湖南中医药大学研究生选修课
Principles of Genetic Engineering
基 因 工 程 原 理湖南中医药大学 鲁耀邦基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶核酸外切酶核酸修饰酶第三讲 基因工程的酶学基础单链 DNA内切酶核酸酶 (nuclease),通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键,从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶 。 其中专门水解断裂 RNA 分子的叫做 核糖核酸酶
(RNase),而特异水解断裂 DNA分子的则叫做 脱氧核糖核酸酶 (DNase)。
按水解断裂核酸分子的方式不同,可分为两种类型：一类是从核酸分子的末端开始,一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,叫 核酸外切酶 (exonuclease)；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段,叫 核酸内切酶
(endonuclease)。
第一节 限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能限制性核酸内切酶 (Restriction endonuclease)是一类能够识别 双链 DNA分子中的某种 特定核苷酸序列 (4-
8bp),并由此处 切割 DNA双链 的核酸 内切酶 。
第一节 限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能据 1994年美国出版的,分子生物学百科全书,统计,
仅 II型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了 2300种以上,可识别 230种不同的 DNA序列 。
2,性质内切酶。
主要是从原核生物中分离纯化出来。
即在核酸分子链的 内部 制造切口的酶。
帮助细菌限制外来 DNA的入侵
3,功能细菌的限制和修饰系统（ R/M体系）
1,来源限制性内切酶将侵入细菌体内的 外源 DNA切成小片断。
（ 1）限制（ Restriction）
细菌自身的 DNA碱基被 甲基化酶 甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
（ 2）修饰（ Modification）
① Dam甲基化酶
GATC 腺嘌呤 N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶
CCAGG或 CCTGG序列在第二个 C上 C5
位置上引入甲基
Enzyme Sequence Dam Dcm CpG
Aat II GACGTC ● ● ■
Acc I GTMKAC ● ● □ ol
Acc65 I GGTACC ● □ scol □ scol
Aci I CCGC ● ● ■
Acl I AACGTT ● ● ■
Acu I CTGAAG(16/14) ● ● ●
Afe I AGCGCT ● ● ■
Afl II CTTAAG ● ● ●
Afl III ACRYGT ● ● ●
Age I ACCGGT ● ● ■
Ahd I GACNNNNNGTC ● ● □ scol
图标说明,● 不敏感 ■ 完全阻断 □ scol某些重叠组合后被阻断 □ ol重叠性阻断 ◆ 阻碍 ◇ ol重叠性阻碍
◇ scol某些重叠组合后被阻碍
Refer,http://rebase.neb.com/rebase/
I 型限制性内切酶目前鉴定出 三种不同类型 的限制性内切酶。
二、限制性内切酶的类型
II 型限制性内切酶
III型限制性内切酶首先由 M,Meselson和 R,Yuan在 1968年从大肠杆菌 B株 和 K株 分离的。
（ 1）识别位点序列
EcoB,TGA(N)8TGCT
EcoK,AAC(N)6GTGC
1,I型限制性内切酶如 EcoB和 EcoK。
未甲基化修饰的特异序列。
需 ATP,Mg2+和 SAM（ S-腺苷蛋氨酸）。
（ 3）作用机理在距离特异性识别位点约 1000— 1500 bp处 随机 切开一条 单链 。
Recognize site cut
1-1.5kb
（ 2）切割位点
1970年,H.O,Smith和 K.W,Wilcox首先从流感嗜血杆菌 d株中分离出来。
（ 1）识别位点序列未甲基化修饰 的 双链 DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。
与 DNA的来源无关。
2,II型限制性内切酶分离的第一个酶是 Hind II，其次是 Hind III
EcoR I 5’-G?AATTC-3’
3’-CTTAA?G-5’
Pst I 5’-CTGCA?G-3’
3’-G?ACGTC-5’
产生粘性末端
EcoR V 5’-GAT?ATC-3’
3’-CTA?TAG-5’
产生平齐末端
（ 2）切割位点切开 双链 DNA。形成 粘性末端 （ sticky end）或平齐末端 （ blunt end）。如：
识别位点处。
（ 3）粘性末端（ sticky ends,cohensive ends）
含有几个核苷酸 单链 的末端。
分两种类型：
① 5’端凸出（如 EcoR I切点）
G?AATTC
CTTAA G
G AATTC
CTTAA?G
5’- -3’
3’- -5’
5’- -3’
3’- -5’
EcoR I等产生的 5‘粘性末端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoR I 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
OH P
OHP
CTGCA?G
② 3’端凸出（如 Pst I切点）
G?ACGTC
5’- -3’
3’- -5’
5’- -3’
3’- -5’
CTGCA G
G ACGTC
Pst I等产生的 3‘粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ Pst I 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ 退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
① 连接便利
（ 3）粘性末端的意义
i）不同的 DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
ii）同一个 DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接成 环形分子 。
这比连接两个平齐末端容易的多。
③ 补平成平齐末端凸出的 3’端 可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或 TTT等）造成人工粘性末端。
② 5’末端标记凸出的 5’末端 可用 DNA多核苷酸激酶进行 32P
标记。
粘性末端可以用 DNA聚合酶补平成平齐末端。
Pvu II等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
Pvu II 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
识别位点的序列相同的限制性内切酶。
（ 4）同裂酶 (Isoschizomers)
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。
如 Hind Ⅲ 和 Hsu I。
Hind Ⅲ 5’-A?AGCTT-3’
3’-TTCGA?A-5’
Hsu I 5’-A?AGCTT-3’
3’-TTCGA?A-5’
Xma I 5’-C?CCGGG -3’
3’-GGGCC?C-5’
Sma I 5’-CCC?GGG-3’
3’-GGG?CCC-5’
识别位点相同，但切点不同。
如 Xma I 和 Sma I。
② 不完全同裂酶：
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如
BamH I,Bgl Ⅱ,Bcl I,Xho Ⅱ 等
（ 5）同尾酶 (Isocaudamers）
5’-G?GATCC-3’
3’-CCTAG?G-5’
BamH I
Bcl I 5’-T?GATCA-3’ 3’-ACTAG?T-5’
5’-A?GATCT-3’
3’-TCTAG?A-5’ Bgl Ⅱ
5’-U?GATCY-3’
3’-YCTAG?U-5’ Xho Ⅱ
U代表嘌呤； Y代表嘧啶。
5’-?GATC----3’
3’----CTAG?-5’Sau 3A
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能 再被原来的酶识别。？
5’-G
3’-CCTAG
GATCT-3’
A-5’ BamH I Bgl Ⅱ
5’-GGATCT-3’
3’-CCTAGA-5’ BamH I Bgl Ⅱ
Sau 3A
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度,pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。
（ 6）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（ *）活性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。
① 星号（ *）活性
EcoR I和 BamH I等都有 *活性。
在低盐、高 pH（ >8）时可识别和切割
GAATTA,AAATTC,GAGTTC等
GAATTCEcoR I：
使用的时候要特别注意！
在离它的 不对称识别位点 一侧的 特定距离 处切割 DNA双链。
（ 7） Ⅱ s型限制性内切酶移动切割（ shifted cleavage):
GACGCNNNNN?
Hga I
CTGCGNNNNNNNNNN?
