湖南中医药大学研究生选修课
Principles of Genetic Engineering
基 因 工 程 原 理湖南中医药大学 鲁耀邦基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定第五讲 目的基因的克隆与分离目的基因：
准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组 DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组 DNA切成不同大小的片断。
酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。
1,优点
2,缺点目的基因 内部 也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I BamH I
gene
二、随机片断化
1,限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间,使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开 。
① 内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。
（ 1）限制性内切酶的选用原则
1） 4bp的内切酶平均每 46（ 4096） bp一个切点。
2） 6bp的内切酶平均每 44（ 256） bp一个切点。
随机程度高。如 HaeⅢ,AluI,Sau3A。
② 内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。
（ Sau3A— BamH I）
2,机械切割法
（ 1）超声波超声波强烈作用于 DNA，可使其断裂成约 300bp的随机片断。
（ 2）高速搅拌
1500转 /分下搅拌 30min，可产生约 8kb
的随机片断。
1976年 H.G,Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于 1979年在 science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸 tRNA基因的论文。
第二节 化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法,磷酸三酯法、
亚磷酸三酯法,固相合成法自动化合成法。
① 保护 dNTP的 5’端 P 或 3’端 -OH
③ 用酸或碱的脱保护
（ 1）原理
1,磷酸二酯法
② 带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。
带 5’保护的单核苷酸与带 3’保护的另一个单核苷酸以 磷酸二酯键 连接起来。
（ 2）合成过程下一个 5’端保护的单核苷酸又可以同 3’端保护的二核苷酸聚合。
原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在 3’端磷酸和 5’-OH上都先连接了一个保护基团。
2,磷酸三酯法
DMT— 二甲氧基三苯甲基将第一个核苷酸的 3’-OH端固定在 固相支持物上 。
固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的 DNA,5’ DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相支持物固相支持物
C
化学合成的 DNA片断一般在 200bp以内。
二,化学合成 DNA片断的组装用 T4多核苷酸激酶 使各个片段的 5’端带上磷酸。
1,互补连接法预先设计合成的片断之间都有 互补区域,不同片断之间的互补区域能形成有 断点 的完整双链 。
（ 2） 5’端磷酸化
（ 1）互补配对
（合成的 DNA单链的 5’端是 -OH）
T4 DNA连接酶
T4多核苷酸激酶 使 5’-OH磷酸化完整的 DNA双链
（ 3）连接酶连成完整双链
2,互补延伸连接法预先设计的片断之间有 局部互补区,可以相互作为另一个片断延长的引物，用 DNA聚合酶 延伸成完整的双链。
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
T4DNA连接酶
Klenow片段 引物
1,直接合成基因三,寡聚核苷酸化学合成的优点
2,合成引物（ 20mer左右）
（ 1） mRNA的含量很低，很难作 cDNA
3,合成探针序列
4,定点突变合成合成带有 定点突变 的基因片断。
（ 2）有些基因比较短，化学合成费用较低
DNA合成仪
5,合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点 人工接头 （ Adaptor）或 衔接物 （ Linker）序列。
EcoRI
EcoRI Linker
Adaptor
将某种生物细胞的 整个基因组 DNA切割成大小合适的片断,并将 所有这些片断 都与适当的载体连接,引入相应的宿主细胞中 保存和扩增 。
理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体的全部基因,称为基因文库 。
一,基因文库的构建
1,基因文库 （ gene library）
第三节 目的基因的保存与文库构建
（ 2）目前常用的载体
2,构建基因文库的载体选用载体能够容载的 DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的 重组子 的数目。
载体容量越大，所要求的 DNA片断数目越少，
所需的 重组子 越少。
（ 1）对载体的要求
载体系列,容量为 24 kp
cosmid载体,容量为 50 kb
YAC,容量为 1 Mb
BAC,容量为 300 kb
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。
（ 1）染色体 DNA大片段的制备
3,基因文库构建的一般步骤超声波（ 300bp）或机械搅拌（ 8kb）。
① 物理切割法：
内切酶 Sau3A进行局部消化。可得到 10-
30kb的随机片断。
② 酶切法：
（ 2）载体与基因组 DNA大片段的连接
① 粘性末端直接连接载体与外源 DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。
如,Sau3A与 BamH I的酶切末端。
直接连接、人工接头或同聚物加尾。
②人工接头法（ adapter）
人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头粘性末端
CCC CCC末端转移酶粘性末端
③ 同聚物加尾
4,基因组文库的大小一个文库要包含 99%的基因组 DNA时所需要的克隆数目。
N= ln (1-p)ln (1-f)
p,文库包含了整个基因组 DNA的概率（ 99%）
f,插入载体的 DNA片断的平均长度占整个基因组 DNA的 百分数
N：所需的重组载体数（克隆数）
例如：人的基因组是 3× 109 bp，插入 DNA片断的平均长度如果是 1.7× 104 bp
N= ln (1-p)ln (1-f) = ln (1-99%)ln (1-f) = 4.61× Gf
N= 4.61×
G
f
G,Genome大小； f,fragment大小
N= 4.61×
G
f = 4.61×
3× 109
1.7× 104 = 8.1× 105
1,cDNA
以 mRNA为模板 逆转录 出的 DNA称 cDNA。
2,cDNA library
二,cDNA文库的构建
mRNA
cDNA
3’
3’
5’
5’
反转录酶引物利用某种生物的 总 mRNA合成 cDNA，再将这些
cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称 cDNA文库。
（ 1） 不含内含子序列 。
（ 2）可以在细菌中直接表达。
（ 3）包含了所有 编码蛋白质的基因 。
（ 4）比 DNA文库小 的多，容易构建。
4,构建 cDNA文库的一般步骤
（ 1）总 RNA（ total RNA）提取
3,cDNA文库的特点提取总 RNA有商业化的试剂盒（ kit）。
分离 mRNA用商业化的 Oligo dT纤维柱。
利用 mRNA 都含有一段 polyA 尾巴,将
mRNA从总 RNA（ rRNA,tRNA等 ） 中分离纯化 。
mRNA只占总 RNA的 1%-2%。
（ 2） mRNA的分离纯化
① 原理
② mRNA的分离纯化
Column（柱）
反转录酶
（ 3） cDNA的合成
① cDNA第一链合成逆转录酶能以 RNA为模板合成 DNA。
用 Oligo dT（或随机引物）作引物，合成
cDNA的第一链。
mRNA
cDNA
3’
5’
5’ AAAAAAA
TTTTTTT
Oligo dT引物用 碱 处理或用 RNase H降解 mRNA-DNA杂交分子中的 mRNA。
mRNA
cDNA
3’
3’
5’
5’
反转录酶引物
mRNA
cDNA第一链
3’
3’5’
5’
引物
cDNA第一链 3’5’ 引物
② 降解 mRNA模板或 RNaseH碱剩下的 cDNA单链的 3’末端一般形成一个 弯回来的双链发卡结构 （ 机理不明 ）,可成为合成第二条 cDNA链的引物 。 用 DNA聚合酶合成第二链
DNA。
cDNA第一链5’
cDNA第二链合成 DNA聚合酶
cDNA第一链
cDNA第二链
5’
3’
③ cDNA第二链合成
④去掉发卡结构核酸酶 S1
用 核酸酶 S1可以切掉发卡结构（但这会导致
cDNA中有用的序列被切掉！）。
cDNA第一链
cDNA第二链
5’
3’
cDNA第一链
cDNA第二链
5’
3’ 5’
3’
这种酶能识别 mRNA-cDNA杂交分子中的
mRNA,并将其降解成许多小 片断 。
妙用 RNaseH
小片断正好成为 DNA聚合酶的引物，用来合成 冈崎片断 。
DNA Pol I除去引物并修补后再使用 DNA连接酶 连成一整条 DNA链。
mRNA
cDNA
3’
5’ 反转录酶引物
mRNA
cDNA第一链
3’
5’ 引物
mRNA
cDNA第一链
3’
5’
mRNA mRNA
DNA
聚合酶DNA 聚合酶
cDNA第二链
cDNA第一链
3’
5’
RNaseH
DNA ligase去引物在双链 cDNA末端接上 人工接头,即可与载体连接,转入受体菌 。
或借助 末端转移酶 给载体和双链 cDNA的 3’端分别加上几个 C或 G,成为粘性末端 。
5,cDNA与载体连接：
接上人工接头粘性末端
CCC CCC末端转移酶
6,cDNA文库的大小一个 cDNA文库要包含 99%的 mRNA时所需要的克隆数目。
N= ln (1-p)ln (1- )
p,文库包含了完整 mRNA的概率（ 99%）
,某一种低丰度（不足 14份拷贝） mRNA占细胞整个 mRNA的比例
N：所需的重组载体数（克隆数）
1n
1
n
三、文库的查询（ screening）
用目的基因探针与文库中的重组载体进行 Southern blot杂交。
文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析第四节 目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离
1,探针柱分离特异 mRNA
根据已知的基因序列合成探针,结合到 纤维素柱 上,用来分离纯化该基因的 mRNA。
富集 特定基因的 mRNA或 cDNA模板。
纤维柱探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
Total mRNA
纤维柱探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
过柱与探针碱基互补的 mRNA结合到柱上，其它 mRNA流走。
特异
mRNA
洗脱
RT-PCR
2,mRNA消减杂交原理：
羟基磷灰石柱结合单链 DNA-RNA或 DNA-DNA双链，
不结合单链 DNA。
（ Hydroxylapatite column）
从表达 A蛋白 和不表达 A蛋白的组织细胞中分别提取和分离 总 mRNA。
将表达 A蛋白的 mRNA合成 cDNA第一链 。 再同不表达 A蛋白的总 mRNA杂交成 cDNA-mRNA双链 。
不能杂交的 cDNA就包括特异表达的 A基因 的 cDNA
单链 。
用 羟磷灰石柱 收集单链 cDNA,合成为双链 DNA进行扩增,克隆,测序 。
A
A
A组织 B组织总 mRNA（ A） 总 mRNA（ B）
含蛋白 A的 mRNA 不含蛋白 A的 mRNA
总 cDNA第一链
A
杂交内含蛋白 A 的 cDNA
羟磷灰石柱过柱吸收
RNA-
DNA
单链滤过羟磷灰石柱
B
A PCR cDNA文库
3,mRNA差异显示 PCR（ DD RT-PCR）
