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第四章 中药制剂的含量分析湖南中医药大学赵碧清
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牛黄解毒片中黄芩苷的含量测定 (HPLC）
色谱条件与系统适用性试验,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇 -水 -磷酸（ 45:55:0.2)为流动相；检测波长为
315nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于 3000。
对照品溶液的制备,取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1mL含 30μ g的溶液，即得。
供试品溶液的制备,取本品 20片（包衣片除去包衣），精密称定，研细，取 0.6g，精密称定，臵锥形瓶中，加 70％乙醇
30ml,超声处理 （功率 250W，频率 33KHz） 20min，放冷，滤过，滤液臵 100mL量瓶中，用少量 70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加 70％乙醇至刻度，摇匀；精密量取 2ml，臵 10ml量瓶中，加 70％乙醇至刻度，摇匀，即得。
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测定法,分别精密吸取对照品溶液 5μ l与供试品溶液 10μ l，注入 液相色谱仪,测定，即得。
本品每片含黄芩以黄芩苷计，小片不得少于
3.0mg，大片不得少于 4.5mg
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含量测定的目的与意义反映其制剂中 有效成分 或者 毒性成分 的含量。
衡量其制剂工艺的 稳定性 和中药材的 质量优劣,确保中药制剂临床用药 安全,有效 和中药制剂进入国际市场的需要，必需用含量测定来控制中药制剂的质量。
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,中国药典,（ 2005版）中牛黄清心丸、大黄清胃丸等均无含量测定方法。
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1977
1985
1990
1995
2000
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
1977
1985
1990
1995
2000
2005
药典中中药及其制剂的含量测定所占比例
1977 1985 1990 1995 2000 2005
1.48% 5.31% 8.73% 12.81% 29.04% 63.26%
含量测定的发展：
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第一节 含量测定样品的处理样品处理的主要作用：
释放被测组分，制成稳定试样；除去杂质，纯化；浓缩；试样形式符合测定的要求。
一、样品的粉碎目的 取样均匀，提取完全粉碎设备 粉碎机、研钵、匀浆机
※ 粒度大小合适
※ 防止污染或损失
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二、样品的提取关键 提取完全
1、溶剂的选择水、酸水、碱水；
亲水性 的有机溶剂：
乙醇（酒精）、甲醇、丙酮；
亲脂性 的有机溶剂：
石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷
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2、冷浸法部分测定法：不适于挥发性较大的提取溶剂；
全部测定法（总量测定法）
优点,操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少缺点,费时（ 12-24 h）、费溶剂（ 10-50倍）
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灵宝护心丹（牛黄、麝香等）中胆酸的含量测定取本品适量，研细，取约 0.5g，精密称定，
臵具塞锥形瓶中，加 石油醚 （ 60-90℃ ） 4ml，浸泡 1小时，滤过，滤渣及滤纸挥去溶剂，放回锥形瓶中，精密加入冰醋酸无水乙醇溶液（ 1 →
10） 15ml，摇匀，密塞，称定重量，浸泡 12小时，
再称定重量，用冰醋酸无水乙醇溶液（ 1 → 10 ）
补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
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3、回流提取法万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定
+ HCl-70%乙醇溶液，加热回流 1h
4、连续回流提取法保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定
+ 甲醇，加热回流至提取液无色为止
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索氏提取器 是利用溶剂的 回流 和 虹吸 原理,对固体混合物中所需成分进行连续 提取。当提取筒中回流下的溶剂的液面超过索氏提取器的虹吸管时,提取筒中的溶剂流回圆底烧瓶内,即发生虹吸,随温度升高,再次回流开始,每次虹吸前,固体物质都能被纯的热溶剂所萃取,溶剂反复利用,缩短了提取时间,所以萃取效率较高。
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5、超声提取法原理,超声波的助溶作用优点,操作简便，提取速度快
※ 需对超声频率、提取时间、溶媒等进行考察
※ 超声波可能引起供试品成分的改变保济丸（厚扑等）中厚扑酚测定
+ 石油醚（ 30-60℃ ），超声处理（功率 500W，频率 33kHz） 2次，每次 30min
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6、超临界流体提取法（ SFE）
超临界流体 —— 特殊的物质状态密度 ～ 液体 → 溶解能力强粘度 ～ 气体 → 传质快，有利于待测组分的扩散表面张力 几乎为 0 → 浸润性能好密度受 压力,温度 的影响大 → 改变对溶质的溶解能力加入甲醇、氯仿、苯等改变 极性 → 提取不同极性的成分优点,速度快、萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、
节省溶剂、易于自动化，而且可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光谱等分析仪器直接联用 。
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三、样品的分离纯化
1、沉淀法某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液达到精制的目的。
蛇胆糖浆口服液含有大量糖，可用无水乙醇回流样品，冷后过滤，除糖以消除其干扰。
复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。
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2、蒸馏法适用于具挥发性的待测组分，如挥发油、小分子的生物碱、丹皮酚等。
最常用 水蒸气 蒸馏法：
共水 蒸馏法通水蒸气 蒸馏法水上 蒸馏法利用 盐析 作用，提高蒸馏效果
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3、液 -液萃取法
(1)直接萃取法萃取剂 的选择亲脂性有机溶剂，如氯仿或乙醚弱亲脂性的溶剂，如乙酸乙酯、正丁醇等原则,多次 萃取（ 3-4次）；
调整水相 酸度,提取有机酸、有机碱；
利用 盐析 作用，提高提取率。
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（ 2）离子对萃取法在适当的 pH介质 中，某些有机酸 (碱 )性物质形成的离子与带 相反电荷 的离子 (也称离子对试剂 )定量地结合成为弱极性的 离子对,而易溶于有机溶剂，
使之萃取分离。适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取 (不能用直接法萃取 )，在中药制剂分析中主要用于生物碱 (B)的分析 。
BH+（水相） + In-(水相 ) BH+·In-（水相） BH+·In-
（有机相）
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适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取
※ 水相酸度的控制
※ 离子对试剂的选择
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4、色谱法
4.1色谱法（层析法）
分离的原理：
吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱按操作方式,柱色谱、薄层色谱、纸色谱装柱方法,湿法装柱、干法装柱微柱色谱（固相萃取）：
柱的大小：长 5～ 15cm，内径 0.5～ 1cm
柱填料,硅胶、氧化铝、氧化镁、活性炭、聚酰胺、
大孔树脂、硅藻土、离子交换树脂,C8,C18等
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4.2色谱法（层析法）
硅胶,酸性吸附剂,适用于中性或酸性成分的层析，
强烈保留碱性化合物。洗脱顺序：极性小 → 大氧化铝,带有碱性，分离一些碱性中草药成分，不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。
中性氧化铝、酸性氧化铝,适用于酸性成分的分离键合相硅胶（ C18或 ODS）,分开脂溶性和水溶性成分操作程序：
①柱的活化；②上样；③清洗；④洗脱。
洗脱顺序,极性大 → 小
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大孔树脂分为极性（丙烯酰胺聚合物 ）和非极性（苯乙烯和二乙烯苯的共聚物）型非极性型（ XAD-2等）：分开脂溶性和水溶性成分
※ 使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗聚酰胺：
与溶质形成 氢键 而产生吸附作用，常用于含酚、
酸、醌类药物样品液的净化分离
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硅藻土、纤维素：
以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相的分配色谱洗脱顺序：极性小 → 大离子交换树脂：
用于除去样品中的离子及萃取可离解化合物
(弱 酸、弱碱药物 )。
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5、消化法 测定中药制剂中的无机元素湿法消化硝酸 -高氯酸法,适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏
※ 对含氮杂环类有机物破坏不够完全硝酸 -硫酸法本法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。
※ 与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，
不宜采用此法。
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硫酸 -硫酸盐法：
本法是往样品中加入 浓硫酸 作氧化剂，加入 硫酸盐 提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，
且防止硫酸的分解损失。
常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。
注意事项：
1、所用仪器 凯氏烧瓶
2、空白试验
3、通风橱中进行
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干法消化供试品 灰分灼烧灰化
(+NaCO3/MgO)
※ 控制温度在 420℃ 以下
※ 不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等 )有机样品的破坏。