5’
3’
3,III型限制性内切酶在完全确定的位点切割 DNA,但反应需要
ATP,Mg2+和 SAM (S-腺苷蛋氨酸 )的激活作用 。
在基因工程操作中用途不大。
EcoP1,AGACC
EcoP15,CAGCAG
核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性 I型内切酶 II型内切酶 III型内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶 内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构
3种不同的亚基 单一成分 2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子
ATP,Mg2+和 SAM Mg2+ ATP,Mg2+和
SAM
寄主特异性位点识别序列
EcoB：
TGA(N)8TGCT
EcoK：
AAC(N)6GTGC
回文序列，旋转对称
（ IIs型除外）
EcoP1,
AGACC
EcoP15,
CAGCAG
切割位点 在距离识别位点至少 1000 bp处随机切开一条单链。
位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点 3‘端
24-26bp处酶催转换 不能 能 能
DNA易位作用 能 不能 不能甲基化作用的位点 寄主特异性位点 寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能 能 能序列特异的切割 不是 是 是基因工程中的用途 无用 十分有用 用处不大
1973年 H.O Smith和 D,Nathans提议的命名系统，命名原则如下：
三、限制性内切酶的命名
1.用 属名 的第一个字母和 种名 的头两个字母组成 3
个字母的略语表示 寄主菌 的物种名。
大肠杆菌 （ Escherichia coli） 用 Eco表示；
流感嗜血菌 （ Haemophilus influenzae） 用 Hin表示 。
4,限制酶前面要带上 R（ Restriction),修饰酶前面要带上 M（ Modification）。（现已省略）。
2,用一个右下标的大写字母表示 菌株或型 。 如 Ecok,
EcoR（ 现在都写成平行,如 EcoRI） 。
3,如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统,用罗马字母表示 。 如 EcoR I,EcoR V。
大部分 II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：
Tris-HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl 0 - 150 mM
DTT 1 mM
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
150 mM 高盐酶
Volume 20 - 100 ml
T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性,在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准 DNA所需的酶量四,II 型限制性内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
5‘ … GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’
BamHI SmaI
5‘ … GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’
5‘ … GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
四,II 型限制性内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4
2.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心 10分钟、干燥四,II 型限制性内切酶酶解反应的操作
DNA中的杂质如蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、
SDS,EDTA,NaCl等都会影响酶的活性。
1,DNA的纯度五、影响限制性内切酶活性的因素
①纯化 DNA
② 加大酶的用量,1mg DNA 用 10U 酶
③延长保温时间
④ 扩大反应体积（ >20ml）
一般采取大肠杆菌中的 dam甲基化酶在 5‘ GATC3’序列中的腺 嘌呤 N6位引入甲基，受其影响的酶有 Bcl I,MboI等，但 BamH I、
Bgl II,Sau3A I不受影响大肠杆菌中的 dcm甲基化酶在 5‘ CCAGG3’或 5‘ CCTGG3’序列 中的 胞嘧啶 C5位 上引入甲基,受其影响的酶有 EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在 5‘ CG3’序列中的 C5位 上引入甲基
2,DNA的甲基化程度基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是 37 oC，少数要求 40-65 oC。
酶 最适温度 oC
酶 最适温度 oC
酶 最适温度 oC
Apa I
Bcl I
Mae II
Taq I
30
50
50
65
Apy I
BstE II
Mae III
30
60
55
Ban I
Mae I
Sma I
50
45
25
3,温度是影响限制酶活性的重要因素 。
4,缓冲液 (Buffer)
缓冲液的化学组成
MgCl2,NaCl/KCl,提供 Mg2+和离子强度；
Tris-HCl,维持 pH；
二硫苏糖醇 （ DTT）,保持酶稳定性；
牛血清白蛋白 BSA等：有助于酶的稳定；
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液 。
核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端
pH值 等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的 Star activity现象。
EcoR I在正常条件下识别并切割 5‘ GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过 5%（ v/v） 时，也可切割
5‘ PuPuATPyPy3’或者 5‘ AATT3’
五、限制性内切酶对 DNA的消化
1,内切酶与识别序列的结合模式
1986年 J.A,McClarin等通过 X射线晶体衍射发现 II型限制性内切酶是以 同型二聚体 的形式与靶序列结合。
GAATTC
CTTAAG
内切酶在 DNA上的 所有 识别位点都被切开。
2,完全消化
1 2 3 4
1 2 3 4
只有有限数量的酶切位点被切开。
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
3,局部消化
1 2 3 4
1 4
5,几种常用限制酶识别位点大多数酶可用 65 oC温育 5分钟失活。
或用 乙醇 沉淀 DNA。
4,限制酶酶切反应的终止
6,限制性内切酶识别序列的交叉列表
AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
****
**?** MaeII HpaⅡ c
MspIc
***?* Alu I
****?
A?****T Nla Ⅲ
A*?***T ApoI Hind
Ⅲ
Afl III AgeI
BsrFI
A**?**T
A***?*T SspI
A****?T
AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
A****?T Nsp752
4
C?****G NcoI
StyI
Dsa I
XmaI
AvaI
C*?***G NdeI
C**?**G Pml I
BsaAI
PvuII
NspBII
SmaI
C***?*G
C****?G
G?****C EcoRI
ApoI
NgoMI
BsrFI
AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
G*?***C BseHI
G**?**C Ecl136II EcoRV NaeI
G***?*C
G****?C AatII SacI
BanII
HgiAI
Bsp1286
SphI
Nsp752
4
T?****A BspHI BspMII
T*?***A
T**?**A SnaBI
BsaAI
T***?*A
T****?A
CGCG CTAG GATC GCGC GGCC
**** MboIc
Sau3AIc
**?** BfaI HinpI
***?* BstUI DpnI HaeIII
****? HhaI
A?****T
A*?***T MluI
Afl III
SpeI Bgl II
BstYI
A**?**T
A***?*T Eco47III StuI
A****?T
CGCG CTAG GATC GCGC GGCC
A****?T HaeII
C?****G DsaI AvrII
StyI
EagI
EaeI
GdiII
C*?***G
C**?**G NspBII
C***?*G SacII PvuI
C****?G BsiEI BsiEI
G?****C BssHII NheI BamHI
BstYI
KasI
BanI
Bsp120
I
CGCG CTAG GATC GCGC GGCC
G*?***C NarI
BsaHI
G**?**C
G***?*C
G****?C
T?****A BbeI
HaeII
ApaI
BanII
Bsp1286
T*?***A XbaI Bcl I EaeI
T**?**A NruI FspI MscI
T***?*A
T****?A
GTAC TATA TCGA TGCA TTAA
****
**?** Csp61 TaqI MseI
***?* RsaI
****?
A?****T
A*?***T
A**?**T ClaI AseI
A***?*T ScaI
A****?T
GTAC TATA TCGA TGCA TTAA
A****?T Nsi I
C?****G Bsi WI SfcI XhoI
AvaI
AvaI SfcI
C*?***G
C**?**G
C***?*G
C****?G PstI
G?****C Asp718
BanI
Sal I ApaLI
GTAC TATA TCGA TGCA TTAA
G*?***C AccI AccI
G**?**C Bsrl10
7I
HincII HpaI
HincII
G***?*C
G****?C KpnI Bsp12
86
HgiAI
T?****A
T*?***A BstBI
T**?**A DraI
T***?*A
从细菌 DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条
DNA双链连接到一起的酶。
第二节 DNA 连接酶一,DNA连接酶（ ligase)的发现
1967年,世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化两条 DNA的末端之间形成磷酸二酯键的酶,即 DNA连接酶 。
修复双链 DNA上缺口处的磷酸二酯键
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
