第五章 细菌浸铀细菌浸铀
5.1 概述
5.2 细菌的生物化学特性
5.3 细菌浸铀（矿）的基本原理
5.4 微生物培养基
5.5 菌种的保藏
5.6 细菌的驯化培养
5.7 细菌浸出的影响因素
5.1 概 述
利用细菌的生物化学作用进行铀（矿）的浸出，叫做细菌浸铀（矿），又称细菌冶金、
微生物浸矿等。细菌浸矿是用浸矿微生物将矿石或精矿中有用组份有选择地转化为可溶化合物，实现有用组份与杂质的分离，达到回收有用金属的目的。
16世纪，匈牙利人从矿坑水中回收铜；
1953年，葡萄牙的,镭公司,应用细菌浸出铀矿石；
中国微生物研究所、核工业北京化冶院和 711
矿联合开展了含铀贫矿细菌浸出试验 。
浸矿细菌是一种特殊性质的微生物。用于工业生产的主要有：氧化硫硫杆菌、聚生硫杆菌、氧化铁硫杆菌、氧化铁杆菌和氧化硫杆菌等。一般在 pH=2～ 4，温度 30～ 35℃ 条件下生长良好、繁殖速度快。对于铜和铀浸出工艺最有价值的为氧化铁硫杆菌，能氧化金属硫化物、
硫酸亚铁、硫代硫酸盐以及元素硫。
氧化硫硫杆菌为化能自氧菌，它把元素硫氧化生成硫酸，利用这一反应生成的能量作为其生活能源，以 CO2和氨为原料合成菌体进行繁殖；氧化铁硫杆菌和氧化铁杆菌，以 Fe3+作为能源在含有矿物盐类强酸性介质中生长。
细菌浸出铀矿石最早被葡萄牙的,镭公司,应用。
他们从 1953年开始进行铀矿石的自然浸出研究，利用铀矿石中存在的或外加的黄铁矿（ FeS2），在水和空气的作用下产生 Fe3+和 SO42-，使铀氧化为 UO22+而溶解出来。在 1956年的第二届国际和平利用原子能会议上，他们发表了,铀的自然浸出法,的研究报告。从此，细菌浸出研究和应用开始受到各国的重视，许多国家相继开展了从贫矿、废矿及表外矿中细菌浸出回收铀的研究工作。从 20世纪 60年代起细菌浸出铀的技术用于工业生产。加拿大的安大略州伊利奥特湖曾是世界上规模最大的原地生物浸出铀矿的场所，该地区的斯坦洛克矿从 1964年起在采空区利用细菌浸出铀，
平均每月回收 U3O8 6804 kg，产量占当时全矿总产量的 7%，且生产成本由原来的每磅 5美元降至 3.3美元。
其他产铀国如美国、法国、前苏联、澳大利亚等也在不同程度上利用细菌浸出贫矿石的铀。
5.2 浸矿微生物的种类、特性
将可直接或间接参与金属硫化矿物的氧化和溶解过程称为微生物浸出，用于微生物浸出的微生物菌种，称为浸矿微生物。在微生物湿法冶金过程中参与浸出的主要微生物类群有以下几种：
(1)中温细菌：硫杆菌属及钩端螺菌属
(2)中等嗜热细菌：硫化杆菌属
(3)极端嗜热细菌：嗜酸嗜热古生菌纲中的硫化叶菌属、酸菌属、生金球菌属及硫球菌属
5.2.1硫杆菌属（ Thiobacillus）
硫杆菌属是 小杆状细胞，以单根极生鞭毛运动，无休眠阶段，属革兰氏阴性菌种。能量获自一种或多种还原态的或部分还原的含硫化合物，
包括各种硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、连多硫酸盐和亚硫酸盐。该菌属属无机化能营养类型，
专性好氧。最适温度约 28~30℃,pH范围较宽。
发现于海水、海泥、土壤、淡水、各种酸性矿水、
污水、含硫矿泉中和硫沉积物内或附近。
硫杆菌属包括至少 14个种，其中在生物浸铀中应用最广泛的是氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、排硫硫杆菌及蚀阴沟硫杆菌这四个种。
1）氧化亚铁硫杆菌（ T.ferrooxidans）
该菌属于短杆菌,0.5微米 × 1.0微米，具有圆钝的末端，单生或对生，成短链者较少，显微镜下的照片见图 2-1。其能源为 Fe2+和还原态硫，能将 Fe2+氧化成 Fe3+,硫代硫酸盐氧化成硫酸。在 pH值 1.5~3.5
范围内生长良好，生长的最佳 pH值为 2.0，在
16~40℃ 存活，最佳生长温度为 30~35℃ 。
该菌在含亚铁的液体培养基中由于能将亚铁氧化成高铁，而使培养基由浅绿色变为红棕色，最后由于
Fe3+水解生成氢氧化物或铁矾而生成沉淀。在硫酸亚铁固体培养基上，借助显微镜可以见到有微小菌落，
直径约为 1.0mm，颜色由红变褐，并在菌落周围可见褐色沉淀。
在硫代硫酸盐固体培养基上形成圆形的微小菌落（直径 0.5~1.0mm），有时会形成不规则的边缘，菌落也会因为有硫磺的沉淀而呈白色。
1） 氧化亚铁硫杆菌图 2-1 氧化亚铁硫杆菌 C-3 菌株的细胞形态
A：菌体为赤藓红染色,25o投影,× 1800
B：电镜观察照片,× 10000
2) 氧化硫硫杆菌（ T,thiooxidans）
短杆菌,0.5微米 × 1.0~2.0微米，单生对生或成短链，显微镜下的照片见图 2-2，其能源为硫及其化合物。该菌在 pH=1.4~6.0的范围内能生长，更低的范围可延至 1.4以下，最适 pH
值在 2.5~5.8之间，最适温度为 25~30℃ 。该菌的亚铁液体培养基保持清澈，由于三价铁的产生，迅速由琥珀色转为红褐色。如果 pH上升至
1.9以上，会产生高铁沉淀的水合物，并形成一层由三价铁的水合物和细胞组成的膜。在硫代硫酸盐的固体培养基上生长的微小菌落呈透明状或随着培养时间的延长而变成黄白色，菌落边缘整齐。
2) 氧化硫硫杆菌
图 2-2 氧化硫硫杆菌在显微镜下的形态,× 4500
3) 排硫硫杆菌（ T,thioparus）
细短杆菌,0.5微米 × 1.0~3.0微米，平均 0.5微米 × 1.7微米。靠氧化硫代硫酸盐成硫酸盐获取能量。
最适 pH值在 6.6~7.2之间，在 pH4.5~7.8之间生长，有一些菌株 pH达到 10也能生长，最适温度为 28℃ 。在硫代硫酸盐洋菜 (琼脂 )上的菌落是小的（直径 1～ 2毫米），圆形，由于硫的沉淀而呈白黄色。
4) 蚀阴沟硫杆菌（ T,concretivorus）
该菌与氧化硫硫杆菌类似,但它可以利用硝酸盐或氨离子作为氮源，不能利用亚硝酸盐。
5.2.2 钩端螺菌属（ Leptospirillum）
该菌属属于螺菌科（ Spirillaceae），
其中包括一个中度嗜热铁氧化钩端螺菌
（ L.ferooxidans）。铁氧化钩端螺菌
（ L.ferrooxidans）的最适生长温度为
30℃ 左右，严格好氧，专一性地通过氧化溶液中的 Fe2+或矿物中的 Fe2+来获取能量，在浸矿系统中通常和氧化亚铁硫杆菌协调作用。
5.2.3 硫化杆菌属（ Sulfobacillus）
它们的能量来源于 Fe2+、硫磺及其它矿物，如硫铁矿、黄铜矿、砷黄铁矿、
闪锌矿、亚锑硫酸盐、蓝铜矿、辉铜矿等。绝大多数需要酵母提取液或某种有机物以及空气中 CO2浓度较高时才能旺盛生长。该菌属菌均严格好氧且极度嗜酸，
广泛分布于自然界，主要集中在硫化矿物床及火山地带。
5.2.4 嗜酸嗜热古生菌纲
（ Thermoacidophili archaebacteria）
在该类群中，一共有四个属的菌种可以氧化硫化物作为浸矿菌，它们分别是硫化叶菌属（ Sulfolobus）、酸菌属
（ Acidanus）、生金球菌属（ MetallospHaera）及硫球菌属（ Sulfurococcus）。该四属菌均为兼性无机化能自养菌，
可以在自养、兼性营养及异养条件下生长。在自养条件下，
细菌可以通过氧化元素硫,Fe2+或硫化物获取能量。在兼性营养条件下，添加酵母膏或其他一些有机物可以促进它们的生长。它们均为好氧菌，极度嗜热嗜酸，外形均为球形，细胞不具运动性，不具有鞭毛，主要分布在高温硫磺泉中。
这类细菌可潜在地用于顽固硫化矿物的快速、高温浸出，
但易破碎的细胞壁（因缺少肽聚糖）限制了它们在工业浸矿中的应用。同时，该类群菌是耐高温酶的重要来源，对它们的研究和应用无疑将开拓酶工业的新邻域。
5.3 浸矿微生物的培养基、采集、分离纯化、保藏
5.3.1 浸矿微生物的培养基
5.3.2 浸矿微生物的采集、分离
5.3.3 浸矿微生物的纯化
5.3.4 菌种的保藏
5.3.1 浸矿微生物的培养基
培养基指用人工方法配制的专供微生物生长繁殖的营养混合物。
用于培养浸矿细菌的培养基主要有表 2-2所示的几种培养基。
名称 培养对象
Leathen 铁氧化沟端螺菌氧化铁铁杆菌氧化亚铁硫杆菌
9K 氧化铁铁杆菌氧化亚铁硫杆菌
Waksman 氧化硫硫杆菌
ONM 氧化硫硫杆菌
Colmer 氧化亚铁硫杆菌
1)液体培养基（ Liquid medium）
在液体培养基中营养物质以溶质状态溶解于其中，使微生物能更充分地接触和利用养料，因而也能更好地积累代谢产物。
因此，在实验室中，液体培养基主要用于生理、代谢研究及获得大量菌体；在生产中，则用于大规模生产、发酵。
9K,Leathen培养基由于有易被氧化的 FeSO4?7H2O，一旦温度超过 50℃,其中的 Fe2+就会自发地快速氧化，并生成硫酸高铁、水合硫酸铁及黄钾铁钒沉淀。解决的办法有：
（ 1）调节培养基的 pH值至 1.5。在配制上述两种培养基时，
pH值是一个很重要的考虑因素。 pH值高则培养基经高温灭菌后，会在瓶底生成沉淀，而使溶液浑浊；实验表明，在 pH值低的溶液中，培养基的各成分溶解度大些。
（ 2）减少铁盐及磷酸盐的用量并补充少量的酵母膏。调整后的低磷酸盐培养基组成如下（ g/L）,K2HPO4 0.4、
MgSO4?7H2O 0.4,(NH4)2SO4 0.4,FeSO4?7H2O 27.8、
酵母膏 0.2（也可用谷胱苷肽 0.1或半胱氨酸 0.1）； pH=1.5。
（ 3）将 FeSO4?7H2O溶液单独过滤灭菌，再与用高温灭菌的培养基中的其他无机盐溶液混合。这种方法得到的培养基 Fe2+
被氧化成 Fe3+的量少，培养基为浅绿色澄清溶液。
2) 半固体培养基（ Semi-solid medium）
在液体培养基中加入 0.2~0.5%的琼脂作凝固剂，就可得到半固体培养基。半固体培养基呈现出在容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后能破散的状态。半固体培养基在微生物实验中有许多独特的用途，如细菌的动力观察
（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，
观察细菌的运动能力），各种厌氧菌的培养及菌种保藏等。绝大多数的浸矿细菌是能运动的，
可以通过这种方法来鉴定菌种。
3) 固体培养基（ Solid medium）
在液体培养基中加入 1%~2%琼脂或 5%~12%
明胶作凝固剂，就可制成遇热可融化、冷却后则凝固的固体培养基。固体培养基主要用于菌种的分离、菌种保藏、鉴定等。 T,f菌种在琼脂培养基上生长很弱，
难以形成菌落，为菌种分离及遗传操作带来了很大困难。出现这种情况的主要原因是琼脂在酸性条件下生成的水解产物对菌体有毒害作用。针对这个问题可采用多种方法克服：
（ 1）适当地降低琼脂浓度，小于 2%；
（ 2）控制 pH值在 3.0左右,pH值太低，琼脂粉因水解而不凝固； pH值太高，细菌的生长缓慢；
（ 3）适当降低 FeSO4?7H2O和磷酸盐的浓度，分别不宜超过 22.2g/L和 0.05g/L；
（ 4）选用质量较好的琼脂，如琼脂糖等；
（ 5）经过多年探索，彭基斌、颜望明等研究设计出一种新的适用于氧化亚铁硫杆菌遗传操作的固体培养基，称之为 2∶2 培养基。组成为,FeSO4?7H2O 2?,Na2S2O3?5H2O 2?,
(NH4)2SO4 4.5?,KCl 0.15?,MgSO4?7H2O 0.75?,琼脂粉
6?,pH4.6～ 4.8。这种培养基含两种能源，亚铁和硫代硫酸钠,pH在 4.6～ 4.8范围内，至少卡那霉素（ 300μg/mL ）和链霉素（ 200～ 300μg/mL ）可以在该培养基上使用。尽管氧化亚铁硫杆菌形成菌落需要两周时间，但菌落形成率相对较高。在
2∶2 培养基上生长，形态特征明显、稳定，氧化亚铁硫杆菌、
抗卡那霉素和抗链霉素的自发突变率均低于 10-8，这就为利用这两种抗生素为遗传标记、选择转移接合子奠定了基础。
（ 6）除此之外还可采用 ISP固体培养基。 ISP固体培养基的配制：溶液 A,300 mL蒸馏水中加入 FeSO4?7H2O，配成浓度
33.4%的溶液；用 6M H2SO4调 pH值至 2.5，搅拌至几乎无色，用细菌滤膜灭菌后，臵于室温中。溶液 B,550mL 蒸馏水中加入
(NH4)2SO4 6.0g,KCl 0.2g,MgSO4· 7H2O 1.0g,Ca(NO3)2
0.02g，调 pH值至 3.0,121℃,1.21atm，灭菌 15min。溶液 C，
纯化的琼脂 7.0g加到 150mL水中，浸泡 15min，在 1升锥形瓶中升温至 121℃,1.21atm灭菌 5min。 B和 C从高压釜中取出，在空气中冷却 5 min，然后将 B,C混合，将 A加入上述混合物，并搅匀。三者混合物倒于平板上，深度约为培养皿的高度的一半。
5.3.2 浸矿微生物的采集、分离
工作微生物可从菌种保藏机构直接购得。但多数情况，仍需从自然界中采集。
浸矿微生物可能存在的地点有以下一些：
（ 1）矿山、矿堆或尾矿中流淌的酸性水；
（ 2）矿石本身；
（ 3）热泉水样或矿浆。
在选择采集地点时，应结合将来的工作目的选择合适的地方，例如，研究细菌浸出铀矿的影响因素，则最好到铀矿山采集菌种。
以浸矿细菌中最常见的氧化亚铁硫杆菌为例，介绍浸矿微生物的采集、分离的基本方法。
氧化亚铁硫杆菌广泛存在于金属硫化矿山、煤矿的酸性 (pH<4)矿坑水中，因此可到这些矿山采集，
采集的步骤如下：
取 50～ 250mL细口瓶，洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于 120℃ 烘箱灭菌 20min，待冷却后即可作为细菌取样瓶。带取样瓶到矿山取酸性矿坑水。如矿坑水的 pH为 1.5～ 3.5并呈红棕色（说明有 Fe3+存在），则很可能存在氧化亚铁硫杆菌，可对此水样进行分离培养。取样时将牛皮纸取下，用一只手拔去瓶塞，另一只手持瓶接取或舀取水样，其量不宜超过瓶容量的 2/3。（若所取样不是水样而是已被氧化成棕褐色的潮湿矿块，则应在灭菌的取样瓶中，加入约占瓶容积 1/3的液体培养基）取样后，
立即盖好胶塞，并用牛皮纸包好，在瓶上贴上标签，
标明取样地点及时间。
为了分离、培养所需细菌，还需配制好专供这种菌生长的 Leathen或 9K培养基，配好的培养基用蒸气灭菌 15min，然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的 100毫升的三角瓶中。塞好棉塞置于 20～
30℃ 的恒温条件下静置培养（或振荡培养） 7～ 10天。
由于细菌生长繁殖，三角瓶中培养基的颜色由浅绿色变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀（与空白对照）。选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取
1毫升培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液比头一次更快地变成红棕色，以后按同样方法反复转移培养，至少十次以上。每转移一次，
接种量逐渐减少，只需 1～ 2滴就可。而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养 3～ 5天就可把培养基中的