mRNA differential display RT-PCR
（ 1） 3’端的锚定引物
Oligo(dT)引物的 3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是 T）。
AAAAAAAAAAAAAAAA
mRNA 3’ 5’
NM TTTTTTTT
M,A,G or C
N,A,G,T or C
5’ 3’
（ 2） 12种锚定引物
AG TTTTTTTT 5’ 3’
CG TTTTTTTT 5’ 3’
GG TTTTTTTT 5’ 3’
TG TTTTTTTT 5’ 3’
AA TTTTTTTT 5’ 3’
CA TTTTTTTT 5’ 3’
GA TTTTTTTT 5’ 3’
TA TTTTTTTT 5’ 3’
AC TTTTTTTT 5’ 3’
CC TTTTTTTT 5’ 3’
GC TTTTTTTT 5’ 3’
TC TTTTTTTT 5’ 3’
（ 3） 5’端的随机引物
10 mer
AAAAAAAAAAAAAAAA
mRNA 3’ 5’
NM TTTTTTTT 5’
3’
扩增 cDNA第一链。
RT
NM TTTTTTTT 5’ cDNA 3’
NNNNNNNNNN5’ 3’
NNNNNNNNNN5’ 3’
cDNA第二链，并 PCR
（ 4）随机引物与锚定引物成对扩增
12种锚定引物，若与 20种随机引物，可组成
240组引物。
引物组合：
240组能分出 20000多条带！
实验结果：
如果每条带相当于一种 mRNA,20000 mRNA
基本上反映了一种特定细胞中全部的 mRNA。
在测序胶上，每组扩出 50-100条长度为 100-
500bp的带。
（ 5）随机 -锚定引物 PCR的产物电泳比较不同组织的 240组引物组合 PCR产物在测序胶中电泳。
选择有差异的带，进一步 PCR作探针。
筛选文库，找到差别基因的全长序列。
二,PCR扩增获得目的基因
1,直接从基因组中扩增
（ 1）提取基因组 DNA作模板
（ 2）根据目的基因序列设计引物
（ 3） PCR扩增真核生物基因组含有内含子！
适合扩增原核生物基因。
原核基因组部分原核细胞提取基因组 DNA
PCR扩增
（ 1）提取基因组 total RNA
（ 2）反转录合成总 cDNA作模板
（ 4） PCR扩增
（ 3）根据目的基因序列设计引物
2,从 mRNA中扩增,RT-PCR
原核生物不易得到 mRNA，也不含有 polyA
尾。
适合扩增真核生物基因。
目的基因的引物 1
反转录成目的基因 cDNA第一链目的基因的引物 2
目的 基因 cDNA第二链
PCR
mRNA
克隆外源基因外源 DNA 载体 DNA
重组分子原核细胞 真核细胞扩增或表达 表达连接转化或转导 电穿孔或显微注射受体细胞基因的重组与转移一、粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的 5’端磷酸 与 3’-OH
连到一起。
第五节 DNA片段的体外连接
1,两段 DNA的连接依靠粘性末端
2,DNA片断与载体的连接依靠粘性末端
ligase
nick
二、齐平末端（ blunt end）的连接
5’端与 3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。
1,直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的 1%。
5’ 5’
5’ 5’ 3’
3’
3’
3’ -OH -OH
-P -P
P- P-
HO- HO-
5’
3’ -OH-PP-
HO-
5’
3’
1972年，斯坦福大学的 P,Labban和 P,Kaiser
提出。
（ 1）同聚加尾法
2,人工加尾形成,粘性末端”
DNA末端转移酶 能在没有模板的情况下给 DNA
的 3’-OH端 加上脱氧核苷酸。
①原理：
分别给载体和插入片断加上 互补的 核苷酸。
②加尾 — 碱基互补
④ 缺点：
③ 优点：
能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。
非酶切位点用 T4 DNA连接酶连到平端 DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
（ 2）衔接物 (linker)连接
① linker
用化学合成法合成的一段 10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的 平端双链 。
GGAATTCC
CCTTAAGG
EcoR I linker：
② linker的作用
④ 缺点：
1）可以用内切酶把插入片段切下来。
如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段
2）能给载体连接上 Polylinker:
③ 优点：
（ 3） DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
5‘p-GATCCCGG-OH3’
GGCC-p5’ BamHI adapter
用 T4DNA连接酶连到 DNA分子的两端，
直接成为人工粘性末端。
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。
② adapter的作用
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’
HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
P-
-P
5‘p-GATCCCGG-
GGCC-
-CCGG
-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-
GGCC-
CCGG
GGCCCTAG-P5’
CCGGGATCCCGG-OH
GGCCCTAGGGCC-P5’
接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与 DNA片段的连接。
③优点：
连上后就能用。
④缺点：
先用小牛肠 碱性磷酸酶 （ CIP） 处理接头,水解掉其 5’端的磷酸,防止自我连接 。
（ 以后再用 T4多核苷酸激酶 加上磷酸 。 ）
⑤防止自我连接
5‘p-GATCCCGG-OH
HO-GGCC-P
P-CCGG-OH
HO-GGCCCTAG-P5’
CCGGGATCCCGG-OH
HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
5‘GATCCCGG-OH
HO-GGCC5’
5’CCGG-OH
HO-GGCCCTAG5’
CIP处理
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’
HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
P-
-P
5‘GATCCCGG-
HO-GGCC
CCGG-OH
-GGCCCTAG5’
5’GATCCCGG-OH3’
HO-GGCC5’
缺口缺口
HO-
-OH
CIP处理
T4 ligase
虽然有缺口，但仍然能与 DNA片断连接。
三,PCR产物的连接
1,在引物的 5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；
（ 1）设计原则
（ 2）带酶切位点的引物的结构
3’端 15-20bp与模板互补；
5’端 6-10bp是某个内切酶的识别序列。
（ 5’端多余的 3-5bp属 保护碱基 ）
避免与所扩增的 DNA片断内部酶切位点重复。
引物 1GCAGAATTC 互补序列模板
EcoR I位点
5’- -3’
GCAGAATTC 互补序列5’- -3’
3’
模板
GCAGAATTC 互补序列 PCR产物5’- -3’
3’
复性延伸模板模板
3’
3’
GCTAGCCGG互补序列模板
BamH I 位点
-5’ 3-’
5’
复性延伸模板模板
3’
3’
GCTAGCCGG互补序列 -5’ 3’-
模板5’
GCTAGCCGGPCR产物 互补序列 -5’ 3’-
引物 2
带酶切位点的 PCR产物
GCAGAATTC PCR产物5’- -3’
GCTAGCCGGPCR产物 -5’ 3’- CGTCTTAAG
CGATCGGCC
EcoR I位点 BamH I位点
AATTC PCR产物5’- -3’
GCTAGPCR产物 -5’ 3’- G
C
EcoR I BamH I
两头各有一个粘性末端！
2,与 T载体直接连接
（ 1） PCR产物两个 3’端一般都有一个 A
Taq DNA聚合酶的特性：在 DNA双链的 3’
端再加上一个多余的核苷酸 （ 优先加 A） 。
（ 2） T载体的两个 3’端人为地各加一个 T
利用 Taq DNA聚合酶，当原料中只有
dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
A
A
dNTP
T
T
dTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物
TA TA
四,DNA体外连接应注意的事项
1,插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。
尽量避免平端连接。
决不能进行非粘性末端连接。
EcoR I EcoR I EcoR I
（ 1）用相同的酶切
（ 2）用同尾酶切
BamH I,Bcl I,Bgl II,Sau3A I,Xho II
都产生 GATC4个碱基的粘性末端。
2,DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。
EcoR I BamH I
EcoR I BamH I
EcoR I BamH I
3,插入基因的开放阅读框（ ORF）正确
（ 1） DNA定向插入
（ 2）起始密码尤其当 载体上有 ATG起始密码的时候，更要注意。
ATGGAATTC
载体
ATGCGGAATTCT
插入片断
EcoR I EcoR I
ATGGAATTC T
重组 但移码突变！
4,防止载体自身环化连接
（ 1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多 10倍以上。
（ 2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的 5’磷酸被除去，不能自我连接。
但可以与插入片断以单链连接。
5’ 3’
载体插入片断
1,载体自身环化连接（能存活）
2,载体之间互相连接（能存活）
3,插入片段互相连接（不能存活）
4,一个载体与几个插入片段重组（能存活）
五、载体和外源 DNA插入片段的连接结果
5,几个载体与一个插入片段重组（能存活）
1,目的增加受体菌细胞膜的通透性。
第六节 重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备使用丧失了 限制体系 的大肠杆菌。如 K12
系列的大肠杆菌。
2,菌种用 CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
3,制备原理
4,制备过程培养大肠杆菌
OD600 至
0.3-0.4
On ice 5-
10 min
4℃ 离心收集菌用冰冷的
60mM CaCl2
重悬
4℃ 离心收集菌
4℃ 离心收集菌分装,-70℃
冻存用冰冷的
60mM CaCl2
重悬
On ice
30 min
用冰冷的
60mM CaCl2
重悬二、重组 DNA导入大肠杆菌
（ 1）转化（ transformation)
大肠杆菌捕获 质粒 DNA的过程。
（ 2）转染（ transfection)
大肠杆菌捕获 噬菌体 DNA的过程。
1,外源 DNA导入细菌的几种方法
（ 3）转导（ transduction)
借助 噬菌体 把外源 DNA导入细菌的过程。
每?g DNA转化成功的细菌克隆数。
3,转化方法
2,转化率简单,但转化效率不高（ 106-108/?g DNA）。
（ 1）热休克法（ heat shock）
转化效率高（高于 109/?g DNA）。
（ 2）电转化法
10ng载体
DNA
100?L感受态菌
On ice混合，静置
10分钟
42oC 1分钟加入 1mL
LB培养基37℃ 摇 1小时10-100?L转化液涂含抗菌素的平板吸附 DNA
摄入 DNA
（ 1）热休克法
LB培养受体菌至
OD600=0.5-0.6
冰浴 15分钟，
2℃ 离心集菌冰冷的水重悬菌体
2℃ 离心集菌冰冷的水重悬菌体
2℃ 离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成
50-300?L
电转仪调为
2.5kV,25?F
脉冲控制器
200-400?