nick
nick
二,DNA连接酶 的基本性质与特点
DNA连接酶的基本性质
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质修复与 RNA链结合的 DNA链上缺口处的磷酸二酯键
T4-DNA连接酶
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C …
5’ OHP nick
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C …
5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链 DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…
5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
T4-DNA连接酶
（ 1）大肠杆菌连接酶
1,两种 DNA连接酶只能连接 粘性末端 。
DNA ligase的特点
（ 2） T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，
还能连接 齐平末端 。
（ 1）必须是两条 双链 DNA。
（ 2） DNA 3’端有游离的 -OH，
5’端有一个磷酸基团（ P）。
（ 3）需要 能量动物或噬菌体中,ATP
大肠杆菌中,NAD+（ Nicotinamide
adenine dinucleotide free acid ）
2,连接条件
1,ATP（ NAD+）提供激活的 AMP。
三、连接反应的机理
2,ATP与连接酶形成共价,连接酶 -AMP”复合物，
并释放出焦磷酸 PPi。
3,AMP与连接酶的 赖氨酸?-氨基 相连。
OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+
+H3N
AMP
ATP
PPi
4,AMP随后从连接酶的赖氨酸?-氨基转移到
DNA一条链的 5‘端 P上,形成,DNA-腺苷酸,
复合物 。
-OH HO-P-
AMP
-OH O-P-
AMP
5,3‘-OH对磷原子作亲核攻击,形成磷酸二脂键,释放出 AMP。
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
ATP 0.5 - 1 mM
DTT 5 mM
Volume 10 - 20 ml
T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 ℃ 反应 1 小时，
完全连接 1 mg l-DNA（ Hind III片段）所需的酶量四、连接反应的条件连接酶反应的最佳温度是 37?C。
四、连接反应的条件最佳温度但在 37℃ 下 粘性末端 的结合很不稳定。
实用温度所以一般采用 4~16?C。
增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。
1,插入片段与载体的浓度比例
2,反应温度
12.5℃ 。
五、影响连接反应的因素
10~20倍。
一般 14~16℃
平头双链 DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（ 10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入 10% PEG8000(Polyethylene Glycol 8000)，
促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（ NaCl）,最终浓度 150-200 mM
第三节 DNA聚合酶一、基因工程中常用的 DNA聚合酶
1.大肠杆菌 DNA聚合酶
2,Klenow fragment
3,T7 DNA聚合酶
4,T4 DNA聚合酶
5,修饰过的 T7 DNA聚合酶
6,逆转录酶
1,共同特点把 dNTPs连续地加到引物的 3’-OH端。
2,主要区别
T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个 dNTPs而不从模板上掉下来。
其它几种 DNA聚合酶只能连续添加 10多个
dNTPs就会从模板上解离下来。
二、常用的 DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。
DNA聚合酶 3’?5’外切酶活性
5’?3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌 DNA聚合酶 低 有 中 低
Klenow fragment 低 无 中 低
T4DNA聚合酶 高 无 中 低
T7DNA聚合酶 高 无 快 高化学修饰 T7DNA聚合酶 低 无 快 高遗传修饰 T7DNA聚合酶 无 无 快 高逆转录酶 无 无 低 中
Taq DNA聚合酶 无 有 快 高
3,常用 DNA聚合酶的特性比较三,DNA聚合酶在基因工程中的用途
1,大肠杆菌 DNA聚合酶 I
主要用来制备带放射性标记的 DNA探针。
（ 1）大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的性质
①一条 单链多肽 。
② 5’?3’外切酶活性位于 N端。
③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉 N端的
5’?3’外切酶活性部分。就成为 Klenow
fragment。
① 底物：
dNTPs（ dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
② Mg2+
③ 带有 3’-OH游离端的引物
④ DNA模板
（ 2） DNA聚合酶 I（ Pol I）的反应条件
-OH5’
3’
dNTPs
标记
① 核酸探针（ probe）
能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。
（ 3）用 DNA聚合酶 I 制备探针已知序列的核酸片断显示位置 与互补的待测序列杂交标记 已知序列的核酸片断
② 探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断
5’
3’
③ DNA聚合酶 I 对探针序列的标记切口转移法 (nick translation )：
a,放射性同位素标记：
DNA聚合酶 I 同时具备 5’?3’外切酶 活性和
5’?3’的聚合酶 活性（以及 3’?5’外切酶活性）。
5’?3’外切酶活性从 DNA切口的 下一段 DNA5’端除去一个核苷酸后,聚合酶活性就会在切口的 上一段 DNA
的 3’一侧补上一个新的核苷酸 。
切口 切口
5’
5’ 3’
3’
5’ 3’
5’ 3’
纯化的 DNA
片断
DNase I 制造单链切口
DNA Pol I 进行切口转移一种?-32P-dNTP
和 dNTPs
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
32P-dNTP
32P-dNTP
从头至尾都被标记
2,Klenow fragment
具有 5’?3’聚合酶活性和 3’?5’外切酶活性。
（ 失去了 5’?3’外切酶活性 ）。
（ 1） Klenow fragment的性质
DNA Pol I? Klenow fragment (76KD）
枯草杆菌蛋白酶
Klenow片段是 DNA聚合酶 Ⅰ 被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有 5′→3′ 聚合酶和
5′→3′ 外切酶活性，无 3′→5′ 外切酶活性。
可用于缺口转移（ Nick translation）法标记核酸，也可用于 DNA序列测定，修补 DNA链等。
① 3’端补平
5’
5’
klenow
② DNA 3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的 3’隐蔽端 。
在 3’隐蔽端 加上放射性标记的 dNTP。
klenow
（ 2）主要用途
3’隐蔽末端的
DNA片断
Klenow fragment
补平根据末端的顺序选择一种?-32P-dNTPs
末端标记的 DNA
限制性内切酶切
5’----G3’
3’----CTTAA5’
5’----GAA3’
3’----CTTAA5’
5’----GAATT3’
3’----CTTAA5’
5’----G3’
3’----CCTAG5’
5’----GG3’
3’----CCTAG5’
5’----GGATC3’
3’----CCTAG5’
EcoR I BamH I
-32P-dATP?-32P-dGTP
25oC 1h
③ cDNA第二链的合成
mRNA
cDNA第一链逆转录
cDNA第二链
klenow
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
引物
（ 1） T4 DNA聚合酶的性质
3,T4 DNA聚合酶从 T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由 噬菌体基因 43编码。
有 5’?3’聚合酶活性和 3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。
① 来源
② 酶活性
③ 特点当没有 dNTP时,T4 DNA聚合酶行使 3’?5’外切酶功能,制造出 3’隐蔽端 。
如果只有一种 dNTP,则降解到该 dNTP的位置 。
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
T4 DNA聚合酶无 dNTPs
T4 DNA聚合酶有 dNTPs
5’
5’
（ 2） T4 DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）
用 3’?5’外切酶活性作用于 所有末端形式的 3’端
（ 平端,3’隐蔽端,5’隐蔽端 ） 制造出 3’隐蔽端 。
再利用它的 5’?3’聚合酶活性补平,并加入放射性标记的 dNTP。
① 补平隐蔽末端
② DNA 3’末端标记酶切中间产生两个末端标记加入某种 32P-dNTP和 dNTPs
T4 DNA聚合酶
（ 3’?5’外切 ）
DNA酶切片断
T4 DNA聚合酶
（ 5’?3’聚合 ）
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
内切酶切无 dNTPs
a,放射性标记的 优缺点,
制作简单、
高比放射性、
放射自显影效果好。
优点：
缺点：
半衰期短（ 32P只有 14.3天）、
不易保存、
对人体有害。
要求在专门实验室操作。
b,非放射性标记
i）生物素标记：
生物素（ biotin），又称维生素 H、辅酶 R
可以与 dNTP酰化结合成为生物素 -1,6-dUTP、生物素 -1,4-dATP、生物素 -1,1-dUTP等。
CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH
也可以被生物素连接酶（ biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。
纯化的 DNA片断
DNase I 制造单链缺口
DNA Pol I 进行缺口转移生物素 -dTTP和
dNTPs
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
生物素 -dTTP
生物素 -dTTP
