划分的,所以在作这些类型的一般性概述时,要特别留心它的具体内容 。
此外,由于通常研究的都是二倍体细胞,因此一种不重复的唯一序列,实际上是存在着 2个拷贝 。
3,基因的现代概念
（ 1）移动基因
（ 2）断裂基因
（ 3）假基因
（ 4）重复序列及重复基因
（ 5）重叠基因
◆ （ 5）重叠基因
英国剑桥分子生物学家 F,Sanger(1977)在分析了一种小的单链 DNA噬菌体 φX174的全序列后,惊奇地发现在 5386个核苷酸中组成了 11个基因,通过对这
11个基因编码的氨基酸总数,按三联体密码子的原则计算,其所需核苷酸数超过 5386个 。 后来 Sanger
实验室的 G,G,Garrell等发现 φX174基因组中有些密码是重读的,从而形成 重叠基因 (overlapping gene)
。 所谓重叠基因是指两个或两个以上的基因共有一段
DNA序列,或是指一段 DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分 。
◆ （ 5）重叠基因
重叠基因的 重叠方式 可以有许多种,如小基因包含在大基因之内,前后两个基因的首尾重叠甚至三个基因重叠,操纵子重叠,或反向重叠 (DNA双链都转录,
密码读框相同,但方向不同 )。 如在噬菌体 φX174中 (
图 1-23),基因 B完全包含在基因 A之内,基因 A与基因 K共用一段序列,基因 D和 E的读码框相差一个碱基 。 虽然这些基因使用的是同样的 DNA序列,但它们表达时使用的读码框不同,因而表达出来的是不同的蛋白质 。 重叠基因现象反映了原核生物利用有限的遗传物质表达更多生物功能的能力 。
◆ （ 5）重叠基因图 1-23 噬菌体 φX174的重叠基因
◆ （ 5）重叠基因
在原核生物中,重叠基因是一种较为普遍的现象 。
1978年 猴病毒 SV40基因组全序列发表后,发现编码病毒外壳蛋白的三个基因 VP1,VP2和 VP3都有重叠部分 。 在真核生物甚至高等真核生物包括人的基因组中也偶尔发现有重叠基因 。 1998年 12月公布的秀丽新小杆线虫 (Caenorhabditis elegans)全基因组序列分析表明,有的 内含子序列中包含了 tRNA基因,且
tRNA基因的转录方向不一定与它所包含的基因的转录方向相同 。
一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
A,DNA是遗传物质
1952年 Alfred Hershy和 Marsha Chase进一步证明 遗传物质是 DNA。
1944年 Avery,确定 了基因的分子载体是
DNA，而不是蛋白质。
（ a） 肺炎双球菌转化实验
（ b） 噬菌体转染实验
◆ （ 1） 基因工程诞生的理论基础
1953年 James D,Watson
和 Francis H,C,Crick揭示了 DNA分子的 双螺旋结构和 半保留复制机制 。
B,DNA双螺旋结构
1958年,Crick提出遗传信息传递的,中心法则,
DNA RNA protein
1964年 Marshall Nirenberg和 Gobind Khorana
等终于 破译了 64个遗传密码
C,中心法则和遗传密码
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
A,限制性内切酶 (restriction enzymes)
1970年 H.O,Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 。
Werner Arber
理论预见限制酶
Daniel Nathans
用限制酶切得
SV40 DNA片断
Hamilton O,Smith
得到第一个限制酶
1978年 Nobel生理或医学奖
◆ （ 2）基因工程诞生的技术突破
B,DNA连接酶 (ligase)
1967年 5个实验室几乎同时发现了 DNA连接酶。
C,载体 (vector)
1972年 前后使用小分子量的细菌 质粒 和?噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。
D,感受态体系
1970年 M,Mandel和 A,Higa发现经过 氯化钙 处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体 DNA 。 1972年 S.
Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒
DNA。
E,琼脂糖凝胶电泳
1960s发明了琼脂糖凝胶电泳,可将不同长度的
DNA分离开 。
F,DNA测序技术
1975年 F,Sanger,A,Maxam和 W,Gilbert发明了
DNA快速测序技术。
1980年 Nobel化学奖
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
1980年 Nobel化学奖
1972年 斯坦福大学的 Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：
A,Berg的开创性实验将 SV40的 DNA片断与?噬菌体的 DNA片断连接起来。
（用 DNA末端转移酶，
而非限制性内切酶）
◆ （ 3）基因工程的诞生
B,Boyer-Cohen实验
1973年 斯坦福大学的 S,Cohen小组将含有 卡那霉素抗性 基因的大肠杆菌 R6-5质粒与含有 四环素抗性 基因的另一种大肠杆菌质粒 pSC101连接成重组质粒,具有 双重抗药性 。
后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同 pSC101质粒重组,转化大肠杆菌,并在菌体内成功转录出相应的 mRNA。 这是 第一次成功的基因克隆实验 。
Boyer-Cohen
实验
Stanley Cohen
1986 Nobel生理或医学奖
Herb Boyer
4,基因工程的诞生与发展
（ 1）基因工程诞生的理论基础
（ 2）基因工程诞生的技术突破
（ 3）基因工程的诞生
（ 4）基因工程的基本概念与内容
（ 4） 基因工程的基本概念与内容
A 重组 DNA技术的基本定义
B 基因工程的基本定义
C 重组 DNA技术与基因工程的基本用途
D 基因工程的基本形式
E 基因工程的特征
F 基因工程的主要操作内容
A 重组 DNA技术 的基本定义
（ 4） 基因工程的基本概念与内容重组 DNA技术 是指将一种生物体 (供体 )的基因与 载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体 (受体 )
内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的 DNA体外操作程序，也称为 分子克隆技术 。
供体、受体、载体 是重组 DNA技术的三大基本元件。
B 基因工程的基本定义
（ 4） 基因工程的基本概念与内容基因工程 是指重组 DNA技术的产业化设计与应用,包括 上游技术 和 下游技术 两大组成部分 。
上游技术 指的是基因重组,克隆和表达的设计与构建 （ 即重组 DNA技术 ） ；而 下游技术 则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程 。
C 重组 DNA技术 与基因工程的基本用途
（ 4） 基因工程的基本概念与内容分离、扩增、鉴定、研究、整理 生物信息资源大规模生产 生物活性物质设计、构建 生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质生物活性物质
D 基因工程的基本形式
（ 4） 基因工程的基本概念与内容第一代基因工程 (经典基因工程 )
蛋白多肽基因的高效表达第二代基因工程 (蛋白质工程 )
蛋白编码基因的定向诱变第三代基因工程 (途径工程 )
代谢信息途径的修饰重构第四代基因工程 (基因组工程 )
基因组或染色体的转移外源 DNA在寄主细胞内可大量扩增，
和高水平表达。
a,跨物种性
b,无性扩增外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。
（ 4） 基因工程的基本概念与内容
E 基因工程的特征
b,重组体的制备
a,目的基因的获取从复杂的生物基因组中,经过酶切消化或 PCR
扩增等步骤,分离出带有目的基因的 DNA片断 。
将目的基因的 DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记 (抗菌素抗性 )的载体分子上 。
（ 4） 基因工程的基本概念与内容
F 基因工程的主要操作内容将重组体 (载体 )转入 适当的受体细胞中 。
d,克隆鉴定
c,重组体的转化挑选 转化成功的细胞克隆 (含有目的基因 )。
e,目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物 。
F 基因工程的主要操作内容
1946 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995
1944DNA是遗传物质
1949Hbs贫血
1953双螺旋
1956HbsGlu-Val
1966遗传密码第一个 R酶
1972重组质粒
1975DNA杂交
1977DNA测序
1981转 G小鼠
1983HD病 G定位
1985PCR
1986位置克隆
1987G剔除小鼠
1989位置克隆
1990第一个基因治疗
1995细菌 G组序列
1996酵母基因组序列现代分子遗传学发展重要事件一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
5,基因工程的应用
（ 1）基因工程在农业生产中的应用
（ 2）基因工程在工业中的应用
（ 3）基因工程在医药上的应用
（ 4）基因工程在环境保护中的应用
（ 5）基因工程技术的商业化发展
A,提高植物的光合作用效率改变与光合作用有关的酶的结构和组成
（如二磷酸核酮糖羧化酶）。
（ a）提高 CO2的固定率改变光能交换系统的分子的基因结构。
（ b）提高光能吸收率和转化率
