湖南中医药大学研究生选修课
Principles of Genetic Engineering
基 因 工 程 原 理湖南中医药大学 鲁耀邦基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定第四讲 基因克隆的载体与受体
vectors
在基因工程操作中，把能携带外源 DNA进入受体细胞的 DNA分子叫 载体 。
1,载体 (Vectors)
（ 1）在宿主细胞内能独立复制。
（ 2）有选择性标记。
（ 3）有一段多克隆位点。
2,基因工程对载体的要求外源 DNA插入其中不影响载体的复制。
（ 4）分子量小，拷贝数多。
（ 5）容易从宿主细胞中分离纯化。
基因工程中常用的载体有 5类：
3,载体的种类质粒 （ plasmid）
单链 DNA噬菌体 M13
噬菌体的衍生物柯斯质粒 （ cosmid）
动物病毒 （ virus）
第一节 质粒载体一、质粒（ plasmid）
是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
大肠杆菌的质粒
（ 1）分子小：
1,质粒的一般生物学特性
1— 200 kb
（ 2）编码基因少：
2— 3个中等大小的蛋白质。
（ 3）环形状：
双链环状 DNA。
（酵母的“杀伤质粒”是 RNA）。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。
（ 4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状 DNA（ cccDNA)
呈超螺旋（ SC）（ super coil）
Covalent close circular DNA
③ 线形 DNA （ linear,lDNA）
一条链上有一至数个缺口。
② 开环 DNA（ open circular,ocDNA）
（ 5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
scDNA最快,lDNA次之,ocDNA最慢。
SC
OC
L
在大肠杆菌中的质粒，可以分为：
接合型质粒,
非接合型质粒能自我转移不能自我转移
2,质粒的类型除了带有自我 复制 所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌 配对 和质粒 接合转移 的基因。
如,F质粒（性质粒、或 F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
又叫 自我转移型质粒 。
不符合基因工程的安全要求。
（ 1）接合型质粒：
大肠杆菌接合（ conjunction）
（ 2）非接合型质粒：
虽然带有自我 复制 所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合 转移 的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
① R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种 抗生素抗性基因,使寄主获得同样的抗生素抗性性状（ resistance）。
符合基因工程的安全要求。
pBR322和 pUC18质粒及酶切位点带有控制 大肠杆菌素（ colicin） 合成的基因。
② Col质粒：
大肠杆菌素对不带 Col质粒的大肠杆菌有毒。
Col质粒或 R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。
3、质粒的复制类型
（ 1） 严紧型质粒（ stringent plasmid）
拷贝数少,只有 1-2份拷贝。
（ 2） 松弛型质粒（ relaxed plasmid）
拷贝数多,有 10-200份拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。
（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
① 分子量大，拷贝数低
4、质粒载体的构建
（ 1） 天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒 pSC101，
分子长 9.1 kb。
但只有一个 EcoR I切点充当克隆位点，
Tetr 作为筛选标志。
ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素 E1
（ colicin E1）。
② 筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗 colicin E1的细胞 …….
colicin E1能杀死不含 ColE1 质粒的菌，形成
,噬菌斑,。
唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。
ColE1
① 具有复制起点（ ORI）
（ 2） 质粒载体必须具备的基本条件
② 具有抗菌素抗性基因
③ 若干限制性内切酶的单一位点：
是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。
用来插入外源 DNA片断。且插入后不影响复制功能。
一个质粒只含一个复制子（ Replicon)。
④ 具有较小的分子量和较高的拷贝数。
⑤ 应属于松驰型质粒
⑥ 应为非传递性质粒具有较小的宿主范围。
能在氯霉素存在下大量扩增其拷贝数。
氨苄青霉素抗性（ Ampr）
卡那霉素抗性 （ Kanr）
四环素抗性 （ Tetr）
链霉素抗性 （ Strr）
氯霉素抗性 （ Cmlr）
（ 3） 质粒的选择标记及其工作原理：
选择标记
① 抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：
常用抗菌素的抗性工作原理
i）氨苄青霉素（ Ampicillin,Amp）
青霉素的衍生物。
通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，
杀死 生长的细菌 。
a）抑菌原理
b）细菌抗性原理
Ampr基因编码?-内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的?-内酰胺环。
ii）氯霉素（ chloramphenicol,Cml）
通过与 50S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成 。 杀死 生长的细菌 。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码 乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活。
a）抑菌原理
a） 杀菌原理
iii） 卡那霉素 （ kanamycin,Kan）
通过与 70S核糖体结合,导致 mRNA发生错读 。 杀死细菌 。
b） 细菌抗性原理
Kanr 编码的 氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用 。
iv）链霉素（ Streptomycin,Str）
a）杀菌原理通过与 30S核糖体亚基结合，导致 mRNA错译。 杀死细菌 。
b）细菌抗性原理
Strr 编码一种 氨基糖苷磷酸转移酶 对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体 30S亚基结合作用。
v）四环素（ Tetracycline,Tet）
b）细菌抗性原理
a）抑菌原理通过于 30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌 。
Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。
(from Molecular Biology of Gene (Fifth Edition,2004).PP.453)
② 遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。
当带有 抗菌素抗性基因 的 载体 进入受体菌后，
受体菌才能生长。
不带有 抗菌素抗性基因 的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。
抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素
(4) 人工构建的质粒载体的类型
① 高拷贝数的质粒载体
ColE1,pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点 。
而且在没有菌体蛋白质合成的条件下 （ 蛋白质合成抑制剂,氯霉素等存在下 ） 仍能复制,
达到每个细胞的拷贝数 1000— 3000个 ！
适合大量增殖克隆基因,或需要表达大量的基因产物 。
② 低拷贝数的质粒载体但有特殊用途,
由 pSC101派生来的载体特点是分子量小,拷贝数低 。
当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动,导致寄主菌死亡时,
就需要低拷贝的载体 。
pLG338,pLG339,pHSG415等不适合大量扩增 DNA用 。
③ 失控的质粒载体这是一类 温度敏感型复制控制 质粒。
温度低（低于 37 oC），拷贝数很少；
温度增加（ >40 oC）时，拷贝数会很快增加到
1000个以上。
如 pBEU1,pBEU2。
runaway plasmid vectors
1979年 B,E,Uhlin等构建。
④ 插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
如 pDF41,pDF42,pBR329。
抗菌素抗性外源 DNA
无抗菌素抗性
⑤ 正选择的质粒载体如 pUR2,pTR262等。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
直接选择转化后的细胞。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
Direct selection vectors
⑥ 表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录 — 翻译信号控制之下。
注意启动子的性质，终止子、起始密码、
终止密码的阅读正确。
复制起始点 ORI
选择标记多克隆位点 MCS
2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因 I
操纵基因 O
启动基因 P
核糖体结合位点序列（ SD）
转录终止信号区。
1）普通载体元件
表达载体的结构
(5) 经典的大肠杆菌质粒载体
A,pSC101
第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。
a,类型 天然质粒，属低拷贝型。
b,长度 9.09 kb
c,选择标记 四环素抗性 Tetr
6个克隆位点：
EcoR I,Xho I,Pvu I,Hind III、
BamH I,Sal I
主要使用 EcoR I。
（其中 Hind III,BamH I,Sal I 3个位于选择标记 Tetr的内部）
d,克隆位点
B,ColE1
a,类型 天然质粒，属高拷贝型。
b,长度 6.3 kb。
c,选择标记大肠杆菌素（ colicin） E1和对 E1免疫的基因（ immE1）
特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后,质粒仍然能复制达到每个细胞 1000-
3000拷贝之多 ！
① colicin E1基因的结构
cea imm kil
结构基因 免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有 ColE1细菌的原因
cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的 colicin E1所杀死的原因
imm基因
EcoR I位于 E1内部，插入外源 DNA会导致 E1
失活，使受体菌不能合成 E1（ ColE1-），但仍然表现出对 E1免疫型（ ImmE1+）。
EcoR I
d,克隆位点
Colicin E1
外源 DNA
无 Colicin
用对外源 colicin E1的免疫性和自身不能合成
colicin E1作选择,操作非常繁杂 。
对 colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生抗 colicin E1的频率很高 ！
e,ColE1的选择缺陷
ColE1
抗 colicinE1
杀 ColE1-
仍抗 colicinE1
不杀 ColE1-
插入片断
ColE1
pSF2124质粒的 Ampr基因
C,pBR322
a,元件来源
F,Bolivar和 R.L,Rodriguez人工构建载体。
① 复制起点 ori
pMB1系列（来源于 ColE1）的 高拷贝 型复制起点
② Ampr基因
③ Tetr基因
pSC101的 Tetr 基因。
b,长度 4363bp
c,选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。
d,克隆位点其中 9个会导致 Tetr基因失活 （ 如 BamH I、
Hind Ⅲ,Sal I） ；
3个会导致 Ampr基因失活 （ Sca I,PvuI、
Pst I） 。
24个克隆位点。
e,pBR322的优点
① 双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞?
在 Amp或 Tet中 都 死亡。
获得载体的寄主细胞?
在 Amp或 Tet其中之一 中死亡。
外源基因?BamH I
Amp中存活但在 Tet中死亡外源基因?Pst I
Tet中存活但在 Amp中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000
拷贝
④ 安全失去了转移蛋白基因 mob（ mobilization）。
不能通过接合转移。
③ 高拷贝数
② 分子小，克隆能力大载体越小越好。
>10kb的 DNA在纯化过程中容易断裂。
保留了转移蛋白（ mob）的 作用位点 。
f,pBR322的缺点能够被 ColK质粒编码的 mob蛋白识别，如果再有 F质粒的参与，就有可能转移！
① 删除 mob识别位点
（如质粒 pBR327,pAT153等）。
pAT153：
从 pBR322上切去 HaeII片断，既除去了
mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。
g,PBR322的改进
pBR325：
在 pBR322位点上接入一段来自噬菌体
PICm的 HaeII酶切片断 （ 带有氯霉素抗性基因 cmlr） 。
cmlr上也带一个 EcoRI位点 。
使 EcoRI 也成为插入失活型位点。
② 改造 EcoR I 位点
D,pUC系列
University of California 的 J,Messing 和 J.
Vieria于 1978年,在 pBR322的基础上改造而成 。 属正选择载体 。
pUC7,pUC8,pUC9,pUC10,pUC11、
pUC18,pUC19
① 复制起点 pBR322的 ori
但其上失去了克隆位点。
② Ampr 基因
a,元件来源
③ lacZ的启动子 大肠杆菌
④ lacZ’基因大肠杆菌 lacZ的?-肽链序列,是 LacZ
的氨基端片断。
pBR322的 Ampr基因
b,长度 约 2.7kb
c,克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于 lacZ’基因的 5’端。
G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G G C A T G C A A G C T T
5 ’
3 ’
EcoRI SacI KpnI
Sm aI
Xm aI
Bam HI X baI SalI
AccI
HincII
PstI SphI Hind Ⅲ
pUC 18
l ac Z ’
A A G C T T G C A T G C C T G C A G G T C G A C T C T A G A G G A T C C C G G G G T A C C G A G C T C G A A T T C
5 ’
3 ’
EcoRISacIKpnI
Sm aI
Xm aI
Bam HI
X baI
SalI
AccI
HincII
PstI
SphIHind Ⅲ
pUC 19
l ac Z ’
Ampicillin 抗性 和 lacZ的?肽互补 （蓝白斑）相结合。
d,选择标记蓝白斑选择原理：
① X-gal
（ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-?-D-galactoside）
-半乳糖苷酶 能把无色的化合物 X-gal分解成半乳糖和一个 深蓝色 的物质 5-溴 -4-氯靛蓝 。
X-gal 半乳糖
5-溴 -4-氯靛蓝
-半乳糖苷酶
② X-gal显色反应
③ lacZ的?肽互补
1）?-肽（ lacZ’ ）：
-半乳糖苷酶 N端的一段氨基酸片断（ 11-41
氨基酸）。
lacZ只有在 4聚体的状态下才有功能,
C端大部分N端的 11-41aa
C端大部分N端的 11-41aa
C端大部分N端的 11-41aa
C端大部分N端的 11-41aa
4聚体
2）受体菌 lacZ突变（ lacZ?M15）
受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失 （ 缺失?肽 ）,不能形成 4聚体的活性酶,不能分解 X-gal
受体菌株,JM系列,TG1,TG2,XL1-blue、
XS127,XS101,KK2186,MV1184,DH5a
pUC质粒载体上的 lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶,互补,,使它能形成 4
聚体,从而能分解 X-gal,产生蓝色物质 。
C端大部分N端的 11-41aa
pUC lacZ’ 受体菌 lacZ?