0.5?g质粒 DNA
On ice
混合加入
1mLSOC
培养液37℃ 中速震荡 60分钟10-100?L转化液涂含抗菌素的平板转化
（ 2）电转化法
4,平板培养基培养细菌
10-100?L转化液涂于含抗菌素的平板
37℃ 过夜环形重组质粒质粒自我连接线性载体或 DNA片断进入细菌会被降解。
① 环形质粒数
（ 1）重组质粒
5,影响转化率的因素
①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。
要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。
④储存感受态菌要在 -70℃ 以下。
③ CaCl2处理
⑤使用感受态菌时必须迅速融化。
融化后一般不能再次冻存使用。
（ 2）感受态细胞 （ competent cells)
把重组的噬菌体?DNA或 Cosmid质粒 DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。
6,体外包装的噬菌体的转导
（ 1）体外包装（ in vitro packaging）
（ 2）转导（ transduction）
通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点
（ receptor site),使带有外源基因的重组体
DNA注入受体大肠杆菌进行扩增 。
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因,感染细菌后,在 32℃ 下培养细菌时能够保持溶源性 。
但当温度升高到 44℃ -45℃ 时,就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活,?DNA复制,外壳蛋白合成 。 便于提取外壳蛋白 。
（ 3） cI857基因突变的?噬菌体但由于该噬菌体的 S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。
cI857 其它基因溶源状态（?DNA不转录、不翻译）
DNA
阻遏蛋白阻遏蛋白
44℃ -45℃
DNA转录、翻译合成外壳蛋白
32℃
噬菌体 1 外壳蛋白基因 E发生了无义突变,不能合成头部蛋白,但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。
在 cI857基因突变的?噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型?噬菌体。
（ 4）互补型噬菌体外壳蛋白基因 D发生了无义突变,不能合成头部的包装识别蛋白,但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
噬菌体 2
(5)
体外包装过程体外包装好的重组噬菌体感染受体菌,使受体菌发生溶菌,形成噬菌斑 。 （ 每?g?DNA能形成 106
噬菌斑 ） 。
（ 6）转导转化率高的菌株；
有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；
不育的菌株（不会与其他酵母接合）。
第七节 外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞
1,菌株选择如,ura3-52,trp1-289,
leu2-3,leu2-112,his3?1
（ 1）利用原生质球进行转化
2,酵母的转化方法酵母 原生质体 感受态酶去壁 CaCl2、
PEG
插入外源基因的酵母载体
PEG（聚乙二醇）使 细胞壁 具有通透性，允许
DNA进入。
CaCl2使 细胞膜 具有通透性，允许 DNA进入。
转化酵母 0.1mol/L LiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态
40%
PEG 4000
（ 2）利用 Li+盐进行转化叶盘消毒 切取 土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞
1,叶盘法（ leaf disk)
植物细胞 原生质体纤维素酶和果胶酶 DNA
混合入电击缓冲液
1-2kV,3-25?F电击愈伤组织 幼苗分化
2,电击法（ electroporation)
又称 高速微型子弹射击法（ High-velocity
microprojectiles)
DNA 1.2?m钨弹头吸附 特制手枪射击植物装入
3.基因枪法（ gene gun）
4,农杆菌（ agrobacterium）介导根瘤农杆菌和发根农杆菌,
根瘤农杆菌和发根农杆菌同属于根瘤菌科
，革兰氏阴性菌。它们可以将自己的一部分
DNA转移给植物，进而转化植物细胞，同时农杆菌能从植物细胞中获得营养物质。这两种农杆菌之所以能够转化植物基因，主要是因为它们携带有诱瘤质粒，简称 Ti质粒。该质粒上有一段 DNA，称为 T-DNA，它能转移并整合进植物基因组中，并导致植物冠瘿瘤的形成。
（ 1）原理：
三、导入哺乳动物细胞
1,磷酸钙沉淀法
HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和 DNA的溶液缓慢混合,会形成含磷酸钙和 DNA的沉淀 。
依据不同的细胞类型，平皿上最多能有 10%
的细胞能吸收 DNA沉淀。
不需要载体。（ 2）特点：
脂质体有商业试剂盒（如 Life Technologies）。
2,脂质体（ lipofectin）载体法脂类包埋 DNA，通过细胞膜进入细胞。
直接把外源 DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。
3,显微注射法 (microinjection)
二乙氨乙基（ diethyl-aminoehtyl,DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源 DNA。
4,DEAE— 葡萄糖传染法二乙氨乙基
（ DE AE ）
+ + + + + + + + +
+
+
++++++++
+
+
+
+
DNA
- - - - - -
-
-
--------
-
-
二乙氨乙基
（ DEA E ）
+ + + + + + + + +
+
+
++++++++
+
+
+
+
葡聚糖葡聚糖 +DNA
吸附到细胞表面后被细胞吞入,部分 DNA可以进入到细胞核里 。
DEAE-dextran 细胞 外源 DNA预处理摄入
DEAE-dextran
外源 DNA
细胞混合
DEAE-dextran对细胞有毒 !
5,病毒（ virus）介导
（详见另外章节）
外源基因导入细胞的方法基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定第六讲 克隆基因的检测与鉴定一、抗药性标记及其插入失活选择法
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因,
Tetr和 Ampr。
Tetr上有插入位点 BamH I和 Sal I;
Ampr上有插入位点 Pst I。
第一节 载体表型选择法
1,原理：
pBR322
（ 1）四环素：
（ 2）氨苄青霉素抗性基因：
2,pBR322抗菌素标记选择产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘 -青霉素指示液（ I2-KI-Aampicillin）
（蓝灰色）褪色。
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
（ 3）环丝氨酸：
3,选择过程：
如果在 Tetr上插入外源 DNA，导致四环素抗性基因失活，可用 四环素加环丝氨酸 平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
（ 1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基
（ 2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果 Ampr上插入外源 DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘 -青霉素指示液选择。
二,?-半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶乳糖 半乳糖 葡萄糖
X-gal 半乳糖 5-溴 -4-氯靛蓝
+
+
深蓝色
1,原理：
载体 上有一段?-半乳糖苷酶基因 （ Lac Z） 的?片段
（ 氨基端 ）,其上有外源 DNA的插入位点 。 受体菌基因组 中有突变的?-半乳糖苷酶基因 （?片段缺失 ） 。
可以被 IPTG诱导表达 。 载体和受体菌基因组可以 互补 形成完整有功能的?-半乳糖苷酶 。
假阳性：
如果插入的外源 DNA正好是 3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。
2,选择过程
-半乳糖苷酶使 X-gal分解成蓝色产物。
利用插入的外源基因的 表达产物 特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。
一、原理：
第二节 根据插入基因的表型选择
1.弥补缺陷
his-
his+
受体菌：
外源基因：
在不含组氨酸的培养基中生长小鼠的二氢叶酸还原酶（ DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR
载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含 DHFR的克隆才能生长例：
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
2,增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。
第三节 DNA电泳检测法分子量
Marker
载体重组克隆二、酶切电泳筛选法
1,原理：
根据已知的外源 DNA序列的限制性酶切图谱，
选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（ DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。
A B
A或 B
不同克隆的酶切结果筛选过程表型筛选加酶切筛选
A
A
T
T
A
AT
T
三,PCR扩增检测法
1,原理
PCR能在模板序列上扩增出预期 DNA片断。
2,过程
（ 1）从重组克隆中提取质粒（或 DNA）。
（ 2）用外源 DNA插入片断引物作 PCR。
（ 3）电泳 PCR产物。
（ 4）检查是否有 PCR产物。
（ 5） PCR产物的长度是否与外源基因一致。
1,核酸杂交第四节 核酸杂交检测法一、原理：
重组克隆与探针杂交。
3,识别标记
32P 或 125I 。（ 1）放射性同位素
2,检测用的探针与外源 DNA插入片断互补的序列。
（ 2）非放射性标记 荧光素二、核酸杂交检测方法用 DNA（或 RNA）探针检测 DNA样品。
1,Southern blotting
从宿主细胞中提取 DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。
只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前 酶切后插入片断载体
Southern
blot 筛选结果
（ 1）原位杂交筛选特点：
对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。
（ 2） R-环检测法
DNA-RNA杂交。
1）原理：
2）选择过程在 70%甲酰胺中，把 DNA双链变性，复性的时候,DNA-RNA杂交分子比 DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种 R-环形结构。
用外源基因的 mRNA与重组载体杂交。
缺点：需要电镜！
2,Northern blotting
用 DNA（或 RNA）
探针检测 RNA样品。
主要检测插入片断是否被转录。
从宿主细胞中提取
RNA，再用探针杂交。
利用抗体作为,探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：
一、放射性抗体检测法第五节 免疫化学检测法
1,抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。 蛋白 —— 蛋白“杂交”
待测基因产物蛋白一抗 二抗
125I 标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗
125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白 一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白 一抗 二抗
125I 标记的二抗结合蛋白
125I标记的二抗
2,放射性抗体检测法过程
3,Broome-Gilbert双位点检测法质粒基因 A 插入基因 B
表达质粒蛋白 A 外源蛋白 B
融合蛋白检测融合蛋白。
既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
重组质粒重组质粒重组质粒固相支持滤膜 抗 A抗体
125I标记的抗 B抗体质粒蛋白 A 外源蛋白 B
质粒蛋白 A 外源蛋白 B固相支持滤膜抗 A抗体发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中,当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时,
就会与抗体反应形成,沉淀圈,。
1,原理抗原 —— 抗体凝集反应。
检测分泌型产物。
2,方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1,原理：
一抗（ primary antibody）,
与目标分子的特异结合。
二抗（ secondary antibody）：
与一抗的特异性结合。
酶连（ enzyme-linke）,
二抗上携带一种酶 能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。
待测基因产物蛋白一抗 二抗酶待测基因产物蛋白 一抗 二抗无色的底物 有色的产物比色观察酶
2,ELISA检测的一般步骤
（ 1）固定样品将待测样品加入 96孔微量滴定板 （ microtiter
plate） 的孔中,干燥后就被固定在 孔底 。
孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。
（ 2）一抗结合一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、
脲酶等）。
（ 3）二抗结合二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。
（ 4）显色反应在特殊的分光光度仪（ 酶标仪 ）上比色，打印出结果。
（ 5）比色
3.ELISA的局限性有效,但准确性稍差 （ 主要取决于一抗的特异性 ） 。
必须与其他方法一起综合考虑 。
最好用单克隆抗体（ monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗四、免疫印迹（ western blotting）法
1.原理：
在蛋白质凝胶电泳以后，用 转膜和免疫 的方法检测胶上的蛋白质泳带。
（ 1） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质 维持线性状态,并与蛋白质结合，使蛋白质 带上负电荷 。
① SDS:
（ SDS-PAGE）：
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）：
（ Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动,移动的速率主要取决于其分子量大小 （ 链的长短 ）,从而把不同分子量的肽链分开 。
电泳 buffer
电泳 buffer
点样电泳方向
③蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液,与待测样品一起电泳,
为样品蛋白质提供分子量估计 。
商品化供应
Da
道尔顿 (质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一 。
一克约为 6× 1023道尔顿
Dalton
SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色：
考马斯亮蓝：
灵敏度底、只能检出 >0.3-1μg/带，但可褪色回收。
硝酸银：
灵敏度高、可检出 2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
1）直接染色直接染色电泳结果
（ 2） Western blotting
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法,转到膜上 （ 硝酸纤维素膜,膜,中性尼龙膜等 ） 。
① Western（转膜）
胶里的蛋白质带在电场的作用下 横向 转移到正极一侧的膜上 。
膜胶蛋白
Western装置
② Blotting
原理与 ELISA相同。
待测蛋白硝酸纤维素膜 一抗 二抗辣根过氧化物酶底物 产物，
并发出光
PAGE胶 待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶,HRPO
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（ 二抗上带有 HRPO）。
4）清洗掉未结合的二抗。
5）用 HRPO的底物浸泡膜。
6）暗室里曝光，冲洗胶片。
③ Blotting过程
Immuno
Blotting
④ 结果多克隆抗体
Blotting的结果单抗 blotting结果一、无细胞翻译系统第六节 转译筛选法能把外源的 mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。
如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。
借助无细胞翻译系统,通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录,来筛选其产物是否符合预期 。
适用于 mRNA转录丰度高的外源基因。
二,转译筛选
mRNA
无细胞翻译系统
35S标记的甲硫氨酸翻译 35S标记的肽链
PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体 +外源 DNA
转录与预期的产物分子量相符？
三、杂交抑制转译法
mRNA一旦与 DNA杂交成 RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。
单链 mRNA
核糖体小亚基核糖体大亚基能翻译
mRNA
DNA
核糖体小亚基 核糖体大亚基不能翻译
1,原理
2,过程四、杂交释放转译法
1,原理：
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的 cDNA与它的 mRNA杂交吸附,然后洗脱,释放出与它对应的 mRNA,进行体外转录 。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物 （ 如分子量,免疫源性等 ） 。
2,过程硝酸纤维素滤膜载体和插入的 cDNA
总 mRNA
cDNA基因的
mRNA
杂交洗脱
cDNA基因的
mRNA 体外翻译
cDNA编码的蛋白电泳凝胶放射自显影
cDNA编码的蛋白硝酸纤维素滤膜载体和插入的 cDNA
硝酸纤维素滤膜载体和插入的 cDNA
收集 35S标记的氨基酸专门设计检测能同 DNA特异结合的蛋白质因子。
待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的 DNA序列 放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的 DNA序列 放射性标记五,DNA-蛋白质相互作用筛选法一般克隆与筛选策略第七节 几种常用的 真核生物重组基因选择方法真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。
二氢叶酸 四氢叶酸二氢叶酸还原酶（ dihydrofolate reductase,DHFR）
一、哺乳动物基因转移的选择标记
1,胸苷激酶（ thymidine kinase,tk）
（ 1） TK选择原理
①四氢叶酸的必要性
DHFR
②氨甲喋啉（ Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉 （ 或氨基喋啉 ） 是叶酸的类似物 。 能抑制二氢叶酸还原酶,从而阻断 dATP,dCTP
和 dTTP的合成：
dUMP dATP TTP
dCTP 氨甲喋啉抑制抑制
④ 胸苷酸激酶 的补救作用
TK+细胞 能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（ T）合成 TTP，存活。
T tk
③ 次黄嘌呤 的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成 dATP和 dCTP。
dUMP dATP TTP
dCTP 次黄嘌呤补救氨甲喋啉抑制抑制
① HAT培养基：
Tk- 细胞株。
TK基因。
② 宿主细胞
③ 载体标记
（ 2） TK选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。
(hypoxanthine,aminopterin,thiymidine）
只有转入 TK基因的细胞才能生存。
真核细胞核苷酸的合成需要 四氢叶酸 提供甲基。
2,二氢叶酸还原酶基因（ DHFR）
（ 1） 选择原理
①二氢叶酸还原酶的必要性
dUMP dATPTTP
dCTP
四氢叶酸四氢叶酸
DHFR+细胞二氢叶酸 四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸
DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。
能在 无胸腺嘧啶和次黄嘌呤 的培养基中生存不需要补救！
DHFR- 细胞
DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。
不能在无 胸腺嘧啶和次黄嘌呤 的培养基中生存。
需要补救！
② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救
dUMP dATPTTP
dATP 次黄嘌呤补救胸苷补救无四氢叶酸提供甲基,dNTP合成受阻 时，
胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救,
DHFR-细胞株（不能在 无核苷酸 的培养基中生长）。
① 宿主细胞
（ 2）选择过程透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。
② 无核苷酸的培养基需要 胸腺嘧啶和次黄嘌呤 补救！
③ 氨甲喋呤“加压”
添加少量氨甲喋啉抑制 内源性 DHFR的补救作用，可提高选择。
DHFR+基因。
④ 载体标记只有转入 DHFR+基因的细胞才能生存。
DHFR-
DHFR-DHFR+ DHFR+ live
die
无核苷酸的培养基是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但 不影响真核生物 。
3,新霉素抗性基因（ neor）
（ 1）选择原理
① 新霉素（ neomycin）
新霉素的类似物，是一种氨基糖苷，对 真核细胞和原核细胞都有毒性 。
② G418（ geneticin）
③ 新霉素抗性基因 --neor
细菌的新霉素抗性基因（ neor）编码一种 磷酸转移酶（ APH）,能使 G418失活。
G418真核细胞死亡
G418
存活neor 真核细胞含 致死剂量 G418的完全培养基。
① G418培养基真核细胞株均可。
neor基因。
②宿主细胞
③载体标记
（ 2）选择过程
G418：（ 100-800?g/mL）
CAT是由大肠杆菌转座子 Tn9编码的，催化 氯霉素发生乙酰化 失活。
氯霉素
cat
含氯霉素的完全培养基。
真核细胞株均可。
cat基因。
乙酰氯霉素
4,氯霉素乙酰转移酶（ CAT）
（ 1）选择原理
（ 2） 选择条件
（ 3） 宿主细胞
（ 4）载体标记
chloramphenicol acetyl transferase
在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。
（ 5） CAT分析方法
② 免疫学检查：
用抗 CAT的血清进行 Western blot或 ELISA，
检查 CAT的表达。
Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen,
Other kits to assay for CAT protein
using ELISA assay are available from Roche
Molecular Biochemicals and Molecular Probes.