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目的：
证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。
测定方法的效能指标精密度、准确度、专属性、
检测限、定量限、线性与范围、耐用性等第二节 含量测定方法的验证
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适用范围：
1,建立中药质量标准时，分析方法需经验证。
2,处方、工艺变更或改变原分析方法时，
分析方法需经验证。
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需验证的分析项目：
鉴别试验,限量检查 和 含量测定 ；以及其它 需控制成分 （如残留物、添加剂等）的测定。中药制剂溶出度,释放度 等检查中，其溶出量等检测方法也应做必要验证。
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验证内容 (8项 )
准确度、
精密度（重复性、中间精密度和重现性）、
专属性、
检测限、定量限、
线性、范围耐用性
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一,准确度（ accuracy）
准确度是指用该方法测定的 结果 与 真实值 或参考值接近的程度，用 百分回收率 表示。
测定回收率 R（ recovery）的具体方法可采用加样回收试验法。
已准确测定药物含量 P的真实样品 +已知量 A的对照品（或标准品）测定，测定值为 M
%1 0 0
A
PMR
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数据要求,
在规定的范围内，取 同一浓度 的供试品，用 6个 测定结果进行评价；或设计 3个不同浓度,每个浓度各分别制备 3份供试品溶液 进行测定，用 9个测定 结果进行评价。一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在 1:1左右。应报告供试品 取样量,供试品中 含有量,对照品 加入量,测定结果 和 回收率 （％）计算值，以及回收率的 相对标准偏差 （ RSD%）或可信限。
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二、精密度（ precision）
是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（ d）、标准偏差 (SD)、相对标准偏差 (RSD)（变异系数,CV）
表示。
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1、重复性在相同操作条件下，由 同一个分析人员 在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度；
在规定的范围内，取 同一浓度 的供试品，用 6个测定结果进行评价。或设计 3个不同 浓度，每个浓度各分别制备 3份 供试品溶液进行测定，用 9个 测定结果进行评价。
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2、中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度；
为考察随机变动因素对精密度的影响，应进行中间精密度试验，变动因素为不同 日期,不同 分析人员,不同 设备 等。
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3、重现性不同实验室,不同分析人员 测定结果的精密度；
如建立药典方法时 分析通过不同实验室的复核检验得出重现性结果。复核检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中。
应注意重现性试验用样品本身的质量均匀性和储存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。
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三、专属性指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。
常用阴性对照法四、线性在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。
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五、范围指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，
测试方法适用的高低限浓度或量的区间。
六、耐用性指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。
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检测限（ LOD）
系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。常用 %,ppm,ppb表示。一般信噪比为 S/N=3或 2
定量限（ LOQ）
指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用 %,ppm,ppb表示。 一般信噪比为 S/N=10
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应用
1,鉴别试验 除专属性、耐用性外，其它都不要求。
2,杂质 的 限量检查 除专属性、检测限、耐用性外，
其它都不要求。杂质的 定量测定 除检测限外，其它都要求。
3,含量测定及溶出量 测定除检测限、定量限外，其它都要求。
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一、化学分析法适用于 含量较高 的成分及 无机成分 的测定包括,重量分析和滴定分析重量分析：
挥发法：如水分测定萃取法：如冰片散中冰片的含量测定沉淀法：如苦参片中苦参总碱的含量测定第三节 常用定量分析方法滴定分析
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地奥心血康胶囊的含量测定取本品装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于甾体总皂苷元 0.12g），臵 150ml圆底烧瓶中，
加硫酸 40%乙醇溶液（取 60ml硫酸，缓缓注入适量的 40%乙醇溶液中，放冷，加 40%乙醇溶液至 1000ml，摇匀） 50ml，臵沸水浴中回流 5小时，放冷，加水 100ml，摇匀，用 105℃ 干燥至恒重的 4号垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀用水洗涤至滤液不显酸性,105℃ 干燥至恒重，计算，即得。
本品每粒含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于 35mg。
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止咳灵注射液中总生物碱的含量测定精密量取本品 10mL,臵分液漏斗中，加 1mol/LNaOH溶液
0.5ml，用三氯甲烷提取 4次（ 10ml,10ml,5ml,5ml，合并三氯甲烷溶液，臵具塞锥形瓶中，精密加入硫酸滴定液
（ 0.01mol/L)10ml及新沸过的冷水 10ml，充分振摇，加茜素磺酸钠指示液 1～ 2滴，用 NaOH滴定液（ 0.02mol/L)滴定至淡红色，并将滴定结果用空白试验校正，每 1ml硫酸滴定液
（ 0.01mol/L）相当于 3.305mg的麻黄碱（ C10H15NO)。
本品每 1ml含总生物碱以麻黄碱（ C10H15NO)计，应为
0.50～ 0.80mg。
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★ 定义 根据被测物质在紫外 -可见光的特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性定量分析的方法称紫外 -可见分光光法。
二、紫外－可见分光光度法
★ 特点 本法操作简便，灵敏度高，常用于中成药含测。但本法不具分离功能，常用于 总成分 的测定。
★ 定量依据 Beer-Lambert定律。测定单一物质时，先测定其吸收光谱，然后选择最大吸收峰的波长?max进行定量分析。
一个物质若有几个吸收峰时，可选择吸收峰较高，在此吸收峰处吸光度随波长变化较小，并且其它物质无吸收的波长作为定量条件。
一般不选择光谱最左边的末端吸收峰作定量测定的波长。
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灯草细辛注射液中总咖啡酸酯的含量测定对照品溶液的制备,取 1,5-氧 -二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，加 0.1mol碳酸氢钠溶液制成每
1mL含 10μ g的溶液。
供试品溶液的制备,精密量取本品 1mL,臵 200ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，即得。
测定法,分别取对照溶液与供试品溶液，照紫外 -
可见分光光度法（附录 V A），在 305nm波长处测定吸光度，计算，即得。
本品每 1ml含总 咖啡酸酯以 1,5-氧 -二咖啡酰奎宁酸（ C25H24O12)计，应为 2.0～ 3.0mg。
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复方皂矾丸中皂矾的含量测定对照品溶液的制备,取硫酸亚铁对照品 0.4g，精密称定，臵
100ml量瓶中，加硫酸溶液（ 1→20 ） 1ml和水 80ml使溶解，加水至刻度，摇匀。精密量取 2ml，臵 100ml量瓶中，加水至刻度，
摇匀，即得（每 1ml中含硫酸亚铁 80μg）（临用前配制）
标准曲线的制备,精密量取对照品溶液 1ml,2ml,4ml,6ml，
8ml，分别臵于 25ml量瓶中，加水至 10ml，再加 1%盐酸羟胺溶液
1ml及 0.2% 2,2-联吡啶乙醇溶液 1ml，混匀，加水至刻度，摇匀；以相应的溶液为空白，照紫外 -可见分光光度法（附录 V
A），在 522nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。
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测定法,取本品 30丸，精密称定，剪碎，取 2g，精密称定，
臵 50ml量瓶中，加硫酸溶液（ 1→20 ） 5ml和水 200ml，超声处理至全部溶散，加水至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液约
20ml，精密量取续滤液 10ml，臵 100ml量瓶中，加水至刻度，
摇匀，精密量取 5ml，至 25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自,加水至 10ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中硫酸亚铁的 重量,计算，即得。
本品每丸含皂矾以硫酸亚铁（ FeSO4.7H2O)计，不得少于
30.0mg。
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六味地黄颗粒中牡丹皮的含量测定取装量差异项下的本品约 2g，研细，精密称定，
用水蒸气蒸馏，收集馏出液约 450ml，臵 500ml量瓶中，
加水稀释至刻度，照紫外 -可见分光光度法（附录 V
A），在 274nm波长处测定吸光度，按丹皮酚（ C9H10O3)
的吸收系数（ )为 862计算，即得。
本品每袋含牡丹皮按丹皮酚（ C9H10O3)计，不得少于 6.0mg。
%1cmE
49
★ （单组分测定法）
药典收载了 三种 测定方法
1.吸收系数法 不需对照品。
2.对照品比较法 需用对照品。
3.标准曲线法 需用对照品。
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1、吸收系数法原理将求得的 C值（供试液浓度）、样品溶液的稀释倍数和取样量或平均片（丸）重代入公式计算，即可求出药品中被测成分的含量。
特点不需 对照品随行测定，操作简便，仅用于紫外分光光度法。故需严格校正仪器，规范实验条件，做好前处理工作。
1%
CLEA cm%11?