◆ （ 1）基因工程在农业生产中的应用使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。
B,提高豆科植物的固氮效率是农业生物技术的主要内容。
是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些 优质性状 (高产、稳定、优质、抗虫、抗病等 )。
C,转基因植物
◆ （ 1）基因工程在农业生产中的应用转基因番茄转基因胡萝卜世界各国转基因作物大田释放情况（ 1987.1-1998.4）
转基因作物特性 批准项数 所占比例抗除草剂 1297 29.6%
抗虫 1046 23.8%
产品质量高 886 20.2%
抗病毒 436 9.9%
农学性状好 211 4.8%
抗真菌 208 4.7%
其它 303 6.9%
中国已经批准进入大田的转基因植物（ 1998.3）
转基因植物 特性 申请单位 获批准数马铃薯 抗病毒 中科院 4
抗病 中国农科院 1
抗逆 北京大学 1
高营养品质 北京大学 1
水稻 抗虫 中科院 1
抗病毒 北京大学 2
抗病 农科院 2
抗除草剂 水稻所 1
棉花 抗虫 中科院农科院美国孟山都公司
9
玉米 抗虫 美国孟山都公司等 3
大豆 抗除草剂 农科院 1
小麦 抗除草剂 北京农林科学院 1
高营养品质 北京农林科学院 1
番茄 抗病 北京大学 1
耐储存 中科院华中农大
3
甜椒 抗病 北京大学 1
辣椒 抗病毒 中科院 1
烟草 抗病毒 北京大学 2
抗虫 中科院北京大学
2
番木瓜 抗病毒 中国热带作物 1
广藿香 抗病 农业科学学院 1
矮牵牛 改变花色 北京大学 1
杨树 抗虫 中科院 1
微生物 提高固氮效率 中科院农科院华中农大广东微生物所
6
将外源基因导入动物细胞,并在基因组内稳定整合,遗传给后代 。
使动物成为 生物反应器 生产有用的活性蛋白等 。
D,转基因动物在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物 (TPA)和尿激酶的转基因小鼠；
分泌 a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等 。
◆ （ 1）基因工程在农业生产中的应用转基因鱼转基因鱼转基因蚕
20
01
年1
月11
日
，
世界上首例转基因灵长类动物—
转基因猴
“
安迪
”
在美国安全降生
2004 年,
美国科学家研制出世界上第一只转基因蝴蝶 。
克隆各种参与纤维素降解的酶的基因,导入酿酒酵母,就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖,
发酵成酒 。
用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。
A,纤维素的开发利用
B,酿酒工业
◆ （ 2）基因工程在工业中的应用
1976年,27岁的风险投资人 Robert Swanson与
University of California的教授 Herb Boyer共饮了几杯啤酒,讨论了基因工程技术的商业前景 。 讨论结束时,他们决定建立一个公司,并取名为
Genentech (Genetic Engineering Technology)。
第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！
◆ （ 3）基因工程在医药上的应用
Genentech的骄人业绩
1976 Genentech创立
1977 首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素
1978 克隆了人胰岛素基因
1979 克隆了人生长激素素基因
1980 公司上市，募集 $ 35million
1982 第一个基因重组药 (人胰岛素 )上市 (转让给 Lilly公司 )
1984 第一个 VIII因子，转让给 Cutter Biological
1985 第一个自己生产的产品 (人生长激素 )
1987 生产组织纤溶酶原激活剂 (TPA)
1990 生产 interferon?1?
1990 与瑞士 Roche医药公司合并（ $ 2.1billion）
制造新型疫苗（如 HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾,SARS）
大肠杆菌或酵母菌生产激素 (如胰岛素 )、干扰素等应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构,制造出高效高特异性的生物制剂
A,用转基因植物或动物生产药物
B,用微生物生产药物
C,设计高效高特异性的生物制剂
D,研制疫苗
F,法医鉴定
G,基因治疗
E,基因诊断将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。
基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。
(仍在探索阶段 )
医药药物基因组学人工设计 克隆 P450s
疾病的动物模型治疗性小分子植物微生物诊断用蛋白治疗性蛋白微生物 动物疫苗植物微生物治疗性核酸基因治疗基因修复反义药物
DNA疫苗诊断性核酸遗传病传染病美国已批准上市的基因工程药物（ 1997.7）
中文名称 商品名称 英文名缩写 开发公司胰岛素 Humulin
Novolin
Humalog
Insulin
lispoinsulin
Lilly
Novo Nordisk
Lilly
人生长激素 Protropin
Humatrope
NutropinAQ
rhuGH Genentech
Lilly
Genentech
干扰素 IntronA
ReferonA
Avonix
Betaseron
Actimmune
Alferon-N
rhuIFNa2b
rhuIFNa2a
rhuIFN?