Fe2+氧化成 Fe3+。在转移培养中，借助培养基的高酸度及高浓度亚铁和高铁离子，可杀死和淘汰一些杂菌，
氧化亚铁硫杆菌可得到充分繁殖，活性越来越好。
对培养的氧化亚铁硫杆菌进行初步鉴定方法
（ 1）肉眼观察如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿色变成红棕色，最后产生高铁沉淀。（需作空白对照，因为空气也能将亚铁氧化成
Fe3+，培养基的颜色会由浅绿色变成黄色，并会产生沉淀附于瓶底。）
（ 2）重铬酸钾容量法测定用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁氧化成高铁的氧化率。用 K2Cr2O7-HgCl2法或 K2Cr2O7-SnCl2的方法测定培养基中的全铁量，再用 K2Cr2O7或 KMnO4滴定 Fe2+（酸性环境），以此计算得 Fe2+的氧化率，氧化率高的，说明细菌生长旺盛。
（ 3）显微镜观察用简单染色或革兰氏染色法对所培养的细菌进行染色，在显微镜下观察是否有 T,f存在。
5.3.3 浸矿微生物的纯化用上述方法获得的菌种往往不纯，其中会有杂菌。要想得到纯菌种，则需要作平板分离。浸矿细菌的分离纯化一般采用稀释涂布平板法、平板划线分离法和终点稀释法。
稀释涂布平板法是一种有效而常用的微生物纯种分离方法。
它是将一定浓度、一定量的待分离菌液移到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒迅速地将其均匀涂布，使长出单菌落而达到分离的目的，见图 2-3。
平板划线分离法是用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种方法。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
终点稀释法取繁殖好的菌样 1mL，注入盛有液体培养基 9mL的试管中，混合均匀，然后再从此试管中吸取 1mL注入另一盛有培养基 9mL的试管中，依次类推制成 10-1,10-2,10-3?10 -10不同稀释度的培养液。将 10支试管均放入恒温培养箱中培养 7～ 8d后取出。由于各管中原始菌浓度不同，培养基颜色变化不一，颜色深浅与原始菌浓度成正比。若第 7支试管变色而第 8支不变色，则认为第 7支试管极有可能含单一菌的纯培养。
图 2-3 稀释涂布平板分离示意图原菌液
10- 1 10- 2 10- 3 10- 4 10- 5
单菌落培养各9 硫酸溶液涂布平板
30 ℃培养挑单菌落
10- 6
稀释涂布平板法的基本步骤如下：
（ 1）制备固体培养基
（ 2）编号,取 6支无菌空试管，依次编号为 10-1、
10-2,10-3,10-4,10-5,10-6，将固体培养基平板分别编号为 10-4,10-5,10-6，每个稀释度各三个平板。
（ 3）稀释,取上述已繁殖好的细菌培养液 1mL，用
pH = 2.5的稀硫酸溶液按每次稀释 10倍，依次稀释成
10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6浓度的稀释液。
（ 4）取样：吸取稀释度 10-4,10-5,10-6的稀释液各 0.2mL，然后分别接种到编好号的平板上，涂布均匀。
（ 5）培养：将涂布后的平板倒置于 30℃ 的恒温培养箱中培养，直至平板表面出现铁锈色圆点状小菌落。
（ 6）选取单菌落：将单独小菌落挑起，每个小菌落分别接种于液体培养基中培养。这样培养出的细菌即为单一菌的纯培养。
平板划线分离法基本步骤如下：
（ 1）制备固体培养基
（ 2）划线,将烧红的接种环冷却后，挑取原菌液划线，划线时动作要轻巧，线条要平行且密集，
要充分利用平板培养基的表面积。平板划分时划为四个作用不同的 A,B,C,D区（见图 2-4），
D区是单菌落的主要分布区。
（ 3）培养：将培养皿置于 30℃ 恒温箱中培养，
直至培养基上出现小的铁锈色圆状小菌落。
（ 4）挑选单菌落,将 D区或 C区出现的典型单菌落移接至液体培养基中培养。
5.3.4 菌种的保藏优良的活性菌种应及时进行保藏。菌种的保藏要达到不死亡和不变异两个要求。因此，
必须使微生物的代谢作用相对地处于最不活跃的状态。若为短期保存，则可将充分生长的 T.f菌停止培养，在菌液中加入少许
FeSO4?7H2O后，移入 4℃ 的冰箱中保存，每月尚需转种一次。长期菌种保藏方法很多，如：
斜面低湿保藏法、液体石蜡保藏法、砂土 —
－ 黄铁矿保藏法及冰冻干燥法。但对于浸矿菌种而言，后两种方法较为有效。
1 砂土 — －黄铁矿保藏法将 T,f菌培养液转移到无菌试管或安瓿管中。
瓶中预先装有砂土与黄铁矿 1∶3 的混合物。砂土、黄铁矿均经过筛砂、清洗、干燥、灭菌。取每 1～ 2mL菌浓度为 109个 /mL的细菌培养液混入砂土 — — 黄铁矿混合物 2～ 3g，将试管塞紧蜡封或将安瓿管熔封，室温保藏。此法可保藏菌种 2.5～ 3年。
2 冰冻干燥法将菌体培养物离心，制得菌种悬浮液。用蒸馏水快速漂洗，直至 pH达到 7左右，然后转移到安瓿管中，
并加入细胞保护剂，将安瓿管置于 -70℃ 的低温冰箱中冰冻 24h，再冰冻干燥 24h后封口。制备好的安瓿管放置在低温避光处保藏。
5.4 浸矿细菌计数及细菌生长曲线微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标。所以有必要对微生物的生长繁殖及其控制规律作介绍。
5.4.1 测生长量
5.4.2测细胞数
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
5.4.1 测生长量生长意味着原生质量的增加，所以测定生长的方法也都直接或间接地以此为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。
1 直接法
（ 1）测体积这是一种很粗放的方法，用于初步比较用。将一定体积的待测培养液放在刻度离心管中自然沉降或进行定时间的离心，然后观察其体积。
（ 2）称干重可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的
10%～ 20%。在离心法中，将待测培养液放入离心管中，用清水离心洗涤 1～ 5次后，进行干燥。干燥温度可采用 105℃,100℃ 或红外线烘干，也可在较低的温度（ 80℃ 或 40℃ ）下进行真空干燥，然后称干重。以细菌为例，一个细胞一般重约 10-12～ 10-13g。
5.4.1 测生长量
2 间接法
（ 1）比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物浑浊度的增高。使用光电比色计测菌液的透光度，或自行制作的比浊管进行测定。
（ 2）测含氮量蛋白质是细胞的重要物质，含量一般比较稳定，而氮又是蛋白质的重要组分。细菌的含氮量约为原生质干重的 12.5%。根据其含量再乘以 6.25，即可测得其粗蛋白的含量。测定含氮量的方法很多，如用硫酸、过氯酸、碘酸或磷酸等消化法和 Dumas
测氮气法。
（ 3） DNA含量测定
DNA与 20 %的 3,5-二氨基苯甲酸 -盐酸溶液能显示特殊的荧光。根据这一原理测出 DNA的含量，即可推算出细菌的总量。
每个细菌平均含 DNA 8.4× 10-14g。
5.4.2 测细胞数
1 直接法是指在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。所测结果是包括死细胞在内的总细菌数。
（ 1）比例计数法这是一种很粗的计数方法。将已知颗粒浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中的细胞浓度。
（ 2）血球计数板法这是用来测定一定容积中的细胞总数的常规方法，也是浸矿细菌计数的一种方法。
在测定细菌数目之前应将血球计数板擦洗干净，再将盖玻片安放在计数室上面，然后用接种环取一环均匀的菌体悬液，
使它沿着盖玻片与计数板的缝隙渗入计数室，连续二至三次，
直至注满计数室为止，后置于显微镜载物台的中央计数。由于浸矿细菌小、无色透明，且 9K,leathen培养基在培养过程中产生氢氧化铁或黄钾铁矾沉淀，干扰测定。为解决上述问题可在计数之前先将待测细菌用草酸铵结晶紫染色。
图 2-5 血球计数板的构造
A：顶面观 B：侧面观 C,九大格 D：一大格（ 25中格）
1,中央平台 2：盖玻片
5.4.2 测细胞数
2 间接法间接法是一种活细菌计数法，是根据活细胞通过生长繁殖会使液体培养基浑浊或在平板培养表面形成菌落的原理而设计的方法。
（ 1）液体释稀法对待测菌样作连续的 10倍系列释稀。根据估计数，从最适宜的 3个连续的 10倍的释稀液中各取 5ml试样，接种到 3组共
15支装有培养液的试管中（每管接入 1mL）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管，然后查最大可能数量表，再根据样品的稀释倍数计算出其中的活菌含量。
（ 2）平板菌落计数法这是一种最常见的活菌计数法。取一定体积的释稀菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。经保温培养后，以平板上 (内 )出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个 9cm
直径的培养皿平板上，一般以出现 50~500个菌落为宜。
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线当我们把少量纯种微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气等条件下，它们的群体就会有规律地生长起来。如以细胞数目对数值作纵坐标，
以培养时间作横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，
这就是微生物的生长曲线（ growth curve，见图 2-
6）。根据微生物的生长速度常数 (growth rate
constant)，即每小时的分裂代数（ R）的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期。细菌的生长曲线对掌握细菌生长规律很重要。
通过生长曲线可以知道细菌在哪个时期年轻且代谢活跃，
哪个时期衰老而濒于死亡，这样可根据需要在不同时期收集菌种。如需快速氧化 Fe2+，则应收集对数期的浸矿细菌，若保存菌种，则最好取稳定期的菌种。
图 2-6 典型生长曲线
Ⅰ,延滞期 Ⅱ,指数期 Ⅲ,稳定期 Ⅳ,衰亡期
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
1 延滞期 (lag phase)
又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一般时间内细胞数目不增加的时期。该时期的细胞有以下几个特点：
（ 1）生长速度常数等于零；
（ 2）细胞形态变大或增大；
（ 3）细胞 RNA尤其是 rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；
（ 4）合成代谢活跃、核糖体、酶类和 ATP的合成加快，易产生诱导酶；
（ 5）对外界不良条件反应敏感。
影响延滞期长短的因素除细胞本身的生理特性外，还有接种龄、按种量、培养基成分等。延滞期太长不利于工业生产，因此应尽量设法缩短延滞期。常用的措施有增加接种量，采用最适菌龄（即处于对数期的细菌）等。
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
2 指数期（ exponential phase）
又称为对数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期，见图 2-7。
指数期的细菌有以下几个特点：
（ 1）生长速度常数 R最大；
（ 2）细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；
（ 3）酶系活跃，代谢旺盛。
在指数期中，有三个参数最为重要,
繁殖代数（ n） ；生长速率常数（ R） ；代时（ G）
指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致，
细胞成分平衡发展和生长速度恒定，故可作为代谢、
生理等研究的良好材料。
图 2-7 指数期生长曲线
n2xx 12
细胞个数（个
）
x1
x2
培养时间（ ）
t1 t2
（ 1）繁殖代数（ n），
n lg 2lg xlg x 12
（ 2）生长速率常数（ R）
)l g x3,3 2 2 ( l g xl g 2l g xl g xn 1212
12
12
12 tt
)lg x3,3 2 2 ( lg x
tt
nR
（ 3）代时（ G）
)lg x3,3 2 2 ( lg x
tt
R
1G
12
12
n2xx 12
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
3 稳定期（ stationary phase）
又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速度常数 R等于 0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等或正生长与负生长相等的动态平衡之中。
稳定期到来的主要原因是：
（ 1）营养物尤其是生长限制因子的耗尽；
（ 2）营养物的比例失调，例如 C/N比例不合适等；
（ 3）酸、醇、毒素等有害代谢产物的积累；
（ 4） pH值、氧化还原 势等物化条件越来越不适宜等等。
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
4 衰亡期在衰亡期，个体死亡速度超过新生的速度。
因此，整个群体呈现出负生长（ R为负值）。
产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。
5 浸矿细菌生长曲线的绘制浸矿细菌生长曲线的绘制关键是细菌数量。
只需在细菌培养或浸出过程中每隔一定时间，
按前面介绍的方法测得细胞个数，后以时间为横坐标，以菌数为纵坐标画曲线即可。
5.5 浸矿细菌活性的测定细菌的活性是微生物浸矿的重要参数。在硫化矿浸出中，它表示细菌在单位时间内氧化目的矿物的量，在细菌培养中，它表示细菌生长的活跃程度。目前，测定细菌活性的方法有很多，主要有：亚铁离子氧化速率,CO2的固定速率 (即吸收速率 )、氧的消耗速率以及目的矿物氧化速率等。
5.5.1 亚铁离子氧化速率法
5.5.2 细菌耗氧速率法
5.5.1 亚铁离子氧化速率法氧化 Fe2+为 Fe3+是 T.f菌的主要特征,Fe2+氧化速度快，表明细菌代谢旺盛，活性高。实验室或工业生产上常用图 2-8所示的装臵来测定细菌活性。其它具有良好充气与搅拌功能的装臵也可。
测定方法如下：抽取 25mL待测菌液（或矿浆）
于装臵中，测定其中 Fe2+浓度，然后根据测得的
Fe2+浓度值，补加 FeSO4·7H2O至 Fe2+浓度为
10~15g/L，再准确测定 Fe2+浓度，这时的 Fe2+浓度即为起始浓度 C0。