① 分析乙酰氯霉素二、植物转化体报告基因筛选法
（ 1） 大肠杆菌的 β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶
（ β-D-glucuronidase,GUS）；
（ 2）细菌和萤火虫的荧光素酶
（ luciferase）；
（ 3）水母绿色荧光蛋白（ GFP）基因
（ Green Fluorescent Protein）。
1,报告基因（ reporter gene)
（ 4）其它
2,几种报告基因的作用原理
4-甲 -β-D-葡糖醛酸 荧光产物GUS
GFP
紫外光照发绿色荧光
5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-葡糖醛酸蓝色水解产物
GUS
Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP
转入萤火虫的
luciferase的烟草烟草叶片表达 B
型肝炎抗原植物细胞中适用的报道基因酶活性 是否显性 方法是否成熟新霉素磷酸转移酶 显性 成熟潮霉素磷酸转移酶 显性 成熟二氢叶酸还原酶 显性 成熟氯霉素乙酰基转移酶 显性 成熟庆大霉素乙酰基转移酶 显性 成熟胭脂碱合成酶 隐性 成熟章鱼碱合成酶 隐性 成熟
β-D-葡萄糖苷酶 隐性 成熟链霉素磷酸转移酶 显性 成熟萤火虫荧光素酶 隐性 成熟细菌荧光素酶 隐性 成熟苏氨酸脱氢酶 显性 成熟磷酸肌醇乙酰转移酶 显性 成熟乙酰乳酸合酶 显性 不成熟绿色荧光蛋白 显性 成熟
Bromoxynil 硝化酶 显性 不成熟
5-enolpyruvylshikimate-3磷酸转移酶显性 成熟复习思考题
试述 cDNA文库的特点和构建 cDNA文库的一般步骤。
Principles of Genetic Engineering
基 因 工 程 原 理湖南中医药大学 鲁耀邦基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定第五讲 目的基因的克隆与分离目的基因：
准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组 DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组 DNA切成不同大小的片断。
酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。
1,优点
2,缺点目的基因 内部 也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I BamH I
gene
二、随机片断化
1,限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间,使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开 。
① 内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。
（ 1）限制性内切酶的选用原则
1） 4bp的内切酶平均每 46（ 4096） bp一个切点。
2） 6bp的内切酶平均每 44（ 256） bp一个切点。
随机程度高。如 HaeⅢ,AluI,Sau3A。
② 内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。
（ Sau3A— BamH I）
2,机械切割法
（ 1）超声波超声波强烈作用于 DNA，可使其断裂成约 300bp的随机片断。
（ 2）高速搅拌
1500转 /分下搅拌 30min，可产生约 8kb
的随机片断。
1976年 H.G,Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于 1979年在 science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸 tRNA基因的论文。
第二节 化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法,磷酸三酯法、
亚磷酸三酯法,固相合成法自动化合成法。
① 保护 dNTP的 5’端 P 或 3’端 -OH
③ 用酸或碱的脱保护
（ 1）原理
1,磷酸二酯法
② 带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。
带 5’保护的单核苷酸与带 3’保护的另一个单核苷酸以 磷酸二酯键 连接起来。
（ 2）合成过程下一个 5’端保护的单核苷酸又可以同 3’端保护的二核苷酸聚合。
原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在 3’端磷酸和 5’-OH上都先连接了一个保护基团。
2,磷酸三酯法
DMT— 二甲氧基三苯甲基将第一个核苷酸的 3’-OH端固定在 固相支持物上 。
固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的 DNA,5’ DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相支持物固相支持物
C
化学合成的 DNA片断一般在 200bp以内。
二,化学合成 DNA片断的组装用 T4多核苷酸激酶 使各个片段的 5’端带上磷酸。
1,互补连接法预先设计合成的片断之间都有 互补区域,不同片断之间的互补区域能形成有 断点 的完整双链 。
（ 2） 5’端磷酸化
（ 1）互补配对
（合成的 DNA单链的 5’端是 -OH）
T4 DNA连接酶
T4多核苷酸激酶 使 5’-OH磷酸化完整的 DNA双链
（ 3）连接酶连成完整双链
2,互补延伸连接法预先设计的片断之间有 局部互补区,可以相互作为另一个片断延长的引物，用 DNA聚合酶 延伸成完整的双链。
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
T4DNA连接酶
Klenow片段 引物
1,直接合成基因三,寡聚核苷酸化学合成的优点
2,合成引物（ 20mer左右）
（ 1） mRNA的含量很低，很难作 cDNA
3,合成探针序列
4,定点突变合成合成带有 定点突变 的基因片断。
（ 2）有些基因比较短，化学合成费用较低
DNA合成仪
5,合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点 人工接头 （ Adaptor）或 衔接物 （ Linker）序列。
EcoRI
EcoRI Linker
Adaptor
将某种生物细胞的 整个基因组 DNA切割成大小合适的片断,并将 所有这些片断 都与适当的载体连接,引入相应的宿主细胞中 保存和扩增 。
理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体的全部基因,称为基因文库 。
一,基因文库的构建
1,基因文库 （ gene library）
第三节 目的基因的保存与文库构建
（ 2）目前常用的载体
2,构建基因文库的载体选用载体能够容载的 DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的 重组子 的数目。
载体容量越大，所要求的 DNA片断数目越少，
所需的 重组子 越少。
（ 1）对载体的要求
载体系列,容量为 24 kp
cosmid载体,容量为 50 kb
YAC,容量为 1 Mb
BAC,容量为 300 kb
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。
（ 1）染色体 DNA大片段的制备
3,基因文库构建的一般步骤超声波（ 300bp）或机械搅拌（ 8kb）。
① 物理切割法：
内切酶 Sau3A进行局部消化。可得到 10-
30kb的随机片断。
② 酶切法：
（ 2）载体与基因组 DNA大片段的连接
① 粘性末端直接连接载体与外源 DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。
如,Sau3A与 BamH I的酶切末端。
直接连接、人工接头或同聚物加尾。
②人工接头法（ adapter）
人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头粘性末端
CCC CCC末端转移酶粘性末端
③ 同聚物加尾
4,基因组文库的大小一个文库要包含 99%的基因组 DNA时所需要的克隆数目。
N= ln (1-p)ln (1-f)
p,文库包含了整个基因组 DNA的概率（ 99%）
f,插入载体的 DNA片断的平均长度占整个基因组 DNA的 百分数
N：所需的重组载体数（克隆数）
例如：人的基因组是 3× 109 bp，插入 DNA片断的平均长度如果是 1.7× 104 bp
N= ln (1-p)ln (1-f) = ln (1-99%)ln (1-f) = 4.61× Gf
N= 4.61×
G
f
G,Genome大小； f,fragment大小
N= 4.61×
G
f = 4.61×
3× 109
1.7× 104 = 8.1× 105
1,cDNA
以 mRNA为模板 逆转录 出的 DNA称 cDNA。
2,cDNA library
二,cDNA文库的构建
mRNA
cDNA
3’
3’
5’
5’
反转录酶引物利用某种生物的 总 mRNA合成 cDNA，再将这些
cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称 cDNA文库。
（ 1） 不含内含子序列 。
（ 2）可以在细菌中直接表达。
（ 3）包含了所有 编码蛋白质的基因 。
（ 4）比 DNA文库小 的多，容易构建。
4,构建 cDNA文库的一般步骤
（ 1）总 RNA（ total RNA）提取
3,cDNA文库的特点提取总 RNA有商业化的试剂盒（ kit）。
分离 mRNA用商业化的 Oligo dT纤维柱。
利用 mRNA 都含有一段 polyA 尾巴,将
mRNA从总 RNA（ rRNA,tRNA等 ） 中分离纯化 。
mRNA只占总 RNA的 1%-2%。
（ 2） mRNA的分离纯化
① 原理
② mRNA的分离纯化
Column（柱）
反转录酶
（ 3） cDNA的合成
① cDNA第一链合成逆转录酶能以 RNA为模板合成 DNA。
用 Oligo dT（或随机引物）作引物，合成
cDNA的第一链。
mRNA
cDNA
3’
5’
5’ AAAAAAA
TTTTTTT
Oligo dT引物用 碱 处理或用 RNase H降解 mRNA-DNA杂交分子中的 mRNA。
mRNA
cDNA
3’
3’
5’
5’
反转录酶引物
mRNA
cDNA第一链
3’
3’5’
5’
引物
cDNA第一链 3’5’ 引物
② 降解 mRNA模板或 RNaseH碱剩下的 cDNA单链的 3’末端一般形成一个 弯回来的双链发卡结构 （ 机理不明 ）,可成为合成第二条 cDNA链的引物 。 用 DNA聚合酶合成第二链
DNA。
cDNA第一链5’
cDNA第二链合成 DNA聚合酶
cDNA第一链
cDNA第二链
5’
3’
③ cDNA第二链合成
④去掉发卡结构核酸酶 S1
用 核酸酶 S1可以切掉发卡结构（但这会导致
cDNA中有用的序列被切掉！）。
cDNA第一链
cDNA第二链
5’
3’
cDNA第一链
cDNA第二链
5’
3’ 5’
3’
这种酶能识别 mRNA-cDNA杂交分子中的
mRNA,并将其降解成许多小 片断 。
妙用 RNaseH
小片断正好成为 DNA聚合酶的引物，用来合成 冈崎片断 。
DNA Pol I除去引物并修补后再使用 DNA连接酶 连成一整条 DNA链。
mRNA
cDNA
3’
5’ 反转录酶引物
mRNA
cDNA第一链
3’
5’ 引物
mRNA
cDNA第一链
3’
5’
mRNA mRNA
DNA
聚合酶DNA 聚合酶
cDNA第二链
cDNA第一链
3’
5’
RNaseH
DNA ligase去引物在双链 cDNA末端接上 人工接头,即可与载体连接,转入受体菌 。
或借助 末端转移酶 给载体和双链 cDNA的 3’端分别加上几个 C或 G,成为粘性末端 。
5,cDNA与载体连接：
接上人工接头粘性末端
CCC CCC末端转移酶
6,cDNA文库的大小一个 cDNA文库要包含 99%的 mRNA时所需要的克隆数目。
N= ln (1-p)ln (1- )
p,文库包含了完整 mRNA的概率（ 99%）
,某一种低丰度（不足 14份拷贝） mRNA占细胞整个 mRNA的比例
N：所需的重组载体数（克隆数）
1n
1
n
三、文库的查询（ screening）
用目的基因探针与文库中的重组载体进行 Southern blot杂交。
文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析第四节 目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离
1,探针柱分离特异 mRNA
根据已知的基因序列合成探针,结合到 纤维素柱 上,用来分离纯化该基因的 mRNA。
富集 特定基因的 mRNA或 cDNA模板。
纤维柱探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
Total mRNA
纤维柱探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
探针 DNA
过柱与探针碱基互补的 mRNA结合到柱上，其它 mRNA流走。
特异
mRNA
洗脱
RT-PCR
2,mRNA消减杂交原理：