51
实例 前列舒丸（水蜜丸）中牡丹皮的含量测定取本品切碎，取 2g，精密称定 （ 2.135g）；用水蒸气蒸馏，收集馏出液约 450ml,臵 500ml量瓶中，加水稀释至刻度，照分光光度法（附录 Ⅴ A ）在 274nm 的波长处测定吸收度 （ A = 0.333）,按丹皮酚（ C9H10O3 ）吸收系数
（ ）为 862 计算，即得。本品含牡丹皮按丹皮酚
(C9H10O3) 计，每 1g不得少于 0.53mg
%11cmE
52
(1)供试液浓度的计算
（ 2）牡丹皮含量计算
0 0 0 3 8 6 3.0)1 0 0/ %1
1
LE
AmlgC
cm
（供
90.0
)100
10 00500)100/)/?
gm
mlmlgCgmg
（
（含量（
供供
53
驻车丸（水丸）中总生物碱的含量测定本品由 黄连,炮姜、当归、阿胶等四味中药制成。
取本品粉末（过三号筛） 2g，精密称定，臵索氏提取器中，
加盐酸 -甲醇 (1:100) 的混合溶液适量，加热回流至回流提取液无色时为止，将提取液（必要时浓缩）移至 50ml量瓶中，加盐酸 -甲醇 (1:100) 的混合溶液至刻度，摇匀。照柱色谱法（附录
Ⅵ C ）试验，精密量取 5ml,臵 中性氧化铝柱 （ 5g，内径 0.9cm,
湿法装柱，用乙醇 30ml预洗）上，用乙醇 25ml分次洗脱，收集洗脱液，臵 50ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，精密量取 2ml
臵 50ml量瓶中，加 0.05mol/L硫酸溶液至刻度，摇匀，照分光光度法（附录 Ⅴ A ），在 345nm 的波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱 (C20H17NO4·HCl)的吸收系数（ ）为 728 计算，即得。
本品按干燥品计算，每 1g含 总生物碱 以盐酸小檗碱
(C20H17NO4·HCl) 计，不得少于 30.0mg。
%11cmE
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2、对照品比较法原理在相同条件下分别配制供试品溶液和对照品溶液，
在规定波长处测定供试品溶液和对照品溶液的 吸收度后，按下式计算 供试品溶液的浓度,
供试品的含量（ %） =（ C供 〓 D供 ) / W供 〓 100%
式中,C对为供试品溶液浓度； D供为供试品溶液的稀释倍数； W供为供试品取样量。
样标样标
C
C
A
A
55
特点对照品溶液与供试品溶液的浓度应尽可能接近，一般要求对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的 100%〒 10%。
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实例 黄杨宁片中黄杨宁的含量测定本品为黄杨宁经加工制成的片剂。 每片含 环维黄杨星 D
0.5mg或 1mg。
对照品溶液的制备 精密称取经 105℃ 干燥至恒重的环维黄杨星 D对照品 25mg，臵 250ml量瓶中，加甲醇 70ml使溶解,用
0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，精密量取
10ml，臵 100ml量瓶中，用 0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得 （ 每 1ml含环维黄杨星 D10μ g）。
环维黄杨星 D
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供试品溶液的制备取本品 20片（每片含环维黄杨星 D0.5mg），精密称定
（ 2.050g），研细，精密称取 0.1020g（约相当于黄杨宁
0.5mg），臵 50ml量瓶中，加 0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至近刻度,80℃ 水浴恒温 1.5小时后取出，冷却至室温,加
0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，离心 6分钟（每分钟转速 3000转），取上清液，即得。
测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液各 5ml,分别臵分液漏斗中，各精密加入 溴麝香草酚蓝溶液 （取溴麝香草酚蓝 18mg，臵
250ml量瓶中，加甲醇 5ml使溶解，加 0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，即得） 5ml，摇匀，立即分别精密
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加入氯仿 10ml，振摇 2分钟，静臵 1.5小时，分取氯仿层，臵含 0.5g无水硫酸钠的具塞试管中，振摇，静臵，取上清液，
照分光光度法（附录 ⅤA ），在 410nm的波长处分别测定吸收度（ A对 ＝ 0.454,A供 ＝ 0.445），计算，即得。
本品每片含黄杨宁以环维黄杨星 D(C26H46N2O)计，应为标示量的 90.0%～ 110.0％。
（ 1）求算供试液的浓度
（ 2）求算供试品的含量（标示量％）
59
【 注 】 环维黄杨星 D无紫外吸收，故本法采用 酸性染料比色法
= 96.5％
C供 （ mg/ml） × 10-3 × 50ml × 平均片重 （ mg）
取样量（ mg） × 标示量（ mg）
含量 = × 100%
BH+ + In-
BH+ In-生物碱盐阳离子溴麝香草酚蓝阴离子有色络合物
（ 溶于氯仿 λ max 410nm ）
缓冲液 （ pH6.8）
定量生成
C供 （ μ g/ml） =（ A供 /A对 ） C对 = 9.8
60
3、标准曲线法原理配制一系列不同浓度（ Ci）的对照品溶液（ 5～ 7份 ），在相同条件下分别测其吸收度 (Ai)，以 A为纵坐标，浓度 C为横坐标绘制 A-C曲线,即得 标准曲线 （又称工作曲线）。在相同条件下测定供试品的 A,从标准曲线上查出与之对应的 C，即可求出浓度和含量。亦可将一系列对照品溶液的 C与相应的 A进行一元线性回归，求出 回归方程 （相关系数 r≥0.999 ），将供试品溶液的 A代入回归方程，算出被测成分的浓度和含量。
61
特点 本法多用于可见分光光度法，由于影响显色反应的因素较多，有的仪器单色光纯度较差，故测定时应用对照品同时操作。本法适用于批量样品的分析，当仪器和测定条件固定时，曲线可多次使用。
C
A
A-C曲 线
A= a + b C
62
实例 益心酮片总黄酮的含量测定本品为山楂叶经提取总黄酮制成的片剂。
对照品溶液的制备 精密称取经 120℃ 干燥至恒重的芦丁对照品 25mg臵 50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处 理使溶解，
放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取 20ml，臵 50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每 1ml含无水芦丁
0.20mg）。
63
标准曲线的制备 精密量取对照品溶液 1.0 ml,2.0 ml、
3.0 ml,4.0 ml,5.0 ml,6.0 ml，分别臵 25ml量瓶中，
各 加水至 6ml，加 5%亚硝酸钠溶液 1ml，使混匀，放臵 6分钟。
加 10%硝酸铝溶液 1ml，摇匀，放臵 6分钟，加 10%硝酸铝溶液 1ml，摇匀，放臵 6分钟，加氢氧化钠试液 10ml，再加水至刻度，摇匀，放臵 15分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法（中国药典附录 V B），在 500nm为波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
64
测定法 取本品 20片，除去包衣，精密称定 0.2100g，研成细粉，精密称取 0.5315g（约相当于 5片的重量），精密加入稀乙醇 25ml，密塞，摇匀，超声处理 5分钟，静臵 3小时以上，滤过，
精密量取滤液 4ml，臵 50ml量瓶中，用水稀释到刻度，摇匀，
再精密量取 2ml，臵 25ml量瓶中，照标准曲线臵备项下的方法，
自,加水至 6ml”起，依法测定吸收度,A = 0.362，并取同样量的供试品溶液，加水至 25ml作空白。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算每片总黄酮含量（以无水芦丁计）。
,中国药典,规定本品每片含黄酮以无水芦丁（ C27H30O16）计，
不得少于 25.0mg。
① 标准曲线的制备？ ② 计算供试溶液浓度？
③ 计算每片总黄酮含量？
65
份号 1 2 3 4 5 6
C
（ mg/ml）
0.008 0.016 0.024 0.032 0.040 0.048
A 0.102 0.202 0.305 0.406 0.510 0.627
..
.