将装臵臵于恒温箱内充气培养 2h，温度保持在
30℃,再测菌液中 Fe2+浓度，即最终 Fe2+浓度 Cf。
细菌活性可用下式计算：
除此之外，还可在细菌培养或浸矿过程中，每隔一定时间取待测菌液（或矿浆） 5～ 10mL，用重铬酸钾容量法测得其中全铁,Fe2+的量（全铁量测一次即可），计算不同时间段 Fe2+的氧化率也能表征细菌的活性。
) /2C(CA f0
图 2-8 细菌活性测定装臵式中,A—— 测得的细菌活性
（ g/L?h）
C0—— 起始 Fe2+浓度
（ g/L）；
Cf—— 最终 Fe2+浓度
（ g/L）。
空 气
5.5.2 细菌耗氧速率法浸矿细菌大多数是好氧菌，其代谢过程中要消耗氧气，氧的消耗速率越快，说明细菌代谢越旺盛，活性越高，故氧的消耗速率也可表征细菌的活性。细菌对氧的消耗速率，可用瓦勃氏（ Warbury）呼吸器测定，
其构造如图 2-9所示。
测定时，将 1.5～ 2.5mL矿浆放进瓦勃氏呼吸器的反应瓶中。反应瓶中央小瓶盛 0.5mL20%的 KOH溶液以吸收 CO2。然后，将反应瓶接上测压计。整个呼吸器应臵于恒温环境（如恒温水浴），开动搅拌器。当测压计与环境温度相同时，反应开始，调节测压计 U型管闭臂液面，使达到零点，并关闭三通。反应一定时间后，
细菌吸入氧气的体积 ΔV 可由 U型测压计液柱差的读数换算得出。细菌活性单位可用 O2 g/（ L?h）或者
mol/min表示。
图 2-9 瓦勃氏呼吸器及测量操作示意图
T：开关 F,反应器 M,U形压力计
S：瓶侧臂 C,CO2吸收器 R：温度计
5.6 浸矿微生物的育种选育高效浸矿菌种是生物浸矿技术实现工业化的前提条件。对浸矿细菌进行性状改良，主要从以下几个因素考虑：
（ 1）细菌生长速度（生物量增加速度）；
（ 2）硫化矿的氧化速度（活性）；
（ 3）对重金属的耐受能力；
（ 4）细菌在矿物颗粒上的粘附速度及细菌在矿物颗粒和溶液中的分布情况；
（ 5）菌种保藏的稳定性；
选育高效菌种的方法除了从自然界筛选高品质的浸矿微生物外，更主要的是传统的驯化、诱变育种、
杂交育种和现代的原生质体融合技术以及基因工程育种。
5.6.1 驯化培养驯化是用某一特定因素长期处理某微生物的群体，
同时不断地对它们进行接种传代，以达到累积并选择相应的自发突变株的目的。
现以驯化细菌对某种金属的耐受能力为例，说明其过程。首先在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的该金属离子，然后接入要驯化的细菌进行恒温培养。开始细菌不适应，要较长时间才能生长，待细菌适应并能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续培养。依次类推，每转移一次都提高金属浓度，如此进行下去，就可以获得对该金属离子具有较强耐性的菌株。表 2-3表明了驯化氧化亚铁硫杆菌对铀耐受能力的过程及成果,T,f耐受铀离子的能力从未驯化前的 600mg/L到驯化后的
1000mg/L，提高了 66.7%。
表 2-3 氧化亚铁硫杆菌对铀适应性的驯化铀浓度
（ mg/
L）
氧化培养基中全部 Fe2+所需时间（ d）
驯化前细菌 第一次转移 第二次转移 第三次转移 第四次转移
0 4 4 4 4 4
100 4 4 4 4 4
200 4 4 4 4 4
300 7 4 4 4 4
400 7 4 4 4 4
500 7 4 4 4 4
600 7 10 4 4 4
700 不生长 10 7 7 4
800 不生长 10 7 7
900 10 7 7
1000 不生长 10 10
野生菌经过驯化，活性极大地提高。表 2-4是野生菌与驯化菌氧化二价铁的对比情况。
表 2-4 氧化亚铁硫杆菌氧化二价铁的对比试验氧化时间（ h）
驯 化 菌 野 生 菌
Fe3+/Fe2
+
亚铁氧化率
（ %）
Fe3+/Fe2
+
亚铁氧化率
（ %）
0 0.224 0.000 0.297 0.000
24 0.658 6.527 0.480 1.149
48 256.600 99.524 0.272 0.148
72 485.615 99.758 0.441 1.186
96 0.546 20.082
120 0.673 23.842
144 0.923 24.231
168 7.958 79.659
192 84.171 97.610
5.6.2 诱变育种诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，
然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。一般育种程序包括菌种的选择、菌悬液的制备、诱变处理和变异株的筛选。
1 菌种的选择具有以下性状的菌株可作为育种菌株：
（ 1）具有很高的氧化亚铁或元素硫的活性；
（ 2）具有再生生长的能力；
（ 3）已有相当程度的变异。
挑选优良菌株的方法是采用平板分离法，找出符合上述性状的菌株。
2 菌悬液的制备吸取 10ml菌液，于 4000rpm下离心 20min，去上层清液得到菌体沉淀。用预先配好并灭菌的稀硫酸
（ pH2.0左右）对沉淀洗涤，再次离心，去上层清液，
重复三次。用稀硫酸调节细胞浓度为 108个 /mL的悬液，
即为细胞悬液。
3 诱变处理诱变剂分为两大类，物理诱变剂和化学诱变剂。
物理诱变剂，如紫外线、电离辐射,He-Ne激光等；
化学诱变剂，如亚硝基胍（ MNNG）、亚硝基等。 T,f
菌生长于酸性（最佳 pH=2.0~3.5）环境，而且以自养方式生存，有机物对其有强烈的抑制作用，而且大多数化学诱变剂只能在近中性环境下发挥最佳诱变作用，
在稍酸性的环境下会分解成各种各样的有毒害的有机物，而且诱变效果大大降低。故在选择诱变剂时，首选物理诱变剂，其次才考虑 结合化学诱变,
表 2-5 不同紫外线辐射时间对细菌氧化活性的影响紫外线辐射时间
（ s） 0 40 80 120 160 200 250
氧化 Fe2+速率
（ g/L?h） 0.07 0.27 0.58 1.08 1.12 1.28 1.54
提高率（ %） - 586 728 1443 1500 1728 2100
表 2-6 不同时间微波诱变对菌种生长速度及氧化活性的影响微波处理时间（ s） 50 100 150 250
致死率（ %） 80 90 96 99
第一代繁殖耗时（ h） 184 184 206 386
第二代繁殖耗时（ h） 96 78 72 40
第三代繁殖耗时（ h） 71 57 48 30
第四代繁殖耗时（ h） 47 40 30 24
氧化 Fe2+速率（ g/L?h） 0.37 1.09 1.35 1.92
4 变异株的筛选
T,f菌已有的育种研究表明，诱变其亚铁氧化活性时，最有效的突变可以通过以下四种指标确定，四种指标要结合使用。
（ 1）相邻比较，如果杀伤率大的比杀伤率小的氧化快，那么前者正突变大；
（ 2）测稳定期（约 65%~75%的氧化率时）氧化速度，氧化越快，正突变较大；
（ 3）测对数期（约 15%~45%的氧化率时）细菌生长速度，确定传代时间，对数期以见到较多的二连体细菌为标志；
（ 4）颜色观察法，颜色越红，表明氧化越快。
平板分离的筛选指标有：
（ 1）相对位臵，如果中央位臵的菌落比边缘的大，那么中央菌落为氧化活性高的菌株；
（ 2）同一半径位臵上菌落大的则氧化活性高；
（ 3）先出现的菌落的氧化活性高，特别是中央位臵；
（ 4）中央为红色，边缘为白色，丝状扩展型菌落比菌落黄色混浊的氧化活性高。
平板分离筛选仍需多次摇瓶比较方可确定。
5.6.3 杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经接合使遗传质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株。
所谓细菌接合，是指通过供体菌和受体菌的细胞间直接传递大段 DNA的过程，可将不同菌株的优良性状集中于重组体，从而获得优良菌株。细菌接合过程可用图 2-10
表示。
亲本雄性菌株形成接合管，与亲本雌性菌株联接。
接着，雄性体中的一端 DNA通过接合管进入雌性体中，
这样雌性菌株中便含有雌性菌株的一段 DNA片段，并在自身细胞分裂时稳定地遗传给子代。如果吸入的雄性
DNA片段中，基因型不同于雌性，那么重组菌株便形成，
可能表现出人们感兴趣的某些优良性状 。
图 2-10 浸矿细菌接合过程示意图
5.6.4 基因工程育种基因工程是一种体外 DNA重组技术，用人为方法将所需要的某一供体菌的遗传物质 — DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和作为载体的 DNA
分子连接起来，得到重组 DNA，导入某一受体细胞中，
使该外来的遗传物质在其中进行正常的复制与表达。
重组 DNA上携带了人们感兴趣的性状，如抗砷等特性。
大致流程如下（图 2-11）：
筛选含有所需酶的菌株 → 确定酶基因的位臵（质粒或染色体上） → 如果在基因组上，提取及纯化基因组染色体 → 将纯化好的基因组片段克隆到大肠杆菌的质粒上 → 检出被转化的大肠菌菌株 → 从转化菌株中将质粒提取出来，并将质粒上有关的酶基因片段切割下来 → 检测所获得的酶基因片段及有该基因表达出来的酶的氨基酸顺序 → 构建穿梭质粒，并将酶基因导入目的硫杆菌内 → 表达。
图 2-11 T,f菌基因工程示意图
5.7 微生物浸矿的基本原理自 50年代发现浸矿微生物以来，经过许多人的研究和实验，人们已基本掌握了微生物浸出过程的规律和作用原理。细菌浸矿的机理主要有直接作用理论、间接理论以及复合作用理论，也有学者提出了破硫膜作用说。
5.7.1 直接作用理论
5.7.2 间接作用理论
5.7.3 微生物浸矿复合作用
5.7.4 破硫膜说
5.7.1 直接作用理论所谓细菌直接浸出是指不依赖于 Fe3+的触媒作用，细菌的细胞和金属硫化矿固体之间直接紧密接触，通过细菌细胞内特有的铁氧化酶和硫氧化酶直接氧化金属硫化物，使金属溶解出来。试验结果表明：只有在细菌的参与下，
对黄铁矿（ FeS2）、铜蓝（ CuS）、毒砂
（ FeAsS）等的浸出才有明显的效果。
42 C u S OO2C u S 细菌
44322 F e S O2A s OH2O2
13OH3F e A s S2 细菌
442222 F e S O2SOH2OH2O7F e S2 细菌
5.7.2 间接作用理论氧化硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌等浸矿细菌具有氧化低价铁和元素硫生成高价铁和硫酸的能力，其反应如下：
OH2)SO(Fe2SOH2OF e S O4 23424224 细菌
4222 SOH2OH2O3S2 细菌
Fe2(SO4)3溶液是一种有效的金属矿物的氧化剂和溶浸液，铜、铀及其它多种金属矿物如黄铁矿、黄铜矿（ CuFeS2）等都可以被 Fe2(SO4)3浸出。
42423422 SOH8F e S O15OH8)SO(Fe7F e S
S2F e S O5C u S O)SO(Fe2C u F e S 443422
铀矿石的浸出亦主要是利用上述细菌所生成的氧化产物硫酸高铁和硫酸对沥青铀矿等主要铀矿物进行溶解和氧化。 Fe2(SO4)3能将不溶于水的四价铀氧化成可溶的六价铀，从而将铀浸出。
5.7.3 微生物浸矿复合作用微生物浸矿复合作用理论是指在细菌浸出过程中，
既有细菌直接作用，又有通过 Fe3+氧化的间接作用。
有时以直接作用为主，有时则以间接作用为主，但两种作用都不可排除，这是迄今为止绝大多数研究者都赞同的细菌浸矿机理。实际上，矿石总会多少存在一些铁的硫化矿，所以浸出时 Fe3+的作用不可排除。黄铁矿浸出就是两种机制同时存在的例子。
5.7.4破硫膜说有的学者认为，在浸矿过程中，矿石块表面覆盖着硫的薄膜，阻碍了溶浸液与矿石块表面的直接作用，
若有细菌存在，可以将硫膜氧化和破坏，使浸出得以继续进行。
5.8 细菌浸出动力学细菌浸出过程，包括细菌生长繁殖及与矿物之间的生化反应，也包括细菌溶浸液与矿物之间的化学反应，
这些反应过程之间的影响因素，有的相互统一，有的则相互矛盾和抵触。增加浸出过程的通气量和适当提高搅拌速度，对各反应过程有利，但反映环境的温度和酸度则不同，有利于矿物浸出化学反应的温度和酸度，却不一定对细菌生长有利。相对于矿物浸出化学反应来说，细菌繁殖过程是一个缓慢的过程，因此，
细菌浸出反应的总反应速度受细菌生长速度控制。
由试验和生产实践中得知，细菌浸出速度和浸出介质中细菌的浓度成正比。细菌生长繁殖受环境因素控制，由细菌生长曲线可知，细菌在对数生长期的曲线斜率为细菌生长率 μ,μ 为单位时间单位体积内的细菌增长量。当环境的通气量与其他条件固定时生长率与培养基中某一组分浓度的关系如图 2-12所示。
图 2-12 细菌生长率与培养基浓度的关系
μ m
细菌生长率
μ
培养基浓度Ks
μ
该曲线可表示为如下关系：
该曲线可表示为如下关系：
SK
S
s
m
式中,μ m—— 最大生长率；
S —— 培养基浓度；
Ks —— 常数（最大生长率一半时的培养基浓度）。
在矿物浸出环境中，细菌从矿物获取营养，矿物好比是固体培养基，可取矿物的表面积为培养基浓度
S。当连续培养达到稳定状态时，细菌生长繁殖和培养基消耗达到平衡，在此状态下可得到如下关系式：
0 DNNdtdN?
0 YNDSDSdtdS r?
式中,N—— 细菌浓度（ g/L）；
D—— 稀释率（新培养基添加率或旧培养基流出率）（ L/(h?L)）；
Sr—— 流入液体培养基的浓度；
S—— 培养容器内已有培养基的浓度；
Y—— 每消耗一克培养基所产生的细菌数。
由以上关系式可知 μ ＝ D，单位时间内细菌产量为：
)( DDKSDYDN
m
sr
由上两式可看出，稀释率 D越低，培养基在培养容器内的停留时间越长，则培养基的利用率越高。如果在此设备中进行连续细菌浸出，则溶浸液的消耗率越高，得到的浸出液金属浓度越高。
相反，如果稀释率 D越高，则菌液流出量越大，但细菌浓度较低。如果用于浸出，浸出液金属浓度较低。为取得更理想的细菌培养或浸出效果，在实践中应采用适当的稀释率，以控制细菌的产率、
浓度和理想的浸出速率。
由于细菌浸出速率和细菌产量成正比，则此时培养基的消耗率 η为：
r
m
sr
r
r
S
D
DKS
S
SS
)(
式中,C—— 培养容器或浸出设备中溶解氧的浓度；
C*—— 同样温度下氧的饱和溶解度；
q—— 细菌耗氧率（ mL/(g?h)）；
N—— 细菌浓度；
α —— 常数，和传质系数有关。
在细菌连续培养和矿石搅拌浸出条件下,C存在最佳值，上式中的其他项 C*,q,N都是固定值，所以要取得充分的供氧量和理想的溶解氧浓度 C，只有改变常数项 α 。由上式可以看到，供气量与 α 成正比，而 α 值与传质系数有关，传质系数越大,α 值越大。要提高传质系数，应使供气的气泡细小，进入容器液体时气体要充分散开，尽量减小传质边界层的厚度，提高气液混合的湍流度。在堆浸条件下，提高供气量的有效办法是采用喷淋方式布液，周期性地向矿堆注入溶浸液，使矿石堆内保持良好的通气量和通畅的渗透性。
当浸出矿石的品位较高、粒度较细时，相当于为细菌提供充分的培养基，此时氧气的供应量就成为细菌产量或矿石中金属浸出量的限制因素。因此可引出如下关系式：
qNCCdtdC )( *?