羟基磷灰石柱结合单链 DNA-RNA或 DNA-DNA双链，
不结合单链 DNA。
（ Hydroxylapatite column）
从表达 A蛋白 和不表达 A蛋白的组织细胞中分别提取和分离 总 mRNA。
将表达 A蛋白的 mRNA合成 cDNA第一链 。 再同不表达 A蛋白的总 mRNA杂交成 cDNA-mRNA双链 。
不能杂交的 cDNA就包括特异表达的 A基因 的 cDNA
单链 。
用 羟磷灰石柱 收集单链 cDNA,合成为双链 DNA进行扩增,克隆,测序 。
A
A
A组织 B组织总 mRNA（ A） 总 mRNA（ B）
含蛋白 A的 mRNA 不含蛋白 A的 mRNA
总 cDNA第一链
A
杂交内含蛋白 A 的 cDNA
羟磷灰石柱过柱吸收
RNA-
DNA
单链滤过羟磷灰石柱
B
A PCR cDNA文库
3,mRNA差异显示 PCR（ DD RT-PCR）
mRNA differential display RT-PCR
（ 1） 3’端的锚定引物
Oligo(dT)引物的 3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是 T）。
AAAAAAAAAAAAAAAA
mRNA 3’ 5’
NM TTTTTTTT
M,A,G or C
N,A,G,T or C
5’ 3’
（ 2） 12种锚定引物
AG TTTTTTTT 5’ 3’
CG TTTTTTTT 5’ 3’
GG TTTTTTTT 5’ 3’
TG TTTTTTTT 5’ 3’
AA TTTTTTTT 5’ 3’
CA TTTTTTTT 5’ 3’
GA TTTTTTTT 5’ 3’
TA TTTTTTTT 5’ 3’
AC TTTTTTTT 5’ 3’
CC TTTTTTTT 5’ 3’
GC TTTTTTTT 5’ 3’
TC TTTTTTTT 5’ 3’
（ 3） 5’端的随机引物
10 mer
AAAAAAAAAAAAAAAA
mRNA 3’ 5’
NM TTTTTTTT 5’
3’
扩增 cDNA第一链。
RT
NM TTTTTTTT 5’ cDNA 3’
NNNNNNNNNN5’ 3’
NNNNNNNNNN5’ 3’
cDNA第二链，并 PCR
（ 4）随机引物与锚定引物成对扩增
12种锚定引物，若与 20种随机引物，可组成
240组引物。
引物组合：
240组能分出 20000多条带！
实验结果：
如果每条带相当于一种 mRNA,20000 mRNA
基本上反映了一种特定细胞中全部的 mRNA。
在测序胶上，每组扩出 50-100条长度为 100-
500bp的带。
（ 5）随机 -锚定引物 PCR的产物电泳比较不同组织的 240组引物组合 PCR产物在测序胶中电泳。
选择有差异的带，进一步 PCR作探针。
筛选文库，找到差别基因的全长序列。
二,PCR扩增获得目的基因
1,直接从基因组中扩增
（ 1）提取基因组 DNA作模板
（ 2）根据目的基因序列设计引物
（ 3） PCR扩增真核生物基因组含有内含子！
适合扩增原核生物基因。
原核基因组部分原核细胞提取基因组 DNA
PCR扩增
（ 1）提取基因组 total RNA
（ 2）反转录合成总 cDNA作模板
（ 4） PCR扩增
（ 3）根据目的基因序列设计引物
2,从 mRNA中扩增,RT-PCR
原核生物不易得到 mRNA，也不含有 polyA
尾。
适合扩增真核生物基因。
目的基因的引物 1
反转录成目的基因 cDNA第一链目的基因的引物 2
目的 基因 cDNA第二链
PCR
mRNA
克隆外源基因外源 DNA 载体 DNA
重组分子原核细胞 真核细胞扩增或表达 表达连接转化或转导 电穿孔或显微注射受体细胞基因的重组与转移一、粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的 5’端磷酸 与 3’-OH
连到一起。
第五节 DNA片段的体外连接
1,两段 DNA的连接依靠粘性末端
2,DNA片断与载体的连接依靠粘性末端
ligase
nick
二、齐平末端（ blunt end）的连接
5’端与 3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。
1,直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的 1%。
5’ 5’
5’ 5’ 3’
3’
3’
3’ -OH -OH
-P -P
P- P-
HO- HO-
5’
3’ -OH-PP-
HO-
5’
3’
1972年，斯坦福大学的 P,Labban和 P,Kaiser
提出。
（ 1）同聚加尾法
2,人工加尾形成,粘性末端”
DNA末端转移酶 能在没有模板的情况下给 DNA
的 3’-OH端 加上脱氧核苷酸。
①原理：
分别给载体和插入片断加上 互补的 核苷酸。
②加尾 — 碱基互补
④ 缺点：
③ 优点：
能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。
非酶切位点用 T4 DNA连接酶连到平端 DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
（ 2）衔接物 (linker)连接
① linker
用化学合成法合成的一段 10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的 平端双链 。
GGAATTCC
CCTTAAGG
EcoR I linker：
② linker的作用
④ 缺点：
1）可以用内切酶把插入片段切下来。
如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段
2）能给载体连接上 Polylinker:
③ 优点：
（ 3） DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。
5‘p-GATCCCGG-OH3’
GGCC-p5’ BamHI adapter
用 T4DNA连接酶连到 DNA分子的两端，
直接成为人工粘性末端。
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。
② adapter的作用
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’
HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
P-
-P
5‘p-GATCCCGG-
GGCC-
-CCGG
-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-
GGCC-
CCGG
GGCCCTAG-P5’
CCGGGATCCCGG-OH
GGCCCTAGGGCC-P5’
接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与 DNA片段的连接。
③优点：
连上后就能用。
④缺点：
先用小牛肠 碱性磷酸酶 （ CIP） 处理接头,水解掉其 5’端的磷酸,防止自我连接 。
（ 以后再用 T4多核苷酸激酶 加上磷酸 。 ）
⑤防止自我连接
5‘p-GATCCCGG-OH
HO-GGCC-P
P-CCGG-OH
HO-GGCCCTAG-P5’
CCGGGATCCCGG-OH
HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
5‘GATCCCGG-OH
HO-GGCC5’
5’CCGG-OH
HO-GGCCCTAG5’
CIP处理
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’
HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
P-
-P
5‘GATCCCGG-
HO-GGCC
CCGG-OH
-GGCCCTAG5’
5’GATCCCGG-OH3’
HO-GGCC5’
缺口缺口
HO-
-OH
CIP处理
T4 ligase
虽然有缺口，但仍然能与 DNA片断连接。
三,PCR产物的连接
1,在引物的 5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；
（ 1）设计原则
（ 2）带酶切位点的引物的结构
3’端 15-20bp与模板互补；
5’端 6-10bp是某个内切酶的识别序列。
（ 5’端多余的 3-5bp属 保护碱基 ）
避免与所扩增的 DNA片断内部酶切位点重复。
引物 1GCAGAATTC 互补序列模板
EcoR I位点
5’- -3’
GCAGAATTC 互补序列5’- -3’
3’
模板
GCAGAATTC 互补序列 PCR产物5’- -3’
3’
复性延伸模板模板
3’
3’
GCTAGCCGG互补序列模板
BamH I 位点
-5’ 3-’
5’
复性延伸模板模板
3’
3’
GCTAGCCGG互补序列 -5’ 3’-
模板5’
GCTAGCCGGPCR产物 互补序列 -5’ 3’-
引物 2
带酶切位点的 PCR产物
GCAGAATTC PCR产物5’- -3’
GCTAGCCGGPCR产物 -5’ 3’- CGTCTTAAG
CGATCGGCC
EcoR I位点 BamH I位点
AATTC PCR产物5’- -3’
GCTAGPCR产物 -5’ 3’- G
C
EcoR I BamH I
两头各有一个粘性末端！
2,与 T载体直接连接
（ 1） PCR产物两个 3’端一般都有一个 A
Taq DNA聚合酶的特性：在 DNA双链的 3’
端再加上一个多余的核苷酸 （ 优先加 A） 。
（ 2） T载体的两个 3’端人为地各加一个 T
利用 Taq DNA聚合酶，当原料中只有
dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
A
A
dNTP
T
T
dTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物
TA TA
四,DNA体外连接应注意的事项
1,插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。
尽量避免平端连接。
决不能进行非粘性末端连接。
EcoR I EcoR I EcoR I
（ 1）用相同的酶切
（ 2）用同尾酶切
BamH I,Bcl I,Bgl II,Sau3A I,Xho II
都产生 GATC4个碱基的粘性末端。
2,DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。
EcoR I BamH I
EcoR I BamH I
EcoR I BamH I
3,插入基因的开放阅读框（ ORF）正确
（ 1） DNA定向插入
（ 2）起始密码尤其当 载体上有 ATG起始密码的时候，更要注意。
ATGGAATTC
载体
ATGCGGAATTCT
插入片断
EcoR I EcoR I
ATGGAATTC T
重组 但移码突变！
4,防止载体自身环化连接
（ 1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多 10倍以上。
（ 2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的 5’磷酸被除去，不能自我连接。
但可以与插入片断以单链连接。
5’ 3’
载体插入片断
1,载体自身环化连接（能存活）
2,载体之间互相连接（能存活）
3,插入片段互相连接（不能存活）
4,一个载体与几个插入片段重组（能存活）
五、载体和外源 DNA插入片段的连接结果
5,几个载体与一个插入片段重组（能存活）
1,目的增加受体菌细胞膜的通透性。
第六节 重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备使用丧失了 限制体系 的大肠杆菌。如 K12
系列的大肠杆菌。
2,菌种用 CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
3,制备原理
4,制备过程培养大肠杆菌
OD600 至
0.3-0.4
On ice 5-
10 min
4℃ 离心收集菌用冰冷的
60mM CaCl2
重悬
4℃ 离心收集菌
4℃ 离心收集菌分装,-70℃
冻存用冰冷的
60mM CaCl2
重悬
On ice
30 min
用冰冷的
60mM CaCl2
重悬二、重组 DNA导入大肠杆菌
（ 1）转化（ transformation)
大肠杆菌捕获 质粒 DNA的过程。
（ 2）转染（ transfection)
大肠杆菌捕获 噬菌体 DNA的过程。
1,外源 DNA导入细菌的几种方法
（ 3）转导（ transduction)
借助 噬菌体 把外源 DNA导入细菌的过程。
每?g DNA转化成功的细菌克隆数。
3,转化方法
2,转化率简单,但转化效率不高（ 106-108/?g DNA）。
（ 1）热休克法（ heat shock）
转化效率高（高于 109/?g DNA）。
（ 2）电转化法
10ng载体
DNA
100?L感受态菌
On ice混合，静置
10分钟
42oC 1分钟加入 1mL
LB培养基37℃ 摇 1小时10-100?L转化液涂含抗菌素的平板吸附 DNA
摄入 DNA
（ 1）热休克法
LB培养受体菌至
OD600=0.5-0.6
冰浴 15分钟，
2℃ 离心集菌冰冷的水重悬菌体
2℃ 离心集菌冰冷的水重悬菌体
2℃ 离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成
50-300?L
电转仪调为
2.5kV,25?F
脉冲控制器
200-400?