3）载体 lacZ’与?互补
4）?互补的插入失活
pUC载体上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位点 (MCS)
区,本身虽不干扰 LacZ’的合成,但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成 。 不能互补 。
lacZ’ 5’ 3’
肽移码突变
lacZ’ 5’ 3’
肽不互补互补
MCS 外源 DNA
④ IPTG的诱导作用
IPTG(Isopropyl β -D-1-Thiogalactopyranoside,
异丙基 -β -D-硫代半乳糖苷 )是乳糖的类似物 。 能诱导 lac操纵子的启动转录,使受体菌基因组中的
lacZ 的 C端部分 和载体的 lacZ’?肽 都表达 。 从而互补 。
但载体 MCS上插入外源 DNA后，仍然不能产生?肽！
IPTG
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有
DNA插入。
MCS无插入时，互补，蓝菌斑。
MCS有插入时，不互补，白菌斑。
IPTG诱导的结果：
无质粒的受体菌
-半乳糖苷酶部分缺失,不能分解 X-gal；
无抗菌素抗性在含抗菌素和 X-gal的培养基上培养无菌斑生长质粒转化的受体菌
-半乳糖苷酶的缺失被载体产物
互补,能分解
X-gal 。 且 有抗菌素抗性在含抗菌素和 X-gal的培养基上培养有蓝色菌斑生长带外源 DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活,
不能互补?-半乳糖苷酶 的缺失 。 不能分解
X-gal,但有抗菌素抗性在含抗菌素和 X-gal的培养基上培养有白色菌斑生长
e,pUC系列载体的优点
① 更小的分子量：
如 pUC18为 2682bp,pUC8为 2750bp。
② 选择方便
X-gal显色、抗菌素双重直接选择。
③ 克隆便利具有多克隆位点（ MCS），使有两个不同粘性末端的外源 DNA方便地插入。
④ 测序方便
pUC的 MCS与 M13噬菌体载体的 MCS完全相同，
便于把外源 DNA转移到 M13载体上测序。
G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G G C A T G C A A G C T T
5 ’
3 ’
EcoRI SacI KpnI
Sm aI
Xm aI
Bam HI X baI SalI
AccI
HincII
PstI SphI Hind Ⅲ
pUC 18
l ac Z ’
M13mp18的多克隆位点
（ 6） 其它质粒载体
A,pGEM-3Z 由 pUC派生而来。
与 pUC的主要区别是在 MCS的两侧分别加了一个噬菌体 启动子 T7和 SP6。
T7启动子
SP6启动子
MCS
lacZ’
Ampr
ori
可被 T7和 SP6的 RNA聚合酶识别转录。
① 如果加入纯化的 T7或 SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录 mRNA
② 外源基因正接反接都可以转录。
③ MCS与 pUC18的完全一样。
B,pGEM-4Z
与 pGEM-3Z相同，只是 T7启动子和 SP6启动子的 位置互换 。
pGEM-3Z的特点
C,穿梭质粒载体
（ 1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
（ shuttle plasmid vectors）
Yeast复制起点E.coli复制起点
E.coli选择标记 Yeast选择标记
MCS
大肠杆菌?枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌?酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌?动物细胞穿梭载体
（ 2）常用的穿梭质粒载体
（ 3）穿梭载体的优点
② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、
哺乳动物细胞等）进行基因表达。
③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。
克隆、构建 表达
E.coli Animal cell
① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达
(7)、质粒载体的不稳定性
A,质粒稳定遗传必须的两个条件：
（ 1）每个世代、每个质粒至少要复制一次
（ 2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。
有主动分配和随机分配两种假说。
（ 1）主动分配天然质粒。
B,质粒分配方式具有一个控制质粒拷贝分配的功能区
（ Par）,能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中 。
人工构建的质粒载体 缺失了 par区,只能以随机分配方式分到子细胞中。
人工质粒。
（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）
（ 2）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。
在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。
C,分离的不稳定性 （ segregation instability）
D,结构的不稳定性 （ structural instability）
寄主基因组的 IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。
IS
dimer
重组
（ 1）新陈代谢负荷：
E,影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：
质粒载体使寄主的世代时间延长约 15%。
① 复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。
② 转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！
每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同,称差度 。
（ 2） 质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小,遗传稳定 。
差度 （ variance）,
是产生无质粒细胞的重要原因 。
高拷贝数的质粒载体差度大,拥有少量拷贝数的菌体多,发生丢失的可能性大 。
野生型 E.coli中，质粒在寄主的 重组酶 作用下会发生重组形成 二聚体质粒 。
（ 3）寄主菌的重组体系二聚体灾难（ dimer catastrophe）：
含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。
二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。
第二节 噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒（ Bacteriophage）。
一、噬菌体的一般特性结构：
蛋白质外壳内包裹着
DNA（双链、单链、
线性、环状等）。
single linear DNA (about 182,000 bp)
T2 Genomic DNA
T4 Bacteriophage
分为两种：
1,溶菌周期：
二、噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。
烈性噬菌体（ virulent phage)
2,溶原周期：
感染细菌后,将自己的 DNA整合到细菌的染色体 DNA中 。 形成这一过程称为 溶源化 （ lysogenization)。
整合到细菌染色体的噬菌体 DNA称为 原噬菌体,随细菌的染色体复制而复制。
温和噬菌体（ temperate phage)
原噬菌体（ prophage)：
三、单链噬菌体载体
M13,f1,fd 噬菌体单链环状 DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：
M13 噬菌体
（ 2）复制型（ RF）是双链环状 DNA。
1,单链 DNA噬菌体的特点
（ 3） RF DNA和 ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑。
（ 5）可产生大量的含有外源 DNA插入片断的 单链分子,便于作探针或测序。
（ 1） +DNA。（ ssDNA）
（ 4）不存在包装限制。
2,M13 噬菌体
RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。
成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。
M13噬菌体只感染 雄性 大肠杆菌。
但 M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。
6407 bp。（ 2） DNA长度
（ 3） DNA提纯
（ 1）寄主
M13
序列
（ 4） M13的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，
约为正常的 1/2— 3/4）
M13通过雄性细菌的 F性须 注入其 +DNA
+DNA合成－ DNA，形成 RF dsDNA
－ DNA转录 mRNA、合成 +DNA、翻译形成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体 M13,挤出寄主细胞
+DNA
-DNA
mRNA
M13外壳蛋白 组装成子代 M13
+DNA
注入大肠杆菌复制转录翻译
+DNA
指导合成
+DNA
200个 RF DNA
每个细胞可以放出约 1000个
M13颗粒！
M13的包装过程：
RF dsDNA指导合成的 +DNA
M13基因 V编码单链
DNA结合蛋白
DNA-蛋白质复合物转移到寄主的细胞膜
M13外壳蛋白 基因 V蛋白脱落
+DNA溢出细胞膜包装
（ 5）没有包装限制
3,M13载体的构建：
M13基因组中只有基因 II与基因 IV之间存在一段
507bp的基因间隔区（含有 M13DNA复制起点）。
（ 1）克隆区域的选定
① 基因间隔区（ intergenic region,IG区）
IG区内只有一个 BsuI 切点。
其余 9个 BsuI限制性位点分布在其它部位。
② 酶切位点
M13
J,Messing证明,IG区存在 M13的 复制起点,但可以插入外源 DNA而不影响 M13噬菌体的活力。
在 IG区内插入一个大肠杆菌的 LacZ’（?-肽序列 )。
利用?-肽序列中的三个单一酶切位点 （ Bgl II、
Ava II 和 Pvu I） 。
（ 2）加入酶切位点
① 在 IG区内加入单一内切酶位点第一个 M13载体,M13mp1：
M13 RF
BsuI不完全消化各种长度的线性片断
（其中应有只在 IG
上切开的线性全长
M13）
E.coli lac基因的 HindII片断 (lacI,lacP,lacO、
lacZ’）
连接
M13mp1
JM101宿主只有在 IG区插入 lacZ’才能存活并在 X-gal上出现互补的蓝噬菌斑
（ 3） M13载体系列加上常用的酶切位点。
① M13载体系列的命名
M13mpn n代表系列数字
② 对 M13mp1的改进
B,Gronenborn和 J,Messing1978年把 LacZ’
5’端的第 13个核苷酸 G突变成 A，产生了一个
EcoR I切点。
M13mp2：
5’ATGACCATGATTACGGATTCA-
Me
用 N-甲基 -N-亚硝基脲 把 G甲基化
5’ATGACCATGATTACGGATTCA-
转染 E.coli。 mG与 T配对，复制两次后
5’ATGACCATGATTACGAATTCA-
EcoRI切点用 EcoRI切
M13mp1
M13mp2
选择能切开的 线性分子再环化
M13mp1
③ 对 M13mp2的进一步改进在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（ MCS）。
M13mp7,M13mp8,M13mp9,M13mp10、
M13mp11,M13mp18,M13mp19
对应有相同 MCS的 pUC系列载体：
pUC7,pUC8,pUC9,pUC10,pUC11、
pUC18,pUC19
成为 M13mp系列载体：
与 pUC18相同
M13mp18的多克隆位点
4,M13系列载体的优点
（ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段
（ 2） X-gal显色反应，可供直接选择
（ 3）无包装限制，克隆能力大
（ 4）可以克隆双链 DNA分子中的每一条链子代 M13噬菌体中包含的是单连 +DNA。
MCS+
-
+-+-
编码链非编码链 外源 DNA
不同的酶切不同的酶切插入
M13 vector
M13 RF + -
+ - + -
外源 DNA
转染 E,coli
成熟的子代 M13中+ +
① 插入外源 DNA后，遗传稳定性显著下降
② 实际克隆能力小于 1500bp。
虽无包装限制，并非无限包装！
5,M13载体的缺点
6,噬菌粒载体（ phagemid vectors）
由 质粒载体 与 单链噬菌体载体 的复制起点结合而成的新型载体系列。
MCS
噬菌体 ori
质粒 ori
Ampr
lacZ’ lacI
约 3000bp（比 M13小）
②克隆能力大能插入 10kb的外源 DNA。
③两种复制形式
①分子量小
（ 1）噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。
既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。
（ 2）常见的噬菌粒载体噬菌粒载体质粒部分 单链噬菌体部分辅助噬菌体大肠杆菌寄主
pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18
pRSA101?VX M13 M13变异株
XS127，
XS101
pUC118/
pUC119
pUC18/
pUC19
M13 M13K07 MV1184
pBS pUC f1 M13K07 XL1-Blue
辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。
（ 3） pUC118/pUC119
① 构成
1） M13的基因间隔区（ IG）
2） pUC18/pUC19质粒载体：
带有 M13复制起点。
质粒复制起点
Ampr
lacZ’
MCS
MCS
pUC18/pUC19 ori
Ampr
lacZ’ lacI
M13 ori
3.2kb
pUC118/119
② pUC118/119的复制模式两种不同的复制模式
1）双链质粒复制模式受 pUC本身的复制起点（来源于 ColE1）
的控制。
每个细胞能达到 500个拷贝。
来源于 M13的复制起点被 辅助噬菌体 的基因
II产物控制。
2）单链滚环噬菌体复制模式外壳蛋白复制蛋白辅助 M13
包装当寄主细胞被 辅助噬菌体 M13感染后。
③ 噬菌粒载体的包装
1）辅助噬菌体：
自身的 复制起点发生了突变,复制效率低下，
但感染细菌后能表达出 外壳蛋白和复制蛋白,
帮助噬菌粒载体复制。
如 M13K07等。
2）包装：
辅助噬菌体 外壳蛋白和复制蛋白噬菌粒载体 ssDNA
噬菌体
（ 4） pBluescript 噬菌粒载体（ pBS）
Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。
由 pUC质粒载体,f1噬菌体的复制起点和 T3、
T7噬菌体的启动子 组成。
② 特点
① 组成
MCS两侧分别加上 T3和 T7噬菌体的启动子 。 加入适当的噬菌体 RNA聚合酶,就可以定向体外转录 。
1）定向体外转录
2）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。
3）选择方便有 Ampr和 lacZ’，可以进行 Amp抗性选择和
Xgal-IPTG蓝白斑选择。
4）插入方便
18个单一酶切位点的 MCS
SK：表示 lacZ’的 转录方向 是沿 MCS上的
SacI? KpnI
+（ f1+）：单链 复制起始方向 背离
lacZ’，能回收 lacZ’的编码链（ +）
pBluescript SK（ +/-） /pBluescript KS（ +/-）
KS：反向（ KpnI? SacI,MCS相反）
-（ f1-）：能回收 lacZ’的非编码链（ -）
1） pBluescript SK/KS（ +/-）区分：
③ 常用的 pBluescript 载体
pBS SK+
pBS KS-
（ 5） PCR产物克隆载体 T 载体
pCR系列载体
Invitrogen公司开发的 线性 噬菌粒载体。
① 结构
pUC的质粒部分,f1噬菌体 ori,Kanr和
Ampr抗性。
MCS的中部已经切开，各有一个 3’端突出的 T。
② 特点
PCR产物往往在 3’端突出一个 A，所以能与这个载体直接连接。
pCR2.1
pCR2.1的 MCS
克隆的 PCR产物能被两侧的 EcoRI切下来回收。
pCR2.1-topo
pCR1000
Promega 公司的 T载体系列
pGEM-T vector
pTarget vector
G418抗性 可在真核生物表达外显子捕捉
T vector的克隆过程 —— 简便！
T vector PCR product
T4 DNA ligase
T T
7,噬菌体展示载体（ Phage display vector）
（ 1）噬菌体展示（ Phage display）
将外源蛋白 （ 多肽,酶,抗体,DNA结合蛋白 ）
结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白,表达于 噬菌体的外表面 。
G,P,Smith1985年发明。
丝状噬菌体（ M13,f1等）外壳颗粒的一端，
有 3-5个基因 Ⅲ 编码的蛋白质（ g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。
M13
（ 2）噬菌体展示载体的构建把外源 DNA片断插入基因 Ⅲ 的序列 前端,并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。
启动子 外源 DNA M13基因 Ⅲ
ori
M13 display vector
外源多肽四、双链噬菌体载体 —?载体
（ 1）长度为 48502 bp；
（ 2）双链线性 DNA；
（ 3）但在两端有 cos位点，可以环化。
DNA两端各有 12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为 cos位点。
1,?DNA分子的特点
cos位点（ cohensive-end site）：
DNA进入细菌体内后，可形成双链环状 DNA复制型（ RF DNA）。
噬菌体和其 DNA
DNA上有至少 61个基因,有一半是必须的,与自身的活动有关,成簇排列 。
其他约 1/3是 非必须基因 （ 位于尾部合成至阻遏之间的区段 ） 。
2,?噬菌体的基因组特点
genome(48502bp)
噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。
3,?DNA的复制模型
（ 1）?型复制
（ 2）滚环复制感染的晚期：启动滚环复制机制。
形成多联体? DNA分子。
这种多联体分子必须在 cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。
（ 1）构建原理：
4,?噬菌体载体的构建
（ 2）构建过程
①在这个非必须区内制造限制酶切点
②引进某些突变表型，作为选择标记
③突变某些基因，使它成为安全载体
④删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点
噬菌体 DNA上本身有 5个 EcoR I 和 7 个 Hind
III切点！
删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。
（ 3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型：
① 插入型载体（ insertion vectors)：
如?gt10,?gt11,?BV2,?NM540、
NM1590,?NM607
1）免疫功能失活型：
插入位点位于载体合成活性 阻遏物区域 （ cI
基因）内。
EcoR I
cI
gt10
插入导致载体不能合成阻遏物,载体 DNA不能进入溶源期,受体菌全部裂解,形成 清晰的噬菌斑 。
没有外源 DNA插入的?载体感染受体菌形成 混浊噬菌斑 。
选择标记,
如?NM1149载体的两个克隆位点（ EcoR I 和
Hind III）都是位于 cI基因内部。
2）?-半乳糖苷酶失活型载体：
在?基因组中引入了 LacZ’序列。（其上含有一个
EcoR I 克隆位点）。
感染 LacZ突变的大肠杆菌，经 IPTG的诱导，利用 X-gal的显色反应 作选择标记。
LacZ’
EcoR ICharon16A
选择标记,
② 替换型载体（ substitution vectors)
两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于
DNA的非必须区两端。
用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源 DNA片断置换。
可置换区
MCS MCS
如,? EMBL4,Charon40等。
1）? EMBL4
EMBL4的可置换片断内部还有 Sal I酶切位点。
以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。
左臂 可置换区 右臂
Ec
oR
I
Ba
mH
I
Sa
l I
Sa
l I
Ba
mH
I
Ec
oR
I
Sa
l I
Sa
l I
EMBL4
2） Charon40
Charon40的可置换片断是由 DNA短片重复构成，片断之间有 Hae I 切点 。
在克隆的时候，可以用 Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。
左臂 可置换区 右臂
MCS MCS
Charon40
Hae I
可取代片断中如果包含 LacZ’，可用 Xgal显色作筛选标记。
（ 4）?载体的筛选标记
② 插入型载体根据插入所引起的表型突变。
① 置换型载体
载体克隆策略置换型载体
DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低 。
5,?载体的体外包装在试管中与?噬菌体的 头部 和 尾部 蛋白人工装配成噬菌体颗粒,才能高效地感染细菌,把重组 DNA注入受体菌中 。
必须利用噬菌体外壳的作用！
（ 1）体外包装：
的 D基因的产物也是头部蛋白,但主要与?
DNA 进入头部和头部的成熟有关 （ 只占
20%） 。
（ 2）体外包装过程
①?噬菌体外壳蛋白的合成
E 基因
的 E 基因编码头部蛋白的主要成分
（占头部总蛋白的 70%）。
D基因
E基因突变只合成尾部蛋白和包装识别蛋白
D基因突变合成头部蛋白和尾部蛋白，
但不能聚合和包装 DNA
提取尾部蛋白提取头部和尾部蛋白重组的?载体
DNA
体外包装成活性噬菌体外源的重组?DNA载体被诱发与内源性原
DNA发生重组。
（ 3）体外包装存在的问题：
① 包装错误：
既能包装用于生产头部蛋白的 内源性原?DNA，
也能包装 重组的?DNA载体 。
② 重组：
③ 体外包装的容量限制：
必须在正常野生型容量的 75%— 105%
（ 36— 51kb） 之间。
既不能超过正常野生型容量的 5%；
又不能低于正常野生型容量的 75%
野生型?DNA的必须区是 28kb，所以?载体的最大克隆容量是 23kb。（ 实际上为 15kb）。
比一般的质粒载体的容量大的多。
（ 4）?DNA载体的优点用在真核生物基因组文库的建立。
Sau3A
BamHI
噬菌体感染细菌形成的噬菌斑
1978年 J,Collins和 B,Hohn等人发展出 cosmid vector
（ cos site-carrying plasmid)
DNA：
4— 6kb（ 1）大小
（ 2）组成
6,cosmid载体（粘粒）
cos序列和控制包装的的序列。
pBR322：
质粒的复制子抗药性基因几个限制性酶的单一位点
pHC79
由 pBR322质粒 DNA与
噬菌体 DNA的 cos位点及其控制包装作用的序列构成 。
① 具有?噬菌体的特性：
（ 3） cosmid vector的特点克隆外源 DNA后可以 体外包装 成噬菌体颗粒 。
在寄主细胞内形成环化 DNA（ 但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ） 。
② 具有质粒载体的特性：
大多带有 pMB1或 ColE1的复制子,能象质粒一样复制 。
有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。
③方便的选择：
④高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于 30kb）。
51kb-5kb=45kb
（ 4）部分 cosmid vector
Cosmid
载体复制子大小
（ kb)
选择标记克隆位点 克隆能力（ kb)
c2XB pMB1 6.8 Ampr,
Kanr
BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,
PstI,SmaI
32~45
pHC79 pMB1 6.4 Ampr,
Tetr
EcoRI,HindIII,SalI,BamHI,
PstI,CalI
29~46
pHS262 ColE1 2.8 Kanr BamHI,EcoRI,HincII 34~50
pJC74 ColE1 15.8 Ampr EcoRI,BamHI,BglII,SalI 21~37
pJC75-58 ColE1 11.4 Ampr EcoRI,BamHI,BglII 16~42
pJC74m ColE1 21 Ampr,
Kanr
BamHI 16~32
pJC720 ColE1 7.1 Elimm,
Rifr
HindIII,XmaI 11~28
Cosmid
载体复制子大小
（ kb)
选择标记克隆位点 克隆能力（ kb)
pJC81 pMB1 7.1 Ampr,
Tetr
KpnI,BamHI,HindIII,S
alI
30~46
pJB8 ColE1 5.4 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31~47
MuA-3 pMB1 4.8 Tetr PstI,EcoRI,BalI,PvuI,
PvuII
32~48
MuA-10 pMB1 4.8 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuI 32~48
pTL5 pMB1 5.6 Tetr BglII,BalI,HpaI 31~47
pMF7 pMB1 5.4 Ampr EcoRI,SalI 32~48
应用 cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组 DNA技术,叫,柯斯克隆,（ cosmid
cloning） 。
（ 5） cosmid cloning
①理论依据：
cos位点,
噬菌体的生命周期中，会产生数百个?DNA通过 cos位点连接的“多联体”分子。
“多联体”复制：
包装识别。
在包装的时候,?噬菌体具有位点特异的 末端酶（ terminase）体系 （ Ter体系），识别
cos位点，把多联体切成单个?DNA长度。
两个 cos位点之间，必须保持 38— 45kb的
DNA,Ter体系才能识别。
Ter体系：
包装限制：
① 用特定的核酸内切酶消化真核生物 DNA。
（ 6） cosmid克隆的一般过程
② 用同样的内切酶消化 cosmid载体 。
产物中将有一定比例的分子是两端各有一个 cos位点,长度 40kb左右的真核 DNA与载体的连接物 。
③ 连接切割 合适长度 的杂种 DNA连接物，并包装入噬菌体头部。
注入到细菌体内的杂种 DNA分子环化，并按质粒的方式复制。
⑤感染大肠杆菌
④ Ter体系识别并切割大质粒！
①载体片断自我连接。
②外源 DNA片断自我连接。
③多个本来不在一起的外源 DNA片断连接起来同时插入载体。
（ 7） cosmid载体克隆的缺点用 碱性磷酸酶 除去线性质粒片断 5’端的磷酸，可防止载体自体连接。
克服载体自体连接的改良方案：
① Ish-Horowice— Burke改良方案
1981年,D,Ish-Horowice和 J.F,Burke 。
（ 8） cosmid载体的改良在 BamH I位点两侧各有一个 EcoR I切点 。
1） 突出的特点：
pJB8 cosmid载体使克隆在 BamH I上的外源 DNA可被 EcoR I切下来 。
包装识别
2） Ish-Horowice— Burke方案克隆过程
HindIII SalI
SalIHindIII
BamHI
1983年 P.F,Bates和 R.A,Swift
② Bates---Swift 改良方案
a,具有两个 cos位点。
SmaI平端的连接效率低,阻止了 载体臂的自我连接,增加了外源 DNA的连接效率 。
1）特点：
b,一个 SmaI切点把两个 cos位点分开。
c,BamHI克隆位点。
c2XB cosmid载体
Bates---Swift 克隆过程：
第三节 大分子 DNA克隆载体
A.W.Murray 1983年形成基础理论,
D.T.Burke等 1987年变为现实。
一、酵母人工染色体
1,YAC的特点：
（ 1）只能在酵母细胞中扩增。
（ yeast artificial chromosome,YAC)
（ 2）克隆容量大，为 230kb-1700kb。
（ 3）构建原理，按染色体结构构建。
（ 1） DNA复制起始点（ ori）
2,染色体复制和遗传的三个基本组件：
TEL TELCENORI
（ 2）着丝粒（ centromere,cen）
（ 3）两个端粒（ telomeres,tel）
Leu
Leu-
Yeast 后代死
Leu-
Yeast 80%后代死
Leu-
Yeast 后代活
Leu-
Yeast 后代死
Leu-
Yeast 后代活
Tel Tel
（ 1）着丝粒区（ CEN）
A A
GTCACGTG
T
TGTTTCTGNTTTCCGAAA
3,YAC的组成结构酵母染色体着丝粒区的保守序列,
78-86bp
I II III
由三个区组成酵母第 3,4,6,11号染色体的着丝粒区序列：
酵母 端粒保守序列 是 (G4T2)n 重复序列。
（ 3）复制起点（ ORI）
约 100bp的自主复制序列（ ARS）。
（ 2）端粒（ TEL）
人是 TTAGGG重复序列 ;
四膜虫是 GGGTTG重复序列。
（真核生物中只有酵母菌有 ARS）
两个端粒序列 Tel。
位于 SUP4 基因内部。（ 4）克隆位点插入失活选择：
SUP4 酶失活的酵母菌落呈 红色；