5.9 细菌浸出与铀矿石矿物学细菌浸铀过程和一般化学浸出过程有相似之处，两者都是利用某种溶浸液将矿石中的有用组分溶解出来，但细菌浸出是一个比一般化学浸出更复杂的反应过程。在这个浸出过程中，
除一般化学反应外，还有细菌生长繁殖及同浸出物料的作用过程。浸出过程中要时时关注细菌的生长情况，在很大程度上，
只能在细菌生长条件允许的范围内，改变各种浸出条件，提高反应速度。细菌浸出是一种特殊浸出方法，该工艺有自己的独到之处，但也有一定局限性和适应性。
细菌浸出的一个重要方面是铀本身的矿化作用,Mille等人认为，象钛铀矿那样的难浸矿是难以处理的。然而，在加拿大伊利奥特湖附近的各个铀矿中，这种矿石很多，业已采用的细菌浸出具有良好的结果，表 2-7列出了各种铀矿石进行生物浸出的结果。据此可以认为，氧化物、磷酸盐、硫酸盐和碳酸盐矿石比较适合生物浸出，而硅酸盐矿石则难以甚至不可能进行生物浸出。
表 2-7 各种铀矿石的化学组成与生物浸出的关系铀 矿 石 化 学 组 成 细菌浸出的程度沥青铀矿 UO2 +
脂铅铀矿 UO3.nH2O +
深黄铀矿 CaU6019.11H2O +
钛铀矿 (U,Ca,Ce)(Ti,Fe)O6 +
铀钛磁铁矿 (Fe,Ce,U)(Ti,Fe,V,Cr)5O12 +
水硅铀矿 U(S04)1-x(OH)4x -
硅钙铀矿 Ca(UO2)2Si2O7.6H2O + -
硅镁铀矿 Mg(UO2) 2Si2O7.6H2O + -
钙铀云母 Ca(U02)2(PO4)2.12H2O +
铜铀云母 Cu(UO2)2(P04)2· 8H2O +
磷铵铀矿 NH4.UO2.PO4.3H2O +
翠砷铜铀矿 Cu(UO2)2(AsO4)2.12H2O +
钾钒铀矿 K2(UO2)2(VO4)2.3H2O + -
钒钙铀矿 Ca(UO2)2(VO4)2.8H2O + -
水铀矾 (UO2)2SO4+(OH)2.14H2O +
铀钙矾 (UO2)6SO4(OH)10.12H2O +
铀铜矾 Cu(UO2)2(S04)2(OH)2.6H2O +
板菱铀矿 NaCa3UO2SO4(CO3)3F.10H2O +
生物浸出的效率也取决于围岩的性质。当围岩呈碱性时，有可能形成沉淀物，该沉淀物将阻碍浸出液在矿堆中的自然渗滤，导致矿石中有些死角不能浸出，
铀回收率降低；另一方面，当围岩呈酸性时，酸耗低，
有利于铀的浸出。围岩的另一种重要情况是为细菌的不断生长提供充足的矿物，已有资料表明，含铀页岩是一种生物浸出的良好物料，因为它几乎含有细菌培养所需要的全部组分：硫化物、铁、磷酸盐、氮、有机物和微量元素。
表 2-8给出了各种铀矿石的矿物学性质。那些不含黄铁矿的矿石除外，其余所有矿石都适宜于氧化亚铁硫杆菌的生长，这是非常重要的。此外，那些主要由硅酸盐形成的矿物的酸耗很低，可使生产成本降低。
然而，最重要的经济因素仍然是黄铁矿的最低含量，
就是进行细菌氧化所需要的实际数量。
表 2-8 某些矿山铀矿物学矿 山 (地点 )
铀 的 矿 化黄铁矿
（ %）
围 岩氧化物硅酸盐磷酸盐钒酸盐
U3O8
(%)
硅酸盐碳酸盐
Lilljuthatten(瑞典 ) P - - - 0.14 - P -
Vendee(法国 ) P S - - 0.28-1.6 - P -
Urgeirica,(葡萄牙 ) p - - - 0.10 5 P -
Bica(葡萄牙 ) S - P - 0.15 1 P -
Valinhas<葡萄牙 ) P - S - 0.14 0.5 P S
Grants(美国 ) P - - - 0.32 <0.55 P -
E11iot湖 (加拿大 ) S P - - <0.15 5-10 P -
Mid west湖 (加拿大 ) P - - - 1.80 <1 P -
Ningyo— toge(日本 ) - - P - 0.03-0.15 <1 P -
Bhatin(印度 ) P - - - 0.03 <0.1 P -
Dyson’s(澳大利亚 ) - P - - 0.27 - P -
Mary Kathleen(澳大利亚 ) P - - - >0.30 - P -
Ranger(澳大利亚 ) P S S - 0.35 - P -
Yeelirrie(澳大利亚 ) - - - P 0.40 - P S
概括起来可以说，如果矿石中有黄铁矿且矿石几乎不含碳酸盐、铀不以硅酸盐形式存在或者铀不是存在于与介质相抵触的物相中、以及如果氧化亚铁硫杆菌能在适宜的环境 (有必不可少的营养物，不存在抑制剂 )中起作用，那么铀的回收率将是高的。
因此，在考虑细菌浸出对铀矿石的适应性，要注意以下基本要求：（ 1）对细菌浸出敏感的铀矿物学；（ 2）最好含有一定量的黄铁矿；（ 3）矿石中不存在碱性化合物；（ 4）含有细菌生长所需要的营养物质。
根据矿石的岩性和组成，可以大致估计某种矿石是否适于细菌浸出。应当说，适合细菌浸出的矿石种类是比较多的，大部分金属硫化矿和氧化矿都可以用细菌浸出。凡适合堆浸或渗滤浸出处理的矿石，都可以考虑采用细菌浸出，以下几种矿物资源可采用细菌浸出工艺处理。
（ 1）大量的贫矿、表外矿、选矿厂的尾矿等都可用细菌堆浸工艺回收其中的有价金属。
（ 2）废弃矿山或采空坑道中存留的矿石和废矿石，露天采矿剥离出的大量含金属围岩和废矿，矿井或巷道掘进中挖出的大量贫废矿等。
以上是可采用细菌浸出工艺处理的矿石的大致范围，要确切地了解某种矿物的细菌浸出可行性，还须通过试验来确定。比较快的办法是进行摇瓶试验，具体方法如本章下部分所述。用此法一般可在 3～ 4周内得出矿石的最大浸出率、浸出速度、酸耗和产酸量等数据，由这些数据就可较快地判别某种矿石是否适合于细菌浸出。
目前实践中比较常用的是氧化亚铁硫杆菌等嗜酸自养菌。浸出在酸性条件下进行，所以酸性矿物比较合适。矿石的耗酸物质不能太多，否则细菌氧化硫化矿所产生的酸很快被碱性矿物中和，要维持浸出酸度，
就要加入大量酸去中和矿石中的碱性矿物，在这种条件下，嗜酸菌较难适应。此外，该类菌靠氧化硫化矿和亚铁等获取代射过程所需能源，所以矿石中应含有一定量铁等金属的硫化矿物，即细菌氧化矿石中硫所产生的酸应足够去中和矿石中的碱性矿物。
5.10 细菌浸出影响因素金属矿物的细菌浸出过程和矿物的化学浸出过程有所不同，细菌浸出是一个更复杂的化学浸出过程，在这个过程中既有细菌生长繁殖和生物化学反应，又有溶浸液和矿物的化学反应，细菌生长繁殖速度比矿物化学浸出反应慢得多，所以细菌的生长状况是整个细菌浸出的制约环节。细菌浸出不仅与细菌本身特性有关，
还受浸出环境的诸多因素控制 [25-26]（如矿石性质、环境温度、介质酸度、通气量和培养基成分等）。
5.10 细菌浸出影响因素
5.10.1 矿石的性质：矿石的透气性,物理化学性质
5.10.2 矿石的粒度：矿石粒度越细,对浸矿越有利
5.10.3 温度：温度太高或太低都不利
5.10.4 pH值：细菌氧化 Fe2+最适 pH为 1.5~2.5
5.10.5 培养基成分：影响细菌生长繁殖速度
5.10.6 通气量：充分供气是很重要
5.10.7 铁离子,Fe3+是金属矿物的氧化剂
5.10.8 光线,微生物对紫外线很敏感
5.10.9 氨离子浓度：氨离子是细菌生长所必需的
5.10.10 其他影响因素
5.10.1 矿石性质的影响
1 矿石渗透性的影响矿石的透气性、矿石的物理化学性质等因素都将影响细菌与矿物的作用，影响细菌浸出率。一般来说，矿石堆积愈高、矿堆中泥质成分愈多，则矿石堆积愈紧密，堆内孔隙率愈小，细菌存活所需的氧气就愈少，从而影响细菌的活性，对铀的浸出不利；另外，矿堆中如泥土成分过多，还会形成隔水层，影响含细菌的溶浸液向下渗透，影响细菌与矿物之间的接触，进而影响浸出率。因此，在筑堆时，
矿堆的高度应在 10m以下，并尽可能将泥土成分分离出去。
5.10.1 矿石性质的影响
2 矿石粒度及矿浆浓度的影响按常规思想，矿石粒度越细，接触面越大，越有利于细菌与矿石接触，对浸出有利。只要不影响空气流通和溶液的渗流速度，矿石粒度越小越好，
小粒度矿石可获得较快浸出速度和较高浸出率。但矿石粒度越细，矿堆堆积得越紧密，矿堆内空气的流通和浸出液的渗透都会受到影响；对于含泥矿石来说，粒度过小，泥质成分更容易堵塞孔隙，降低矿堆的渗透性。有研究者发现，堆浸中矿块的细菌浸矿深度为 15mm左右，主要和矿石裂隙的毛细作用有关。对于细菌浸出，每种矿石均存在一个最佳粒度，一般通过试验确定。因此，选择最佳矿石粒度可以提高浸出率。
5.10.1 矿石性质的影响
3 矿石化学成分的影响矿石的化学成分影响浸出速度。如，当黄铁矿与黄铜矿共生时，黄铁矿对黄铜矿的细菌浸出有促进作用，黄铜矿的细菌氧化速度将加快；而黄铜矿与方铅矿共存时，方铅矿的存在反而抑制黄铜矿的细菌浸出。矿石中的一些重金属元素如汞、砷、铅等的溶解都会影响细菌的生长、繁殖甚至存活。因此，有目的地将矿石混合或除去某些组分，将会提高细菌浸出的金属浸出率。
5.10.1 矿石性质的影响
4 黄铁矿的影响虽然尚未明确研究过铀矿石类型对细菌浸出的影响，但是有文献指出，矿石中的黄铁矿对细菌浸出具有重要意义。由于这个原因，生物浸出法只限于硫化物含量高的矿石，并未普遍用于从矿石中提取铀。加拿大东部的一些矿石系黄铁矿与铀伴生，
特别适合于细菌浸出。但新墨西哥州、罗基山脉和美国南部得克萨斯州铀矿石的黄铁矿含量较低，甚至没有，因而不太适合于细菌浸出，有研究结果表明：在这类矿石中添加黄铁矿会产生促进作用。在葡萄牙和印度的矿石中通常加入 5公斤黄铁矿 /吨矿石，而在西班牙矿石中 3公斤 /吨矿石的黄铁矿加入量比 5公斤 /吨矿石更为有效。这说明，黄铁矿的最佳加入量取决于待浸矿石的矿物组成和待加入黄铁矿的性质。
5.10.2 温度的影响温度是影响细菌生长的重要条件之一。任何一种细菌都有一个最适生长温度，在一定的温度范围内，
随着温度的上升，该细菌的生长、繁殖加速。此外还有最低生长温度和最高生长温度。所谓最低生长温度是指低于这一温度时，这种细菌的生长停止，但并未死亡，利用这个原理在低温下保藏菌种。最高生长温度是指高于这一温度时，细菌生长停止，并最终导致死亡。各种细菌的最适生长温度范围和最低、最高生长温度都不一致，在环境温度随季节逐月缓慢变化时，
存在着一个天然的驯化和淘汰的过程，与变化的环境温度相适宜的细菌逐渐繁殖并不断增多。有资料表明，
当水温在 15～ 35℃ 范围内运行时，对污水处理厂的去除效果影响并不很大。
每种细菌都有各自最适宜的生长温度，工业上应用最广泛的氧化亚铁硫杆菌的最适生长温度是 30～ 32℃,当温度低于 10℃ 时，细菌活力变得很弱，生长繁殖也很慢。当温度高于 45℃ 时，细菌生长也受影响，甚至要死亡。有研究人员曾做过温度对氧化亚铁硫杆菌生长及氧化活性影响的试验，试验结果见图 2-13。并在 1995～ 1996年的生产实践中对温度与细菌活性关系进行了试验，试验结果见图 2-14。
图 2-13 细菌氧化 Fe2+速率与温度关系图 2-14 温度与细菌活性的关系从图 2-14可以看出，在前 3个月内,Fe2+氧化率保持稳定，说明细菌生长良好；之后，细菌活性减弱,Fe2+氧化率下降。这是因为时值冬天，矿堆内温度为 10℃ 左右，细菌生长缓慢，
细菌体内的酶促反应速度也下降；次年三月后，
随着温度回升，细菌又开始快速生长、繁殖，
氧化亚铁速率加快。
为了扩大细菌浸出的应用范围，使细菌能在低温条件继续发挥作用，王清良、胡凯光等人曾分别在室内和现场进行了低温细菌氧化 Fe2+试验，以检验低温下细菌活性。
首先在室内不同温度条件下进行了细菌活性检测试验，把试验中所得溶液氧化还原电位以及 Fe2+离子浓度与时间关系作图，得图 2-15、图 2-16。
图 2-15 不同温度条件下溶液电位与时间关系曲线图 2-16 不同温度条件下溶液 Fe2+
离子浓度与时间关系曲线图 2-15、图 2-16中曲线表明：没有接种的培养基，氧化还原电位基本不变,Fe2+很少被氧化；接入菌种的培养基，当温度只有 7℃ 左右时，
细菌活性很差,Fe2+基本上不被氧化，氧化还原电位也不升高；当温度升高至 17℃ 时，细菌能较快氧化 Fe2+，氧化还原电位升高；特别当温度升至 30℃ 时，细菌活性很好，能快速氧化溶液中 Fe2+，氧化还原电位迅速升高；但当温度继续升高至 50℃ 时，细菌活性几乎丧失，氧化还原电位基本不变,Fe2+基本不被氧化。而且从图
2-15、图 2-16中曲线 4、曲线 5都可以看出，接种的培养基在培养前阶段，氧化还原电位升高较慢； Fe2+浓度降低也较慢，到后阶段，氧化还原电位迅速升高,Fe2+浓度很快降低，说明越到后面细菌活性越好 。
后来又在现场加工了内径 Ф200mm,高 800
mm的简易生物反应器，由塑料圆柱和筛板组成，
试验装臵见图 2-17。
图 2-17 低温下细菌活性试验装臵示意图配好培养基，按 30%的比例接种，分析溶液中
ρ(Fe 2+)、氧化还原电位，然后通气培养。每天取样，
测定溶液电位，分析 ρ(Fe 2+)，并测量生物反应器中溶液温度、吸附尾液温度、室外温度，结果见表 2-9。
表 2-9 不同温度下细菌氧化 Fe2+情况时 间 溶液温度 (℃) 室外温度 (℃) 溶液电位 (mV) ρ(Fe 2+)(mg/L) ρ(Fe 3+)(mg/L)
1996.
9.23
11:00
16:20
13.5
12.O
14.O
14.O
451
452
330
330
348
348
9.24 11:0016:00 12.512.6 13.013.O 454453 320318 359360
9.25 11:OO16:5O 11.O11.2 12.O11.5 457458 314311 370373
9.26 11:2017:OO 10.010.0 10.510.3 462463 309309 376372
9.27 lO:4017:50 9.09.0 10.08.5 465467 300288 382391
9.28 11:3018:30 8.O8.0 5.05.0 470471 276271 400404
9.29 11:OO17:00 8.07.O 4.04.0 472472 270270 405406
9.30 17:OO 7.5 4.O 472 269 405
5.10.3 pH值的影响浸矿用的氧化亚铁硫杆菌属，是一种产酸又嗜酸的细菌，环境酸度对细菌生长有明显影响。有资料报道：细菌氧化 Fe2+最适 pH范围为 1.5～ 2.5，也有报道为 1.8～ 2.0。对此，作者等人在室内用自行采集的菌种经过驯化培养之后，在不同 pH条件下进行细菌快速氧化亚铁试验，试验装臵见图 2-18。
图 2-18 试验装臵在相同温度条件下，调节溶液 pH分别为
0.42,0.82,0.94,1.27,1.64,2.00、
3.00,4.60进行试验，把不同 pH条件下通气培养时溶液中 Fe2+氧化率与时间关系作图 2-19，
Fe2+氧化速率与 pH关系作图 2-20。
图 2-19 不同 pH条件下，
Fe2+氧化率与时间的关系图 2-20 pH与细菌氧化 Fe2+
速率的关系从图 2-19中不同 pH条件下溶液中 Fe2+氧化率与时间关系可以发现，当 pH在 0.94～ 3.0范围时，细菌氧化 Fe2+速率都比较快，特别在 2.0～ 2.5氧化效果更好，在很短的时间里 Fe2+的氧化率就达到 100%；当 pH值太低时，细菌基本上失去氧化 Fe2+能力，后来作者又对细菌进行了进一步的耐酸驯化，发现细菌的耐酸能力又得到了提高，
在高达几十 g/L的硫酸介质中，细菌还能继续氧化 Fe2+，
只是氧化 Fe2+速度减慢；当 pH太高时,Fe3+已经沉淀，
细菌氧化 Fe2+能力很差。从图 2-13可以发现当 pH为 2.5时，
氧化 Fe2+速率最大，所以为了使细菌快速氧化 Fe2+，一方面通过驯化培养使细菌尽量适应其环境，另一方面最好调节 pH在细菌最适宜范围。
介质酸度影响细菌的活性及繁殖速度，从而影响矿物浸出，这里酸度本身对矿物的作用不很重要。此外，
由于介质中含有 Fe3+，浸出时应控制酸度在 pH2.0左右，
防止铁沉淀。
5.10.4 培养基成分的影响有研究表明：金属矿物的浸出速度和浸出介质中细菌的浓度成正比，要获得矿物浸出的高速度，则须保持细菌生长繁殖的高速度。做到这一点的重要条件之一是提供细菌生长所必需的足够营养。试验证明：在供给足够 CO2的情况下，培养基的各种营养中，氮对矿石浸出效果影响最明显。试验结果表明,NH4+浓度为 40mg/L时浸出速率最高，而浓度达到 80mg/L时，可得到最高浸出率。在其他营养成分供应充足的条件下，磷酸盐浓度是浸出速率的限制因素，而铵离子浓度为总浸出率的限制因素。