AA＝ － 0.00045＋ 10.8696C (r＝ 0.9998)
C ＝ 0.092A ＋ 0.0000413
C（ mg/ml） ＝ 0.092× 0.3620＋ 0.0000413＝ 0.03335
C× 25ml× 50ml× 25ml× 0.105g/片
2ml× 4ml× 0.5315g含量 (mg/片 ) = = 25.7
66
计算分光光度法 （有多组分存在时）
等吸收双波长消去法，导数光谱法等仪器与溶剂的要求校正测定波长；杂散光检查；溶剂的检查
67
定义 薄层扫描法（ TLCS）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量分析的方法。
特点 具有分离分析双重功能。与高效液相色谱法比较，具有多通道 效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。目前随着制板、点样、展开等操作的仪器化及仪器性能的改进，该法检测的灵敏度，结果的精密度与准确度均大大提高，在中药及其制剂检验中，已成为重要的分析方法。,中国药典,中有 32个中成药品种采用该法进行含测。
三、薄层扫描法
68
测定方式
（ 1）吸收法 适用于有 紫外（可见） 吸收的成分，
较常用。该法又可采用反射法或透射法测定。理论上讲，透射法比反射法优越，但实际工作中 常用反射法,因为紫外光不能通过玻板。
（ 2）荧光法 适用于有 荧光性质 的成分，例如小檗碱等。该法 仅采用反射法 测定，其灵敏度比吸收法高
69
方法学考察：
1、工作曲线：确定一点还是两点法定量
2、分离度,应大于 1.0
3、重复性,RSD应不大于 3.0％，需显色的应不大于
5.0％
4、准确度,95％～ 105％之间，测量数据为 5 ～ 6个
5、统计检验,F检验与 t检验
70
含量测定方法（外标法）
TLCS含量测定有 外标法 和 内标法,中国药典仅采用 外标法 。
1.原理 外标法系将一定量的供试品溶液和对照品溶液 分别 点加在同一块薄层板上，展开，显色，定位，扫描被测成分和对照品斑点，测得相应的吸收度或荧光强度积分值，根据定量关系，计算出被测成分的含量。
2.类型 根据对照品标准曲线性质的不同，外标法又分为 外标一点法 和 外标两点法 。
若标准曲线通过原点，采用外标一点法。
若标准曲线不通过原点，采用外标两点法。
71
外标一点法的直线方程,C = F A F 为斜率外标两点法的直线方程：
21 FAFC
12
12
1 AA
CCF
12
2112
2 AA
CACAF
、
F1为斜率 F2为截距
72
3.操作步骤
（ 1）对照品溶液的制备
（ 2）供试品溶液的制备
（ 3）点样在薄层板的起始线上，将定量的样品液点成一条状，点样时应避免任何损失。在板的两边，点上对照品作为定位剂，然后，在选好的溶剂中层开，斑点要集中，不应有拖尾现象。
一般要求使用 市售 薄层板。
73
① 外标一点法：
至少 6个原点对照品（ R） 2个 （ 同一质量 ）,2R
供试品（ S） 4个 （ 同一质量 ）分 2组,2S1 2S2
② 外标两点法：
至少 8个原点对照品（ R） 4个 分 2组 大质量 的 2个,2R1
小质量 的 2个,2R2
供试品（ S） 4个（ 同一质量 ）分 2组,2S1 2S2
对照品与供试品应交叉点加在同一块薄层板上，目的在于消除各种误差。测定时应保证供试品原点的量在线性范围内，
必要时可适当 调整 供试品溶液的点样量。
74
外标两点法外标一点法
75
（ 4）展开
（ 5）显色定位 供试品色谱中待测斑点的比移值
（ Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。
（ 6）扫描 应 沿展开方向 扫描，不得横向扫描。
（ 7）含量计算
76
实例 九分散中士的宁的含量测定九分散是由马钱子粉、麻黄、乳香和没药等制成。
马钱子粉中含有士的宁、番木鳖碱等生物碱，具生理活性但也有毒性，故需控制马钱子含量。中国药典规定按干燥品计每包含马钱子以士的宁计应为 4.5～
5.5mg。
供试品溶液的制备 取本品 10包，混合研匀。精密称取 2g臵具塞锥形瓶中，精密加氯仿 20ml与浓氨试液 1ml，轻轻摇匀，称重，于室温下放臵 24小时，再称重，补足氯仿减失的重量，充分振摇，滤过。精密
77
量取滤液 10ml，用硫酸溶液（ 3→300 ）分次提取，
至生物碱提尽，合并硫酸液，臵另一分液漏斗中，
加浓氨试液使呈碱性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，残渣中精密加氯仿 5ml使溶解，
作为供试品溶液。
对照品溶液的制备 取士的宁对照品，加氯仿制成每 1ml含 0.4mg的溶液，作为对照品溶液。
78
测定法 吸取上述两种溶液各 5μ l,分别 点于同一硅胶 GF254薄层板上，以甲苯 -丙酮 -乙醇 -浓氨试液。
（ 16∶12∶1∶4 ）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长,λ s=
254nm,λ R= 325nm,测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。已知,AR＝
19663.07,As＝ 20617.25,取样量 2.098g。
解答问题,①采用外标一点法还是外标两点法？
②采用什么方法显色定位？③计算每包药品中马钱子的含量。（保留两位有效数字）
79
① 求出供试品斑点中士的宁的质量
②求出供试品中士的宁的含量含量（ mg/包） = Ms X 稀释倍数 X 标示重量取样量
= 0.0021mg X 5ml X 20ml X 2.5g/包0.005ml X 10ml X 2.098g
= 5.0（ mg/包 ）
Ms = MR X = 5 μl x 0.4 μg/ μl x = 2.1μgAsA
R 19663.07
20617.25
80
实例 枳实导滞丸中橙皮苷的含量测定本品系由 枳实,大黄和黄连等八味药材制成的水丸。中国药典规定按干燥品计算，每 1g含枳实以橙皮苷（ C28H34O15） 计，不得少于 20.0mg。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约
0.5g，精密称定（ 0.5124g），臵索氏提取器中，加甲醇 90ml，加热回流 4小时，趁热滤过至 100ml 量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗液与滤液合并，放冷，
加甲醇至刻度，摇匀，精密量取 5ml,臵 250ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
81
对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品，加甲醇制成每 1ml 含 0.05mg的溶液，作为对照品溶液。
测定法 精密吸取供试品溶液 5μ l、对照品溶液
2μ l与 5μ l,分别点于同一 聚酰胺薄膜 上，以甲醇为展开剂，展开，展距约 3cm,取出，晾干，喷以
1％三氯化铝的甲醇溶液，放臵 3 小时，在 紫外光灯
(365nm) 下定位。 上机进行 荧光 扫描，激发波长：
330nm,线性 扫描，测量供试品与对照品荧光强度的积分值 ［ AR(2μ l) = 885.7,AR (5μ l) = 979.4
AS = 835.6］，计算，即得。
82
★ ① 聚酰胺 TLC分离黄酮类成分效果较好故选之。
②橙皮苷与 AlCl3反应显色，在 330nm紫外光下发射较强的 绿色荧光 （波长,500nm）。
★ 回答问题,①本法采用的是吸收测定法还是荧光测定法？外标一点法还是外标两点法？透射法还是反射法？直线扫描还是锯齿扫描？光源是什么？
②求算枳实（橙皮苷）的含量（保留三位有效数字），并判断是否符合药典规定。
83
★ 含量计算
① 求算出斑点中橙皮苷的质量？
)1098.1(0198.0
/05.02/05.0
)7.8854.979(
)7.8856.835)(25(
)(
))((
5
1
12
112
mgg
mlmglmlmg
ll
CVC
AA
AAVV
M
s
84
② 求算出枳实（橙皮苷）在药品中的含量
6.38
5 1 2 4.01055
100.1105.21098.1
)/
3
555
gll
llmg
M
mlmg
S
－
＝
取样量稀释倍数含量（
85
四、气相色谱法工作原理 加热分析样品使其气化，由载气带入色谱柱，由于各组分在固定相与载气间 分配系数不同,
故在色谱柱中 移动速度不同,经一段时间后彼此得到分离，再依次被载气带入检测器，将各组分的浓度或质量转换成电信号并记录成色谱图，根据色谱图的 峰高或峰面积 而进行定量分析。
系统适应性试验：
理论塔板数、分离度、拖尾因子、重复性
86
脑力清丸中冰片的含量测定色谱条件及系统适用性试验,以聚乙二醇（ PEG） -20M为固定相，涂布浓度为 10%；柱温为 120℃,理论板数按龙脑峰计算应不低于 1900，龙脑峰与内标物质峰的分离度应大于 2。