不失活的菌落是白色 。
TRP1,URA3（分别位于两臂）。
细菌的复制起点 ori
和抗生素标记 Ampr
（ 5）在酵母中的标记基因
（ 6）在细菌中操作
URA3TRP1 CEN4
4,YAC克隆外源 DNA
（ 1）宿主酵母菌：
只有同时得到 YAC的 两个臂,才能在基本培养基（不加 TRP和 URA）上生长。
（ 2）选择方式
5,YAC转化过程
trp- 和 ura-
cen ura3trp1
（ 1） 存在插入子的稳定性问题 。
6,YAC的缺点：
（ 2） 同一酵母细胞内多个 YAC引起交换 。
（ 3） 转化效率低 。
（ 4） 难以制备纯的 YAC-DNA。
结合组蛋白
H,Shizuya等 1992年在大肠杆菌 F因子的基础上构建的。
（ 2）克隆容量可达 300kb。
二、细菌人工染色体（ BAC）
1,F质粒的特点：
每细胞只有一个拷贝，不会重组。
（ 4）便于提纯像提取质粒一样直接提纯。
（ 1）单拷贝复制。
（ 3）比较稳定。
（ 1） OriS和 repE控制质粒的单向复制。
（ 2） parA和 parB维持低水平质粒拷贝数。
2,BAC的组成结构
（ 3） CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点。
（ 4） loxP是 P1 Cre蛋白作用位点。
（ 5） HindIII和 BamHI是插入位点。
（ 6）两侧的 NotI可用于切下外源 DNA。
（ 7）氯霉素抗性基因 CMR
第四节 病毒载体一,反转录病毒载体
1.反转录病毒 （ ritrovirus）
属于正链 RNA病毒,显著的特点是具有 2倍体基因组 。
两个相同的 RNA分子在 5’端附近经氢键连接形成 70S RNA,这种结构可能在逆转录过程中起调节作用 。
反转录病毒结构
Influenza virusHIV
类似于真核细胞 mRNA
2,反转录病毒的基因组结构
envpolgag U3U3 U5U5cap polyA 3’
5’
LTR LTR
R R?+
Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV)
长末端重复序列 。 在病毒基因组整合中至关重要 。 整合时,整合酶在 U5-U3连接处切开双链 DNA,随机插入到宿主基因组里 。
LTR本身还具有启动子和 polyA加尾信号的功能 。
LTR：
+：组装时必需的非编码序列 。
env：外壳蛋白。
pol：反转录酶和整合酶。
gag：核心蛋白。
envpolgag U3U3 U5U5cap polyA 3’ 5’
LTR LTR
R R?+
U5,U3,5’段或 3’端独特序列。
3,反转录病毒载体构建
（ 1）删除 pol,env和 gag基因。
5’LTR?+ 外源基因 neor 3’LTR启动子
（ 2）插入标记基因（如 neor）。
（ 3）外源基因和启动子插入到?+下游。
4.反转录病毒载体的包装反转录病毒 DNA转化细胞的效率很低，必须包装成 病毒颗粒 转染细胞。
用两个 缺失了?+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。
（ 1）包装细胞系的构建
5’LTR gag 3’LTR
pol env 3’LTR5’LTR
5’LTR gag 3’LTR
pol env 3’LTR5’LTR
病毒外壳蛋白包装细胞
（ 2）载体 RNA的包装
①用载体 DNA转化包装细胞系转入的载体 DNA上带有?+,转录成的载体 RNA
就会被包装细胞中原有的 病毒外壳蛋白 识别包装成重组病毒颗粒 。
5’LTR?+ 外源基因 neor 3’LTR
高效转染靶细胞
5,反转录病毒载体的优点
（ 1）将 DNA插入宿主基因组的随机位点上。
（ 2）侵染范围广、感染率高。
（ 3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，
拷贝数目较低。
（ 4）包装的外源 DNA可达 10kb。
（ 5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。
反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。
二,DNA病毒载体腺病毒（ adenovirus）
1,腺病毒的基因组线状双链 DNA病毒,基因组中有 14个基因 。
共同特点是都带有倒置的末端重复 （ ITR）,
在病毒的复制过程中起非常重要的作用 。
（ 1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。
（ 2）宿主范围广
2,腺病毒的 优点不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。
（ 4）载体中的插入片断可达 7.5kb
（有包装容量限制）。
（ 5）腺病毒容易制备、纯化。
（ 6）基因组结构和功能了解得清楚。
（ 3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，
可以通过口服或喷雾的方式感染。
3,腺病毒载体是目前最常用的基因治疗载体之一。
（ 1）腺病毒载体的构建用同源重组的方法插入外源基因。
①删除腺病毒 DNA一些非必需区
ITR E1 ITRE3
如 E1或 E3区，增加插入能力。
E1或 E3缺失病毒。
含有 E1或 E3区 两侧的同源序列 。
在同源序列之间插入外源基因和选择标记基因。
②构建质粒载体
③把质粒切成线性
④共同转染细胞在细胞中发生同源重组，把外源 DNA加到病毒基因组中，并包装成 重组病毒颗粒 。
质粒与病毒
DNA（缺失 E1
或 E3）
4,重组腺病毒 DNA在细胞中的生存
（ 1）以游离的附加体形式存在于细胞中不能整合到细胞基因组中。基因表达时间短。
（ 2） E1是腺病毒繁殖的必需区缺失 E1的重组腺病毒必须在已经被腺病毒
（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。
（ 3） E3区对腺病毒的繁殖不是必需的缺失 E3的重组腺病毒不需要辅助病毒。
第五节 基因打靶载体（ Targeting vector）
通过 DNA同源重组,使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因 。
一、基因打靶（ gene targeting）
基因敲出（ knock-out）
基因敲入（ knock-in）
二、基因打靶载体的要求
1,要求能整合到染色体上特定的位置。
2,整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方。
3,必需整合在基因组中可以转录的区域。
定点整合
1,两段同源 DNA序列（ HB1和 HB2）
2,目的基因三、基因打靶载体组成
3,编码抗 G418的基因（ neor）
4,胸苷激酶基因（ HSV-tk1和 HSV-tk2）
与靶位点两端的区域同源新霉素（ neomycin）磷酸转移酶基因分别来自 I型和 II型单纯疱疹病毒（ HSV）。
载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体四、载体的整合方式染色体 DNA HB1 染色体 DNA HB2 染色体 DNA
载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体染色体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 染色体两个 tk基因 至少有一个 可能整合到基因组里。 细胞被
tk基因杀死 。
1,非特异整合 —— 非同源重组
2.特异位点整合 —— 同源重组载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体
HB1 neor 目的基因 HB2
染色体 DNA HB1 染色体 DNA HB2 染色体 DNA
染色体 DNA 染色体 DNA
只有目的基因和 neor基因整合进去,tk基因不会整合。 细胞在 G418中存活 。
五、转染细胞的选择正 -负选择法：
1,正选择（ positive selection）：
用 G418进行选择。
没有整合进 neor基因的细胞都被杀死。
2,负选择（ negative selection）：
用 9-鸟嘌呤 （ ganciclovir,GCV）。
表达胸苷激酶（ tk）的细胞都被杀死（ Tk能把
GCV转化成有毒的化合物 ）。
各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件第六节 用于基因转移的受体菌或细胞受体细胞应具备的条件限制性酶缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（ recB-,recC-,hsdR-
）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞 （ recA-）
不适宜在人体内或在非培养条件下生存
DNA不易转移具有接受外源 DNA的能力防止重组细菌扩散污染，生物武器除外各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源 DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是 DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素各种基因工程受体的特性枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全,生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源 DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是 DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达
DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国 仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，
具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、
基因药物的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶 ）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良遗传操作繁琐实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒,C600,W3110,HB101,JM83、
JM101（ Aps,Tcs,Cms）
用于接受?-DNA,LE392,ED8654
酵母菌哺乳动物细胞 CHO
毕赤酵母啤酒酵母复习思考题
简述基因工程对载体的要求。
Principles of Genetic Engineering
基 因 工 程 原 理湖南中医药大学 鲁耀邦基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定第四讲 基因克隆的载体与受体
vectors
在基因工程操作中，把能携带外源 DNA进入受体细胞的 DNA分子叫 载体 。
1,载体 (Vectors)
（ 1）在宿主细胞内能独立复制。
（ 2）有选择性标记。
（ 3）有一段多克隆位点。
2,基因工程对载体的要求外源 DNA插入其中不影响载体的复制。
（ 4）分子量小，拷贝数多。
（ 5）容易从宿主细胞中分离纯化。
基因工程中常用的载体有 5类：
3,载体的种类质粒 （ plasmid）
单链 DNA噬菌体 M13
噬菌体的衍生物柯斯质粒 （ cosmid）
动物病毒 （ virus）
第一节 质粒载体一、质粒（ plasmid）
是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
大肠杆菌的质粒
（ 1）分子小：
1,质粒的一般生物学特性
1— 200 kb
（ 2）编码基因少：
2— 3个中等大小的蛋白质。
（ 3）环形状：
双链环状 DNA。
（酵母的“杀伤质粒”是 RNA）。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。
（ 4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状 DNA（ cccDNA)
呈超螺旋（ SC）（ super coil）
Covalent close circular DNA
③ 线形 DNA （ linear,lDNA）
一条链上有一至数个缺口。
② 开环 DNA（ open circular,ocDNA）
（ 5）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
scDNA最快,lDNA次之,ocDNA最慢。
SC
OC
L
在大肠杆菌中的质粒，可以分为：
接合型质粒,
非接合型质粒能自我转移不能自我转移
2,质粒的类型除了带有自我 复制 所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌 配对 和质粒 接合转移 的基因。
如,F质粒（性质粒、或 F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
又叫 自我转移型质粒 。
不符合基因工程的安全要求。
（ 1）接合型质粒：
大肠杆菌接合（ conjunction）
（ 2）非接合型质粒：
虽然带有自我 复制 所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合 转移 的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
① R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种 抗生素抗性基因,使寄主获得同样的抗生素抗性性状（ resistance）。
符合基因工程的安全要求。
pBR322和 pUC18质粒及酶切位点带有控制 大肠杆菌素（ colicin） 合成的基因。
② Col质粒：
大肠杆菌素对不带 Col质粒的大肠杆菌有毒。
Col质粒或 R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。
3、质粒的复制类型
（ 1） 严紧型质粒（ stringent plasmid）
拷贝数少,只有 1-2份拷贝。
（ 2） 松弛型质粒（ relaxed plasmid）
拷贝数多,有 10-200份拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。
（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
① 分子量大，拷贝数低
4、质粒载体的构建
（ 1） 天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒 pSC101，
分子长 9.1 kb。
但只有一个 EcoR I切点充当克隆位点，
Tetr 作为筛选标志。
ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素 E1
（ colicin E1）。
② 筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗 colicin E1的细胞 …….