一般浸出液中都缺少 NH4+，应适当补充。但加入 NH4+后不会立刻看到效果，要过一定时间 (数天左右 )后，才可观察到细菌生长状况的改善。可以用 (NH4)2SO4来补充 NH4+，当 NH4+达到 20～
60mg/L时，细菌增长很显著。实践中应根据矿石的组成情况，
通过试验来确定加入氮、磷的量。但由于多数矿石中都含有磷酸盐，所以浸出时可以不加或少加磷酸盐。
除提供细菌所需的营养外，还要提供细菌进行代谢活动所需的能源。浸矿细菌的能源主要是 Fe2+和 S，在培养细菌时可适当加入这两种物质，但为了使细菌适应浸出条件，应当在培育和驯化细菌的培养基中逐渐添加所要浸出的矿物，使细菌逐渐适应浸出矿物的条件，利用矿物中的组分作为代谢活动的能源。
5.10.5 通气量的影响浸矿细菌一般为好氧菌，靠大气中的 CO2作为碳源，
所以在这类细菌的培养和浸出作业中，充分供气是很重要的。有学者做过测定，细菌生长中实际消耗的氧比水中溶解的氧多两个数量级。所以仅靠自然溶解在水中的氧远不能满足细菌需要，向溶液中充气或加快溶液的循环速度，都可以改善溶液中氧的供应状况。常温常压下水中氧的溶解量为 7mg/L。据测定，在细菌分解黄铁矿试验中，充入溶液的空气中氧的利用率仅为 4.7%。
在细菌堆浸中，矿石堆中供气充分与否是浸出效果好坏的决定因素，供气中氧的利用率与供气速度和溶液循环速度之间的比例是否恰当有关。在浸出作业中需提供什么样的供气条件一般要通过试验确定，可以用 Fe2+
被细菌氧化的速度来比较通气与不通气的效果 (图 2-21)。
由图 2-21可以看到，通气条件下经过 4d的培养,Fe2+的氧化量为 660mg/L，而不通气时仅 50mg/L；另外，也可用测定溶液中细菌浓度的办法比较通气效果好坏。
图 2-21 通气条件对细菌氧化 Fe2+的影响在实际浸出作业中，溶液中通气的速度通常为
0.06～ 0.1m3/(m3.min)。一般情况下空气中的 CO2量是可以满足细菌需要的，但有时为加快细菌繁殖速度，
在供气中补加 1%～ 5%的 CO2。
胡凯光、王清良等人通过现场试验，研究了通气量对细菌氧化 Fe2+的影响。即利用地浸现场试验的生物反应器，通过调节不同的溶液流量，试验每一溶液流量条件下，不同通气量对细菌氧化 Fe2+的影响。试验结果表明：对固定的生物反应器，每一溶液流量都有一最佳通气量。在此通气量时,Fe2+全部氧化；小于此通气量,Fe2+氧化不完全；大于此通气量，不但附加作用不大，造成动力浪费，而且可能由于空气的剧烈搅动，
造成细菌从载体上掉下来，影响氧化效果。
5.1 概述
5.2 细菌的生物化学特性
5.3 细菌浸铀（矿）的基本原理
5.4 微生物培养基
5.5 菌种的保藏
5.6 细菌的驯化培养
5.7 细菌浸出的影响因素
5.1 概 述
利用细菌的生物化学作用进行铀（矿）的浸出，叫做细菌浸铀（矿），又称细菌冶金、
微生物浸矿等。细菌浸矿是用浸矿微生物将矿石或精矿中有用组份有选择地转化为可溶化合物，实现有用组份与杂质的分离，达到回收有用金属的目的。
16世纪，匈牙利人从矿坑水中回收铜；
1953年，葡萄牙的,镭公司,应用细菌浸出铀矿石；
中国微生物研究所、核工业北京化冶院和 711
矿联合开展了含铀贫矿细菌浸出试验 。
浸矿细菌是一种特殊性质的微生物。用于工业生产的主要有：氧化硫硫杆菌、聚生硫杆菌、氧化铁硫杆菌、氧化铁杆菌和氧化硫杆菌等。一般在 pH=2～ 4，温度 30～ 35℃ 条件下生长良好、繁殖速度快。对于铜和铀浸出工艺最有价值的为氧化铁硫杆菌，能氧化金属硫化物、
硫酸亚铁、硫代硫酸盐以及元素硫。
氧化硫硫杆菌为化能自氧菌，它把元素硫氧化生成硫酸，利用这一反应生成的能量作为其生活能源，以 CO2和氨为原料合成菌体进行繁殖；氧化铁硫杆菌和氧化铁杆菌，以 Fe3+作为能源在含有矿物盐类强酸性介质中生长。
细菌浸出铀矿石最早被葡萄牙的,镭公司,应用。
他们从 1953年开始进行铀矿石的自然浸出研究，利用铀矿石中存在的或外加的黄铁矿（ FeS2），在水和空气的作用下产生 Fe3+和 SO42-，使铀氧化为 UO22+而溶解出来。在 1956年的第二届国际和平利用原子能会议上，他们发表了,铀的自然浸出法,的研究报告。从此，细菌浸出研究和应用开始受到各国的重视，许多国家相继开展了从贫矿、废矿及表外矿中细菌浸出回收铀的研究工作。从 20世纪 60年代起细菌浸出铀的技术用于工业生产。加拿大的安大略州伊利奥特湖曾是世界上规模最大的原地生物浸出铀矿的场所，该地区的斯坦洛克矿从 1964年起在采空区利用细菌浸出铀，
平均每月回收 U3O8 6804 kg，产量占当时全矿总产量的 7%，且生产成本由原来的每磅 5美元降至 3.3美元。
其他产铀国如美国、法国、前苏联、澳大利亚等也在不同程度上利用细菌浸出贫矿石的铀。
5.2 浸矿微生物的种类、特性
将可直接或间接参与金属硫化矿物的氧化和溶解过程称为微生物浸出，用于微生物浸出的微生物菌种，称为浸矿微生物。在微生物湿法冶金过程中参与浸出的主要微生物类群有以下几种：
(1)中温细菌：硫杆菌属及钩端螺菌属
(2)中等嗜热细菌：硫化杆菌属
(3)极端嗜热细菌：嗜酸嗜热古生菌纲中的硫化叶菌属、酸菌属、生金球菌属及硫球菌属
5.2.1硫杆菌属（ Thiobacillus）
硫杆菌属是 小杆状细胞，以单根极生鞭毛运动，无休眠阶段，属革兰氏阴性菌种。能量获自一种或多种还原态的或部分还原的含硫化合物，
包括各种硫化物、元素硫、硫代硫酸盐、连多硫酸盐和亚硫酸盐。该菌属属无机化能营养类型，
专性好氧。最适温度约 28~30℃,pH范围较宽。
发现于海水、海泥、土壤、淡水、各种酸性矿水、
污水、含硫矿泉中和硫沉积物内或附近。
硫杆菌属包括至少 14个种，其中在生物浸铀中应用最广泛的是氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、排硫硫杆菌及蚀阴沟硫杆菌这四个种。
1）氧化亚铁硫杆菌（ T.ferrooxidans）
该菌属于短杆菌,0.5微米 × 1.0微米，具有圆钝的末端，单生或对生，成短链者较少，显微镜下的照片见图 2-1。其能源为 Fe2+和还原态硫，能将 Fe2+氧化成 Fe3+,硫代硫酸盐氧化成硫酸。在 pH值 1.5~3.5
范围内生长良好，生长的最佳 pH值为 2.0，在
16~40℃ 存活，最佳生长温度为 30~35℃ 。
该菌在含亚铁的液体培养基中由于能将亚铁氧化成高铁，而使培养基由浅绿色变为红棕色，最后由于
Fe3+水解生成氢氧化物或铁矾而生成沉淀。在硫酸亚铁固体培养基上，借助显微镜可以见到有微小菌落，
直径约为 1.0mm，颜色由红变褐，并在菌落周围可见褐色沉淀。
在硫代硫酸盐固体培养基上形成圆形的微小菌落（直径 0.5~1.0mm），有时会形成不规则的边缘，菌落也会因为有硫磺的沉淀而呈白色。
1） 氧化亚铁硫杆菌图 2-1 氧化亚铁硫杆菌 C-3 菌株的细胞形态
A：菌体为赤藓红染色,25o投影,× 1800
B：电镜观察照片,× 10000
2) 氧化硫硫杆菌（ T,thiooxidans）
短杆菌,0.5微米 × 1.0~2.0微米，单生对生或成短链，显微镜下的照片见图 2-2，其能源为硫及其化合物。该菌在 pH=1.4~6.0的范围内能生长，更低的范围可延至 1.4以下，最适 pH
值在 2.5~5.8之间，最适温度为 25~30℃ 。该菌的亚铁液体培养基保持清澈，由于三价铁的产生，迅速由琥珀色转为红褐色。如果 pH上升至
1.9以上，会产生高铁沉淀的水合物，并形成一层由三价铁的水合物和细胞组成的膜。在硫代硫酸盐的固体培养基上生长的微小菌落呈透明状或随着培养时间的延长而变成黄白色，菌落边缘整齐。
2) 氧化硫硫杆菌
图 2-2 氧化硫硫杆菌在显微镜下的形态,× 4500
3) 排硫硫杆菌（ T,thioparus）
细短杆菌,0.5微米 × 1.0~3.0微米，平均 0.5微米 × 1.7微米。靠氧化硫代硫酸盐成硫酸盐获取能量。
最适 pH值在 6.6~7.2之间，在 pH4.5~7.8之间生长，有一些菌株 pH达到 10也能生长，最适温度为 28℃ 。在硫代硫酸盐洋菜 (琼脂 )上的菌落是小的（直径 1～ 2毫米），圆形，由于硫的沉淀而呈白黄色。
4) 蚀阴沟硫杆菌（ T,concretivorus）
该菌与氧化硫硫杆菌类似,但它可以利用硝酸盐或氨离子作为氮源，不能利用亚硝酸盐。
5.2.2 钩端螺菌属（ Leptospirillum）
该菌属属于螺菌科（ Spirillaceae），
其中包括一个中度嗜热铁氧化钩端螺菌
（ L.ferooxidans）。铁氧化钩端螺菌
（ L.ferrooxidans）的最适生长温度为
30℃ 左右，严格好氧，专一性地通过氧化溶液中的 Fe2+或矿物中的 Fe2+来获取能量，在浸矿系统中通常和氧化亚铁硫杆菌协调作用。
5.2.3 硫化杆菌属（ Sulfobacillus）
它们的能量来源于 Fe2+、硫磺及其它矿物，如硫铁矿、黄铜矿、砷黄铁矿、
闪锌矿、亚锑硫酸盐、蓝铜矿、辉铜矿等。绝大多数需要酵母提取液或某种有机物以及空气中 CO2浓度较高时才能旺盛生长。该菌属菌均严格好氧且极度嗜酸，
广泛分布于自然界，主要集中在硫化矿物床及火山地带。
5.2.4 嗜酸嗜热古生菌纲
（ Thermoacidophili archaebacteria）
在该类群中，一共有四个属的菌种可以氧化硫化物作为浸矿菌，它们分别是硫化叶菌属（ Sulfolobus）、酸菌属
（ Acidanus）、生金球菌属（ MetallospHaera）及硫球菌属（ Sulfurococcus）。该四属菌均为兼性无机化能自养菌，
可以在自养、兼性营养及异养条件下生长。在自养条件下，
细菌可以通过氧化元素硫,Fe2+或硫化物获取能量。在兼性营养条件下，添加酵母膏或其他一些有机物可以促进它们的生长。它们均为好氧菌，极度嗜热嗜酸，外形均为球形，细胞不具运动性，不具有鞭毛，主要分布在高温硫磺泉中。
这类细菌可潜在地用于顽固硫化矿物的快速、高温浸出，
但易破碎的细胞壁（因缺少肽聚糖）限制了它们在工业浸矿中的应用。同时，该类群菌是耐高温酶的重要来源，对它们的研究和应用无疑将开拓酶工业的新邻域。
5.3 浸矿微生物的培养基、采集、分离纯化、保藏
5.3.1 浸矿微生物的培养基
5.3.2 浸矿微生物的采集、分离
5.3.3 浸矿微生物的纯化
5.3.4 菌种的保藏
5.3.1 浸矿微生物的培养基
培养基指用人工方法配制的专供微生物生长繁殖的营养混合物。
用于培养浸矿细菌的培养基主要有表 2-2所示的几种培养基。
名称 培养对象
Leathen 铁氧化沟端螺菌氧化铁铁杆菌氧化亚铁硫杆菌
9K 氧化铁铁杆菌氧化亚铁硫杆菌
Waksman 氧化硫硫杆菌
ONM 氧化硫硫杆菌
Colmer 氧化亚铁硫杆菌
1)液体培养基（ Liquid medium）
在液体培养基中营养物质以溶质状态溶解于其中，使微生物能更充分地接触和利用养料，因而也能更好地积累代谢产物。
因此，在实验室中，液体培养基主要用于生理、代谢研究及获得大量菌体；在生产中，则用于大规模生产、发酵。
9K,Leathen培养基由于有易被氧化的 FeSO4?7H2O，一旦温度超过 50℃,其中的 Fe2+就会自发地快速氧化，并生成硫酸高铁、水合硫酸铁及黄钾铁钒沉淀。解决的办法有：
（ 1）调节培养基的 pH值至 1.5。在配制上述两种培养基时，
pH值是一个很重要的考虑因素。 pH值高则培养基经高温灭菌后，会在瓶底生成沉淀，而使溶液浑浊；实验表明，在 pH值低的溶液中，培养基的各成分溶解度大些。
（ 2）减少铁盐及磷酸盐的用量并补充少量的酵母膏。调整后的低磷酸盐培养基组成如下（ g/L）,K2HPO4 0.4、
MgSO4?7H2O 0.4,(NH4)2SO4 0.4,FeSO4?7H2O 27.8、
酵母膏 0.2（也可用谷胱苷肽 0.1或半胱氨酸 0.1）； pH=1.5。
（ 3）将 FeSO4?7H2O溶液单独过滤灭菌，再与用高温灭菌的培养基中的其他无机盐溶液混合。这种方法得到的培养基 Fe2+
被氧化成 Fe3+的量少，培养基为浅绿色澄清溶液。
2) 半固体培养基（ Semi-solid medium）
在液体培养基中加入 0.2~0.5%的琼脂作凝固剂，就可得到半固体培养基。半固体培养基呈现出在容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后能破散的状态。半固体培养基在微生物实验中有许多独特的用途，如细菌的动力观察
（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，
观察细菌的运动能力），各种厌氧菌的培养及菌种保藏等。绝大多数的浸矿细菌是能运动的，
可以通过这种方法来鉴定菌种。
3) 固体培养基（ Solid medium）
在液体培养基中加入 1%~2%琼脂或 5%~12%
明胶作凝固剂，就可制成遇热可融化、冷却后则凝固的固体培养基。固体培养基主要用于菌种的分离、菌种保藏、鉴定等。 T,f菌种在琼脂培养基上生长很弱，
难以形成菌落，为菌种分离及遗传操作带来了很大困难。出现这种情况的主要原因是琼脂在酸性条件下生成的水解产物对菌体有毒害作用。针对这个问题可采用多种方法克服：
（ 1）适当地降低琼脂浓度，小于 2%；
（ 2）控制 pH值在 3.0左右,pH值太低，琼脂粉因水解而不凝固； pH值太高，细菌的生长缓慢；
（ 3）适当降低 FeSO4?7H2O和磷酸盐的浓度，分别不宜超过 22.2g/L和 0.05g/L；
（ 4）选用质量较好的琼脂，如琼脂糖等；
（ 5）经过多年探索，彭基斌、颜望明等研究设计出一种新的适用于氧化亚铁硫杆菌遗传操作的固体培养基，称之为 2∶2 培养基。组成为,FeSO4?7H2O 2?,Na2S2O3?5H2O 2?,
(NH4)2SO4 4.5?,KCl 0.15?,MgSO4?7H2O 0.75?,琼脂粉
6?,pH4.6～ 4.8。这种培养基含两种能源，亚铁和硫代硫酸钠,pH在 4.6～ 4.8范围内，至少卡那霉素（ 300μg/mL ）和链霉素（ 200～ 300μg/mL ）可以在该培养基上使用。尽管氧化亚铁硫杆菌形成菌落需要两周时间，但菌落形成率相对较高。在
2∶2 培养基上生长，形态特征明显、稳定，氧化亚铁硫杆菌、
抗卡那霉素和抗链霉素的自发突变率均低于 10-8，这就为利用这两种抗生素为遗传标记、选择转移接合子奠定了基础。
（ 6）除此之外还可采用 ISP固体培养基。 ISP固体培养基的配制：溶液 A,300 mL蒸馏水中加入 FeSO4?7H2O，配成浓度
33.4%的溶液；用 6M H2SO4调 pH值至 2.5，搅拌至几乎无色，用细菌滤膜灭菌后，臵于室温中。溶液 B,550mL 蒸馏水中加入
(NH4)2SO4 6.0g,KCl 0.2g,MgSO4· 7H2O 1.0g,Ca(NO3)2
0.02g，调 pH值至 3.0,121℃,1.21atm，灭菌 15min。溶液 C，
纯化的琼脂 7.0g加到 150mL水中，浸泡 15min，在 1升锥形瓶中升温至 121℃,1.21atm灭菌 5min。 B和 C从高压釜中取出，在空气中冷却 5 min，然后将 B,C混合，将 A加入上述混合物，并搅匀。三者混合物倒于平板上，深度约为培养皿的高度的一半。
5.3.2 浸矿微生物的采集、分离
工作微生物可从菌种保藏机构直接购得。但多数情况，仍需从自然界中采集。
浸矿微生物可能存在的地点有以下一些：
（ 1）矿山、矿堆或尾矿中流淌的酸性水；
（ 2）矿石本身；
（ 3）热泉水样或矿浆。
在选择采集地点时，应结合将来的工作目的选择合适的地方，例如，研究细菌浸出铀矿的影响因素，则最好到铀矿山采集菌种。
以浸矿细菌中最常见的氧化亚铁硫杆菌为例，介绍浸矿微生物的采集、分离的基本方法。
氧化亚铁硫杆菌广泛存在于金属硫化矿山、煤矿的酸性 (pH<4)矿坑水中，因此可到这些矿山采集，
采集的步骤如下：