利用缺口转移法将生物素掺入 DNA探针中光促生物素标记生物素 连接臂 光敏基因 探针序列探针序列生物素 连接臂 光敏基因
+
光照抗生物素蛋白（ avidin）：
链霉抗生物素蛋白（ streptavidin）：
生物素的识别 —— 亲和素,
是一种 鸡 卵清蛋白。
细菌 中 avidin的类似物。
能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：
ii）地高辛标记：
可以与 dNTP连接成地高辛 -dUTP等，参入 DNA
合成过程。形成地高辛标记的 DNA探针。
生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。
地高辛的结合物是 抗地高辛抗体 。
iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：
辣根过氧化物酶
（ horseradish peroxidase,HRPO）
碱性磷酸酶
（ Alkaline Phosphatase,AP）
催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光 （或生成 有色的产物 ）。
酶的作用：
化学发光底物
HRPO和 AP的显色反应底物
iv）用非放射性标记的探针检测原理生物素 探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光探针 DNA用 生物素或地高辛 标记。
亲和素或地高辛抗体与 酶 偶联。
酶 催化一个 发光或显色反应 。
亲和素或地高辛抗体 与 生物素或地高辛结合 。
核酸 探针 杂交筛选法的缺点是：
只检测是否有外源
DNA插入,而不论该
DNA是否表达出产物 。
4,T7 DNA聚合酶
（ 1）来源从 T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：
① T7基因 5编码的大亚基：
有 5’?3’聚合酶和 3’?5’外切酶活性。
② 大肠杆菌编码的小亚基：
硫氧还蛋白。
增加大亚基对 模板的亲和性 。
（ 2） T7 DNA聚合酶的特点
① 持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。
② 3’?5’外切酶活性高单链和双链都能降解。
③ 不受 DNA二级结构的影响其它 DNA聚合酶受 DNA二级结构的阻碍
② 进行末端标记
① 以大分子量 DNA为模板的合成如 M13
③ 补平隐蔽末端
（ 3） T7 DNA聚合酶的用途取代合成法标记 3’末端。
与 T4 DNA聚合酶相同。
合成 补平 3’隐蔽末端；
水解 修平 3’突出末端。
5,修饰后的 T7 DNA聚合酶
（ 1） T7DNA聚合酶的化学修饰去除 3’?5’外切酶活性，使 DNA聚合能力和聚合速率提高了 3倍。
（ 2）修饰后的 T7 DNA聚合酶的用途
① DNA测序双脱氧法。
② 标记 DNA 3’隐蔽末端
③ 更有效地补平末端
6,逆转录酶最普遍使用的是来源于 鸟类骨髓母细胞瘤病毒 （ avian myeloblastosis virus,
AMV）,
依赖 RNA的 DNA聚合酶（ RNA指导的
DNA聚合酶）。
（ 1）来源 RNA肿瘤病毒。
（ 2） AMV的性质由?和?两条多肽链组成。
①?链有反转录活性和 RNaseH活性。
RNaseH：
链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。
以 5’?3’或 3’?5’方向特异地水解 RNA-DNA杂交双链中的 RNA链 。
RNaseH
RNA
DNA
RNA
DNA
（ 3）逆转录酶的用途
②?链
RNA-DNA杂交双链中 5’?3’DNA外切酶活性。
① 合成 cDNA
以 oligo dT为引物（与 mRNA的 polyA尾巴互补结合）。
AAAAA
TTTTT 5’
3’ mRNA 5’
cDNA
② 合成 DNA探针用随机引物（ random primer）或 oligo dT
做引物。
随机引物：
随机顺序形成的寡聚 DNA片断。
（理论上它能与各种序列的模板结合）
③ RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其 mRNA反转录出
cDNA第一链。
第四节 DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶
1,来源小牛胸腺。
2,组成大小两个亚基。
3,特性
（ 1） 5’?3’DNA聚合酶活性
（ terminal transferase）
② 不需要模板 ！
① 需要 3’-OH、二甲胂酸缓冲液。
③ 底物可以是单链 DNA、
是 3’-OH突出的双链 DNA、
平末端 在 Co2+代替 Mg2+下也可以。
④ 随机添加的 dNTPs。
如果只有一种 dNTP，就添加上 同聚物 。
DNA 5’ 3’
TTT
dTTP,末端转移酶
4,末端转移酶的用途
（ 1）同聚物加尾给 外源 DNA片断 和 载体 分子分别加上互补的同聚物尾巴,以使它们有效地连接 。
外源 DNA 载体 DNA5’ 3’
5’ 3’
CCC
CCC
GGG GGG
dGTPdCTP 末端转移酶
（ 2）再生酶切位点 便于回收克隆片断。
AAGCTT
TTCGAA
5’
5’
HindⅢ 酶切
A
TTCGA
AGCTT
A
Klenow补平
AAGCT
TTCGA
AGCTT
TCGAA
AAGCATTT
TTCGA
AGCTT
TTTTCGAA
末端转移酶dTTP
AAA
AAA外源 DNA
（ 3）非放射性标记 DNA片断的 3’端
AAGCTTTT
TTCGA
AGCTT
TTTTCGAAAAA
AAA
HindⅢ 位点 HindⅢ 位点连接催化非放射性标记物参入 DNA片断的 3’端。
（生物素 -11-dUTP等）
二,T4多核苷酸激酶
1,来源
T4噬菌体的 pseT基因编码。
从 T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。
多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。
2,功能催化?磷酸从 ATP转给双链或单链 DNA或
RNA的 5’-OH端。
不论 5’-OH端突出与否。
5’
3’ HO- -OH5’
3’ HO- -OH
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
ATP T4多核苷酸激酶如果 ATP的?磷酸带有 32P标记，就会被转移到
DNA的 5’端。
但天然的 DNA的 5’端都是磷酸化的。
3,多核苷酸激酶的用途
DNA 5’-OH端磷酸化、标记 DNA的 5’端。
5’
3’ HO- -OH5’
3’ HO- -OH
3’ 32P- -OH5’
3’ HO- -32P 5’
(?-32P)ATP 多核苷酸激酶
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
碱性磷酸酶
（ 1）正向反应（ forward reaction）
（ 2）交换反应标记法反应混合物中具有超量 (?-32P)ATP和 ADP时，多核苷酸激酶能催化 (?-32P)ATP的?-32P与 DNA5’端的磷酸 交换 。
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
3’ 32P- -OH5’
3’ HO- -32P 5’
(?-32P)ATP,ADP 多核苷酸激酶反应效果不理想。
三、碱性磷酸酶
1,碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。
Bacterial alkaline phosphatase,BAP
（ 1）细菌性碱性磷酸酶
（ 2）小牛肠碱性磷酸酶
Calf intestinal alkaline phosphatase,CIP
从小牛肠中纯化出来。
具有抗热性。
SDS中加热 68oC可完全失活。
2,碱性磷酸酶的特性催化脱掉 DNA（或 RNA） 5’端的磷酸 根。
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
5’
3’ HO- -OH5’
3’ HO- -OH
碱性磷酸酶
3,碱性磷酸酶的功能
（ 1）防止线性化的载体份子自我连接单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。
AAGCTT
TTCGAA
HindⅢ 酶切
A-OH
TTCGA-P
P-AGCTT
HO-A
碱性磷酸酶
5’
5’
5’
A-OH
TTCGA-OH
HO-AGCTT
HO-A
OH与 OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。
但同一酶切后的 外源 DNA的 5’端有 P，能与脱磷酸的载体 OH连接。
A
TTCGA
AGCTT
A
AGCTT A
A TTCGA
连接酶 -OH与 -OH连不住其中每条链上都有一个 nick，但转入细菌后会被修复。
3’ P-AGCTT A-OH5’
3’ HO-A TTCGA-P 5’ 外源 DNA
第五节 核酸外切酶 Exonucleases）
是一类从多核苷酸链的一头开始催化 降解 核苷酸的酶。
一、单链 DNA外切酶
1,大肠杆菌核酸外切酶 I（ exo I）
5’?3’外切 识别 5’-OH
2,大肠杆菌核酸外切酶 Ⅶ （ exo Ⅶ ）
5’?3’,3’?5’外切识别 3’-OH,5’-P
二、双链 DNA外切酶
1,核酸外切酶 Ⅲ （ exo Ⅲ ）
3’?5’外切 识别 3’-OH
主要用途：
在 DNA双链的末端产生出单链区域。
5’
5’
5’ 5’
exo Ⅲ
与 klenow配合进行 3’端标记
-OH
HO-
2,l核酸外切酶（ l exo）
5’?3’外切。
主要用途：
使 DNA双链变成单链（短）。
5’ P-
-P 5’
5’
5’
l exo
成为测序模板。
识别 5’-P（但不能降解 5’-OH）
3,T7基因 6核酸外切酶
5’?3’外切。
用途与 l exo一样。
既能识别 5’-P，又能识别 5’-OH。
5’
5’
5’
5’
已被克隆到大肠杆菌中表达。
DNA外切酶 切割方式 识别位点单链大肠杆菌核酸外切酶 I
（ exo I）
5’?3’ 5’-OH
大肠杆菌核酸外切酶 Ⅶ
（ exo Ⅶ ）
5’?3’
3’?5’
5’-P
3’-OH
双链核酸外切酶 Ⅲ （ exo Ⅲ ） 3’?5’ 3’-OH
l核酸外切酶（ l exo） 5’?3’ 5’-P
T7基因 6核酸外切酶 5’?3’ 5’-P
5’-OH
第六节 单链 DNA内切酶一,S1核酸酶
1,来源稻谷曲霉（ Aspergillus oryzae）。
2,特性
（ 1）高度单链特异性
（ 2）反应条件
① 低水平 Zn2+
② pH4.0~4.3
3,S1核酸内切酶的功能
（ 1）催化单链 RNA或 DNA降解。
（ 2）切掉双链核酸中的单链区。
S1
S1
发卡或有缺口的部位。
（ 4）不能降解双链 DNA或 RNA-DNA杂交链
ATGCAT GCATGC
TACGTA CGTACGT
甚至能识别单个核苷酸的单链区！
（ 3）降解限制酶切形成的单链突出端。
4,S1核酸酶的用途
（ 1）定位 RNA
DNA
RNA S1
S1
200bp 400bp
某限制酶切后再与 RNA杂交某限制酶位点（参照物）
内切酶位点不能位于内含子序列中！
RNA
RNA位于某限制酶位点 左 200bp和右 400bp。
RNA位置不能配对的内含子区域形成的单链环被
S1切掉。
mRNA
DNA
（ 2）用 mRNA测定基因中的外显子序列二,Bal 31核酸酶