colicin E1能杀死不含 ColE1 质粒的菌，形成
,噬菌斑,。
唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。
ColE1
① 具有复制起点（ ORI）
（ 2） 质粒载体必须具备的基本条件
② 具有抗菌素抗性基因
③ 若干限制性内切酶的单一位点：
是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。
用来插入外源 DNA片断。且插入后不影响复制功能。
一个质粒只含一个复制子（ Replicon)。
④ 具有较小的分子量和较高的拷贝数。
⑤ 应属于松驰型质粒
⑥ 应为非传递性质粒具有较小的宿主范围。
能在氯霉素存在下大量扩增其拷贝数。
氨苄青霉素抗性（ Ampr）
卡那霉素抗性 （ Kanr）
四环素抗性 （ Tetr）
链霉素抗性 （ Strr）
氯霉素抗性 （ Cmlr）
（ 3） 质粒的选择标记及其工作原理：
选择标记
① 抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：
常用抗菌素的抗性工作原理
i）氨苄青霉素（ Ampicillin,Amp）
青霉素的衍生物。
通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，
杀死 生长的细菌 。
a）抑菌原理
b）细菌抗性原理
Ampr基因编码?-内酰胺酶,特异地切割氨苄青霉素的?-内酰胺环。
ii）氯霉素（ chloramphenicol,Cml）
通过与 50S核糖体亚基结合,干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成 。 杀死 生长的细菌 。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码 乙酰转移酶,特异地使氯霉素乙酰化而失活。
a）抑菌原理
a） 杀菌原理
iii） 卡那霉素 （ kanamycin,Kan）
通过与 70S核糖体结合,导致 mRNA发生错读 。 杀死细菌 。
b） 细菌抗性原理
Kanr 编码的 氨基糖苷磷酸转移酶,对卡那霉素进行修饰,阻断其与核糖体结合作用 。
iv）链霉素（ Streptomycin,Str）
a）杀菌原理通过与 30S核糖体亚基结合，导致 mRNA错译。 杀死细菌 。
b）细菌抗性原理
Strr 编码一种 氨基糖苷磷酸转移酶 对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体 30S亚基结合作用。
v）四环素（ Tetracycline,Tet）
b）细菌抗性原理
a）抑菌原理通过于 30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌 。
Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。
(from Molecular Biology of Gene (Fifth Edition,2004).PP.453)
② 遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。
当带有 抗菌素抗性基因 的 载体 进入受体菌后，
受体菌才能生长。
不带有 抗菌素抗性基因 的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。
抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素
(4) 人工构建的质粒载体的类型
① 高拷贝数的质粒载体
ColE1,pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点 。
而且在没有菌体蛋白质合成的条件下 （ 蛋白质合成抑制剂,氯霉素等存在下 ） 仍能复制,
达到每个细胞的拷贝数 1000— 3000个 ！
适合大量增殖克隆基因,或需要表达大量的基因产物 。
② 低拷贝数的质粒载体但有特殊用途,
由 pSC101派生来的载体特点是分子量小,拷贝数低 。
当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动,导致寄主菌死亡时,
就需要低拷贝的载体 。
pLG338,pLG339,pHSG415等不适合大量扩增 DNA用 。
③ 失控的质粒载体这是一类 温度敏感型复制控制 质粒。
温度低（低于 37 oC），拷贝数很少；
温度增加（ >40 oC）时，拷贝数会很快增加到
1000个以上。
如 pBEU1,pBEU2。
runaway plasmid vectors
1979年 B,E,Uhlin等构建。
④ 插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
如 pDF41,pDF42,pBR329。
抗菌素抗性外源 DNA
无抗菌素抗性
⑤ 正选择的质粒载体如 pUR2,pTR262等。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
直接选择转化后的细胞。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
Direct selection vectors
⑥ 表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录 — 翻译信号控制之下。
注意启动子的性质，终止子、起始密码、
终止密码的阅读正确。
复制起始点 ORI
选择标记多克隆位点 MCS
2）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因 I
操纵基因 O
启动基因 P
核糖体结合位点序列（ SD）
转录终止信号区。
1）普通载体元件
表达载体的结构
(5) 经典的大肠杆菌质粒载体
A,pSC101
第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。
a,类型 天然质粒，属低拷贝型。
b,长度 9.09 kb
c,选择标记 四环素抗性 Tetr
6个克隆位点：
EcoR I,Xho I,Pvu I,Hind III、
BamH I,Sal I
主要使用 EcoR I。
（其中 Hind III,BamH I,Sal I 3个位于选择标记 Tetr的内部）
d,克隆位点
B,ColE1
a,类型 天然质粒，属高拷贝型。
b,长度 6.3 kb。
c,选择标记大肠杆菌素（ colicin） E1和对 E1免疫的基因（ immE1）
特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后,质粒仍然能复制达到每个细胞 1000-
3000拷贝之多 ！
① colicin E1基因的结构
cea imm kil
结构基因 免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有 ColE1细菌的原因
cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的 colicin E1所杀死的原因
imm基因
EcoR I位于 E1内部，插入外源 DNA会导致 E1
失活，使受体菌不能合成 E1（ ColE1-），但仍然表现出对 E1免疫型（ ImmE1+）。
EcoR I
d,克隆位点
Colicin E1
外源 DNA
无 Colicin
用对外源 colicin E1的免疫性和自身不能合成
colicin E1作选择,操作非常繁杂 。
对 colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生抗 colicin E1的频率很高 ！
e,ColE1的选择缺陷
ColE1
抗 colicinE1
杀 ColE1-
仍抗 colicinE1
不杀 ColE1-
插入片断
ColE1
pSF2124质粒的 Ampr基因
C,pBR322
a,元件来源
F,Bolivar和 R.L,Rodriguez人工构建载体。
① 复制起点 ori
pMB1系列（来源于 ColE1）的 高拷贝 型复制起点
② Ampr基因
③ Tetr基因
pSC101的 Tetr 基因。
b,长度 4363bp
c,选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。
d,克隆位点其中 9个会导致 Tetr基因失活 （ 如 BamH I、
Hind Ⅲ,Sal I） ；
3个会导致 Ampr基因失活 （ Sca I,PvuI、
Pst I） 。
24个克隆位点。
e,pBR322的优点
① 双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞?
在 Amp或 Tet中 都 死亡。
获得载体的寄主细胞?
在 Amp或 Tet其中之一 中死亡。
外源基因?BamH I
Amp中存活但在 Tet中死亡外源基因?Pst I
Tet中存活但在 Amp中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000
拷贝
④ 安全失去了转移蛋白基因 mob（ mobilization）。
不能通过接合转移。
③ 高拷贝数
② 分子小，克隆能力大载体越小越好。
>10kb的 DNA在纯化过程中容易断裂。
保留了转移蛋白（ mob）的 作用位点 。
f,pBR322的缺点能够被 ColK质粒编码的 mob蛋白识别，如果再有 F质粒的参与，就有可能转移！
① 删除 mob识别位点
（如质粒 pBR327,pAT153等）。
pAT153：
从 pBR322上切去 HaeII片断，既除去了
mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。
g,PBR322的改进
pBR325：
在 pBR322位点上接入一段来自噬菌体
PICm的 HaeII酶切片断 （ 带有氯霉素抗性基因 cmlr） 。
cmlr上也带一个 EcoRI位点 。
使 EcoRI 也成为插入失活型位点。
② 改造 EcoR I 位点
D,pUC系列
University of California 的 J,Messing 和 J.
Vieria于 1978年,在 pBR322的基础上改造而成 。 属正选择载体 。
pUC7,pUC8,pUC9,pUC10,pUC11、
pUC18,pUC19
① 复制起点 pBR322的 ori
但其上失去了克隆位点。
② Ampr 基因
a,元件来源
③ lacZ的启动子 大肠杆菌
④ lacZ’基因大肠杆菌 lacZ的?-肽链序列,是 LacZ
的氨基端片断。
pBR322的 Ampr基因
b,长度 约 2.7kb
c,克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于 lacZ’基因的 5’端。
G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G G C A T G C A A G C T T
5 ’
3 ’
EcoRI SacI KpnI
Sm aI
Xm aI
Bam HI X baI SalI
AccI
HincII
PstI SphI Hind Ⅲ
pUC 18
l ac Z ’
A A G C T T G C A T G C C T G C A G G T C G A C T C T A G A G G A T C C C G G G G T A C C G A G C T C G A A T T C
5 ’
3 ’
EcoRISacIKpnI
Sm aI
Xm aI
Bam HI
X baI
SalI
AccI
HincII
PstI
SphIHind Ⅲ
pUC 19
l ac Z ’
Ampicillin 抗性 和 lacZ的?肽互补 （蓝白斑）相结合。
d,选择标记蓝白斑选择原理：
① X-gal
（ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-?-D-galactoside）
-半乳糖苷酶 能把无色的化合物 X-gal分解成半乳糖和一个 深蓝色 的物质 5-溴 -4-氯靛蓝 。
X-gal 半乳糖
5-溴 -4-氯靛蓝
-半乳糖苷酶
② X-gal显色反应
③ lacZ的?肽互补
1）?-肽（ lacZ’ ）：
-半乳糖苷酶 N端的一段氨基酸片断（ 11-41
氨基酸）。
lacZ只有在 4聚体的状态下才有功能,
C端大部分N端的 11-41aa
C端大部分N端的 11-41aa
C端大部分N端的 11-41aa
C端大部分N端的 11-41aa
4聚体
2）受体菌 lacZ突变（ lacZ?M15）
受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失 （ 缺失?肽 ）,不能形成 4聚体的活性酶,不能分解 X-gal
受体菌株,JM系列,TG1,TG2,XL1-blue、
XS127,XS101,KK2186,MV1184,DH5a
pUC质粒载体上的 lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶,互补,,使它能形成 4
聚体,从而能分解 X-gal,产生蓝色物质 。
C端大部分N端的 11-41aa
pUC lacZ’ 受体菌 lacZ?