取 50～ 250mL细口瓶，洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于 120℃ 烘箱灭菌 20min，待冷却后即可作为细菌取样瓶。带取样瓶到矿山取酸性矿坑水。如矿坑水的 pH为 1.5～ 3.5并呈红棕色（说明有 Fe3+存在），则很可能存在氧化亚铁硫杆菌，可对此水样进行分离培养。取样时将牛皮纸取下，用一只手拔去瓶塞，另一只手持瓶接取或舀取水样，其量不宜超过瓶容量的 2/3。（若所取样不是水样而是已被氧化成棕褐色的潮湿矿块，则应在灭菌的取样瓶中，加入约占瓶容积 1/3的液体培养基）取样后，
立即盖好胶塞，并用牛皮纸包好，在瓶上贴上标签，
标明取样地点及时间。
为了分离、培养所需细菌，还需配制好专供这种菌生长的 Leathen或 9K培养基，配好的培养基用蒸气灭菌 15min，然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的 100毫升的三角瓶中。塞好棉塞置于 20～
30℃ 的恒温条件下静置培养（或振荡培养） 7～ 10天。
由于细菌生长繁殖，三角瓶中培养基的颜色由浅绿色变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀（与空白对照）。选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取
1毫升培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液比头一次更快地变成红棕色，以后按同样方法反复转移培养，至少十次以上。每转移一次，
接种量逐渐减少，只需 1～ 2滴就可。而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养 3～ 5天就可把培养基中的
Fe2+氧化成 Fe3+。在转移培养中，借助培养基的高酸度及高浓度亚铁和高铁离子，可杀死和淘汰一些杂菌，
氧化亚铁硫杆菌可得到充分繁殖，活性越来越好。
对培养的氧化亚铁硫杆菌进行初步鉴定方法
（ 1）肉眼观察如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿色变成红棕色，最后产生高铁沉淀。（需作空白对照，因为空气也能将亚铁氧化成
Fe3+，培养基的颜色会由浅绿色变成黄色，并会产生沉淀附于瓶底。）
（ 2）重铬酸钾容量法测定用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁氧化成高铁的氧化率。用 K2Cr2O7-HgCl2法或 K2Cr2O7-SnCl2的方法测定培养基中的全铁量，再用 K2Cr2O7或 KMnO4滴定 Fe2+（酸性环境），以此计算得 Fe2+的氧化率，氧化率高的，说明细菌生长旺盛。
（ 3）显微镜观察用简单染色或革兰氏染色法对所培养的细菌进行染色，在显微镜下观察是否有 T,f存在。
5.3.3 浸矿微生物的纯化用上述方法获得的菌种往往不纯，其中会有杂菌。要想得到纯菌种，则需要作平板分离。浸矿细菌的分离纯化一般采用稀释涂布平板法、平板划线分离法和终点稀释法。
稀释涂布平板法是一种有效而常用的微生物纯种分离方法。
它是将一定浓度、一定量的待分离菌液移到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒迅速地将其均匀涂布，使长出单菌落而达到分离的目的，见图 2-3。
平板划线分离法是用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种方法。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
终点稀释法取繁殖好的菌样 1mL，注入盛有液体培养基 9mL的试管中，混合均匀，然后再从此试管中吸取 1mL注入另一盛有培养基 9mL的试管中，依次类推制成 10-1,10-2,10-3?10 -10不同稀释度的培养液。将 10支试管均放入恒温培养箱中培养 7～ 8d后取出。由于各管中原始菌浓度不同，培养基颜色变化不一，颜色深浅与原始菌浓度成正比。若第 7支试管变色而第 8支不变色，则认为第 7支试管极有可能含单一菌的纯培养。
图 2-3 稀释涂布平板分离示意图原菌液
10- 1 10- 2 10- 3 10- 4 10- 5
单菌落培养各9 硫酸溶液涂布平板
30 ℃培养挑单菌落
10- 6
稀释涂布平板法的基本步骤如下：
（ 1）制备固体培养基
（ 2）编号,取 6支无菌空试管，依次编号为 10-1、
10-2,10-3,10-4,10-5,10-6，将固体培养基平板分别编号为 10-4,10-5,10-6，每个稀释度各三个平板。
（ 3）稀释,取上述已繁殖好的细菌培养液 1mL，用
pH = 2.5的稀硫酸溶液按每次稀释 10倍，依次稀释成
10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6浓度的稀释液。
（ 4）取样：吸取稀释度 10-4,10-5,10-6的稀释液各 0.2mL，然后分别接种到编好号的平板上，涂布均匀。
（ 5）培养：将涂布后的平板倒置于 30℃ 的恒温培养箱中培养，直至平板表面出现铁锈色圆点状小菌落。
（ 6）选取单菌落：将单独小菌落挑起，每个小菌落分别接种于液体培养基中培养。这样培养出的细菌即为单一菌的纯培养。
平板划线分离法基本步骤如下：
（ 1）制备固体培养基
（ 2）划线,将烧红的接种环冷却后，挑取原菌液划线，划线时动作要轻巧，线条要平行且密集，
要充分利用平板培养基的表面积。平板划分时划为四个作用不同的 A,B,C,D区（见图 2-4），
D区是单菌落的主要分布区。
（ 3）培养：将培养皿置于 30℃ 恒温箱中培养，
直至培养基上出现小的铁锈色圆状小菌落。
（ 4）挑选单菌落,将 D区或 C区出现的典型单菌落移接至液体培养基中培养。
5.3.4 菌种的保藏优良的活性菌种应及时进行保藏。菌种的保藏要达到不死亡和不变异两个要求。因此，
必须使微生物的代谢作用相对地处于最不活跃的状态。若为短期保存，则可将充分生长的 T.f菌停止培养，在菌液中加入少许
FeSO4?7H2O后，移入 4℃ 的冰箱中保存，每月尚需转种一次。长期菌种保藏方法很多，如：
斜面低湿保藏法、液体石蜡保藏法、砂土 —
－ 黄铁矿保藏法及冰冻干燥法。但对于浸矿菌种而言，后两种方法较为有效。
1 砂土 — －黄铁矿保藏法将 T,f菌培养液转移到无菌试管或安瓿管中。
瓶中预先装有砂土与黄铁矿 1∶3 的混合物。砂土、黄铁矿均经过筛砂、清洗、干燥、灭菌。取每 1～ 2mL菌浓度为 109个 /mL的细菌培养液混入砂土 — — 黄铁矿混合物 2～ 3g，将试管塞紧蜡封或将安瓿管熔封，室温保藏。此法可保藏菌种 2.5～ 3年。
2 冰冻干燥法将菌体培养物离心，制得菌种悬浮液。用蒸馏水快速漂洗，直至 pH达到 7左右，然后转移到安瓿管中，
并加入细胞保护剂，将安瓿管置于 -70℃ 的低温冰箱中冰冻 24h，再冰冻干燥 24h后封口。制备好的安瓿管放置在低温避光处保藏。
5.4 浸矿细菌计数及细菌生长曲线微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标。所以有必要对微生物的生长繁殖及其控制规律作介绍。
5.4.1 测生长量
5.4.2测细胞数
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
5.4.1 测生长量生长意味着原生质量的增加，所以测定生长的方法也都直接或间接地以此为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。
1 直接法
（ 1）测体积这是一种很粗放的方法，用于初步比较用。将一定体积的待测培养液放在刻度离心管中自然沉降或进行定时间的离心，然后观察其体积。
（ 2）称干重可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的
10%～ 20%。在离心法中，将待测培养液放入离心管中，用清水离心洗涤 1～ 5次后，进行干燥。干燥温度可采用 105℃,100℃ 或红外线烘干，也可在较低的温度（ 80℃ 或 40℃ ）下进行真空干燥，然后称干重。以细菌为例，一个细胞一般重约 10-12～ 10-13g。
5.4.1 测生长量
2 间接法
（ 1）比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物浑浊度的增高。使用光电比色计测菌液的透光度，或自行制作的比浊管进行测定。
（ 2）测含氮量蛋白质是细胞的重要物质，含量一般比较稳定，而氮又是蛋白质的重要组分。细菌的含氮量约为原生质干重的 12.5%。根据其含量再乘以 6.25，即可测得其粗蛋白的含量。测定含氮量的方法很多，如用硫酸、过氯酸、碘酸或磷酸等消化法和 Dumas
测氮气法。
（ 3） DNA含量测定
DNA与 20 %的 3,5-二氨基苯甲酸 -盐酸溶液能显示特殊的荧光。根据这一原理测出 DNA的含量，即可推算出细菌的总量。
每个细菌平均含 DNA 8.4× 10-14g。
5.4.2 测细胞数
1 直接法是指在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。所测结果是包括死细胞在内的总细菌数。
（ 1）比例计数法这是一种很粗的计数方法。将已知颗粒浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中的细胞浓度。
（ 2）血球计数板法这是用来测定一定容积中的细胞总数的常规方法，也是浸矿细菌计数的一种方法。
在测定细菌数目之前应将血球计数板擦洗干净，再将盖玻片安放在计数室上面，然后用接种环取一环均匀的菌体悬液，
使它沿着盖玻片与计数板的缝隙渗入计数室，连续二至三次，
直至注满计数室为止，后置于显微镜载物台的中央计数。由于浸矿细菌小、无色透明，且 9K,leathen培养基在培养过程中产生氢氧化铁或黄钾铁矾沉淀，干扰测定。为解决上述问题可在计数之前先将待测细菌用草酸铵结晶紫染色。
图 2-5 血球计数板的构造
A：顶面观 B：侧面观 C,九大格 D：一大格（ 25中格）
1,中央平台 2：盖玻片
5.4.2 测细胞数
2 间接法间接法是一种活细菌计数法，是根据活细胞通过生长繁殖会使液体培养基浑浊或在平板培养表面形成菌落的原理而设计的方法。
（ 1）液体释稀法对待测菌样作连续的 10倍系列释稀。根据估计数，从最适宜的 3个连续的 10倍的释稀液中各取 5ml试样，接种到 3组共
15支装有培养液的试管中（每管接入 1mL）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管，然后查最大可能数量表，再根据样品的稀释倍数计算出其中的活菌含量。
（ 2）平板菌落计数法这是一种最常见的活菌计数法。取一定体积的释稀菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。经保温培养后，以平板上 (内 )出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个 9cm
直径的培养皿平板上，一般以出现 50~500个菌落为宜。
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线当我们把少量纯种微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气等条件下，它们的群体就会有规律地生长起来。如以细胞数目对数值作纵坐标，
以培养时间作横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，
这就是微生物的生长曲线（ growth curve，见图 2-
6）。根据微生物的生长速度常数 (growth rate
constant)，即每小时的分裂代数（ R）的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期。细菌的生长曲线对掌握细菌生长规律很重要。
通过生长曲线可以知道细菌在哪个时期年轻且代谢活跃，
哪个时期衰老而濒于死亡，这样可根据需要在不同时期收集菌种。如需快速氧化 Fe2+，则应收集对数期的浸矿细菌，若保存菌种，则最好取稳定期的菌种。
图 2-6 典型生长曲线
Ⅰ,延滞期 Ⅱ,指数期 Ⅲ,稳定期 Ⅳ,衰亡期
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
1 延滞期 (lag phase)
又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一般时间内细胞数目不增加的时期。该时期的细胞有以下几个特点：
（ 1）生长速度常数等于零；
（ 2）细胞形态变大或增大；
（ 3）细胞 RNA尤其是 rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；
（ 4）合成代谢活跃、核糖体、酶类和 ATP的合成加快，易产生诱导酶；
（ 5）对外界不良条件反应敏感。
影响延滞期长短的因素除细胞本身的生理特性外，还有接种龄、按种量、培养基成分等。延滞期太长不利于工业生产，因此应尽量设法缩短延滞期。常用的措施有增加接种量，采用最适菌龄（即处于对数期的细菌）等。
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
2 指数期（ exponential phase）
又称为对数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期，见图 2-7。
指数期的细菌有以下几个特点：
（ 1）生长速度常数 R最大；
（ 2）细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；
（ 3）酶系活跃，代谢旺盛。
在指数期中，有三个参数最为重要,
繁殖代数（ n） ；生长速率常数（ R） ；代时（ G）
指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致，
细胞成分平衡发展和生长速度恒定，故可作为代谢、
生理等研究的良好材料。
图 2-7 指数期生长曲线
n2xx 12
细胞个数（个
）
x1
x2
培养时间（ ）
t1 t2
（ 1）繁殖代数（ n），
n lg 2lg xlg x 12
（ 2）生长速率常数（ R）
)l g x3,3 2 2 ( l g xl g 2l g xl g xn 1212
12
12
12 tt
)lg x3,3 2 2 ( lg x
tt
nR
（ 3）代时（ G）
)lg x3,3 2 2 ( lg x
tt
R
1G
12
12
n2xx 12
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
3 稳定期（ stationary phase）
又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速度常数 R等于 0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等或正生长与负生长相等的动态平衡之中。
稳定期到来的主要原因是：
（ 1）营养物尤其是生长限制因子的耗尽；
（ 2）营养物的比例失调，例如 C/N比例不合适等；
（ 3）酸、醇、毒素等有害代谢产物的积累；
（ 4） pH值、氧化还原 势等物化条件越来越不适宜等等。
5.4.3 浸矿微生物的生长曲线
4 衰亡期在衰亡期，个体死亡速度超过新生的速度。
因此，整个群体呈现出负生长（ R为负值）。
产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。
5 浸矿细菌生长曲线的绘制浸矿细菌生长曲线的绘制关键是细菌数量。
只需在细菌培养或浸出过程中每隔一定时间，
按前面介绍的方法测得细胞个数，后以时间为横坐标，以菌数为纵坐标画曲线即可。