校正因子测定,取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙醇制成每
1ml含 0.13mg的溶液，作为内标溶液。另取龙脑对照品 8mg，精密称定，臵 100ml量瓶中，加内标溶液使溶解，并稀释至刻度，
摇匀，精密吸取 2μl，注入气相色谱仪，计算校正因子。
测定法,取本品 30丸，研细，取约 1g，精密称定，臵具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液 25mL，密塞，称定重量，超声处理
（功率 250W，频率 50KHz） 30分钟，放冷，再称定重量，用内标溶液补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。吸取
2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。
本品每丸含冰片以龙脑（ C10H18O）计，不得少于 0.22mg。
87
实验条件的选择
1、固定相的选择,大多采用高分子多孔微球
(GDX)，用于分离水及含羟基 (醇 )化合物。
2、柱温的选择,P82
3、载气的选择,N2,H2是最常用的载气，流速为 20～ 80ml／
min。
4、气化室 (进样口 )温度,高于柱温 30～ 50℃
5、检测室温度,高于柱温 30℃ 左右或等于气化室温度
6、进样量,尽量减少进样量
7、检测器,氢焰离子化检测器 (FID)
88
测定法
1、内标法加校正因子求算校正因子
%/
%/
/
/
RR
SS
SS
RR
s
R
CA
CA
AW
AW
f
ff
待测组分含量测定 %% SsXX CAAfC
2、外标法
R
XRX
A
ACC
3、面积归一化法 %100%
i
ii
A
AC
4、标准溶液加入法
89
实例 十滴水软胶囊中樟脑含量的测定本品由樟脑、干姜、大黄、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中药制成,樟脑 是其主成分之一，具升华性，故采用气相色谱法，以樟脑为对照品，薄荷脑为内标物，对其进行含量测定。
1.色谱条件与系统适用性试验 以聚乙二醇（ PEG-20M）
为固定相，涂布浓度为 10%，柱温 150℃ 。理论塔板数按樟脑峰计算应不低于 2000，樟脑峰与内标物质峰的分离度应大于
2。
2.校正因子测定 精密称取樟脑对照品（ R） 50mg，臵
10ml量瓶中，精密加入薄荷脑内标物 (S)50mg,加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取 1～ 2μl,注入气相色谱仪，
AR=211948,As=215835，计算校正因子。
90
3.测定法 取本品内容物，混匀，取 0.8g，精密称定
（ 0.7956g），臵具塞试管中，用无水乙醇提取 5次，每次 4ml，
分取乙醇提取液，合并，转移至 25ml量瓶中，精密加入薄荷脑
125mg，使溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液 (i＋ s)。精密量取 1～ 2μl,注入气相色谱仪测定,Ai＝
108685,As＝ 123544，计算即得（保留两位有效数字 )。
★ 解答问题 ①本法属于气液分配 GC还是气固吸附 GC？ ②使用哪种载气？哪种检测器？ ③采用的是外标 -校正因子法还是内标 -校正因子法？ ④求算樟脑的含量。药典规定，本品每粒含樟脑不得少于 53mg。（平均粒重 0.425g／粒 ）
91
★ 求算校正因子 （ f）（保留四位有效数字 )
mlmgmlmgCAAfC s
s
i
i /87.4/51 2 3 5 4 4
1 0 8 6 8 51 0 8.1
★ 求算药品中樟脑的含量 （ mg／粒）
粒）粒含量＝ /(656.795 /42525/87.4 mgmg mgmlmlmg
★ 求算供试液中樟脑的浓度 Ci（ mg/ml）
108.1
)/5/(2 1 1 9 4 8
)/5/(2 1 5 8 3 5
)/(
)/(
mlmg
mlmg
CA
CAf
RR
ss
92
五,HPLC法 特别适合分析 组分复杂、含量较低 的样品，
在中药和中成药的检验中得到广泛的应用。
历版中国药典（一部）中 HPLC应用情况
0
200
400
600
800
1000
1200
1 9 9 5 年版 2 0 0 0 年版 2 0 0 5 年版应用品种数总品种数
916 992 1146
518
105
12
93
特点：
分离效能高、分析速度快及应用范围广适用于测定 挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型化合物，如蛋白质、氨基酸、生物碱、甾体、类脂、核酸、维生素及无机盐类。
94
色谱柱的选择,多选用 C18柱流动相的选择,
优级纯或光谱纯，脱气，过滤（ 0.45μm ）；
部分含水溶剂：
适用于分离中等极性、弱极性药物；
非水溶剂,分离疏水性物质缓冲溶液,适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质、肽及弱酸弱碱类化合物。
洗脱方式,等度洗脱与梯度洗脱检测器,UVD,FD,ELSD,DVD
95
操作注意事项
1.流动相需用微孔滤膜（ 0.45μm ） 滤过并脱气 才可使用。
2.开泵后，先打开 冲洗键（ PURGE） 进行泵排气。然后将流动相接入色谱柱充分冲洗平衡，待基线稳定后方可进样。
3.测试溶液需用微孔滤膜（ 0.45μm ）滤过。
4.使用键合硅胶柱，流动相的 pH值应控制在 2～ 8，否则色谱柱很容易损坏。
5.由于 C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于使用
C18柱的反相色谱系统，流动相中 有机溶剂的比例 通常应 不低于
5％。 否则 C18链的随机卷曲将导致组分保留值的改变，造成色谱系统的不稳定。
6.工作完毕，应先后用 水 和 甲醇 充分冲洗液路系统，尤其是使用了含盐的流动相，更应充分冲洗。
96
HPLC在药检中的一般步骤测试溶液制备 系统适应性试验数据处理 样品测定结果判断
97
（一）测试溶液的制备按各品种项下规定制备 对照品溶液 和供试品溶液。操作应严格规范,定量取样、提取、纯化、转移和稀释，避免
,跑、冒、滴、漏,。
（二）系统适应性试验
▲ 采用药品标准规定的对照品和条件对色谱系统进行试验考查，包括色谱柱的 理论板数,分离度,重复性 和 拖尾因子等四项指标。其中分离度和重复性更具实用意义。
▲ 用于药品检验的色谱系统，应符合药典对系统适应性试验的规定。否则应对色谱条件作出适当的调整，使其达到有关规定。
98
▲ 各品种项下规定的条件除 固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变 外，其余如 色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、
柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变,以达到系统适用性试验的规定。
99
1.色谱柱的理论板数（ n） 考察柱效
n值越大柱效越高
2R )
W
t5,5 4 (n
21
tR 保留时间
Wh/2 半高峰宽
★ 牛黄解毒片中黄芩的含量测定 理论塔板数按 黄芩苷峰 计算应不低于 3000。
★ 藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定理论板数按 厚朴酚峰 计算应不低于 5000。
100
2.分离度（ R） 考察分离效果
R值越大分离效果越好在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算 待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度 。除另有规定外，应 大于 1.5。
21
)(2
12
WW
tt
R RR
101
3.重复性 考察测量的精密度在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样 3～ 5次，
除另有规定外，其 峰面积 测量值的 相对标准偏差（ RSD） 应不大于 2.0％。
RSD计算公式
102
份号 1 2 3 4 5
A 20617.25 19663.07 19543.30 20412.41 19254.30
例取某对照品溶液 10μ l，连续进样 5次，记录各次色谱峰峰面积如下，试判断色谱系统重复性是否符合规定。
=19898.1
S=586.789
RSD=2.9% 不符合规定
X
103
4.拖尾因子（ T） 考察色谱峰的对称性
T 值越 接近于 1.0 色谱峰的 对称性越好,测量的 准确度越高 。
采用峰高法测量时，应检查待测峰的 T是否符合规定。除另有规定外,T应在 0.95～ 1.05之间。
1
05.0
2 d
W
T h?