3）载体 lacZ’与?互补
4）?互补的插入失活
pUC载体上 LacZ’的 5‘端有一段多克隆位点 (MCS)
区,本身虽不干扰 LacZ’的合成,但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成 。 不能互补 。
lacZ’ 5’ 3’
肽移码突变
lacZ’ 5’ 3’
肽不互补互补
MCS 外源 DNA
④ IPTG的诱导作用
IPTG(Isopropyl β -D-1-Thiogalactopyranoside,
异丙基 -β -D-硫代半乳糖苷 )是乳糖的类似物 。 能诱导 lac操纵子的启动转录,使受体菌基因组中的
lacZ 的 C端部分 和载体的 lacZ’?肽 都表达 。 从而互补 。
但载体 MCS上插入外源 DNA后，仍然不能产生?肽！
IPTG
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有
DNA插入。
MCS无插入时，互补，蓝菌斑。
MCS有插入时，不互补，白菌斑。
IPTG诱导的结果：
无质粒的受体菌
-半乳糖苷酶部分缺失,不能分解 X-gal；
无抗菌素抗性在含抗菌素和 X-gal的培养基上培养无菌斑生长质粒转化的受体菌
-半乳糖苷酶的缺失被载体产物
互补,能分解
X-gal 。 且 有抗菌素抗性在含抗菌素和 X-gal的培养基上培养有蓝色菌斑生长带外源 DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活,
不能互补?-半乳糖苷酶 的缺失 。 不能分解
X-gal,但有抗菌素抗性在含抗菌素和 X-gal的培养基上培养有白色菌斑生长
e,pUC系列载体的优点
① 更小的分子量：
如 pUC18为 2682bp,pUC8为 2750bp。
② 选择方便
X-gal显色、抗菌素双重直接选择。
③ 克隆便利具有多克隆位点（ MCS），使有两个不同粘性末端的外源 DNA方便地插入。
④ 测序方便
pUC的 MCS与 M13噬菌体载体的 MCS完全相同，
便于把外源 DNA转移到 M13载体上测序。
G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G G C A T G C A A G C T T
5 ’
3 ’
EcoRI SacI KpnI
Sm aI
Xm aI
Bam HI X baI SalI
AccI
HincII
PstI SphI Hind Ⅲ
pUC 18
l ac Z ’
M13mp18的多克隆位点
（ 6） 其它质粒载体
A,pGEM-3Z 由 pUC派生而来。
与 pUC的主要区别是在 MCS的两侧分别加了一个噬菌体 启动子 T7和 SP6。
T7启动子
SP6启动子
MCS
lacZ’
Ampr
ori
可被 T7和 SP6的 RNA聚合酶识别转录。
① 如果加入纯化的 T7或 SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录 mRNA
② 外源基因正接反接都可以转录。
③ MCS与 pUC18的完全一样。
B,pGEM-4Z
与 pGEM-3Z相同，只是 T7启动子和 SP6启动子的 位置互换 。
pGEM-3Z的特点
C,穿梭质粒载体
（ 1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
（ shuttle plasmid vectors）
Yeast复制起点E.coli复制起点
E.coli选择标记 Yeast选择标记
MCS
大肠杆菌?枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌?酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌?动物细胞穿梭载体
（ 2）常用的穿梭质粒载体
（ 3）穿梭载体的优点
② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、
哺乳动物细胞等）进行基因表达。
③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。
克隆、构建 表达
E.coli Animal cell
① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达
(7)、质粒载体的不稳定性
A,质粒稳定遗传必须的两个条件：
（ 1）每个世代、每个质粒至少要复制一次
（ 2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。
有主动分配和随机分配两种假说。
（ 1）主动分配天然质粒。
B,质粒分配方式具有一个控制质粒拷贝分配的功能区
（ Par）,能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中 。
人工构建的质粒载体 缺失了 par区,只能以随机分配方式分到子细胞中。
人工质粒。
（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）
（ 2）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。
在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。
C,分离的不稳定性 （ segregation instability）
D,结构的不稳定性 （ structural instability）
寄主基因组的 IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。
IS
dimer
重组
（ 1）新陈代谢负荷：
E,影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：
质粒载体使寄主的世代时间延长约 15%。
① 复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。
② 转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！
每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同,称差度 。
（ 2） 质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小,遗传稳定 。
差度 （ variance）,
是产生无质粒细胞的重要原因 。
高拷贝数的质粒载体差度大,拥有少量拷贝数的菌体多,发生丢失的可能性大 。
野生型 E.coli中，质粒在寄主的 重组酶 作用下会发生重组形成 二聚体质粒 。
（ 3）寄主菌的重组体系二聚体灾难（ dimer catastrophe）：
含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。
二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。
第二节 噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒（ Bacteriophage）。
一、噬菌体的一般特性结构：
蛋白质外壳内包裹着
DNA（双链、单链、
线性、环状等）。
single linear DNA (about 182,000 bp)
T2 Genomic DNA
T4 Bacteriophage
分为两种：
1,溶菌周期：
二、噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。
烈性噬菌体（ virulent phage)
2,溶原周期：
感染细菌后,将自己的 DNA整合到细菌的染色体 DNA中 。 形成这一过程称为 溶源化 （ lysogenization)。
整合到细菌染色体的噬菌体 DNA称为 原噬菌体,随细菌的染色体复制而复制。
温和噬菌体（ temperate phage)
原噬菌体（ prophage)：
三、单链噬菌体载体
M13,f1,fd 噬菌体单链环状 DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：
M13 噬菌体
（ 2）复制型（ RF）是双链环状 DNA。
1,单链 DNA噬菌体的特点
（ 3） RF DNA和 ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑。
（ 5）可产生大量的含有外源 DNA插入片断的 单链分子,便于作探针或测序。
（ 1） +DNA。（ ssDNA）
（ 4）不存在包装限制。
2,M13 噬菌体
RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。
成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。
M13噬菌体只感染 雄性 大肠杆菌。
但 M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。
6407 bp。（ 2） DNA长度
（ 3） DNA提纯
（ 1）寄主
M13
序列
（ 4） M13的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，
约为正常的 1/2— 3/4）
M13通过雄性细菌的 F性须 注入其 +DNA
+DNA合成－ DNA，形成 RF dsDNA
－ DNA转录 mRNA、合成 +DNA、翻译形成噬菌体蛋白组装成新的噬菌体 M13,挤出寄主细胞
+DNA
-DNA
mRNA
M13外壳蛋白 组装成子代 M13
+DNA
注入大肠杆菌复制转录翻译
+DNA
指导合成
+DNA
200个 RF DNA
每个细胞可以放出约 1000个
M13颗粒！
M13的包装过程：
RF dsDNA指导合成的 +DNA
M13基因 V编码单链
DNA结合蛋白
DNA-蛋白质复合物转移到寄主的细胞膜
M13外壳蛋白 基因 V蛋白脱落
+DNA溢出细胞膜包装
（ 5）没有包装限制
3,M13载体的构建：
M13基因组中只有基因 II与基因 IV之间存在一段
507bp的基因间隔区（含有 M13DNA复制起点）。
（ 1）克隆区域的选定
① 基因间隔区（ intergenic region,IG区）
IG区内只有一个 BsuI 切点。
其余 9个 BsuI限制性位点分布在其它部位。
② 酶切位点
M13
J,Messing证明,IG区存在 M13的 复制起点,但可以插入外源 DNA而不影响 M13噬菌体的活力。
在 IG区内插入一个大肠杆菌的 LacZ’（?-肽序列 )。
利用?-肽序列中的三个单一酶切位点 （ Bgl II、
Ava II 和 Pvu I） 。
（ 2）加入酶切位点
① 在 IG区内加入单一内切酶位点第一个 M13载体,M13mp1：
M13 RF
BsuI不完全消化各种长度的线性片断
（其中应有只在 IG
上切开的线性全长
M13）
E.coli lac基因的 HindII片断 (lacI,lacP,lacO、
lacZ’）
连接
M13mp1
JM101宿主只有在 IG区插入 lacZ’才能存活并在 X-gal上出现互补的蓝噬菌斑
（ 3） M13载体系列加上常用的酶切位点。
① M13载体系列的命名
M13mpn n代表系列数字
② 对 M13mp1的改进
B,Gronenborn和 J,Messing1978年把 LacZ’
5’端的第 13个核苷酸 G突变成 A，产生了一个
EcoR I切点。
M13mp2：
5’ATGACCATGATTACGGATTCA-
Me
用 N-甲基 -N-亚硝基脲 把 G甲基化
5’ATGACCATGATTACGGATTCA-
转染 E.coli。 mG与 T配对，复制两次后
5’ATGACCATGATTACGAATTCA-
EcoRI切点用 EcoRI切
M13mp1
M13mp2
选择能切开的 线性分子再环化
M13mp1
③ 对 M13mp2的进一步改进在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（ MCS）。
M13mp7,M13mp8,M13mp9,M13mp10、
M13mp11,M13mp18,M13mp19
对应有相同 MCS的 pUC系列载体：
pUC7,pUC8,pUC9,pUC10,pUC11、
pUC18,pUC19
成为 M13mp系列载体：
与 pUC18相同
M13mp18的多克隆位点
4,M13系列载体的优点
（ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段
（ 2） X-gal显色反应，可供直接选择
（ 3）无包装限制，克隆能力大
（ 4）可以克隆双链 DNA分子中的每一条链子代 M13噬菌体中包含的是单连 +DNA。
MCS+
-
+-+-
编码链非编码链 外源 DNA
不同的酶切不同的酶切插入
M13 vector
M13 RF + -
+ - + -
外源 DNA
转染 E,coli
成熟的子代 M13中+ +
① 插入外源 DNA后，遗传稳定性显著下降
② 实际克隆能力小于 1500bp。
虽无包装限制，并非无限包装！
5,M13载体的缺点
6,噬菌粒载体（ phagemid vectors）
由 质粒载体 与 单链噬菌体载体 的复制起点结合而成的新型载体系列。
MCS
噬菌体 ori
质粒 ori
Ampr
lacZ’ lacI
约 3000bp（比 M13小）
②克隆能力大能插入 10kb的外源 DNA。
③两种复制形式
①分子量小
（ 1）噬菌粒载体的特点既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。
既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。
（ 2）常见的噬菌粒载体噬菌粒载体质粒部分 单链噬菌体部分辅助噬菌体大肠杆菌寄主
pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18