1,来源埃氏交替单胞菌（ Alteromonoas espejiana）
2,功能既有 单链 特异的 DNA（ RNA）内切酶；
又有 双链 特异的 DNA外切酶。
降解双链 DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。
4,Bal31的用途定位测定 DNA片断中的限制酶位点分布。
3,反应条件
Mg2+,Ca2+
EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合 Ca2+，
可终止反应。
EcoR I EcoR IBamH I
Hind III
与对照组 （ 不用 Bal31消化 ） 只用相同的酶切的电泳比较 。
根据酶切片断消失的先后顺序,判断这些片断在原 DNA中的位置 。
用 Bal31消化线性 DNA,并在 不同的时间 加入
EGTA终止反应,再酶切电泳 。
Bal31控制消化法：
EcoR I EcoR IBamH I
分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。
Hind III
EcoR I EcoR IBamH I
Hind III
EcoR I EcoR IBamH I
Hind III
Bal31
分别用原内切酶切后电泳,
判断片断数目和大小 。
复习思考题
试述 II型限制性核酸内切酶的主要特性及用途。
Principles of Genetic Engineering
基 因 工 程 原 理湖南中医药大学 鲁耀邦基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶
DNA连接酶
DNA聚合酶核酸外切酶核酸修饰酶第三讲 基因工程的酶学基础单链 DNA内切酶核酸酶 (nuclease),通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键,从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶 。 其中专门水解断裂 RNA 分子的叫做 核糖核酸酶
(RNase),而特异水解断裂 DNA分子的则叫做 脱氧核糖核酸酶 (DNase)。
按水解断裂核酸分子的方式不同,可分为两种类型：一类是从核酸分子的末端开始,一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,叫 核酸外切酶 (exonuclease)；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段,叫 核酸内切酶
(endonuclease)。
第一节 限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能限制性核酸内切酶 (Restriction endonuclease)是一类能够识别 双链 DNA分子中的某种 特定核苷酸序列 (4-
8bp),并由此处 切割 DNA双链 的核酸 内切酶 。
第一节 限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能据 1994年美国出版的,分子生物学百科全书,统计,
仅 II型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了 2300种以上,可识别 230种不同的 DNA序列 。
2,性质内切酶。
主要是从原核生物中分离纯化出来。
即在核酸分子链的 内部 制造切口的酶。
帮助细菌限制外来 DNA的入侵
3,功能细菌的限制和修饰系统（ R/M体系）
1,来源限制性内切酶将侵入细菌体内的 外源 DNA切成小片断。
（ 1）限制（ Restriction）
细菌自身的 DNA碱基被 甲基化酶 甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
（ 2）修饰（ Modification）
① Dam甲基化酶
GATC 腺嘌呤 N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶
CCAGG或 CCTGG序列在第二个 C上 C5
位置上引入甲基
Enzyme Sequence Dam Dcm CpG
Aat II GACGTC ● ● ■
Acc I GTMKAC ● ● □ ol
Acc65 I GGTACC ● □ scol □ scol
Aci I CCGC ● ● ■
Acl I AACGTT ● ● ■
Acu I CTGAAG(16/14) ● ● ●
Afe I AGCGCT ● ● ■
Afl II CTTAAG ● ● ●
Afl III ACRYGT ● ● ●
Age I ACCGGT ● ● ■
Ahd I GACNNNNNGTC ● ● □ scol
图标说明,● 不敏感 ■ 完全阻断 □ scol某些重叠组合后被阻断 □ ol重叠性阻断 ◆ 阻碍 ◇ ol重叠性阻碍
◇ scol某些重叠组合后被阻碍
Refer,http://rebase.neb.com/rebase/
I 型限制性内切酶目前鉴定出 三种不同类型 的限制性内切酶。
二、限制性内切酶的类型
II 型限制性内切酶
III型限制性内切酶首先由 M,Meselson和 R,Yuan在 1968年从大肠杆菌 B株 和 K株 分离的。
（ 1）识别位点序列
EcoB,TGA(N)8TGCT
EcoK,AAC(N)6GTGC
1,I型限制性内切酶如 EcoB和 EcoK。
未甲基化修饰的特异序列。
需 ATP,Mg2+和 SAM（ S-腺苷蛋氨酸）。
（ 3）作用机理在距离特异性识别位点约 1000— 1500 bp处 随机 切开一条 单链 。
Recognize site cut
1-1.5kb
（ 2）切割位点
1970年,H.O,Smith和 K.W,Wilcox首先从流感嗜血杆菌 d株中分离出来。
（ 1）识别位点序列未甲基化修饰 的 双链 DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。
与 DNA的来源无关。
2,II型限制性内切酶分离的第一个酶是 Hind II，其次是 Hind III
EcoR I 5’-G?AATTC-3’
3’-CTTAA?G-5’
Pst I 5’-CTGCA?G-3’
3’-G?ACGTC-5’
产生粘性末端
EcoR V 5’-GAT?ATC-3’
3’-CTA?TAG-5’
产生平齐末端
（ 2）切割位点切开 双链 DNA。形成 粘性末端 （ sticky end）或平齐末端 （ blunt end）。如：
识别位点处。
（ 3）粘性末端（ sticky ends,cohensive ends）
含有几个核苷酸 单链 的末端。
分两种类型：
① 5’端凸出（如 EcoR I切点）
G?AATTC
CTTAA G
G AATTC
CTTAA?G
5’- -3’
3’- -5’
5’- -3’
3’- -5’
EcoR I等产生的 5‘粘性末端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C …
5’ EcoR I 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
OH P
OHP
CTGCA?G
② 3’端凸出（如 Pst I切点）
G?ACGTC
5’- -3’
3’- -5’
5’- -3’
3’- -5’
CTGCA G
G ACGTC
Pst I等产生的 3‘粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ Pst I 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’ 退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
① 连接便利
（ 3）粘性末端的意义
i）不同的 DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
ii）同一个 DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接成 环形分子 。
这比连接两个平齐末端容易的多。
③ 补平成平齐末端凸出的 3’端 可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或 TTT等）造成人工粘性末端。
② 5’末端标记凸出的 5’末端 可用 DNA多核苷酸激酶进行 32P
标记。
粘性末端可以用 DNA聚合酶补平成平齐末端。
Pvu II等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C …
5’
Pvu II 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
识别位点的序列相同的限制性内切酶。
（ 4）同裂酶 (Isoschizomers)
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。
如 Hind Ⅲ 和 Hsu I。
Hind Ⅲ 5’-A?AGCTT-3’
3’-TTCGA?A-5’
Hsu I 5’-A?AGCTT-3’
3’-TTCGA?A-5’
Xma I 5’-C?CCGGG -3’
3’-GGGCC?C-5’
Sma I 5’-CCC?GGG-3’
3’-GGG?CCC-5’
识别位点相同，但切点不同。
如 Xma I 和 Sma I。
② 不完全同裂酶：
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如
BamH I,Bgl Ⅱ,Bcl I,Xho Ⅱ 等
（ 5）同尾酶 (Isocaudamers）
5’-G?GATCC-3’
3’-CCTAG?G-5’
BamH I
Bcl I 5’-T?GATCA-3’ 3’-ACTAG?T-5’
5’-A?GATCT-3’
3’-TCTAG?A-5’ Bgl Ⅱ
5’-U?GATCY-3’
3’-YCTAG?U-5’ Xho Ⅱ
U代表嘌呤； Y代表嘧啶。
5’-?GATC----3’
3’----CTAG?-5’Sau 3A
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能 再被原来的酶识别。？
5’-G
3’-CCTAG
GATCT-3’
A-5’ BamH I Bgl Ⅱ
5’-GGATCT-3’
3’-CCTAGA-5’ BamH I Bgl Ⅱ
Sau 3A
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度,pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。
（ 6）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（ *）活性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。
① 星号（ *）活性
EcoR I和 BamH I等都有 *活性。
在低盐、高 pH（ >8）时可识别和切割
GAATTA,AAATTC,GAGTTC等
GAATTCEcoR I：
使用的时候要特别注意！
在离它的 不对称识别位点 一侧的 特定距离 处切割 DNA双链。
（ 7） Ⅱ s型限制性内切酶移动切割（ shifted cleavage):
GACGCNNNNN?
Hga I
CTGCGNNNNNNNNNN?