0.5?g质粒 DNA
On ice
混合加入
1mLSOC
培养液37℃ 中速震荡 60分钟10-100?L转化液涂含抗菌素的平板转化
（ 2）电转化法
4,平板培养基培养细菌
10-100?L转化液涂于含抗菌素的平板
37℃ 过夜环形重组质粒质粒自我连接线性载体或 DNA片断进入细菌会被降解。
① 环形质粒数
（ 1）重组质粒
5,影响转化率的因素
①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。
要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。
④储存感受态菌要在 -70℃ 以下。
③ CaCl2处理
⑤使用感受态菌时必须迅速融化。
融化后一般不能再次冻存使用。
（ 2）感受态细胞 （ competent cells)
把重组的噬菌体?DNA或 Cosmid质粒 DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。
6,体外包装的噬菌体的转导
（ 1）体外包装（ in vitro packaging）
（ 2）转导（ transduction）
通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点
（ receptor site),使带有外源基因的重组体
DNA注入受体大肠杆菌进行扩增 。
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因,感染细菌后,在 32℃ 下培养细菌时能够保持溶源性 。
但当温度升高到 44℃ -45℃ 时,就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活,?DNA复制,外壳蛋白合成 。 便于提取外壳蛋白 。
（ 3） cI857基因突变的?噬菌体但由于该噬菌体的 S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。
cI857 其它基因溶源状态（?DNA不转录、不翻译）
DNA
阻遏蛋白阻遏蛋白
44℃ -45℃
DNA转录、翻译合成外壳蛋白
32℃
噬菌体 1 外壳蛋白基因 E发生了无义突变,不能合成头部蛋白,但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。
在 cI857基因突变的?噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型?噬菌体。
（ 4）互补型噬菌体外壳蛋白基因 D发生了无义突变,不能合成头部的包装识别蛋白,但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
噬菌体 2
(5)
体外包装过程体外包装好的重组噬菌体感染受体菌,使受体菌发生溶菌,形成噬菌斑 。 （ 每?g?DNA能形成 106
噬菌斑 ） 。
（ 6）转导转化率高的菌株；
有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；
不育的菌株（不会与其他酵母接合）。
第七节 外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞
1,菌株选择如,ura3-52,trp1-289,
leu2-3,leu2-112,his3?1
（ 1）利用原生质球进行转化
2,酵母的转化方法酵母 原生质体 感受态酶去壁 CaCl2、
PEG
插入外源基因的酵母载体
PEG（聚乙二醇）使 细胞壁 具有通透性，允许
DNA进入。
CaCl2使 细胞膜 具有通透性，允许 DNA进入。
转化酵母 0.1mol/L LiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态
40%
PEG 4000
（ 2）利用 Li+盐进行转化叶盘消毒 切取 土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞
1,叶盘法（ leaf disk)
植物细胞 原生质体纤维素酶和果胶酶 DNA
混合入电击缓冲液
1-2kV,3-25?F电击愈伤组织 幼苗分化
2,电击法（ electroporation)
又称 高速微型子弹射击法（ High-velocity
microprojectiles)
DNA 1.2?m钨弹头吸附 特制手枪射击植物装入
3.基因枪法（ gene gun）
4,农杆菌（ agrobacterium）介导根瘤农杆菌和发根农杆菌,
根瘤农杆菌和发根农杆菌同属于根瘤菌科
，革兰氏阴性菌。它们可以将自己的一部分
DNA转移给植物，进而转化植物细胞，同时农杆菌能从植物细胞中获得营养物质。这两种农杆菌之所以能够转化植物基因，主要是因为它们携带有诱瘤质粒，简称 Ti质粒。该质粒上有一段 DNA，称为 T-DNA，它能转移并整合进植物基因组中，并导致植物冠瘿瘤的形成。
（ 1）原理：
三、导入哺乳动物细胞
1,磷酸钙沉淀法
HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和 DNA的溶液缓慢混合,会形成含磷酸钙和 DNA的沉淀 。
依据不同的细胞类型，平皿上最多能有 10%
的细胞能吸收 DNA沉淀。
不需要载体。（ 2）特点：
脂质体有商业试剂盒（如 Life Technologies）。
2,脂质体（ lipofectin）载体法脂类包埋 DNA，通过细胞膜进入细胞。
直接把外源 DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。
3,显微注射法 (microinjection)
二乙氨乙基（ diethyl-aminoehtyl,DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源 DNA。
4,DEAE— 葡萄糖传染法二乙氨乙基
（ DE AE ）
+ + + + + + + + +
+
+
++++++++
+
+
+
+
DNA
- - - - - -
-
-
--------
-
-
二乙氨乙基
（ DEA E ）
+ + + + + + + + +
+
+
++++++++
+
+
+
+
葡聚糖葡聚糖 +DNA
吸附到细胞表面后被细胞吞入,部分 DNA可以进入到细胞核里 。
DEAE-dextran 细胞 外源 DNA预处理摄入
DEAE-dextran
外源 DNA
细胞混合
DEAE-dextran对细胞有毒 !
5,病毒（ virus）介导
（详见另外章节）
外源基因导入细胞的方法基因工程 原理纲要
基因工程概论
基因工程的主要技术
基因工程的酶学基础
基因克隆的载体与受体
目的基因的克隆与分离
克隆基因的检测与功能鉴定第六讲 克隆基因的检测与鉴定一、抗药性标记及其插入失活选择法
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因,
Tetr和 Ampr。
Tetr上有插入位点 BamH I和 Sal I;
Ampr上有插入位点 Pst I。
第一节 载体表型选择法
1,原理：
pBR322
（ 1）四环素：
（ 2）氨苄青霉素抗性基因：
2,pBR322抗菌素标记选择产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘 -青霉素指示液（ I2-KI-Aampicillin）
（蓝灰色）褪色。
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
（ 3）环丝氨酸：
3,选择过程：
如果在 Tetr上插入外源 DNA，导致四环素抗性基因失活，可用 四环素加环丝氨酸 平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。
（ 1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基
（ 2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果 Ampr上插入外源 DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘 -青霉素指示液选择。
二,?-半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶乳糖 半乳糖 葡萄糖
X-gal 半乳糖 5-溴 -4-氯靛蓝
+
+
深蓝色
1,原理：
载体 上有一段?-半乳糖苷酶基因 （ Lac Z） 的?片段
（ 氨基端 ）,其上有外源 DNA的插入位点 。 受体菌基因组 中有突变的?-半乳糖苷酶基因 （?片段缺失 ） 。
可以被 IPTG诱导表达 。 载体和受体菌基因组可以 互补 形成完整有功能的?-半乳糖苷酶 。
假阳性：
如果插入的外源 DNA正好是 3的倍数并且没有中止密码；（不破坏?肽）。
2,选择过程
-半乳糖苷酶使 X-gal分解成蓝色产物。
利用插入的外源基因的 表达产物 特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。
一、原理：
第二节 根据插入基因的表型选择
1.弥补缺陷
his-
his+
受体菌：
外源基因：
在不含组氨酸的培养基中生长小鼠的二氢叶酸还原酶（ DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR
载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含 DHFR的克隆才能生长例：
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
2,增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。
一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。
第三节 DNA电泳检测法分子量
Marker
载体重组克隆二、酶切电泳筛选法
1,原理：
根据已知的外源 DNA序列的限制性酶切图谱，
选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（ DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。
A B
A或 B
不同克隆的酶切结果筛选过程表型筛选加酶切筛选
A
A
T
T
A
AT
T
三,PCR扩增检测法
1,原理
PCR能在模板序列上扩增出预期 DNA片断。
2,过程
（ 1）从重组克隆中提取质粒（或 DNA）。
（ 2）用外源 DNA插入片断引物作 PCR。
（ 3）电泳 PCR产物。
（ 4）检查是否有 PCR产物。
（ 5） PCR产物的长度是否与外源基因一致。
1,核酸杂交第四节 核酸杂交检测法一、原理：
重组克隆与探针杂交。
3,识别标记
32P 或 125I 。（ 1）放射性同位素
2,检测用的探针与外源 DNA插入片断互补的序列。
（ 2）非放射性标记 荧光素二、核酸杂交检测方法用 DNA（或 RNA）探针检测 DNA样品。
1,Southern blotting
从宿主细胞中提取 DNA（或质粒载体），
再用探针杂交。
只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前 酶切后插入片断载体
Southern
blot 筛选结果
（ 1）原位杂交筛选特点：
对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。
（ 2） R-环检测法
DNA-RNA杂交。
1）原理：
2）选择过程在 70%甲酰胺中，把 DNA双链变性，复性的时候,DNA-RNA杂交分子比 DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种 R-环形结构。
用外源基因的 mRNA与重组载体杂交。
缺点：需要电镜！
2,Northern blotting
用 DNA（或 RNA）
探针检测 RNA样品。
主要检测插入片断是否被转录。
从宿主细胞中提取
RNA，再用探针杂交。
利用抗体作为,探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：
一、放射性抗体检测法第五节 免疫化学检测法
1,抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。 蛋白 —— 蛋白“杂交”
待测基因产物蛋白一抗 二抗
125I 标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗
125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白 一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白 一抗 二抗
125I 标记的二抗结合蛋白
125I标记的二抗
2,放射性抗体检测法过程
3,Broome-Gilbert双位点检测法质粒基因 A 插入基因 B
表达质粒蛋白 A 外源蛋白 B
融合蛋白检测融合蛋白。
既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
重组质粒重组质粒重组质粒固相支持滤膜 抗 A抗体
125I标记的抗 B抗体质粒蛋白 A 外源蛋白 B