pRSA101?VX M13 M13变异株
XS127，
XS101
pUC118/
pUC119
pUC18/
pUC19
M13 M13K07 MV1184
pBS pUC f1 M13K07 XL1-Blue
辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。
（ 3） pUC118/pUC119
① 构成
1） M13的基因间隔区（ IG）
2） pUC18/pUC19质粒载体：
带有 M13复制起点。
质粒复制起点
Ampr
lacZ’
MCS
MCS
pUC18/pUC19 ori
Ampr
lacZ’ lacI
M13 ori
3.2kb
pUC118/119
② pUC118/119的复制模式两种不同的复制模式
1）双链质粒复制模式受 pUC本身的复制起点（来源于 ColE1）
的控制。
每个细胞能达到 500个拷贝。
来源于 M13的复制起点被 辅助噬菌体 的基因
II产物控制。
2）单链滚环噬菌体复制模式外壳蛋白复制蛋白辅助 M13
包装当寄主细胞被 辅助噬菌体 M13感染后。
③ 噬菌粒载体的包装
1）辅助噬菌体：
自身的 复制起点发生了突变,复制效率低下，
但感染细菌后能表达出 外壳蛋白和复制蛋白,
帮助噬菌粒载体复制。
如 M13K07等。
2）包装：
辅助噬菌体 外壳蛋白和复制蛋白噬菌粒载体 ssDNA
噬菌体
（ 4） pBluescript 噬菌粒载体（ pBS）
Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。
由 pUC质粒载体,f1噬菌体的复制起点和 T3、
T7噬菌体的启动子 组成。
② 特点
① 组成
MCS两侧分别加上 T3和 T7噬菌体的启动子 。 加入适当的噬菌体 RNA聚合酶,就可以定向体外转录 。
1）定向体外转录
2）两种复制模式既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。
3）选择方便有 Ampr和 lacZ’，可以进行 Amp抗性选择和
Xgal-IPTG蓝白斑选择。
4）插入方便
18个单一酶切位点的 MCS
SK：表示 lacZ’的 转录方向 是沿 MCS上的
SacI? KpnI
+（ f1+）：单链 复制起始方向 背离
lacZ’，能回收 lacZ’的编码链（ +）
pBluescript SK（ +/-） /pBluescript KS（ +/-）
KS：反向（ KpnI? SacI,MCS相反）
-（ f1-）：能回收 lacZ’的非编码链（ -）
1） pBluescript SK/KS（ +/-）区分：
③ 常用的 pBluescript 载体
pBS SK+
pBS KS-
（ 5） PCR产物克隆载体 T 载体
pCR系列载体
Invitrogen公司开发的 线性 噬菌粒载体。
① 结构
pUC的质粒部分,f1噬菌体 ori,Kanr和
Ampr抗性。
MCS的中部已经切开，各有一个 3’端突出的 T。
② 特点
PCR产物往往在 3’端突出一个 A，所以能与这个载体直接连接。
pCR2.1
pCR2.1的 MCS
克隆的 PCR产物能被两侧的 EcoRI切下来回收。
pCR2.1-topo
pCR1000
Promega 公司的 T载体系列
pGEM-T vector
pTarget vector
G418抗性 可在真核生物表达外显子捕捉
T vector的克隆过程 —— 简便！
T vector PCR product
T4 DNA ligase
T T
7,噬菌体展示载体（ Phage display vector）
（ 1）噬菌体展示（ Phage display）
将外源蛋白 （ 多肽,酶,抗体,DNA结合蛋白 ）
结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白,表达于 噬菌体的外表面 。
G,P,Smith1985年发明。
丝状噬菌体（ M13,f1等）外壳颗粒的一端，
有 3-5个基因 Ⅲ 编码的蛋白质（ g3p），在识别和吸附大肠杆菌的过程中起作用。
M13
（ 2）噬菌体展示载体的构建把外源 DNA片断插入基因 Ⅲ 的序列 前端,并保持两者的阅读框正确，表达出融合蛋白。
启动子 外源 DNA M13基因 Ⅲ
ori
M13 display vector
外源多肽四、双链噬菌体载体 —?载体
（ 1）长度为 48502 bp；
（ 2）双链线性 DNA；
（ 3）但在两端有 cos位点，可以环化。
DNA两端各有 12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为 cos位点。
1,?DNA分子的特点
cos位点（ cohensive-end site）：
DNA进入细菌体内后，可形成双链环状 DNA复制型（ RF DNA）。
噬菌体和其 DNA
DNA上有至少 61个基因,有一半是必须的,与自身的活动有关,成簇排列 。
其他约 1/3是 非必须基因 （ 位于尾部合成至阻遏之间的区段 ） 。
2,?噬菌体的基因组特点
genome(48502bp)
噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。
3,?DNA的复制模型
（ 1）?型复制
（ 2）滚环复制感染的晚期：启动滚环复制机制。
形成多联体? DNA分子。
这种多联体分子必须在 cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。
（ 1）构建原理：
4,?噬菌体载体的构建
（ 2）构建过程
①在这个非必须区内制造限制酶切点
②引进某些突变表型，作为选择标记
③突变某些基因，使它成为安全载体
④删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点
噬菌体 DNA上本身有 5个 EcoR I 和 7 个 Hind
III切点！
删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。
（ 3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型：
① 插入型载体（ insertion vectors)：
如?gt10,?gt11,?BV2,?NM540、
NM1590,?NM607
1）免疫功能失活型：
插入位点位于载体合成活性 阻遏物区域 （ cI
基因）内。
EcoR I
cI
gt10
插入导致载体不能合成阻遏物,载体 DNA不能进入溶源期,受体菌全部裂解,形成 清晰的噬菌斑 。
没有外源 DNA插入的?载体感染受体菌形成 混浊噬菌斑 。
选择标记,
如?NM1149载体的两个克隆位点（ EcoR I 和
Hind III）都是位于 cI基因内部。
2）?-半乳糖苷酶失活型载体：
在?基因组中引入了 LacZ’序列。（其上含有一个
EcoR I 克隆位点）。
感染 LacZ突变的大肠杆菌，经 IPTG的诱导，利用 X-gal的显色反应 作选择标记。
LacZ’
EcoR ICharon16A
选择标记,
② 替换型载体（ substitution vectors)
两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于
DNA的非必须区两端。
用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源 DNA片断置换。
可置换区
MCS MCS
如,? EMBL4,Charon40等。
1）? EMBL4
EMBL4的可置换片断内部还有 Sal I酶切位点。
以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。
左臂 可置换区 右臂
Ec
oR
I
Ba
mH
I
Sa
l I
Sa
l I
Ba
mH
I
Ec
oR
I
Sa
l I
Sa
l I
EMBL4
2） Charon40
Charon40的可置换片断是由 DNA短片重复构成，片断之间有 Hae I 切点 。
在克隆的时候，可以用 Hae I 酶进一步将可置换片断切成小片断，以防止重新与载体连接。
左臂 可置换区 右臂
MCS MCS
Charon40
Hae I
可取代片断中如果包含 LacZ’，可用 Xgal显色作筛选标记。
（ 4）?载体的筛选标记
② 插入型载体根据插入所引起的表型突变。
① 置换型载体
载体克隆策略置换型载体
DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低 。
5,?载体的体外包装在试管中与?噬菌体的 头部 和 尾部 蛋白人工装配成噬菌体颗粒,才能高效地感染细菌,把重组 DNA注入受体菌中 。
必须利用噬菌体外壳的作用！
（ 1）体外包装：
的 D基因的产物也是头部蛋白,但主要与?
DNA 进入头部和头部的成熟有关 （ 只占
20%） 。
（ 2）体外包装过程
①?噬菌体外壳蛋白的合成
E 基因
的 E 基因编码头部蛋白的主要成分
（占头部总蛋白的 70%）。
D基因
E基因突变只合成尾部蛋白和包装识别蛋白
D基因突变合成头部蛋白和尾部蛋白，
但不能聚合和包装 DNA
提取尾部蛋白提取头部和尾部蛋白重组的?载体
DNA
体外包装成活性噬菌体外源的重组?DNA载体被诱发与内源性原
DNA发生重组。
（ 3）体外包装存在的问题：
① 包装错误：
既能包装用于生产头部蛋白的 内源性原?DNA，
也能包装 重组的?DNA载体 。
② 重组：
③ 体外包装的容量限制：
必须在正常野生型容量的 75%— 105%
（ 36— 51kb） 之间。
既不能超过正常野生型容量的 5%；
又不能低于正常野生型容量的 75%
野生型?DNA的必须区是 28kb，所以?载体的最大克隆容量是 23kb。（ 实际上为 15kb）。
比一般的质粒载体的容量大的多。
（ 4）?DNA载体的优点用在真核生物基因组文库的建立。
Sau3A
BamHI
噬菌体感染细菌形成的噬菌斑
1978年 J,Collins和 B,Hohn等人发展出 cosmid vector
（ cos site-carrying plasmid)
DNA：
4— 6kb（ 1）大小
（ 2）组成
6,cosmid载体（粘粒）
cos序列和控制包装的的序列。
pBR322：
质粒的复制子抗药性基因几个限制性酶的单一位点
pHC79
由 pBR322质粒 DNA与
噬菌体 DNA的 cos位点及其控制包装作用的序列构成 。
① 具有?噬菌体的特性：
（ 3） cosmid vector的特点克隆外源 DNA后可以 体外包装 成噬菌体颗粒 。
在寄主细胞内形成环化 DNA（ 但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ） 。
② 具有质粒载体的特性：
大多带有 pMB1或 ColE1的复制子,能象质粒一样复制 。
有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。
③方便的选择：
④高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于 30kb）。
51kb-5kb=45kb
（ 4）部分 cosmid vector
Cosmid
载体复制子大小
（ kb)
选择标记克隆位点 克隆能力（ kb)
c2XB pMB1 6.8 Ampr,
Kanr
BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,
PstI,SmaI
32~45
pHC79 pMB1 6.4 Ampr,
Tetr
EcoRI,HindIII,SalI,BamHI,
PstI,CalI
29~46
pHS262 ColE1 2.8 Kanr BamHI,EcoRI,HincII 34~50
pJC74 ColE1 15.8 Ampr EcoRI,BamHI,BglII,SalI 21~37
pJC75-58 ColE1 11.4 Ampr EcoRI,BamHI,BglII 16~42
pJC74m ColE1 21 Ampr,
Kanr
BamHI 16~32
pJC720 ColE1 7.1 Elimm,
Rifr
HindIII,XmaI 11~28
Cosmid
载体复制子大小
（ kb)
选择标记克隆位点 克隆能力（ kb)
pJC81 pMB1 7.1 Ampr,
Tetr
KpnI,BamHI,HindIII,S
alI
30~46
pJB8 ColE1 5.4 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31~47
MuA-3 pMB1 4.8 Tetr PstI,EcoRI,BalI,PvuI,
PvuII
32~48
MuA-10 pMB1 4.8 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuI 32~48
pTL5 pMB1 5.6 Tetr BglII,BalI,HpaI 31~47
pMF7 pMB1 5.4 Ampr EcoRI,SalI 32~48
应用 cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组 DNA技术,叫,柯斯克隆,（ cosmid
cloning） 。
（ 5） cosmid cloning
①理论依据：
cos位点,
噬菌体的生命周期中，会产生数百个?DNA通过 cos位点连接的“多联体”分子。
“多联体”复制：
包装识别。
在包装的时候,?噬菌体具有位点特异的 末端酶（ terminase）体系 （ Ter体系），识别
cos位点，把多联体切成单个?DNA长度。
两个 cos位点之间，必须保持 38— 45kb的
DNA,Ter体系才能识别。
Ter体系：
包装限制：
① 用特定的核酸内切酶消化真核生物 DNA。
（ 6） cosmid克隆的一般过程
② 用同样的内切酶消化 cosmid载体 。
产物中将有一定比例的分子是两端各有一个 cos位点,长度 40kb左右的真核 DNA与载体的连接物 。