W0.05h为 0.05峰高处的峰宽
d1为峰极大至峰前沿之间的距离
104
（三）上机测定按规定分别精密吸取一定量的对照液和供试液，注入色谱仪测定，记录色谱图和有关数据。
（四）数据处理和结果判断
（ 1） 利用 保留时间（ tR） 进行 定性 鉴别
（ 2） 利用 峰高（面积） 进行 含量 测定
（ 3）利用 特征峰 的 相对保留时间 和 峰面积比值 图谱鉴定等参数对药品进行 指纹图谱鉴定
105
实例 藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定本品由苍术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷等十味中药制成的液体制剂，每支装 10ml（标示装量） 。
其中厚朴为要药之一，故,中国药典,采用 HPLC，
以厚朴酚及和厚朴酚的 总量 为指标，控制厚朴的含量。
（ 1）色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇 -乙腈 -水（ 50:20:40）为流动相；检测波长 294nm。理论板数按厚朴酚峰计算应不低于 5000。
106
107
（ 2）对照品溶液的制备取厚朴酚对照品适量，用甲醇溶解，制成对照品溶液（ 0.2mg/ml）。
取和厚朴酚对照品适量，用甲醇溶解，制成对照品溶（ 0.1mg/ml）。
108
（ 3）供试品溶液的制备样品 5ml
供试液加盐酸 2滴氯仿振摇提取（ 10ml〓 3）
氯仿蒸干甲醇溶解精密稀释至 10ml
甲醇液精密吸取 5ml，臵 10ml量瓶中，加乙醇臵刻度摇匀
109
（ 4）测定法精密吸取上述三种溶液各 10μl,分别注入液相色谱仪测定，根据对照品的峰面积（ AR厚,AR和）
以及供试品中被测成分的峰面积（ AS厚,AS和）计算厚朴的含量。本品每支含厚朴以厚朴酚
（ C18H18O2 ）及和厚朴酚（ C18H18O2）的 总量 计,不得少于 5.8mg。
110
对照品色谱图供试品色谱图
111
【 含量计算 】
① 分别求算供试液中厚朴酚、和厚朴酚的浓度（ mg/ml）
对供对供 A
A
CC
C对 为厚朴酚或和厚朴酚对照溶液的浓度；
A供 为供试品中厚朴酚或和厚朴酚的峰面积；
A对 为对照品厚朴酚或和厚朴酚的峰面积。
112
② 分别求算药品中厚朴酚、和厚朴酚的含量（ mg/支）
含量 厚 （ mg/支） ＝ C供厚 （ mg/ml） × 10ml × 10ml× 标示装量（ ml/支）
5ml × 5ml （ 取样量）
含量 和 （ mg/支） ＝
C供和 （ mg/ml） × 10ml × 10ml× 标示装量（ ml/支）
5ml × 5ml （ 取样量）
③ 求算厚朴酚与和厚朴酚的总量含量 厚 （ mg/支） +总量（ mg/支） ＝ 含量 和 （ mg/支）
113
六、荧光分析法基本原理 处于单重基态的分子吸收了光子的能量后，跃迁到单重激发态，其寿命约 10-6～ 10-9秒，可以直接发射共振荧光，也可以通过去活化机理先回到能级较低的低振动态，
然后再发射出剩下的能量而回至基态。
适用于,胺类、甾体、蛋白质、氨基酸、酶测定方法,直接荧光法、制备荧光法、化学引导荧光法、
荧光淬灭法、胶束增敏荧光法优缺点,灵敏度高（ 10-10～ 10-12g/ml），选择性好，干扰因素多，应用范围有限。
114
七、原子吸收分光光度法原子光谱法,测量自由原子对特征谱线的吸收程度或发射强度，推测样品的元素组成和含量。
特点：
(1) 检出限低,10-10～ 10-14 g；
(2) 准确度高,1%～ 5%；
(3) 选择性高，一般情况下共存元素不干扰；
(4) 应用广，可测定 70多个元素（各种样品中）；
局限性：
难熔元素、非金属元素测定困难、不能同时多元素
115END
第四章 中药制剂的含量分析湖南中医药大学赵碧清
2
牛黄解毒片中黄芩苷的含量测定 (HPLC）
色谱条件与系统适用性试验,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇 -水 -磷酸（ 45:55:0.2)为流动相；检测波长为
315nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于 3000。
对照品溶液的制备,取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1mL含 30μ g的溶液，即得。
供试品溶液的制备,取本品 20片（包衣片除去包衣），精密称定，研细，取 0.6g，精密称定，臵锥形瓶中，加 70％乙醇
30ml,超声处理 （功率 250W，频率 33KHz） 20min，放冷，滤过，滤液臵 100mL量瓶中，用少量 70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加 70％乙醇至刻度，摇匀；精密量取 2ml，臵 10ml量瓶中，加 70％乙醇至刻度，摇匀，即得。
3
测定法,分别精密吸取对照品溶液 5μ l与供试品溶液 10μ l，注入 液相色谱仪,测定，即得。
本品每片含黄芩以黄芩苷计，小片不得少于
3.0mg，大片不得少于 4.5mg
4
含量测定的目的与意义反映其制剂中 有效成分 或者 毒性成分 的含量。
衡量其制剂工艺的 稳定性 和中药材的 质量优劣,确保中药制剂临床用药 安全,有效 和中药制剂进入国际市场的需要，必需用含量测定来控制中药制剂的质量。
5
,中国药典,（ 2005版）中牛黄清心丸、大黄清胃丸等均无含量测定方法。
6
1977
1985
1990
1995
2000
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
1977
1985
1990
1995
2000
2005
药典中中药及其制剂的含量测定所占比例
1977 1985 1990 1995 2000 2005
1.48% 5.31% 8.73% 12.81% 29.04% 63.26%
含量测定的发展：
7
第一节 含量测定样品的处理样品处理的主要作用：
释放被测组分，制成稳定试样；除去杂质，纯化；浓缩；试样形式符合测定的要求。
一、样品的粉碎目的 取样均匀，提取完全粉碎设备 粉碎机、研钵、匀浆机
※ 粒度大小合适
※ 防止污染或损失
8
二、样品的提取关键 提取完全
1、溶剂的选择水、酸水、碱水；
亲水性 的有机溶剂：
乙醇（酒精）、甲醇、丙酮；
亲脂性 的有机溶剂：
石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷
9
2、冷浸法部分测定法：不适于挥发性较大的提取溶剂；
全部测定法（总量测定法）
优点,操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少缺点,费时（ 12-24 h）、费溶剂（ 10-50倍）
10
灵宝护心丹（牛黄、麝香等）中胆酸的含量测定取本品适量，研细，取约 0.5g，精密称定，
臵具塞锥形瓶中，加 石油醚 （ 60-90℃ ） 4ml，浸泡 1小时，滤过，滤渣及滤纸挥去溶剂，放回锥形瓶中，精密加入冰醋酸无水乙醇溶液（ 1 →
10） 15ml，摇匀，密塞，称定重量，浸泡 12小时，
再称定重量，用冰醋酸无水乙醇溶液（ 1 → 10 ）
补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
11
3、回流提取法万应胶囊（黄连等）中盐酸小檗碱测定
+ HCl-70%乙醇溶液，加热回流 1h
4、连续回流提取法保和丸（陈皮等）中橙皮甙测定
+ 甲醇，加热回流至提取液无色为止
12
索氏提取器 是利用溶剂的 回流 和 虹吸 原理,对固体混合物中所需成分进行连续 提取。当提取筒中回流下的溶剂的液面超过索氏提取器的虹吸管时,提取筒中的溶剂流回圆底烧瓶内,即发生虹吸,随温度升高,再次回流开始,每次虹吸前,固体物质都能被纯的热溶剂所萃取,溶剂反复利用,缩短了提取时间,所以萃取效率较高。
13
5、超声提取法原理,超声波的助溶作用优点,操作简便，提取速度快
※ 需对超声频率、提取时间、溶媒等进行考察
※ 超声波可能引起供试品成分的改变保济丸（厚扑等）中厚扑酚测定
+ 石油醚（ 30-60℃ ），超声处理（功率 500W，频率 33kHz） 2次，每次 30min
14
6、超临界流体提取法（ SFE）
超临界流体 —— 特殊的物质状态密度 ～ 液体 → 溶解能力强粘度 ～ 气体 → 传质快，有利于待测组分的扩散表面张力 几乎为 0 → 浸润性能好密度受 压力,温度 的影响大 → 改变对溶质的溶解能力加入甲醇、氯仿、苯等改变 极性 → 提取不同极性的成分优点,速度快、萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、
节省溶剂、易于自动化，而且可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光谱等分析仪器直接联用 。
15
三、样品的分离纯化
1、沉淀法某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液达到精制的目的。
蛇胆糖浆口服液含有大量糖，可用无水乙醇回流样品，冷后过滤，除糖以消除其干扰。
复方益母草口服液中水苏碱的含量测定利用雷氏盐（硫氰酸铬铵）作沉淀剂，在酸性介质中可与大部分有机碱生成难溶于水的配合物与其它杂质分离。