5.5 浸矿细菌活性的测定细菌的活性是微生物浸矿的重要参数。在硫化矿浸出中，它表示细菌在单位时间内氧化目的矿物的量，在细菌培养中，它表示细菌生长的活跃程度。目前，测定细菌活性的方法有很多，主要有：亚铁离子氧化速率,CO2的固定速率 (即吸收速率 )、氧的消耗速率以及目的矿物氧化速率等。
5.5.1 亚铁离子氧化速率法
5.5.2 细菌耗氧速率法
5.5.1 亚铁离子氧化速率法氧化 Fe2+为 Fe3+是 T.f菌的主要特征,Fe2+氧化速度快，表明细菌代谢旺盛，活性高。实验室或工业生产上常用图 2-8所示的装臵来测定细菌活性。其它具有良好充气与搅拌功能的装臵也可。
测定方法如下：抽取 25mL待测菌液（或矿浆）
于装臵中，测定其中 Fe2+浓度，然后根据测得的
Fe2+浓度值，补加 FeSO4·7H2O至 Fe2+浓度为
10~15g/L，再准确测定 Fe2+浓度，这时的 Fe2+浓度即为起始浓度 C0。
将装臵臵于恒温箱内充气培养 2h，温度保持在
30℃,再测菌液中 Fe2+浓度，即最终 Fe2+浓度 Cf。
细菌活性可用下式计算：
除此之外，还可在细菌培养或浸矿过程中，每隔一定时间取待测菌液（或矿浆） 5～ 10mL，用重铬酸钾容量法测得其中全铁,Fe2+的量（全铁量测一次即可），计算不同时间段 Fe2+的氧化率也能表征细菌的活性。
) /2C(CA f0
图 2-8 细菌活性测定装臵式中,A—— 测得的细菌活性
（ g/L?h）
C0—— 起始 Fe2+浓度
（ g/L）；
Cf—— 最终 Fe2+浓度
（ g/L）。
空 气
5.5.2 细菌耗氧速率法浸矿细菌大多数是好氧菌，其代谢过程中要消耗氧气，氧的消耗速率越快，说明细菌代谢越旺盛，活性越高，故氧的消耗速率也可表征细菌的活性。细菌对氧的消耗速率，可用瓦勃氏（ Warbury）呼吸器测定，
其构造如图 2-9所示。
测定时，将 1.5～ 2.5mL矿浆放进瓦勃氏呼吸器的反应瓶中。反应瓶中央小瓶盛 0.5mL20%的 KOH溶液以吸收 CO2。然后，将反应瓶接上测压计。整个呼吸器应臵于恒温环境（如恒温水浴），开动搅拌器。当测压计与环境温度相同时，反应开始，调节测压计 U型管闭臂液面，使达到零点，并关闭三通。反应一定时间后，
细菌吸入氧气的体积 ΔV 可由 U型测压计液柱差的读数换算得出。细菌活性单位可用 O2 g/（ L?h）或者
mol/min表示。
图 2-9 瓦勃氏呼吸器及测量操作示意图
T：开关 F,反应器 M,U形压力计
S：瓶侧臂 C,CO2吸收器 R：温度计
5.6 浸矿微生物的育种选育高效浸矿菌种是生物浸矿技术实现工业化的前提条件。对浸矿细菌进行性状改良，主要从以下几个因素考虑：
（ 1）细菌生长速度（生物量增加速度）；
（ 2）硫化矿的氧化速度（活性）；
（ 3）对重金属的耐受能力；
（ 4）细菌在矿物颗粒上的粘附速度及细菌在矿物颗粒和溶液中的分布情况；
（ 5）菌种保藏的稳定性；
选育高效菌种的方法除了从自然界筛选高品质的浸矿微生物外，更主要的是传统的驯化、诱变育种、
杂交育种和现代的原生质体融合技术以及基因工程育种。
5.6.1 驯化培养驯化是用某一特定因素长期处理某微生物的群体，
同时不断地对它们进行接种传代，以达到累积并选择相应的自发突变株的目的。
现以驯化细菌对某种金属的耐受能力为例，说明其过程。首先在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的该金属离子，然后接入要驯化的细菌进行恒温培养。开始细菌不适应，要较长时间才能生长，待细菌适应并能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续培养。依次类推，每转移一次都提高金属浓度，如此进行下去，就可以获得对该金属离子具有较强耐性的菌株。表 2-3表明了驯化氧化亚铁硫杆菌对铀耐受能力的过程及成果,T,f耐受铀离子的能力从未驯化前的 600mg/L到驯化后的
1000mg/L，提高了 66.7%。
表 2-3 氧化亚铁硫杆菌对铀适应性的驯化铀浓度
（ mg/
L）
氧化培养基中全部 Fe2+所需时间（ d）
驯化前细菌 第一次转移 第二次转移 第三次转移 第四次转移
0 4 4 4 4 4
100 4 4 4 4 4
200 4 4 4 4 4
300 7 4 4 4 4
400 7 4 4 4 4
500 7 4 4 4 4
600 7 10 4 4 4
700 不生长 10 7 7 4
800 不生长 10 7 7
900 10 7 7
1000 不生长 10 10
野生菌经过驯化，活性极大地提高。表 2-4是野生菌与驯化菌氧化二价铁的对比情况。
表 2-4 氧化亚铁硫杆菌氧化二价铁的对比试验氧化时间（ h）
驯 化 菌 野 生 菌
Fe3+/Fe2
+
亚铁氧化率
（ %）
Fe3+/Fe2
+
亚铁氧化率
（ %）
0 0.224 0.000 0.297 0.000
24 0.658 6.527 0.480 1.149
48 256.600 99.524 0.272 0.148
72 485.615 99.758 0.441 1.186
96 0.546 20.082
120 0.673 23.842
144 0.923 24.231
168 7.958 79.659
192 84.171 97.610
5.6.2 诱变育种诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，
然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。一般育种程序包括菌种的选择、菌悬液的制备、诱变处理和变异株的筛选。
1 菌种的选择具有以下性状的菌株可作为育种菌株：
（ 1）具有很高的氧化亚铁或元素硫的活性；
（ 2）具有再生生长的能力；
（ 3）已有相当程度的变异。
挑选优良菌株的方法是采用平板分离法，找出符合上述性状的菌株。
2 菌悬液的制备吸取 10ml菌液，于 4000rpm下离心 20min，去上层清液得到菌体沉淀。用预先配好并灭菌的稀硫酸
（ pH2.0左右）对沉淀洗涤，再次离心，去上层清液，
重复三次。用稀硫酸调节细胞浓度为 108个 /mL的悬液，
即为细胞悬液。
3 诱变处理诱变剂分为两大类，物理诱变剂和化学诱变剂。
物理诱变剂，如紫外线、电离辐射,He-Ne激光等；
化学诱变剂，如亚硝基胍（ MNNG）、亚硝基等。 T,f
菌生长于酸性（最佳 pH=2.0~3.5）环境，而且以自养方式生存，有机物对其有强烈的抑制作用，而且大多数化学诱变剂只能在近中性环境下发挥最佳诱变作用，
在稍酸性的环境下会分解成各种各样的有毒害的有机物，而且诱变效果大大降低。故在选择诱变剂时，首选物理诱变剂，其次才考虑 结合化学诱变,
表 2-5 不同紫外线辐射时间对细菌氧化活性的影响紫外线辐射时间
（ s） 0 40 80 120 160 200 250
氧化 Fe2+速率
（ g/L?h） 0.07 0.27 0.58 1.08 1.12 1.28 1.54
提高率（ %） - 586 728 1443 1500 1728 2100
表 2-6 不同时间微波诱变对菌种生长速度及氧化活性的影响微波处理时间（ s） 50 100 150 250
致死率（ %） 80 90 96 99
第一代繁殖耗时（ h） 184 184 206 386
第二代繁殖耗时（ h） 96 78 72 40
第三代繁殖耗时（ h） 71 57 48 30
第四代繁殖耗时（ h） 47 40 30 24
氧化 Fe2+速率（ g/L?h） 0.37 1.09 1.35 1.92
4 变异株的筛选
T,f菌已有的育种研究表明，诱变其亚铁氧化活性时，最有效的突变可以通过以下四种指标确定，四种指标要结合使用。
（ 1）相邻比较，如果杀伤率大的比杀伤率小的氧化快，那么前者正突变大；
（ 2）测稳定期（约 65%~75%的氧化率时）氧化速度，氧化越快，正突变较大；
（ 3）测对数期（约 15%~45%的氧化率时）细菌生长速度，确定传代时间，对数期以见到较多的二连体细菌为标志；
（ 4）颜色观察法，颜色越红，表明氧化越快。
平板分离的筛选指标有：
（ 1）相对位臵，如果中央位臵的菌落比边缘的大，那么中央菌落为氧化活性高的菌株；
（ 2）同一半径位臵上菌落大的则氧化活性高；
（ 3）先出现的菌落的氧化活性高，特别是中央位臵；
（ 4）中央为红色，边缘为白色，丝状扩展型菌落比菌落黄色混浊的氧化活性高。
平板分离筛选仍需多次摇瓶比较方可确定。
5.6.3 杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经接合使遗传质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株。
所谓细菌接合，是指通过供体菌和受体菌的细胞间直接传递大段 DNA的过程，可将不同菌株的优良性状集中于重组体，从而获得优良菌株。细菌接合过程可用图 2-10
表示。
亲本雄性菌株形成接合管，与亲本雌性菌株联接。
接着，雄性体中的一端 DNA通过接合管进入雌性体中，
这样雌性菌株中便含有雌性菌株的一段 DNA片段，并在自身细胞分裂时稳定地遗传给子代。如果吸入的雄性
DNA片段中，基因型不同于雌性，那么重组菌株便形成，
可能表现出人们感兴趣的某些优良性状 。
图 2-10 浸矿细菌接合过程示意图
5.6.4 基因工程育种基因工程是一种体外 DNA重组技术，用人为方法将所需要的某一供体菌的遗传物质 — DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和作为载体的 DNA
分子连接起来，得到重组 DNA，导入某一受体细胞中，
使该外来的遗传物质在其中进行正常的复制与表达。
重组 DNA上携带了人们感兴趣的性状，如抗砷等特性。
大致流程如下（图 2-11）：
筛选含有所需酶的菌株 → 确定酶基因的位臵（质粒或染色体上） → 如果在基因组上，提取及纯化基因组染色体 → 将纯化好的基因组片段克隆到大肠杆菌的质粒上 → 检出被转化的大肠菌菌株 → 从转化菌株中将质粒提取出来，并将质粒上有关的酶基因片段切割下来 → 检测所获得的酶基因片段及有该基因表达出来的酶的氨基酸顺序 → 构建穿梭质粒，并将酶基因导入目的硫杆菌内 → 表达。
图 2-11 T,f菌基因工程示意图
5.7 微生物浸矿的基本原理自 50年代发现浸矿微生物以来，经过许多人的研究和实验，人们已基本掌握了微生物浸出过程的规律和作用原理。细菌浸矿的机理主要有直接作用理论、间接理论以及复合作用理论，也有学者提出了破硫膜作用说。
5.7.1 直接作用理论
5.7.2 间接作用理论
5.7.3 微生物浸矿复合作用
5.7.4 破硫膜说
5.7.1 直接作用理论所谓细菌直接浸出是指不依赖于 Fe3+的触媒作用，细菌的细胞和金属硫化矿固体之间直接紧密接触，通过细菌细胞内特有的铁氧化酶和硫氧化酶直接氧化金属硫化物，使金属溶解出来。试验结果表明：只有在细菌的参与下，
对黄铁矿（ FeS2）、铜蓝（ CuS）、毒砂
（ FeAsS）等的浸出才有明显的效果。
42 C u S OO2C u S 细菌
44322 F e S O2A s OH2O2
13OH3F e A s S2 细菌
442222 F e S O2SOH2OH2O7F e S2 细菌
5.7.2 间接作用理论氧化硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌等浸矿细菌具有氧化低价铁和元素硫生成高价铁和硫酸的能力，其反应如下：
OH2)SO(Fe2SOH2OF e S O4 23424224 细菌
4222 SOH2OH2O3S2 细菌
Fe2(SO4)3溶液是一种有效的金属矿物的氧化剂和溶浸液，铜、铀及其它多种金属矿物如黄铁矿、黄铜矿（ CuFeS2）等都可以被 Fe2(SO4)3浸出。
42423422 SOH8F e S O15OH8)SO(Fe7F e S
S2F e S O5C u S O)SO(Fe2C u F e S 443422
铀矿石的浸出亦主要是利用上述细菌所生成的氧化产物硫酸高铁和硫酸对沥青铀矿等主要铀矿物进行溶解和氧化。 Fe2(SO4)3能将不溶于水的四价铀氧化成可溶的六价铀，从而将铀浸出。
5.7.3 微生物浸矿复合作用微生物浸矿复合作用理论是指在细菌浸出过程中，
既有细菌直接作用，又有通过 Fe3+氧化的间接作用。
有时以直接作用为主，有时则以间接作用为主，但两种作用都不可排除，这是迄今为止绝大多数研究者都赞同的细菌浸矿机理。实际上，矿石总会多少存在一些铁的硫化矿，所以浸出时 Fe3+的作用不可排除。黄铁矿浸出就是两种机制同时存在的例子。
5.7.4破硫膜说有的学者认为，在浸矿过程中，矿石块表面覆盖着硫的薄膜，阻碍了溶浸液与矿石块表面的直接作用，
若有细菌存在，可以将硫膜氧化和破坏，使浸出得以继续进行。
5.8 细菌浸出动力学细菌浸出过程，包括细菌生长繁殖及与矿物之间的生化反应，也包括细菌溶浸液与矿物之间的化学反应，
这些反应过程之间的影响因素，有的相互统一，有的则相互矛盾和抵触。增加浸出过程的通气量和适当提高搅拌速度，对各反应过程有利，但反映环境的温度和酸度则不同，有利于矿物浸出化学反应的温度和酸度，却不一定对细菌生长有利。相对于矿物浸出化学反应来说，细菌繁殖过程是一个缓慢的过程，因此，
细菌浸出反应的总反应速度受细菌生长速度控制。
由试验和生产实践中得知，细菌浸出速度和浸出介质中细菌的浓度成正比。细菌生长繁殖受环境因素控制，由细菌生长曲线可知，细菌在对数生长期的曲线斜率为细菌生长率 μ,μ 为单位时间单位体积内的细菌增长量。当环境的通气量与其他条件固定时生长率与培养基中某一组分浓度的关系如图 2-12所示。
图 2-12 细菌生长率与培养基浓度的关系
μ m
细菌生长率
μ
培养基浓度Ks
μ
该曲线可表示为如下关系：
该曲线可表示为如下关系：
SK
S
s
m
式中,μ m—— 最大生长率；
S —— 培养基浓度；
Ks —— 常数（最大生长率一半时的培养基浓度）。
在矿物浸出环境中，细菌从矿物获取营养，矿物好比是固体培养基，可取矿物的表面积为培养基浓度
S。当连续培养达到稳定状态时，细菌生长繁殖和培养基消耗达到平衡，在此状态下可得到如下关系式：
0 DNNdtdN?
0 YNDSDSdtdS r?
式中,N—— 细菌浓度（ g/L）；
D—— 稀释率（新培养基添加率或旧培养基流出率）（ L/(h?L)）；
Sr—— 流入液体培养基的浓度；
S—— 培养容器内已有培养基的浓度；
Y—— 每消耗一克培养基所产生的细菌数。
由以上关系式可知 μ ＝ D，单位时间内细菌产量为：
)( DDKSDYDN
m
sr
由上两式可看出，稀释率 D越低，培养基在培养容器内的停留时间越长，则培养基的利用率越高。如果在此设备中进行连续细菌浸出，则溶浸液的消耗率越高，得到的浸出液金属浓度越高。
相反，如果稀释率 D越高，则菌液流出量越大，但细菌浓度较低。如果用于浸出，浸出液金属浓度较低。为取得更理想的细菌培养或浸出效果，在实践中应采用适当的稀释率，以控制细菌的产率、
浓度和理想的浸出速率。
由于细菌浸出速率和细菌产量成正比，则此时培养基的消耗率 η为：
r
m
sr
r
r
S
D
DKS
S
SS
)(
式中,C—— 培养容器或浸出设备中溶解氧的浓度；
C*—— 同样温度下氧的饱和溶解度；
q—— 细菌耗氧率（ mL/(g?h)）；
N—— 细菌浓度；
α —— 常数，和传质系数有关。
在细菌连续培养和矿石搅拌浸出条件下,C存在最佳值，上式中的其他项 C*,q,N都是固定值，所以要取得充分的供氧量和理想的溶解氧浓度 C，只有改变常数项 α 。由上式可以看到，供气量与 α 成正比，而 α 值与传质系数有关，传质系数越大,α 值越大。要提高传质系数，应使供气的气泡细小，进入容器液体时气体要充分散开，尽量减小传质边界层的厚度，提高气液混合的湍流度。在堆浸条件下，提高供气量的有效办法是采用喷淋方式布液，周期性地向矿堆注入溶浸液，使矿石堆内保持良好的通气量和通畅的渗透性。
当浸出矿石的品位较高、粒度较细时，相当于为细菌提供充分的培养基，此时氧气的供应量就成为细菌产量或矿石中金属浸出量的限制因素。因此可引出如下关系式：
qNCCdtdC )( *?