③ 连接切割 合适长度 的杂种 DNA连接物，并包装入噬菌体头部。
注入到细菌体内的杂种 DNA分子环化，并按质粒的方式复制。
⑤感染大肠杆菌
④ Ter体系识别并切割大质粒！
①载体片断自我连接。
②外源 DNA片断自我连接。
③多个本来不在一起的外源 DNA片断连接起来同时插入载体。
（ 7） cosmid载体克隆的缺点用 碱性磷酸酶 除去线性质粒片断 5’端的磷酸，可防止载体自体连接。
克服载体自体连接的改良方案：
① Ish-Horowice— Burke改良方案
1981年,D,Ish-Horowice和 J.F,Burke 。
（ 8） cosmid载体的改良在 BamH I位点两侧各有一个 EcoR I切点 。
1） 突出的特点：
pJB8 cosmid载体使克隆在 BamH I上的外源 DNA可被 EcoR I切下来 。
包装识别
2） Ish-Horowice— Burke方案克隆过程
HindIII SalI
SalIHindIII
BamHI
1983年 P.F,Bates和 R.A,Swift
② Bates---Swift 改良方案
a,具有两个 cos位点。
SmaI平端的连接效率低,阻止了 载体臂的自我连接,增加了外源 DNA的连接效率 。
1）特点：
b,一个 SmaI切点把两个 cos位点分开。
c,BamHI克隆位点。
c2XB cosmid载体
Bates---Swift 克隆过程：
第三节 大分子 DNA克隆载体
A.W.Murray 1983年形成基础理论,
D.T.Burke等 1987年变为现实。
一、酵母人工染色体
1,YAC的特点：
（ 1）只能在酵母细胞中扩增。
（ yeast artificial chromosome,YAC)
（ 2）克隆容量大，为 230kb-1700kb。
（ 3）构建原理，按染色体结构构建。
（ 1） DNA复制起始点（ ori）
2,染色体复制和遗传的三个基本组件：
TEL TELCENORI
（ 2）着丝粒（ centromere,cen）
（ 3）两个端粒（ telomeres,tel）
Leu
Leu-
Yeast 后代死
Leu-
Yeast 80%后代死
Leu-
Yeast 后代活
Leu-
Yeast 后代死
Leu-
Yeast 后代活
Tel Tel
（ 1）着丝粒区（ CEN）
A A
GTCACGTG
T
TGTTTCTGNTTTCCGAAA
3,YAC的组成结构酵母染色体着丝粒区的保守序列,
78-86bp
I II III
由三个区组成酵母第 3,4,6,11号染色体的着丝粒区序列：
酵母 端粒保守序列 是 (G4T2)n 重复序列。
（ 3）复制起点（ ORI）
约 100bp的自主复制序列（ ARS）。
（ 2）端粒（ TEL）
人是 TTAGGG重复序列 ;
四膜虫是 GGGTTG重复序列。
（真核生物中只有酵母菌有 ARS）
两个端粒序列 Tel。
位于 SUP4 基因内部。（ 4）克隆位点插入失活选择：
SUP4 酶失活的酵母菌落呈 红色；
不失活的菌落是白色 。
TRP1,URA3（分别位于两臂）。
细菌的复制起点 ori
和抗生素标记 Ampr
（ 5）在酵母中的标记基因
（ 6）在细菌中操作
URA3TRP1 CEN4
4,YAC克隆外源 DNA
（ 1）宿主酵母菌：
只有同时得到 YAC的 两个臂,才能在基本培养基（不加 TRP和 URA）上生长。
（ 2）选择方式
5,YAC转化过程
trp- 和 ura-
cen ura3trp1
（ 1） 存在插入子的稳定性问题 。
6,YAC的缺点：
（ 2） 同一酵母细胞内多个 YAC引起交换 。
（ 3） 转化效率低 。
（ 4） 难以制备纯的 YAC-DNA。
结合组蛋白
H,Shizuya等 1992年在大肠杆菌 F因子的基础上构建的。
（ 2）克隆容量可达 300kb。
二、细菌人工染色体（ BAC）
1,F质粒的特点：
每细胞只有一个拷贝，不会重组。
（ 4）便于提纯像提取质粒一样直接提纯。
（ 1）单拷贝复制。
（ 3）比较稳定。
（ 1） OriS和 repE控制质粒的单向复制。
（ 2） parA和 parB维持低水平质粒拷贝数。
2,BAC的组成结构
（ 3） CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点。
（ 4） loxP是 P1 Cre蛋白作用位点。
（ 5） HindIII和 BamHI是插入位点。
（ 6）两侧的 NotI可用于切下外源 DNA。
（ 7）氯霉素抗性基因 CMR
第四节 病毒载体一,反转录病毒载体
1.反转录病毒 （ ritrovirus）
属于正链 RNA病毒,显著的特点是具有 2倍体基因组 。
两个相同的 RNA分子在 5’端附近经氢键连接形成 70S RNA,这种结构可能在逆转录过程中起调节作用 。
反转录病毒结构
Influenza virusHIV
类似于真核细胞 mRNA
2,反转录病毒的基因组结构
envpolgag U3U3 U5U5cap polyA 3’
5’
LTR LTR
R R?+
Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV)
长末端重复序列 。 在病毒基因组整合中至关重要 。 整合时,整合酶在 U5-U3连接处切开双链 DNA,随机插入到宿主基因组里 。
LTR本身还具有启动子和 polyA加尾信号的功能 。
LTR：
+：组装时必需的非编码序列 。
env：外壳蛋白。
pol：反转录酶和整合酶。
gag：核心蛋白。
envpolgag U3U3 U5U5cap polyA 3’ 5’
LTR LTR
R R?+
U5,U3,5’段或 3’端独特序列。
3,反转录病毒载体构建
（ 1）删除 pol,env和 gag基因。
5’LTR?+ 外源基因 neor 3’LTR启动子
（ 2）插入标记基因（如 neor）。
（ 3）外源基因和启动子插入到?+下游。
4.反转录病毒载体的包装反转录病毒 DNA转化细胞的效率很低，必须包装成 病毒颗粒 转染细胞。
用两个 缺失了?+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。
（ 1）包装细胞系的构建
5’LTR gag 3’LTR
pol env 3’LTR5’LTR
5’LTR gag 3’LTR
pol env 3’LTR5’LTR
病毒外壳蛋白包装细胞
（ 2）载体 RNA的包装
①用载体 DNA转化包装细胞系转入的载体 DNA上带有?+,转录成的载体 RNA
就会被包装细胞中原有的 病毒外壳蛋白 识别包装成重组病毒颗粒 。
5’LTR?+ 外源基因 neor 3’LTR
高效转染靶细胞
5,反转录病毒载体的优点
（ 1）将 DNA插入宿主基因组的随机位点上。
（ 2）侵染范围广、感染率高。
（ 3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，
拷贝数目较低。
（ 4）包装的外源 DNA可达 10kb。
（ 5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。
反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。
二,DNA病毒载体腺病毒（ adenovirus）
1,腺病毒的基因组线状双链 DNA病毒,基因组中有 14个基因 。
共同特点是都带有倒置的末端重复 （ ITR）,
在病毒的复制过程中起非常重要的作用 。
（ 1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。
（ 2）宿主范围广
2,腺病毒的 优点不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。
（ 4）载体中的插入片断可达 7.5kb
（有包装容量限制）。
（ 5）腺病毒容易制备、纯化。
（ 6）基因组结构和功能了解得清楚。
（ 3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，
可以通过口服或喷雾的方式感染。
3,腺病毒载体是目前最常用的基因治疗载体之一。
（ 1）腺病毒载体的构建用同源重组的方法插入外源基因。
①删除腺病毒 DNA一些非必需区
ITR E1 ITRE3
如 E1或 E3区，增加插入能力。
E1或 E3缺失病毒。
含有 E1或 E3区 两侧的同源序列 。
在同源序列之间插入外源基因和选择标记基因。
②构建质粒载体
③把质粒切成线性
④共同转染细胞在细胞中发生同源重组，把外源 DNA加到病毒基因组中，并包装成 重组病毒颗粒 。
质粒与病毒
DNA（缺失 E1
或 E3）
4,重组腺病毒 DNA在细胞中的生存
（ 1）以游离的附加体形式存在于细胞中不能整合到细胞基因组中。基因表达时间短。
（ 2） E1是腺病毒繁殖的必需区缺失 E1的重组腺病毒必须在已经被腺病毒
（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。
（ 3） E3区对腺病毒的繁殖不是必需的缺失 E3的重组腺病毒不需要辅助病毒。
第五节 基因打靶载体（ Targeting vector）
通过 DNA同源重组,使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基因 。
一、基因打靶（ gene targeting）
基因敲出（ knock-out）
基因敲入（ knock-in）
二、基因打靶载体的要求
1,要求能整合到染色体上特定的位置。
2,整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方。
3,必需整合在基因组中可以转录的区域。
定点整合
1,两段同源 DNA序列（ HB1和 HB2）
2,目的基因三、基因打靶载体组成
3,编码抗 G418的基因（ neor）
4,胸苷激酶基因（ HSV-tk1和 HSV-tk2）
与靶位点两端的区域同源新霉素（ neomycin）磷酸转移酶基因分别来自 I型和 II型单纯疱疹病毒（ HSV）。
载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体四、载体的整合方式染色体 DNA HB1 染色体 DNA HB2 染色体 DNA
载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体染色体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 染色体两个 tk基因 至少有一个 可能整合到基因组里。 细胞被
tk基因杀死 。
1,非特异整合 —— 非同源重组
2.特异位点整合 —— 同源重组载体 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 载体
HB1 neor 目的基因 HB2
染色体 DNA HB1 染色体 DNA HB2 染色体 DNA
染色体 DNA 染色体 DNA
只有目的基因和 neor基因整合进去,tk基因不会整合。 细胞在 G418中存活 。
五、转染细胞的选择正 -负选择法：
1,正选择（ positive selection）：
用 G418进行选择。
没有整合进 neor基因的细胞都被杀死。
2,负选择（ negative selection）：
用 9-鸟嘌呤 （ ganciclovir,GCV）。
表达胸苷激酶（ tk）的细胞都被杀死（ Tk能把
GCV转化成有毒的化合物 ）。
各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件第六节 用于基因转移的受体菌或细胞受体细胞应具备的条件限制性酶缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（ recB-,recC-,hsdR-
）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞 （ recA-）
不适宜在人体内或在非培养条件下生存
DNA不易转移具有接受外源 DNA的能力防止重组细菌扩散污染，生物武器除外各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源 DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是 DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产结构复杂、种类繁多的内毒素各种基因工程受体的特性枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全,生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源 DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是 DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达
DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性哺乳动物细胞（中国 仓鼠卵巢细胞 CHO）
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，
具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、
基因药物的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶 ）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良遗传操作繁琐实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒,C600,W3110,HB101,JM83、
JM101（ Aps,Tcs,Cms）
用于接受?-DNA,LE392,ED8654
酵母菌哺乳动物细胞 CHO
毕赤酵母啤酒酵母复习思考题
简述基因工程对载体的要求。