5’
3’
3,III型限制性内切酶在完全确定的位点切割 DNA,但反应需要
ATP,Mg2+和 SAM (S-腺苷蛋氨酸 )的激活作用 。
在基因工程操作中用途不大。
EcoP1,AGACC
EcoP15,CAGCAG
核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性 I型内切酶 II型内切酶 III型内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶 内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构
3种不同的亚基 单一成分 2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子
ATP,Mg2+和 SAM Mg2+ ATP,Mg2+和
SAM
寄主特异性位点识别序列
EcoB：
TGA(N)8TGCT
EcoK：
AAC(N)6GTGC
回文序列，旋转对称
（ IIs型除外）
EcoP1,
AGACC
EcoP15,
CAGCAG
切割位点 在距离识别位点至少 1000 bp处随机切开一条单链。
位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点 3‘端
24-26bp处酶催转换 不能 能 能
DNA易位作用 能 不能 不能甲基化作用的位点 寄主特异性位点 寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能 能 能序列特异的切割 不是 是 是基因工程中的用途 无用 十分有用 用处不大
1973年 H.O Smith和 D,Nathans提议的命名系统，命名原则如下：
三、限制性内切酶的命名
1.用 属名 的第一个字母和 种名 的头两个字母组成 3
个字母的略语表示 寄主菌 的物种名。
大肠杆菌 （ Escherichia coli） 用 Eco表示；
流感嗜血菌 （ Haemophilus influenzae） 用 Hin表示 。
4,限制酶前面要带上 R（ Restriction),修饰酶前面要带上 M（ Modification）。（现已省略）。
2,用一个右下标的大写字母表示 菌株或型 。 如 Ecok,
EcoR（ 现在都写成平行,如 EcoRI） 。
3,如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统,用罗马字母表示 。 如 EcoR I,EcoR V。
大部分 II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：
Tris-HCl 50 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
NaCl 0 - 150 mM
DTT 1 mM
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
150 mM 高盐酶
Volume 20 - 100 ml
T T 37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性,在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准 DNA所需的酶量四,II 型限制性内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
5‘ … GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’
BamHI SmaI
5‘ … GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’
5‘ … GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’
3‘ … CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
四,II 型限制性内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：
使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4
2.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心 10分钟、干燥四,II 型限制性内切酶酶解反应的操作
DNA中的杂质如蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、
SDS,EDTA,NaCl等都会影响酶的活性。
1,DNA的纯度五、影响限制性内切酶活性的因素
①纯化 DNA
② 加大酶的用量,1mg DNA 用 10U 酶
③延长保温时间
④ 扩大反应体积（ >20ml）
一般采取大肠杆菌中的 dam甲基化酶在 5‘ GATC3’序列中的腺 嘌呤 N6位引入甲基，受其影响的酶有 Bcl I,MboI等，但 BamH I、
Bgl II,Sau3A I不受影响大肠杆菌中的 dcm甲基化酶在 5‘ CCAGG3’或 5‘ CCTGG3’序列 中的 胞嘧啶 C5位 上引入甲基,受其影响的酶有 EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在 5‘ CG3’序列中的 C5位 上引入甲基
2,DNA的甲基化程度基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是 37 oC，少数要求 40-65 oC。
酶 最适温度 oC
酶 最适温度 oC
酶 最适温度 oC
Apa I
Bcl I
Mae II
Taq I
30
50
50
65
Apy I
BstE II
Mae III
30
60
55
Ban I
Mae I
Sma I
50
45
25
3,温度是影响限制酶活性的重要因素 。
4,缓冲液 (Buffer)
缓冲液的化学组成
MgCl2,NaCl/KCl,提供 Mg2+和离子强度；
Tris-HCl,维持 pH；
二硫苏糖醇 （ DTT）,保持酶稳定性；
牛血清白蛋白 BSA等：有助于酶的稳定；
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液 。
核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端
pH值 等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的 Star activity现象。
EcoR I在正常条件下识别并切割 5‘ GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过 5%（ v/v） 时，也可切割
5‘ PuPuATPyPy3’或者 5‘ AATT3’
五、限制性内切酶对 DNA的消化
1,内切酶与识别序列的结合模式
1986年 J.A,McClarin等通过 X射线晶体衍射发现 II型限制性内切酶是以 同型二聚体 的形式与靶序列结合。
GAATTC
CTTAAG
内切酶在 DNA上的 所有 识别位点都被切开。
2,完全消化
1 2 3 4
1 2 3 4
只有有限数量的酶切位点被切开。
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
3,局部消化
1 2 3 4
1 4
5,几种常用限制酶识别位点大多数酶可用 65 oC温育 5分钟失活。
或用 乙醇 沉淀 DNA。
4,限制酶酶切反应的终止
6,限制性内切酶识别序列的交叉列表
AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
****
**?** MaeII HpaⅡ c
MspIc
***?* Alu I
****?
A?****T Nla Ⅲ
A*?***T ApoI Hind
Ⅲ
Afl III AgeI
BsrFI
A**?**T
A***?*T SspI
A****?T
AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
A****?T Nsp752
4
C?****G NcoI
StyI
Dsa I
XmaI
AvaI
C*?***G NdeI
C**?**G Pml I
BsaAI
PvuII
NspBII
SmaI
C***?*G
C****?G
G?****C EcoRI
ApoI
NgoMI
BsrFI
AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
G*?***C BseHI
G**?**C Ecl136II EcoRV NaeI
G***?*C
G****?C AatII SacI
BanII
HgiAI
Bsp1286
SphI
Nsp752
4
T?****A BspHI BspMII
T*?***A
T**?**A SnaBI
BsaAI
T***?*A
T****?A
CGCG CTAG GATC GCGC GGCC
**** MboIc
Sau3AIc
**?** BfaI HinpI
***?* BstUI DpnI HaeIII
****? HhaI
A?****T
A*?***T MluI
Afl III
SpeI Bgl II
BstYI
A**?**T
A***?*T Eco47III StuI
A****?T
CGCG CTAG GATC GCGC GGCC
A****?T HaeII
C?****G DsaI AvrII
StyI
EagI
EaeI
GdiII
C*?***G
C**?**G NspBII
C***?*G SacII PvuI
C****?G BsiEI BsiEI
G?****C BssHII NheI BamHI
BstYI
KasI
BanI
Bsp120
I
CGCG CTAG GATC GCGC GGCC
G*?***C NarI
BsaHI
G**?**C
G***?*C
G****?C
T?****A BbeI
HaeII
ApaI
BanII
Bsp1286
T*?***A XbaI Bcl I EaeI
T**?**A NruI FspI MscI
T***?*A
T****?A
GTAC TATA TCGA TGCA TTAA
****
**?** Csp61 TaqI MseI
***?* RsaI
****?
A?****T
A*?***T
A**?**T ClaI AseI
A***?*T ScaI
A****?T
GTAC TATA TCGA TGCA TTAA
A****?T Nsi I
C?****G Bsi WI SfcI XhoI
AvaI
AvaI SfcI
C*?***G
C**?**G
C***?*G
C****?G PstI
G?****C Asp718
BanI
Sal I ApaLI
GTAC TATA TCGA TGCA TTAA
G*?***C AccI AccI
G**?**C Bsrl10
7I
HincII HpaI
HincII
G***?*C
G****?C KpnI Bsp12
86
HgiAI
T?****A
T*?***A BstBI
T**?**A DraI
T***?*A
从细菌 DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条
DNA双链连接到一起的酶。
第二节 DNA 连接酶一,DNA连接酶（ ligase)的发现
1967年,世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化两条 DNA的末端之间形成磷酸二酯键的酶,即 DNA连接酶 。
修复双链 DNA上缺口处的磷酸二酯键
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
OH P
OHP
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C …
5’
nick
nick
二,DNA连接酶 的基本性质与特点
DNA连接酶的基本性质