5.9 细菌浸出与铀矿石矿物学细菌浸铀过程和一般化学浸出过程有相似之处，两者都是利用某种溶浸液将矿石中的有用组分溶解出来，但细菌浸出是一个比一般化学浸出更复杂的反应过程。在这个浸出过程中，
除一般化学反应外，还有细菌生长繁殖及同浸出物料的作用过程。浸出过程中要时时关注细菌的生长情况，在很大程度上，
只能在细菌生长条件允许的范围内，改变各种浸出条件，提高反应速度。细菌浸出是一种特殊浸出方法，该工艺有自己的独到之处，但也有一定局限性和适应性。
细菌浸出的一个重要方面是铀本身的矿化作用,Mille等人认为，象钛铀矿那样的难浸矿是难以处理的。然而，在加拿大伊利奥特湖附近的各个铀矿中，这种矿石很多，业已采用的细菌浸出具有良好的结果，表 2-7列出了各种铀矿石进行生物浸出的结果。据此可以认为，氧化物、磷酸盐、硫酸盐和碳酸盐矿石比较适合生物浸出，而硅酸盐矿石则难以甚至不可能进行生物浸出。
表 2-7 各种铀矿石的化学组成与生物浸出的关系铀 矿 石 化 学 组 成 细菌浸出的程度沥青铀矿 UO2 +
脂铅铀矿 UO3.nH2O +
深黄铀矿 CaU6019.11H2O +
钛铀矿 (U,Ca,Ce)(Ti,Fe)O6 +
铀钛磁铁矿 (Fe,Ce,U)(Ti,Fe,V,Cr)5O12 +
水硅铀矿 U(S04)1-x(OH)4x -
硅钙铀矿 Ca(UO2)2Si2O7.6H2O + -
硅镁铀矿 Mg(UO2) 2Si2O7.6H2O + -
钙铀云母 Ca(U02)2(PO4)2.12H2O +
铜铀云母 Cu(UO2)2(P04)2· 8H2O +
磷铵铀矿 NH4.UO2.PO4.3H2O +
翠砷铜铀矿 Cu(UO2)2(AsO4)2.12H2O +
钾钒铀矿 K2(UO2)2(VO4)2.3H2O + -
钒钙铀矿 Ca(UO2)2(VO4)2.8H2O + -
水铀矾 (UO2)2SO4+(OH)2.14H2O +
铀钙矾 (UO2)6SO4(OH)10.12H2O +
铀铜矾 Cu(UO2)2(S04)2(OH)2.6H2O +
板菱铀矿 NaCa3UO2SO4(CO3)3F.10H2O +
生物浸出的效率也取决于围岩的性质。当围岩呈碱性时，有可能形成沉淀物，该沉淀物将阻碍浸出液在矿堆中的自然渗滤，导致矿石中有些死角不能浸出，
铀回收率降低；另一方面，当围岩呈酸性时，酸耗低，
有利于铀的浸出。围岩的另一种重要情况是为细菌的不断生长提供充足的矿物，已有资料表明，含铀页岩是一种生物浸出的良好物料，因为它几乎含有细菌培养所需要的全部组分：硫化物、铁、磷酸盐、氮、有机物和微量元素。
表 2-8给出了各种铀矿石的矿物学性质。那些不含黄铁矿的矿石除外，其余所有矿石都适宜于氧化亚铁硫杆菌的生长，这是非常重要的。此外，那些主要由硅酸盐形成的矿物的酸耗很低，可使生产成本降低。
然而，最重要的经济因素仍然是黄铁矿的最低含量，
就是进行细菌氧化所需要的实际数量。
表 2-8 某些矿山铀矿物学矿 山 (地点 )
铀 的 矿 化黄铁矿
（ %）
围 岩氧化物硅酸盐磷酸盐钒酸盐
U3O8
(%)
硅酸盐碳酸盐
Lilljuthatten(瑞典 ) P - - - 0.14 - P -
Vendee(法国 ) P S - - 0.28-1.6 - P -
Urgeirica,(葡萄牙 ) p - - - 0.10 5 P -
Bica(葡萄牙 ) S - P - 0.15 1 P -
Valinhas<葡萄牙 ) P - S - 0.14 0.5 P S
Grants(美国 ) P - - - 0.32 <0.55 P -
E11iot湖 (加拿大 ) S P - - <0.15 5-10 P -
Mid west湖 (加拿大 ) P - - - 1.80 <1 P -
Ningyo— toge(日本 ) - - P - 0.03-0.15 <1 P -
Bhatin(印度 ) P - - - 0.03 <0.1 P -
Dyson’s(澳大利亚 ) - P - - 0.27 - P -
Mary Kathleen(澳大利亚 ) P - - - >0.30 - P -
Ranger(澳大利亚 ) P S S - 0.35 - P -
Yeelirrie(澳大利亚 ) - - - P 0.40 - P S
概括起来可以说，如果矿石中有黄铁矿且矿石几乎不含碳酸盐、铀不以硅酸盐形式存在或者铀不是存在于与介质相抵触的物相中、以及如果氧化亚铁硫杆菌能在适宜的环境 (有必不可少的营养物，不存在抑制剂 )中起作用，那么铀的回收率将是高的。
因此，在考虑细菌浸出对铀矿石的适应性，要注意以下基本要求：（ 1）对细菌浸出敏感的铀矿物学；（ 2）最好含有一定量的黄铁矿；（ 3）矿石中不存在碱性化合物；（ 4）含有细菌生长所需要的营养物质。
根据矿石的岩性和组成，可以大致估计某种矿石是否适于细菌浸出。应当说，适合细菌浸出的矿石种类是比较多的，大部分金属硫化矿和氧化矿都可以用细菌浸出。凡适合堆浸或渗滤浸出处理的矿石，都可以考虑采用细菌浸出，以下几种矿物资源可采用细菌浸出工艺处理。
（ 1）大量的贫矿、表外矿、选矿厂的尾矿等都可用细菌堆浸工艺回收其中的有价金属。
（ 2）废弃矿山或采空坑道中存留的矿石和废矿石，露天采矿剥离出的大量含金属围岩和废矿，矿井或巷道掘进中挖出的大量贫废矿等。
以上是可采用细菌浸出工艺处理的矿石的大致范围，要确切地了解某种矿物的细菌浸出可行性，还须通过试验来确定。比较快的办法是进行摇瓶试验，具体方法如本章下部分所述。用此法一般可在 3～ 4周内得出矿石的最大浸出率、浸出速度、酸耗和产酸量等数据，由这些数据就可较快地判别某种矿石是否适合于细菌浸出。
目前实践中比较常用的是氧化亚铁硫杆菌等嗜酸自养菌。浸出在酸性条件下进行，所以酸性矿物比较合适。矿石的耗酸物质不能太多，否则细菌氧化硫化矿所产生的酸很快被碱性矿物中和，要维持浸出酸度，
就要加入大量酸去中和矿石中的碱性矿物，在这种条件下，嗜酸菌较难适应。此外，该类菌靠氧化硫化矿和亚铁等获取代射过程所需能源，所以矿石中应含有一定量铁等金属的硫化矿物，即细菌氧化矿石中硫所产生的酸应足够去中和矿石中的碱性矿物。
5.10 细菌浸出影响因素金属矿物的细菌浸出过程和矿物的化学浸出过程有所不同，细菌浸出是一个更复杂的化学浸出过程，在这个过程中既有细菌生长繁殖和生物化学反应，又有溶浸液和矿物的化学反应，细菌生长繁殖速度比矿物化学浸出反应慢得多，所以细菌的生长状况是整个细菌浸出的制约环节。细菌浸出不仅与细菌本身特性有关，
还受浸出环境的诸多因素控制 [25-26]（如矿石性质、环境温度、介质酸度、通气量和培养基成分等）。
5.10 细菌浸出影响因素
5.10.1 矿石的性质：矿石的透气性,物理化学性质
5.10.2 矿石的粒度：矿石粒度越细,对浸矿越有利
5.10.3 温度：温度太高或太低都不利
5.10.4 pH值：细菌氧化 Fe2+最适 pH为 1.5~2.5
5.10.5 培养基成分：影响细菌生长繁殖速度
5.10.6 通气量：充分供气是很重要
5.10.7 铁离子,Fe3+是金属矿物的氧化剂
5.10.8 光线,微生物对紫外线很敏感
5.10.9 氨离子浓度：氨离子是细菌生长所必需的
5.10.10 其他影响因素
5.10.1 矿石性质的影响
1 矿石渗透性的影响矿石的透气性、矿石的物理化学性质等因素都将影响细菌与矿物的作用，影响细菌浸出率。一般来说，矿石堆积愈高、矿堆中泥质成分愈多，则矿石堆积愈紧密，堆内孔隙率愈小，细菌存活所需的氧气就愈少，从而影响细菌的活性，对铀的浸出不利；另外，矿堆中如泥土成分过多，还会形成隔水层，影响含细菌的溶浸液向下渗透，影响细菌与矿物之间的接触，进而影响浸出率。因此，在筑堆时，
矿堆的高度应在 10m以下，并尽可能将泥土成分分离出去。
5.10.1 矿石性质的影响
2 矿石粒度及矿浆浓度的影响按常规思想，矿石粒度越细，接触面越大，越有利于细菌与矿石接触，对浸出有利。只要不影响空气流通和溶液的渗流速度，矿石粒度越小越好，
小粒度矿石可获得较快浸出速度和较高浸出率。但矿石粒度越细，矿堆堆积得越紧密，矿堆内空气的流通和浸出液的渗透都会受到影响；对于含泥矿石来说，粒度过小，泥质成分更容易堵塞孔隙，降低矿堆的渗透性。有研究者发现，堆浸中矿块的细菌浸矿深度为 15mm左右，主要和矿石裂隙的毛细作用有关。对于细菌浸出，每种矿石均存在一个最佳粒度，一般通过试验确定。因此，选择最佳矿石粒度可以提高浸出率。
5.10.1 矿石性质的影响
3 矿石化学成分的影响矿石的化学成分影响浸出速度。如，当黄铁矿与黄铜矿共生时，黄铁矿对黄铜矿的细菌浸出有促进作用，黄铜矿的细菌氧化速度将加快；而黄铜矿与方铅矿共存时，方铅矿的存在反而抑制黄铜矿的细菌浸出。矿石中的一些重金属元素如汞、砷、铅等的溶解都会影响细菌的生长、繁殖甚至存活。因此，有目的地将矿石混合或除去某些组分，将会提高细菌浸出的金属浸出率。
5.10.1 矿石性质的影响
4 黄铁矿的影响虽然尚未明确研究过铀矿石类型对细菌浸出的影响，但是有文献指出，矿石中的黄铁矿对细菌浸出具有重要意义。由于这个原因，生物浸出法只限于硫化物含量高的矿石，并未普遍用于从矿石中提取铀。加拿大东部的一些矿石系黄铁矿与铀伴生，
特别适合于细菌浸出。但新墨西哥州、罗基山脉和美国南部得克萨斯州铀矿石的黄铁矿含量较低，甚至没有，因而不太适合于细菌浸出，有研究结果表明：在这类矿石中添加黄铁矿会产生促进作用。在葡萄牙和印度的矿石中通常加入 5公斤黄铁矿 /吨矿石，而在西班牙矿石中 3公斤 /吨矿石的黄铁矿加入量比 5公斤 /吨矿石更为有效。这说明，黄铁矿的最佳加入量取决于待浸矿石的矿物组成和待加入黄铁矿的性质。
5.10.2 温度的影响温度是影响细菌生长的重要条件之一。任何一种细菌都有一个最适生长温度，在一定的温度范围内，
随着温度的上升，该细菌的生长、繁殖加速。此外还有最低生长温度和最高生长温度。所谓最低生长温度是指低于这一温度时，这种细菌的生长停止，但并未死亡，利用这个原理在低温下保藏菌种。最高生长温度是指高于这一温度时，细菌生长停止，并最终导致死亡。各种细菌的最适生长温度范围和最低、最高生长温度都不一致，在环境温度随季节逐月缓慢变化时，
存在着一个天然的驯化和淘汰的过程，与变化的环境温度相适宜的细菌逐渐繁殖并不断增多。有资料表明，
当水温在 15～ 35℃ 范围内运行时，对污水处理厂的去除效果影响并不很大。
每种细菌都有各自最适宜的生长温度，工业上应用最广泛的氧化亚铁硫杆菌的最适生长温度是 30～ 32℃,当温度低于 10℃ 时，细菌活力变得很弱，生长繁殖也很慢。当温度高于 45℃ 时，细菌生长也受影响，甚至要死亡。有研究人员曾做过温度对氧化亚铁硫杆菌生长及氧化活性影响的试验，试验结果见图 2-13。并在 1995～ 1996年的生产实践中对温度与细菌活性关系进行了试验，试验结果见图 2-14。
图 2-13 细菌氧化 Fe2+速率与温度关系图 2-14 温度与细菌活性的关系从图 2-14可以看出，在前 3个月内,Fe2+氧化率保持稳定，说明细菌生长良好；之后，细菌活性减弱,Fe2+氧化率下降。这是因为时值冬天，矿堆内温度为 10℃ 左右，细菌生长缓慢，
细菌体内的酶促反应速度也下降；次年三月后，
随着温度回升，细菌又开始快速生长、繁殖，
氧化亚铁速率加快。
为了扩大细菌浸出的应用范围，使细菌能在低温条件继续发挥作用，王清良、胡凯光等人曾分别在室内和现场进行了低温细菌氧化 Fe2+试验，以检验低温下细菌活性。
首先在室内不同温度条件下进行了细菌活性检测试验，把试验中所得溶液氧化还原电位以及 Fe2+离子浓度与时间关系作图，得图 2-15、图 2-16。
图 2-15 不同温度条件下溶液电位与时间关系曲线图 2-16 不同温度条件下溶液 Fe2+
离子浓度与时间关系曲线图 2-15、图 2-16中曲线表明：没有接种的培养基，氧化还原电位基本不变,Fe2+很少被氧化；接入菌种的培养基，当温度只有 7℃ 左右时，
细菌活性很差,Fe2+基本上不被氧化，氧化还原电位也不升高；当温度升高至 17℃ 时，细菌能较快氧化 Fe2+，氧化还原电位升高；特别当温度升至 30℃ 时，细菌活性很好，能快速氧化溶液中 Fe2+，氧化还原电位迅速升高；但当温度继续升高至 50℃ 时，细菌活性几乎丧失，氧化还原电位基本不变,Fe2+基本不被氧化。而且从图
2-15、图 2-16中曲线 4、曲线 5都可以看出，接种的培养基在培养前阶段，氧化还原电位升高较慢； Fe2+浓度降低也较慢，到后阶段，氧化还原电位迅速升高,Fe2+浓度很快降低，说明越到后面细菌活性越好 。
后来又在现场加工了内径 Ф200mm,高 800
mm的简易生物反应器，由塑料圆柱和筛板组成，
试验装臵见图 2-17。
图 2-17 低温下细菌活性试验装臵示意图配好培养基，按 30%的比例接种，分析溶液中
ρ(Fe 2+)、氧化还原电位，然后通气培养。每天取样，
测定溶液电位，分析 ρ(Fe 2+)，并测量生物反应器中溶液温度、吸附尾液温度、室外温度，结果见表 2-9。
表 2-9 不同温度下细菌氧化 Fe2+情况时 间 溶液温度 (℃) 室外温度 (℃) 溶液电位 (mV) ρ(Fe 2+)(mg/L) ρ(Fe 3+)(mg/L)
1996.
9.23
11:00
16:20
13.5
12.O
14.O
14.O
451
452
330
330
348
348
9.24 11:0016:00 12.512.6 13.013.O 454453 320318 359360
9.25 11:OO16:5O 11.O11.2 12.O11.5 457458 314311 370373
9.26 11:2017:OO 10.010.0 10.510.3 462463 309309 376372
9.27 lO:4017:50 9.09.0 10.08.5 465467 300288 382391
9.28 11:3018:30 8.O8.0 5.05.0 470471 276271 400404
9.29 11:OO17:00 8.07.O 4.04.0 472472 270270 405406
9.30 17:OO 7.5 4.O 472 269 405
5.10.3 pH值的影响浸矿用的氧化亚铁硫杆菌属，是一种产酸又嗜酸的细菌，环境酸度对细菌生长有明显影响。有资料报道：细菌氧化 Fe2+最适 pH范围为 1.5～ 2.5，也有报道为 1.8～ 2.0。对此，作者等人在室内用自行采集的菌种经过驯化培养之后，在不同 pH条件下进行细菌快速氧化亚铁试验，试验装臵见图 2-18。
图 2-18 试验装臵在相同温度条件下，调节溶液 pH分别为
0.42,0.82,0.94,1.27,1.64,2.00、
3.00,4.60进行试验，把不同 pH条件下通气培养时溶液中 Fe2+氧化率与时间关系作图 2-19，
Fe2+氧化速率与 pH关系作图 2-20。
图 2-19 不同 pH条件下，
Fe2+氧化率与时间的关系图 2-20 pH与细菌氧化 Fe2+
速率的关系从图 2-19中不同 pH条件下溶液中 Fe2+氧化率与时间关系可以发现，当 pH在 0.94～ 3.0范围时，细菌氧化 Fe2+速率都比较快，特别在 2.0～ 2.5氧化效果更好，在很短的时间里 Fe2+的氧化率就达到 100%；当 pH值太低时，细菌基本上失去氧化 Fe2+能力，后来作者又对细菌进行了进一步的耐酸驯化，发现细菌的耐酸能力又得到了提高，
在高达几十 g/L的硫酸介质中，细菌还能继续氧化 Fe2+，
只是氧化 Fe2+速度减慢；当 pH太高时,Fe3+已经沉淀，
细菌氧化 Fe2+能力很差。从图 2-13可以发现当 pH为 2.5时，
氧化 Fe2+速率最大，所以为了使细菌快速氧化 Fe2+，一方面通过驯化培养使细菌尽量适应其环境，另一方面最好调节 pH在细菌最适宜范围。
介质酸度影响细菌的活性及繁殖速度，从而影响矿物浸出，这里酸度本身对矿物的作用不很重要。此外，
由于介质中含有 Fe3+，浸出时应控制酸度在 pH2.0左右，
防止铁沉淀。
5.10.4 培养基成分的影响有研究表明：金属矿物的浸出速度和浸出介质中细菌的浓度成正比，要获得矿物浸出的高速度，则须保持细菌生长繁殖的高速度。做到这一点的重要条件之一是提供细菌生长所必需的足够营养。试验证明：在供给足够 CO2的情况下，培养基的各种营养中，氮对矿石浸出效果影响最明显。试验结果表明,NH4+浓度为 40mg/L时浸出速率最高，而浓度达到 80mg/L时，可得到最高浸出率。在其他营养成分供应充足的条件下，磷酸盐浓度是浸出速率的限制因素，而铵离子浓度为总浸出率的限制因素。
一般浸出液中都缺少 NH4+，应适当补充。但加入 NH4+后不会立刻看到效果，要过一定时间 (数天左右 )后，才可观察到细菌生长状况的改善。可以用 (NH4)2SO4来补充 NH4+，当 NH4+达到 20～
60mg/L时，细菌增长很显著。实践中应根据矿石的组成情况，
通过试验来确定加入氮、磷的量。但由于多数矿石中都含有磷酸盐，所以浸出时可以不加或少加磷酸盐。
除提供细菌所需的营养外，还要提供细菌进行代谢活动所需的能源。浸矿细菌的能源主要是 Fe2+和 S，在培养细菌时可适当加入这两种物质，但为了使细菌适应浸出条件，应当在培育和驯化细菌的培养基中逐渐添加所要浸出的矿物，使细菌逐渐适应浸出矿物的条件，利用矿物中的组分作为代谢活动的能源。
5.10.5 通气量的影响浸矿细菌一般为好氧菌，靠大气中的 CO2作为碳源，
所以在这类细菌的培养和浸出作业中，充分供气是很重要的。有学者做过测定，细菌生长中实际消耗的氧比水中溶解的氧多两个数量级。所以仅靠自然溶解在水中的氧远不能满足细菌需要，向溶液中充气或加快溶液的循环速度，都可以改善溶液中氧的供应状况。常温常压下水中氧的溶解量为 7mg/L。据测定，在细菌分解黄铁矿试验中，充入溶液的空气中氧的利用率仅为 4.7%。
在细菌堆浸中，矿石堆中供气充分与否是浸出效果好坏的决定因素，供气中氧的利用率与供气速度和溶液循环速度之间的比例是否恰当有关。在浸出作业中需提供什么样的供气条件一般要通过试验确定，可以用 Fe2+
被细菌氧化的速度来比较通气与不通气的效果 (图 2-21)。
由图 2-21可以看到，通气条件下经过 4d的培养,Fe2+的氧化量为 660mg/L，而不通气时仅 50mg/L；另外，也可用测定溶液中细菌浓度的办法比较通气效果好坏。
图 2-21 通气条件对细菌氧化 Fe2+的影响在实际浸出作业中，溶液中通气的速度通常为
0.06～ 0.1m3/(m3.min)。一般情况下空气中的 CO2量是可以满足细菌需要的，但有时为加快细菌繁殖速度，
在供气中补加 1%～ 5%的 CO2。
胡凯光、王清良等人通过现场试验，研究了通气量对细菌氧化 Fe2+的影响。即利用地浸现场试验的生物反应器，通过调节不同的溶液流量，试验每一溶液流量条件下，不同通气量对细菌氧化 Fe2+的影响。试验结果表明：对固定的生物反应器，每一溶液流量都有一最佳通气量。在此通气量时,Fe2+全部氧化；小于此通气量,Fe2+氧化不完全；大于此通气量，不但附加作用不大，造成动力浪费，而且可能由于空气的剧烈搅动，
造成细菌从载体上掉下来，影响氧化效果。