16
2、蒸馏法适用于具挥发性的待测组分，如挥发油、小分子的生物碱、丹皮酚等。
最常用 水蒸气 蒸馏法：
共水 蒸馏法通水蒸气 蒸馏法水上 蒸馏法利用 盐析 作用，提高蒸馏效果
17
3、液 -液萃取法
(1)直接萃取法萃取剂 的选择亲脂性有机溶剂，如氯仿或乙醚弱亲脂性的溶剂，如乙酸乙酯、正丁醇等原则,多次 萃取（ 3-4次）；
调整水相 酸度,提取有机酸、有机碱；
利用 盐析 作用，提高提取率。
18
（ 2）离子对萃取法在适当的 pH介质 中，某些有机酸 (碱 )性物质形成的离子与带 相反电荷 的离子 (也称离子对试剂 )定量地结合成为弱极性的 离子对,而易溶于有机溶剂，
使之萃取分离。适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取 (不能用直接法萃取 )，在中药制剂分析中主要用于生物碱 (B)的分析 。
BH+（水相） + In-(水相 ) BH+·In-（水相） BH+·In-
（有机相）
19
适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取
※ 水相酸度的控制
※ 离子对试剂的选择
20
4、色谱法
4.1色谱法（层析法）
分离的原理：
吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱按操作方式,柱色谱、薄层色谱、纸色谱装柱方法,湿法装柱、干法装柱微柱色谱（固相萃取）：
柱的大小：长 5～ 15cm，内径 0.5～ 1cm
柱填料,硅胶、氧化铝、氧化镁、活性炭、聚酰胺、
大孔树脂、硅藻土、离子交换树脂,C8,C18等
21
4.2色谱法（层析法）
硅胶,酸性吸附剂,适用于中性或酸性成分的层析，
强烈保留碱性化合物。洗脱顺序：极性小 → 大氧化铝,带有碱性，分离一些碱性中草药成分，不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。
中性氧化铝、酸性氧化铝,适用于酸性成分的分离键合相硅胶（ C18或 ODS）,分开脂溶性和水溶性成分操作程序：
①柱的活化；②上样；③清洗；④洗脱。
洗脱顺序,极性大 → 小
22
大孔树脂分为极性（丙烯酰胺聚合物 ）和非极性（苯乙烯和二乙烯苯的共聚物）型非极性型（ XAD-2等）：分开脂溶性和水溶性成分
※ 使用前需要用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗聚酰胺：
与溶质形成 氢键 而产生吸附作用，常用于含酚、
酸、醌类药物样品液的净化分离
23
硅藻土、纤维素：
以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相的分配色谱洗脱顺序：极性小 → 大离子交换树脂：
用于除去样品中的离子及萃取可离解化合物
(弱 酸、弱碱药物 )。
24
5、消化法 测定中药制剂中的无机元素湿法消化硝酸 -高氯酸法,适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏
※ 对含氮杂环类有机物破坏不够完全硝酸 -硫酸法本法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。
※ 与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，
不宜采用此法。
25
硫酸 -硫酸盐法：
本法是往样品中加入 浓硫酸 作氧化剂，加入 硫酸盐 提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，
且防止硫酸的分解损失。
常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。
注意事项：
1、所用仪器 凯氏烧瓶
2、空白试验
3、通风橱中进行
26
干法消化供试品 灰分灼烧灰化
(+NaCO3/MgO)
※ 控制温度在 420℃ 以下
※ 不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等 )有机样品的破坏。
27
目的：
证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。
测定方法的效能指标精密度、准确度、专属性、
检测限、定量限、线性与范围、耐用性等第二节 含量测定方法的验证
28
适用范围：
1,建立中药质量标准时，分析方法需经验证。
2,处方、工艺变更或改变原分析方法时，
分析方法需经验证。
29
需验证的分析项目：
鉴别试验,限量检查 和 含量测定 ；以及其它 需控制成分 （如残留物、添加剂等）的测定。中药制剂溶出度,释放度 等检查中，其溶出量等检测方法也应做必要验证。
30
验证内容 (8项 )
准确度、
精密度（重复性、中间精密度和重现性）、
专属性、
检测限、定量限、
线性、范围耐用性
31
一,准确度（ accuracy）
准确度是指用该方法测定的 结果 与 真实值 或参考值接近的程度，用 百分回收率 表示。
测定回收率 R（ recovery）的具体方法可采用加样回收试验法。
已准确测定药物含量 P的真实样品 +已知量 A的对照品（或标准品）测定，测定值为 M
%1 0 0
A
PMR
32
数据要求,
在规定的范围内，取 同一浓度 的供试品，用 6个 测定结果进行评价；或设计 3个不同浓度,每个浓度各分别制备 3份供试品溶液 进行测定，用 9个测定 结果进行评价。一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在 1:1左右。应报告供试品 取样量,供试品中 含有量,对照品 加入量,测定结果 和 回收率 （％）计算值，以及回收率的 相对标准偏差 （ RSD%）或可信限。
33
二、精密度（ precision）
是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（ d）、标准偏差 (SD)、相对标准偏差 (RSD)（变异系数,CV）
表示。
34
1、重复性在相同操作条件下，由 同一个分析人员 在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度；
在规定的范围内，取 同一浓度 的供试品，用 6个测定结果进行评价。或设计 3个不同 浓度，每个浓度各分别制备 3份 供试品溶液进行测定，用 9个 测定结果进行评价。
35
2、中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度；
为考察随机变动因素对精密度的影响，应进行中间精密度试验，变动因素为不同 日期,不同 分析人员,不同 设备 等。
36
3、重现性不同实验室,不同分析人员 测定结果的精密度；
如建立药典方法时 分析通过不同实验室的复核检验得出重现性结果。复核检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中。
应注意重现性试验用样品本身的质量均匀性和储存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。
37
三、专属性指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。
常用阴性对照法四、线性在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。
38
五、范围指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，
测试方法适用的高低限浓度或量的区间。
六、耐用性指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。
39
检测限（ LOD）
系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。常用 %,ppm,ppb表示。一般信噪比为 S/N=3或 2
定量限（ LOQ）
指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用 %,ppm,ppb表示。 一般信噪比为 S/N=10
40
应用
1,鉴别试验 除专属性、耐用性外，其它都不要求。
2,杂质 的 限量检查 除专属性、检测限、耐用性外，
其它都不要求。杂质的 定量测定 除检测限外，其它都要求。
3,含量测定及溶出量 测定除检测限、定量限外，其它都要求。
41
一、化学分析法适用于 含量较高 的成分及 无机成分 的测定包括,重量分析和滴定分析重量分析：
挥发法：如水分测定萃取法：如冰片散中冰片的含量测定沉淀法：如苦参片中苦参总碱的含量测定第三节 常用定量分析方法滴定分析
42
地奥心血康胶囊的含量测定取本品装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于甾体总皂苷元 0.12g），臵 150ml圆底烧瓶中，
加硫酸 40%乙醇溶液（取 60ml硫酸，缓缓注入适量的 40%乙醇溶液中，放冷，加 40%乙醇溶液至 1000ml，摇匀） 50ml，臵沸水浴中回流 5小时，放冷，加水 100ml，摇匀，用 105℃ 干燥至恒重的 4号垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀用水洗涤至滤液不显酸性,105℃ 干燥至恒重，计算，即得。