质粒蛋白 A 外源蛋白 B固相支持滤膜抗 A抗体发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中,当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时,
就会与抗体反应形成,沉淀圈,。
1,原理抗原 —— 抗体凝集反应。
检测分泌型产物。
2,方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1,原理：
一抗（ primary antibody）,
与目标分子的特异结合。
二抗（ secondary antibody）：
与一抗的特异性结合。
酶连（ enzyme-linke）,
二抗上携带一种酶 能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。
待测基因产物蛋白一抗 二抗酶待测基因产物蛋白 一抗 二抗无色的底物 有色的产物比色观察酶
2,ELISA检测的一般步骤
（ 1）固定样品将待测样品加入 96孔微量滴定板 （ microtiter
plate） 的孔中,干燥后就被固定在 孔底 。
孔底加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。
（ 2）一抗结合一抗加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、
脲酶等）。
（ 3）二抗结合二抗加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。
（ 4）显色反应在特殊的分光光度仪（ 酶标仪 ）上比色，打印出结果。
（ 5）比色
3.ELISA的局限性有效,但准确性稍差 （ 主要取决于一抗的特异性 ） 。
必须与其他方法一起综合考虑 。
最好用单克隆抗体（ monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗四、免疫印迹（ western blotting）法
1.原理：
在蛋白质凝胶电泳以后，用 转膜和免疫 的方法检测胶上的蛋白质泳带。
（ 1） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质 维持线性状态,并与蛋白质结合，使蛋白质 带上负电荷 。
① SDS:
（ SDS-PAGE）：
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）：
（ Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动,移动的速率主要取决于其分子量大小 （ 链的长短 ）,从而把不同分子量的肽链分开 。
电泳 buffer
电泳 buffer
点样电泳方向
③蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液,与待测样品一起电泳,
为样品蛋白质提供分子量估计 。
商品化供应
Da
道尔顿 (质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一 。
一克约为 6× 1023道尔顿
Dalton
SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色：
考马斯亮蓝：
灵敏度底、只能检出 >0.3-1μg/带，但可褪色回收。
硝酸银：
灵敏度高、可检出 2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
1）直接染色直接染色电泳结果
（ 2） Western blotting
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法,转到膜上 （ 硝酸纤维素膜,膜,中性尼龙膜等 ） 。
① Western（转膜）
胶里的蛋白质带在电场的作用下 横向 转移到正极一侧的膜上 。
膜胶蛋白
Western装置
② Blotting
原理与 ELISA相同。
待测蛋白硝酸纤维素膜 一抗 二抗辣根过氧化物酶底物 产物，
并发出光
PAGE胶 待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶,HRPO
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（ 二抗上带有 HRPO）。
4）清洗掉未结合的二抗。
5）用 HRPO的底物浸泡膜。
6）暗室里曝光，冲洗胶片。
③ Blotting过程
Immuno
Blotting
④ 结果多克隆抗体
Blotting的结果单抗 blotting结果一、无细胞翻译系统第六节 转译筛选法能把外源的 mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。
如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。
借助无细胞翻译系统,通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录,来筛选其产物是否符合预期 。
适用于 mRNA转录丰度高的外源基因。
二,转译筛选
mRNA
无细胞翻译系统
35S标记的甲硫氨酸翻译 35S标记的肽链
PAGE电泳放射自显影比较放射性带纹的位置载体 +外源 DNA
转录与预期的产物分子量相符？
三、杂交抑制转译法
mRNA一旦与 DNA杂交成 RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。
单链 mRNA
核糖体小亚基核糖体大亚基能翻译
mRNA
DNA
核糖体小亚基 核糖体大亚基不能翻译
1,原理
2,过程四、杂交释放转译法
1,原理：
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的 cDNA与它的 mRNA杂交吸附,然后洗脱,释放出与它对应的 mRNA,进行体外转录 。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物 （ 如分子量,免疫源性等 ） 。
2,过程硝酸纤维素滤膜载体和插入的 cDNA
总 mRNA
cDNA基因的
mRNA
杂交洗脱
cDNA基因的
mRNA 体外翻译
cDNA编码的蛋白电泳凝胶放射自显影
cDNA编码的蛋白硝酸纤维素滤膜载体和插入的 cDNA
硝酸纤维素滤膜载体和插入的 cDNA
收集 35S标记的氨基酸专门设计检测能同 DNA特异结合的蛋白质因子。
待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的 DNA序列 放射性标记待测蛋白质硝酸纤维素滤膜能与蛋白质结合的 DNA序列 放射性标记五,DNA-蛋白质相互作用筛选法一般克隆与筛选策略第七节 几种常用的 真核生物重组基因选择方法真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。
二氢叶酸 四氢叶酸二氢叶酸还原酶（ dihydrofolate reductase,DHFR）
一、哺乳动物基因转移的选择标记
1,胸苷激酶（ thymidine kinase,tk）
（ 1） TK选择原理
①四氢叶酸的必要性
DHFR
②氨甲喋啉（ Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉 （ 或氨基喋啉 ） 是叶酸的类似物 。 能抑制二氢叶酸还原酶,从而阻断 dATP,dCTP
和 dTTP的合成：
dUMP dATP TTP
dCTP 氨甲喋啉抑制抑制
④ 胸苷酸激酶 的补救作用
TK+细胞 能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（ T）合成 TTP，存活。
T tk
③ 次黄嘌呤 的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成 dATP和 dCTP。
dUMP dATP TTP
dCTP 次黄嘌呤补救氨甲喋啉抑制抑制
① HAT培养基：
Tk- 细胞株。
TK基因。
② 宿主细胞
③ 载体标记
（ 2） TK选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。
(hypoxanthine,aminopterin,thiymidine）
只有转入 TK基因的细胞才能生存。
真核细胞核苷酸的合成需要 四氢叶酸 提供甲基。
2,二氢叶酸还原酶基因（ DHFR）
（ 1） 选择原理
①二氢叶酸还原酶的必要性
dUMP dATPTTP
dCTP
四氢叶酸四氢叶酸
DHFR+细胞二氢叶酸 四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸
DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。
能在 无胸腺嘧啶和次黄嘌呤 的培养基中生存不需要补救！
DHFR- 细胞
DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。
不能在无 胸腺嘧啶和次黄嘌呤 的培养基中生存。
需要补救！
② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救
dUMP dATPTTP
dATP 次黄嘌呤补救胸苷补救无四氢叶酸提供甲基,dNTP合成受阻 时，
胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救,
DHFR-细胞株（不能在 无核苷酸 的培养基中生长）。
① 宿主细胞
（ 2）选择过程透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。
② 无核苷酸的培养基需要 胸腺嘧啶和次黄嘌呤 补救！
③ 氨甲喋呤“加压”
添加少量氨甲喋啉抑制 内源性 DHFR的补救作用，可提高选择。
DHFR+基因。
④ 载体标记只有转入 DHFR+基因的细胞才能生存。
DHFR-
DHFR-DHFR+ DHFR+ live
die
无核苷酸的培养基是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但 不影响真核生物 。
3,新霉素抗性基因（ neor）
（ 1）选择原理
① 新霉素（ neomycin）
新霉素的类似物，是一种氨基糖苷，对 真核细胞和原核细胞都有毒性 。
② G418（ geneticin）
③ 新霉素抗性基因 --neor
细菌的新霉素抗性基因（ neor）编码一种 磷酸转移酶（ APH）,能使 G418失活。
G418真核细胞死亡
G418
存活neor 真核细胞含 致死剂量 G418的完全培养基。
① G418培养基真核细胞株均可。
neor基因。
②宿主细胞
③载体标记
（ 2）选择过程
G418：（ 100-800?g/mL）
CAT是由大肠杆菌转座子 Tn9编码的，催化 氯霉素发生乙酰化 失活。
氯霉素
cat
含氯霉素的完全培养基。
真核细胞株均可。
cat基因。
乙酰氯霉素
4,氯霉素乙酰转移酶（ CAT）
（ 1）选择原理
（ 2） 选择条件
（ 3） 宿主细胞
（ 4）载体标记
chloramphenicol acetyl transferase
在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。
（ 5） CAT分析方法
② 免疫学检查：
用抗 CAT的血清进行 Western blot或 ELISA，
检查 CAT的表达。
Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen,
Other kits to assay for CAT protein
using ELISA assay are available from Roche
Molecular Biochemicals and Molecular Probes.
① 分析乙酰氯霉素二、植物转化体报告基因筛选法
（ 1） 大肠杆菌的 β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶
（ β-D-glucuronidase,GUS）；
（ 2）细菌和萤火虫的荧光素酶
（ luciferase）；
（ 3）水母绿色荧光蛋白（ GFP）基因
（ Green Fluorescent Protein）。
1,报告基因（ reporter gene)
（ 4）其它
2,几种报告基因的作用原理
4-甲 -β-D-葡糖醛酸 荧光产物GUS
GFP
紫外光照发绿色荧光
5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -β-D-葡糖醛酸蓝色水解产物
GUS
Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP
转入萤火虫的
luciferase的烟草烟草叶片表达 B
型肝炎抗原植物细胞中适用的报道基因酶活性 是否显性 方法是否成熟新霉素磷酸转移酶 显性 成熟潮霉素磷酸转移酶 显性 成熟二氢叶酸还原酶 显性 成熟氯霉素乙酰基转移酶 显性 成熟庆大霉素乙酰基转移酶 显性 成熟胭脂碱合成酶 隐性 成熟章鱼碱合成酶 隐性 成熟
β-D-葡萄糖苷酶 隐性 成熟链霉素磷酸转移酶 显性 成熟萤火虫荧光素酶 隐性 成熟细菌荧光素酶 隐性 成熟苏氨酸脱氢酶 显性 成熟磷酸肌醇乙酰转移酶 显性 成熟乙酰乳酸合酶 显性 不成熟绿色荧光蛋白 显性 成熟
Bromoxynil 硝化酶 显性 不成熟
5-enolpyruvylshikimate-3磷酸转移酶显性 成熟复习思考题
试述 cDNA文库的特点和构建 cDNA文库的一般步骤。