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质修复与 RNA链结合的 DNA链上缺口处的磷酸二酯键
T4-DNA连接酶
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C …
5’ OHP nick
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C …
5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链 DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…
5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …
3’3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
T4-DNA连接酶
（ 1）大肠杆菌连接酶
1,两种 DNA连接酶只能连接 粘性末端 。
DNA ligase的特点
（ 2） T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，
还能连接 齐平末端 。
（ 1）必须是两条 双链 DNA。
（ 2） DNA 3’端有游离的 -OH，
5’端有一个磷酸基团（ P）。
（ 3）需要 能量动物或噬菌体中,ATP
大肠杆菌中,NAD+（ Nicotinamide
adenine dinucleotide free acid ）
2,连接条件
1,ATP（ NAD+）提供激活的 AMP。
三、连接反应的机理
2,ATP与连接酶形成共价,连接酶 -AMP”复合物，
并释放出焦磷酸 PPi。
3,AMP与连接酶的 赖氨酸?-氨基 相连。
OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+
+H3N
AMP
ATP
PPi
4,AMP随后从连接酶的赖氨酸?-氨基转移到
DNA一条链的 5‘端 P上,形成,DNA-腺苷酸,
复合物 。
-OH HO-P-
AMP
-OH O-P-
AMP
5,3‘-OH对磷原子作亲核攻击,形成磷酸二脂键,释放出 AMP。
DNA连接酶的反应条件
Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5
MgCl2 10 mM
ATP 0.5 - 1 mM
DTT 5 mM
Volume 10 - 20 ml
T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 15 ℃ 反应 1 小时，
完全连接 1 mg l-DNA（ Hind III片段）所需的酶量四、连接反应的条件连接酶反应的最佳温度是 37?C。
四、连接反应的条件最佳温度但在 37℃ 下 粘性末端 的结合很不稳定。
实用温度所以一般采用 4~16?C。
增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。
1,插入片段与载体的浓度比例
2,反应温度
12.5℃ 。
五、影响连接反应的因素
10~20倍。
一般 14~16℃
平头双链 DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（ 10倍大于粘性末端的连接）
加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入 10% PEG8000(Polyethylene Glycol 8000)，
促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（ NaCl）,最终浓度 150-200 mM
第三节 DNA聚合酶一、基因工程中常用的 DNA聚合酶
1.大肠杆菌 DNA聚合酶
2,Klenow fragment
3,T7 DNA聚合酶
4,T4 DNA聚合酶
5,修饰过的 T7 DNA聚合酶
6,逆转录酶
1,共同特点把 dNTPs连续地加到引物的 3’-OH端。
2,主要区别
T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个 dNTPs而不从模板上掉下来。
其它几种 DNA聚合酶只能连续添加 10多个
dNTPs就会从模板上解离下来。
二、常用的 DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。
DNA聚合酶 3’?5’外切酶活性
5’?3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌 DNA聚合酶 低 有 中 低
Klenow fragment 低 无 中 低
T4DNA聚合酶 高 无 中 低
T7DNA聚合酶 高 无 快 高化学修饰 T7DNA聚合酶 低 无 快 高遗传修饰 T7DNA聚合酶 无 无 快 高逆转录酶 无 无 低 中
Taq DNA聚合酶 无 有 快 高
3,常用 DNA聚合酶的特性比较三,DNA聚合酶在基因工程中的用途
1,大肠杆菌 DNA聚合酶 I
主要用来制备带放射性标记的 DNA探针。
（ 1）大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的性质
①一条 单链多肽 。
② 5’?3’外切酶活性位于 N端。
③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉 N端的
5’?3’外切酶活性部分。就成为 Klenow
fragment。
① 底物：
dNTPs（ dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
② Mg2+
③ 带有 3’-OH游离端的引物
④ DNA模板
（ 2） DNA聚合酶 I（ Pol I）的反应条件
-OH5’
3’
dNTPs
标记
① 核酸探针（ probe）
能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。
（ 3）用 DNA聚合酶 I 制备探针已知序列的核酸片断显示位置 与互补的待测序列杂交标记 已知序列的核酸片断
② 探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断
5’
3’
③ DNA聚合酶 I 对探针序列的标记切口转移法 (nick translation )：
a,放射性同位素标记：
DNA聚合酶 I 同时具备 5’?3’外切酶 活性和
5’?3’的聚合酶 活性（以及 3’?5’外切酶活性）。
5’?3’外切酶活性从 DNA切口的 下一段 DNA5’端除去一个核苷酸后,聚合酶活性就会在切口的 上一段 DNA
的 3’一侧补上一个新的核苷酸 。
切口 切口
5’
5’ 3’
3’
5’ 3’
5’ 3’
纯化的 DNA
片断
DNase I 制造单链切口
DNA Pol I 进行切口转移一种?-32P-dNTP
和 dNTPs
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
32P-dNTP
32P-dNTP
从头至尾都被标记
2,Klenow fragment
具有 5’?3’聚合酶活性和 3’?5’外切酶活性。
（ 失去了 5’?3’外切酶活性 ）。
（ 1） Klenow fragment的性质
DNA Pol I? Klenow fragment (76KD）
枯草杆菌蛋白酶
Klenow片段是 DNA聚合酶 Ⅰ 被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有 5′→3′ 聚合酶和
5′→3′ 外切酶活性，无 3′→5′ 外切酶活性。
可用于缺口转移（ Nick translation）法标记核酸，也可用于 DNA序列测定，修补 DNA链等。
① 3’端补平
5’
5’
klenow
② DNA 3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的 3’隐蔽端 。
在 3’隐蔽端 加上放射性标记的 dNTP。
klenow
（ 2）主要用途
3’隐蔽末端的
DNA片断
Klenow fragment
补平根据末端的顺序选择一种?-32P-dNTPs
末端标记的 DNA
限制性内切酶切
5’----G3’
3’----CTTAA5’
5’----GAA3’
3’----CTTAA5’
5’----GAATT3’
3’----CTTAA5’
5’----G3’
3’----CCTAG5’
5’----GG3’
3’----CCTAG5’
5’----GGATC3’
3’----CCTAG5’
EcoR I BamH I
-32P-dATP?-32P-dGTP
25oC 1h
③ cDNA第二链的合成
mRNA
cDNA第一链逆转录
cDNA第二链
klenow
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
引物
（ 1） T4 DNA聚合酶的性质
3,T4 DNA聚合酶从 T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由 噬菌体基因 43编码。
有 5’?3’聚合酶活性和 3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。
① 来源
② 酶活性
③ 特点当没有 dNTP时,T4 DNA聚合酶行使 3’?5’外切酶功能,制造出 3’隐蔽端 。
如果只有一种 dNTP,则降解到该 dNTP的位置 。
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
T4 DNA聚合酶无 dNTPs
T4 DNA聚合酶有 dNTPs
5’
5’
（ 2） T4 DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）
用 3’?5’外切酶活性作用于 所有末端形式的 3’端
（ 平端,3’隐蔽端,5’隐蔽端 ） 制造出 3’隐蔽端 。
再利用它的 5’?3’聚合酶活性补平,并加入放射性标记的 dNTP。
① 补平隐蔽末端
② DNA 3’末端标记酶切中间产生两个末端标记加入某种 32P-dNTP和 dNTPs
T4 DNA聚合酶
（ 3’?5’外切 ）
DNA酶切片断
T4 DNA聚合酶
（ 5’?3’聚合 ）
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
内切酶切无 dNTPs
a,放射性标记的 优缺点,
制作简单、
高比放射性、
放射自显影效果好。
优点：
缺点：
半衰期短（ 32P只有 14.3天）、
不易保存、
对人体有害。
要求在专门实验室操作。
b,非放射性标记
i）生物素标记：
生物素（ biotin），又称维生素 H、辅酶 R
可以与 dNTP酰化结合成为生物素 -1,6-dUTP、生物素 -1,4-dATP、生物素 -1,1-dUTP等。
CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH
也可以被生物素连接酶（ biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。
纯化的 DNA片断
DNase I 制造单链缺口
DNA Pol I 进行缺口转移生物素 -dTTP和
dNTPs
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
生物素 -dTTP
生物素 -dTTP
利用缺口转移法将生物素掺入 DNA探针中光促生物素标记生物素 连接臂 光敏基因 探针序列探针序列生物素 连接臂 光敏基因
+
光照抗生物素蛋白（ avidin）：
链霉抗生物素蛋白（ streptavidin）：
生物素的识别 —— 亲和素,
是一种 鸡 卵清蛋白。
细菌 中 avidin的类似物。
能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：
ii）地高辛标记：
可以与 dNTP连接成地高辛 -dUTP等，参入 DNA
合成过程。形成地高辛标记的 DNA探针。
生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。