rhuIFN?1b
rhuIFN?1b
rhuIFNa3
Schering
Roche
Biogen
Chiron
Genentech
Interferon Science
白细胞介素 2 Proleukin rhuIL2 Chiron
粒细胞集落刺激因子
Neupogen rhuG-CSF Amgen
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
Leukine rhuGM-GSF Immunex
红细胞生成素 Epogen
Procrit
rhuEPO Amgen
Ortho
组织溶纤原激活剂
Activase rhuTPA Genentech
生长激素 Serostin somatotropin Serono
促生长素 Nutropin
Saizen
Genotropin
Norditropin
Bio-Tropin
somatopin Genentech
Serono
Pharma/Upjohn
Novo Nordisk
Biotech General
抗血友病因子 VIII
Kogenate
Recombinat
e
Factor VIII Bayer
Baxter
葡萄脑苷脂酶
Cerezyme glucocerebr
osidase
Genzyml
脱氧核糖核酸酶
Pulmozyme domase Genentech
乙型肝炎疫苗
Recombivax
HB
Engerix B
Comrax
Hepatitis B
vaccine
Merck
Smith Kline
Merck
甲型肝炎疫苗
Havrix Hepatitis B
vaccine
Smith Kline
体内用单克隆抗体
Reopro
Ortho OKT-3
Onco Scint
CR/OV
Onco Scint
OC103
Onco Scint
CR103
Prostascint
MAB,blood
clots
MAB,Kidney
sup
MAB,diag
inject
Centocor
Ortho
Biotech
Cytogen
Cytogen
Cytogen
Cytogen
鼠单克隆抗体
Panorex Murine MAB Glaxo
Welcome
1
中国已经批准上市的基因工程药物（ 1998.5）
药品名缩写 开发生产公司 批准时间 适应症
rhuINFa1b(外用）
rhuINFa1b
rhuINFa2a
长春生研所上海生研所深圳兴科长春生研所长生药业三生药业
1989试
1996正
1996正
1996正
1997正
1997正病毒性角膜炎
HBV,HCV
HBV,HCV
尖锐湿疣，疱疹等
HBV,HCV
HBV,HCV
rhuIFNa2b 新大洲药业里亚哈尔华立达安科华新
1997正
1996正
1997正
1997试
1997试
HBV,HCV
HBV,HCV
HBV,HCV
HBV,HCV
HBV,HCV
rhuINF? 上海生研所克隆丽珠生物工程
1994试
1995试
1995试类风湿类风湿类风湿
rhuIL2 长春生研所长春药业四环制药华新三生药业深圳兴科中华合通金丝利康利制药
1997正
1997正
1997正
1997正
1997正
1997正
1995试
1995试
1995试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗
rhuG-CSF 九源 1997试 化疗生白血病
rhuGM-CSF 特宝 1997试 化疗生白血病
rSK 医大实业 1996试 心梗溶栓
rhuEPO 华欣永铭维沃
1997试
1997试再生障碍性贫血再生障碍性贫血
bFGF（外用） 珠海东大 1996试 创伤，烧伤
2004年中国已批准上市的生物工程药品及疫苗用带有重组质粒的,超级菌,分解油（烷烃类）、有机农药污染。
A,检测水污染
B,生物降解用重组细菌或转基因鱼等检测水污染
◆ （ 4）基因工程在环境保护中的应用生物技术的发展在某种程度上是由商品经济 的发展所推动的。
Genentech公司 1980年上市后 20分钟内由 35$涨到
89$/股。
A,商业投资支持现代生物技术研究
1980-1983年，美国成立了 200多家生物技术公司。
1985年 400多家,1300多家。 现在几乎每个大跨国公司（化学和制药）都投巨资。
◆ （ 5）基因工程技术的商业化发展
B,基因工程商业化特点
a,技术密集型
（ i）产品来源于实验室
Boyer教授是 Genentech的副总裁。
（ ii）科学家往往就是公司的领导人
1994年仅美国的总销售额 40多亿美元。
1992年日本 4000亿日元。
20世纪末 6000亿美元。
b,市场扩张迅速美国 1993年 40多亿美元 。
日本 1997年 5000多亿日元 。
80年代初,加拿大联邦政府出资参与建立的
Allelix生物技术公司,注册资本高达一亿美元 ！
c,投入巨大
d,风险太高前期的资金投入是极其巨大的,非一般企业所能承受 。
我国在,七五,和,八五,计划的 10年间,仅就,基因重组人生长激素,一个项目的研发就先后投入了近 1.5亿元人民币的经费 。 这仅仅是一个仿制型的二类新药,而且又仅仅是制药工艺的研发 。 长达 10余年的研发过程,巨额资金的投入,最终也并未获得高质量的,国产二类新药,。
全世界只有不超过 100家生物技术公司有 自己的产品 。其中真正盈利的公司很少。
制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。
已取得的成果中 60%是医学领域的。
g,医学生物技术产业进展最快
f,研究专一、产品专一
h,专门为基因工程实验提供研发试剂的公司
e,产品不断增加基因工程不是发现，而是创造。
基工的魅力只有想不到的没有办不到的一,基因工程概论
1、现代生物技术 —重塑自然生命
2、基因研究的发展
3、基因的现代概念
4、基因工程的诞生与发展
5、基因工程的应用
6、基因工程的安全性
6,基因工程的安全性
（ 1）基因工程的安全隐患
（ 2）重组 DNA研究的安全准则
（ 3）生物工程的人文忧患与讨论制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播 。
A,对环境的影响
B,新型病毒的出现重新组合一种在自然界尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响 。
◆ （ 1）基因工程的安全隐患将肿瘤病毒或其它动物病毒的 DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。
D,人造生物扩散新组成的重组 DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。
C,癌症扩散
A,公众的担忧
1973年 美国的公众第一次公开表示担心应用重组 DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。
◆ （ 2）重组 DNA研究的安全准则
1974年 美国国立卫生研究院 （ NIH） 考虑到重组
DNA的潜在危险,提请 Paul Berg博士组成一个重组
DNA咨询委员会 。
这个由 11名分子生物学和重组 DNA权威学者组成的委员会在同年 7月发表公开信 (science,158,303),要求在没有弄清楚重组 DNA所涉及的危险性范围和程度,以及在采取必要的防护措施之前,暂停两类试验 （ 带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒 ） 。
B,专家的态度
C,制定安全规则
1976年 6月 23日,NIH正式公布了,重组 DNA
研究的安全准则,。
规定了 安全防护 （ 物理防护和生物防护 ） 标准以及 禁止 若干类型的实验 。
1979年,1981年,1989年 NIH又做了多次修改,放宽了许多限制 。
分 4级,P1—P4级。
（ a）实验室的物理安全
D,基因工程的安全措施一般装备良好的普通微生物实验室。
① P1级实验室
② P2 级实验室在 P1级实验室的基础上还装备有 负压 的安全操作柜。
全负压 的实验室，同时装备安全操作柜。
④ P4级实验室专用的实验大楼,周围与其它建筑物应有隔离带。
具有最高安全防护措施。
③ P3 级实验室在自然环境中 无法 存活。
（ b）实验室的生物安全分 3 级（大肠杆菌）,EK1—EK3级。
① EK1级的大肠杆菌在自然环境中 一般 都要死亡。
② EK2-EK3级大肠杆菌第一个“安全”菌株是 K12（ 1976年），
很不实用，已淘汰。
（ c） 载体的安全应该是失去了 自我迁移 的能力。
不会自动从,安全,的菌株转移到,不安全,
的菌株中 。
（ 容易构建 ） 。 如 pMB9,pBR322等 。
（ A） 现代生物技术会打破生物物种间的平衡吗？
目前,自然界存在的生物物种,包括微生物,植物,
动物,当然也包括我们人类 。 这些生物物种是在几千万年,甚至上亿年自然界优胜劣汰的进化中形成的,它们之间丝丝相扣,存在着十分有序,也异常复杂的食物链和生态链,同时这些生物物种也和整个地球的生态环境保持着和谐的关系 。 可是,现代生物技术的出现,它在创造新的生命的同时,是否会给自然界物种间的这种平衡的保持带来威胁？
◆ （ 3）生物工程的人文忧患与讨论
（ B） 吃与不吃的选择 ——对转基因食物的担忧在生物物种的食物链上,人类处于终端的位置,
也就是说,人类是以植物和动物为食物而维持生命的 。 当转基因技术用于植物和动物的基因改造,
改变原来这些生物物种的性状和品质时,就不可避免地给人类带来有关食品安全的问题 。
◆ （ 3）生物工程的人文忧患与讨论
（ C） 克隆一个,你,,你能和,你,和平相处吗？ —
—我们是否要接纳克隆人 。
克隆技术用于一切动物,都还仅仅是一项技术的生产运用,不会从根本上影响人类,威胁人类的社会,但是如果真的有一天这项技术运用于人类生殖领域,问题必然会复杂化 。
有关,克隆人,的讨论也提醒我们,科技进步就是一首悲喜交集的进行曲,生物技术的发展,必定更广泛,更深入地渗透到社会,引起许多伦理,道德和法律等问题 。
◆ （ 3）生物工程的人文忧患与讨论
It’s over for today!