地高辛的结合物是 抗地高辛抗体 。
iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：
辣根过氧化物酶
（ horseradish peroxidase,HRPO）
碱性磷酸酶
（ Alkaline Phosphatase,AP）
催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光 （或生成 有色的产物 ）。
酶的作用：
化学发光底物
HRPO和 AP的显色反应底物
iv）用非放射性标记的探针检测原理生物素 探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光探针 DNA用 生物素或地高辛 标记。
亲和素或地高辛抗体与 酶 偶联。
酶 催化一个 发光或显色反应 。
亲和素或地高辛抗体 与 生物素或地高辛结合 。
核酸 探针 杂交筛选法的缺点是：
只检测是否有外源
DNA插入,而不论该
DNA是否表达出产物 。
4,T7 DNA聚合酶
（ 1）来源从 T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：
① T7基因 5编码的大亚基：
有 5’?3’聚合酶和 3’?5’外切酶活性。
② 大肠杆菌编码的小亚基：
硫氧还蛋白。
增加大亚基对 模板的亲和性 。
（ 2） T7 DNA聚合酶的特点
① 持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。
② 3’?5’外切酶活性高单链和双链都能降解。
③ 不受 DNA二级结构的影响其它 DNA聚合酶受 DNA二级结构的阻碍
② 进行末端标记
① 以大分子量 DNA为模板的合成如 M13
③ 补平隐蔽末端
（ 3） T7 DNA聚合酶的用途取代合成法标记 3’末端。
与 T4 DNA聚合酶相同。
合成 补平 3’隐蔽末端；
水解 修平 3’突出末端。
5,修饰后的 T7 DNA聚合酶
（ 1） T7DNA聚合酶的化学修饰去除 3’?5’外切酶活性，使 DNA聚合能力和聚合速率提高了 3倍。
（ 2）修饰后的 T7 DNA聚合酶的用途
① DNA测序双脱氧法。
② 标记 DNA 3’隐蔽末端
③ 更有效地补平末端
6,逆转录酶最普遍使用的是来源于 鸟类骨髓母细胞瘤病毒 （ avian myeloblastosis virus,
AMV）,
依赖 RNA的 DNA聚合酶（ RNA指导的
DNA聚合酶）。
（ 1）来源 RNA肿瘤病毒。
（ 2） AMV的性质由?和?两条多肽链组成。
①?链有反转录活性和 RNaseH活性。
RNaseH：
链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。
以 5’?3’或 3’?5’方向特异地水解 RNA-DNA杂交双链中的 RNA链 。
RNaseH
RNA
DNA
RNA
DNA
（ 3）逆转录酶的用途
②?链
RNA-DNA杂交双链中 5’?3’DNA外切酶活性。
① 合成 cDNA
以 oligo dT为引物（与 mRNA的 polyA尾巴互补结合）。
AAAAA
TTTTT 5’
3’ mRNA 5’
cDNA
② 合成 DNA探针用随机引物（ random primer）或 oligo dT
做引物。
随机引物：
随机顺序形成的寡聚 DNA片断。
（理论上它能与各种序列的模板结合）
③ RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其 mRNA反转录出
cDNA第一链。
第四节 DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶
1,来源小牛胸腺。
2,组成大小两个亚基。
3,特性
（ 1） 5’?3’DNA聚合酶活性
（ terminal transferase）
② 不需要模板 ！
① 需要 3’-OH、二甲胂酸缓冲液。
③ 底物可以是单链 DNA、
是 3’-OH突出的双链 DNA、
平末端 在 Co2+代替 Mg2+下也可以。
④ 随机添加的 dNTPs。
如果只有一种 dNTP，就添加上 同聚物 。
DNA 5’ 3’
TTT
dTTP,末端转移酶
4,末端转移酶的用途
（ 1）同聚物加尾给 外源 DNA片断 和 载体 分子分别加上互补的同聚物尾巴,以使它们有效地连接 。
外源 DNA 载体 DNA5’ 3’
5’ 3’
CCC
CCC
GGG GGG
dGTPdCTP 末端转移酶
（ 2）再生酶切位点 便于回收克隆片断。
AAGCTT
TTCGAA
5’
5’
HindⅢ 酶切
A
TTCGA
AGCTT
A
Klenow补平
AAGCT
TTCGA
AGCTT
TCGAA
AAGCATTT
TTCGA
AGCTT
TTTTCGAA
末端转移酶dTTP
AAA
AAA外源 DNA
（ 3）非放射性标记 DNA片断的 3’端
AAGCTTTT
TTCGA
AGCTT
TTTTCGAAAAA
AAA
HindⅢ 位点 HindⅢ 位点连接催化非放射性标记物参入 DNA片断的 3’端。
（生物素 -11-dUTP等）
二,T4多核苷酸激酶
1,来源
T4噬菌体的 pseT基因编码。
从 T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。
多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。
2,功能催化?磷酸从 ATP转给双链或单链 DNA或
RNA的 5’-OH端。
不论 5’-OH端突出与否。
5’
3’ HO- -OH5’
3’ HO- -OH
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
ATP T4多核苷酸激酶如果 ATP的?磷酸带有 32P标记，就会被转移到
DNA的 5’端。
但天然的 DNA的 5’端都是磷酸化的。
3,多核苷酸激酶的用途
DNA 5’-OH端磷酸化、标记 DNA的 5’端。
5’
3’ HO- -OH5’
3’ HO- -OH
3’ 32P- -OH5’
3’ HO- -32P 5’
(?-32P)ATP 多核苷酸激酶
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
碱性磷酸酶
（ 1）正向反应（ forward reaction）
（ 2）交换反应标记法反应混合物中具有超量 (?-32P)ATP和 ADP时，多核苷酸激酶能催化 (?-32P)ATP的?-32P与 DNA5’端的磷酸 交换 。
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
3’ 32P- -OH5’
3’ HO- -32P 5’
(?-32P)ATP,ADP 多核苷酸激酶反应效果不理想。
三、碱性磷酸酶
1,碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。
Bacterial alkaline phosphatase,BAP
（ 1）细菌性碱性磷酸酶
（ 2）小牛肠碱性磷酸酶
Calf intestinal alkaline phosphatase,CIP
从小牛肠中纯化出来。
具有抗热性。
SDS中加热 68oC可完全失活。
2,碱性磷酸酶的特性催化脱掉 DNA（或 RNA） 5’端的磷酸 根。
3’ P- -OH5’
3’ HO- -P 5’
5’
3’ HO- -OH5’
3’ HO- -OH
碱性磷酸酶
3,碱性磷酸酶的功能
（ 1）防止线性化的载体份子自我连接单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。
AAGCTT
TTCGAA
HindⅢ 酶切
A-OH
TTCGA-P
P-AGCTT
HO-A
碱性磷酸酶
5’
5’
5’
A-OH
TTCGA-OH
HO-AGCTT
HO-A
OH与 OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。
但同一酶切后的 外源 DNA的 5’端有 P，能与脱磷酸的载体 OH连接。
A
TTCGA
AGCTT
A
AGCTT A
A TTCGA
连接酶 -OH与 -OH连不住其中每条链上都有一个 nick，但转入细菌后会被修复。
3’ P-AGCTT A-OH5’
3’ HO-A TTCGA-P 5’ 外源 DNA
第五节 核酸外切酶 Exonucleases）
是一类从多核苷酸链的一头开始催化 降解 核苷酸的酶。
一、单链 DNA外切酶
1,大肠杆菌核酸外切酶 I（ exo I）
5’?3’外切 识别 5’-OH
2,大肠杆菌核酸外切酶 Ⅶ （ exo Ⅶ ）
5’?3’,3’?5’外切识别 3’-OH,5’-P
二、双链 DNA外切酶
1,核酸外切酶 Ⅲ （ exo Ⅲ ）
3’?5’外切 识别 3’-OH
主要用途：
在 DNA双链的末端产生出单链区域。
5’
5’
5’ 5’
exo Ⅲ
与 klenow配合进行 3’端标记
-OH
HO-
2,l核酸外切酶（ l exo）
5’?3’外切。
主要用途：
使 DNA双链变成单链（短）。
5’ P-
-P 5’
5’
5’
l exo
成为测序模板。
识别 5’-P（但不能降解 5’-OH）
3,T7基因 6核酸外切酶
5’?3’外切。
用途与 l exo一样。
既能识别 5’-P，又能识别 5’-OH。
5’
5’
5’
5’
已被克隆到大肠杆菌中表达。
DNA外切酶 切割方式 识别位点单链大肠杆菌核酸外切酶 I
（ exo I）
5’?3’ 5’-OH
大肠杆菌核酸外切酶 Ⅶ
（ exo Ⅶ ）
5’?3’
3’?5’
5’-P
3’-OH
双链核酸外切酶 Ⅲ （ exo Ⅲ ） 3’?5’ 3’-OH
l核酸外切酶（ l exo） 5’?3’ 5’-P
T7基因 6核酸外切酶 5’?3’ 5’-P
5’-OH
第六节 单链 DNA内切酶一,S1核酸酶
1,来源稻谷曲霉（ Aspergillus oryzae）。
2,特性
（ 1）高度单链特异性
（ 2）反应条件
① 低水平 Zn2+
② pH4.0~4.3
3,S1核酸内切酶的功能
（ 1）催化单链 RNA或 DNA降解。
（ 2）切掉双链核酸中的单链区。
S1
S1
发卡或有缺口的部位。
（ 4）不能降解双链 DNA或 RNA-DNA杂交链
ATGCAT GCATGC
TACGTA CGTACGT
甚至能识别单个核苷酸的单链区！
（ 3）降解限制酶切形成的单链突出端。
4,S1核酸酶的用途
（ 1）定位 RNA
DNA
RNA S1
S1
200bp 400bp
某限制酶切后再与 RNA杂交某限制酶位点（参照物）
内切酶位点不能位于内含子序列中！
RNA
RNA位于某限制酶位点 左 200bp和右 400bp。
RNA位置不能配对的内含子区域形成的单链环被
S1切掉。
mRNA
DNA
（ 2）用 mRNA测定基因中的外显子序列二,Bal 31核酸酶
1,来源埃氏交替单胞菌（ Alteromonoas espejiana）
2,功能既有 单链 特异的 DNA（ RNA）内切酶；
又有 双链 特异的 DNA外切酶。
降解双链 DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。
4,Bal31的用途定位测定 DNA片断中的限制酶位点分布。
3,反应条件
Mg2+,Ca2+
EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合 Ca2+，
可终止反应。
EcoR I EcoR IBamH I
Hind III
与对照组 （ 不用 Bal31消化 ） 只用相同的酶切的电泳比较 。
根据酶切片断消失的先后顺序,判断这些片断在原 DNA中的位置 。
用 Bal31消化线性 DNA,并在 不同的时间 加入
EGTA终止反应,再酶切电泳 。
Bal31控制消化法：
EcoR I EcoR IBamH I
分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。
Hind III
EcoR I EcoR IBamH I
Hind III
EcoR I EcoR IBamH I
Hind III
Bal31
分别用原内切酶切后电泳,
判断片断数目和大小 。
复习思考题
试述 II型限制性核酸内切酶的主要特性及用途。