本品每粒含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，不得少于 35mg。
43
止咳灵注射液中总生物碱的含量测定精密量取本品 10mL,臵分液漏斗中，加 1mol/LNaOH溶液
0.5ml，用三氯甲烷提取 4次（ 10ml,10ml,5ml,5ml，合并三氯甲烷溶液，臵具塞锥形瓶中，精密加入硫酸滴定液
（ 0.01mol/L)10ml及新沸过的冷水 10ml，充分振摇，加茜素磺酸钠指示液 1～ 2滴，用 NaOH滴定液（ 0.02mol/L)滴定至淡红色，并将滴定结果用空白试验校正，每 1ml硫酸滴定液
（ 0.01mol/L）相当于 3.305mg的麻黄碱（ C10H15NO)。
本品每 1ml含总生物碱以麻黄碱（ C10H15NO)计，应为
0.50～ 0.80mg。
44
★ 定义 根据被测物质在紫外 -可见光的特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性定量分析的方法称紫外 -可见分光光法。
二、紫外－可见分光光度法
★ 特点 本法操作简便，灵敏度高，常用于中成药含测。但本法不具分离功能，常用于 总成分 的测定。
★ 定量依据 Beer-Lambert定律。测定单一物质时，先测定其吸收光谱，然后选择最大吸收峰的波长?max进行定量分析。
一个物质若有几个吸收峰时，可选择吸收峰较高，在此吸收峰处吸光度随波长变化较小，并且其它物质无吸收的波长作为定量条件。
一般不选择光谱最左边的末端吸收峰作定量测定的波长。
45
灯草细辛注射液中总咖啡酸酯的含量测定对照品溶液的制备,取 1,5-氧 -二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，加 0.1mol碳酸氢钠溶液制成每
1mL含 10μ g的溶液。
供试品溶液的制备,精密量取本品 1mL,臵 200ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，即得。
测定法,分别取对照溶液与供试品溶液，照紫外 -
可见分光光度法（附录 V A），在 305nm波长处测定吸光度，计算，即得。
本品每 1ml含总 咖啡酸酯以 1,5-氧 -二咖啡酰奎宁酸（ C25H24O12)计，应为 2.0～ 3.0mg。
46
复方皂矾丸中皂矾的含量测定对照品溶液的制备,取硫酸亚铁对照品 0.4g，精密称定，臵
100ml量瓶中，加硫酸溶液（ 1→20 ） 1ml和水 80ml使溶解，加水至刻度，摇匀。精密量取 2ml，臵 100ml量瓶中，加水至刻度，
摇匀，即得（每 1ml中含硫酸亚铁 80μg）（临用前配制）
标准曲线的制备,精密量取对照品溶液 1ml,2ml,4ml,6ml，
8ml，分别臵于 25ml量瓶中，加水至 10ml，再加 1%盐酸羟胺溶液
1ml及 0.2% 2,2-联吡啶乙醇溶液 1ml，混匀，加水至刻度，摇匀；以相应的溶液为空白，照紫外 -可见分光光度法（附录 V
A），在 522nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。
47
测定法,取本品 30丸，精密称定，剪碎，取 2g，精密称定，
臵 50ml量瓶中，加硫酸溶液（ 1→20 ） 5ml和水 200ml，超声处理至全部溶散，加水至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液约
20ml，精密量取续滤液 10ml，臵 100ml量瓶中，加水至刻度，
摇匀，精密量取 5ml，至 25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自,加水至 10ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中硫酸亚铁的 重量,计算，即得。
本品每丸含皂矾以硫酸亚铁（ FeSO4.7H2O)计，不得少于
30.0mg。
48
六味地黄颗粒中牡丹皮的含量测定取装量差异项下的本品约 2g，研细，精密称定，
用水蒸气蒸馏，收集馏出液约 450ml，臵 500ml量瓶中，
加水稀释至刻度，照紫外 -可见分光光度法（附录 V
A），在 274nm波长处测定吸光度，按丹皮酚（ C9H10O3)
的吸收系数（ )为 862计算，即得。
本品每袋含牡丹皮按丹皮酚（ C9H10O3)计，不得少于 6.0mg。
%1cmE
49
★ （单组分测定法）
药典收载了 三种 测定方法
1.吸收系数法 不需对照品。
2.对照品比较法 需用对照品。
3.标准曲线法 需用对照品。
50
1、吸收系数法原理将求得的 C值（供试液浓度）、样品溶液的稀释倍数和取样量或平均片（丸）重代入公式计算，即可求出药品中被测成分的含量。
特点不需 对照品随行测定，操作简便，仅用于紫外分光光度法。故需严格校正仪器，规范实验条件，做好前处理工作。
1%
CLEA cm%11?
51
实例 前列舒丸（水蜜丸）中牡丹皮的含量测定取本品切碎，取 2g，精密称定 （ 2.135g）；用水蒸气蒸馏，收集馏出液约 450ml,臵 500ml量瓶中，加水稀释至刻度，照分光光度法（附录 Ⅴ A ）在 274nm 的波长处测定吸收度 （ A = 0.333）,按丹皮酚（ C9H10O3 ）吸收系数
（ ）为 862 计算，即得。本品含牡丹皮按丹皮酚
(C9H10O3) 计，每 1g不得少于 0.53mg
%11cmE
52
(1)供试液浓度的计算
（ 2）牡丹皮含量计算
0 0 0 3 8 6 3.0)1 0 0/ %1
1
LE
AmlgC
cm
（供
90.0
)100
10 00500)100/)/?
gm
mlmlgCgmg
（
（含量（
供供
53
驻车丸（水丸）中总生物碱的含量测定本品由 黄连,炮姜、当归、阿胶等四味中药制成。
取本品粉末（过三号筛） 2g，精密称定，臵索氏提取器中，
加盐酸 -甲醇 (1:100) 的混合溶液适量，加热回流至回流提取液无色时为止，将提取液（必要时浓缩）移至 50ml量瓶中，加盐酸 -甲醇 (1:100) 的混合溶液至刻度，摇匀。照柱色谱法（附录
Ⅵ C ）试验，精密量取 5ml,臵 中性氧化铝柱 （ 5g，内径 0.9cm,
湿法装柱，用乙醇 30ml预洗）上，用乙醇 25ml分次洗脱，收集洗脱液，臵 50ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，精密量取 2ml
臵 50ml量瓶中，加 0.05mol/L硫酸溶液至刻度，摇匀，照分光光度法（附录 Ⅴ A ），在 345nm 的波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱 (C20H17NO4·HCl)的吸收系数（ ）为 728 计算，即得。
本品按干燥品计算，每 1g含 总生物碱 以盐酸小檗碱
(C20H17NO4·HCl) 计，不得少于 30.0mg。
%11cmE
54
2、对照品比较法原理在相同条件下分别配制供试品溶液和对照品溶液，
在规定波长处测定供试品溶液和对照品溶液的 吸收度后，按下式计算 供试品溶液的浓度,
供试品的含量（ %） =（ C供 〓 D供 ) / W供 〓 100%
式中,C对为供试品溶液浓度； D供为供试品溶液的稀释倍数； W供为供试品取样量。
样标样标
C
C
A
A
55
特点对照品溶液与供试品溶液的浓度应尽可能接近，一般要求对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的 100%〒 10%。
56
实例 黄杨宁片中黄杨宁的含量测定本品为黄杨宁经加工制成的片剂。 每片含 环维黄杨星 D
0.5mg或 1mg。
对照品溶液的制备 精密称取经 105℃ 干燥至恒重的环维黄杨星 D对照品 25mg，臵 250ml量瓶中，加甲醇 70ml使溶解,用
0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，精密量取
10ml，臵 100ml量瓶中，用 0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得 （ 每 1ml含环维黄杨星 D10μ g）。
环维黄杨星 D
57
供试品溶液的制备取本品 20片（每片含环维黄杨星 D0.5mg），精密称定
（ 2.050g），研细，精密称取 0.1020g（约相当于黄杨宁
0.5mg），臵 50ml量瓶中，加 0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至近刻度,80℃ 水浴恒温 1.5小时后取出，冷却至室温,加
0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，离心 6分钟（每分钟转速 3000转），取上清液，即得。
测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液各 5ml,分别臵分液漏斗中，各精密加入 溴麝香草酚蓝溶液 （取溴麝香草酚蓝 18mg，臵
250ml量瓶中，加甲醇 5ml使溶解，加 0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，即得） 5ml，摇匀，立即分别精密
58
加入氯仿 10ml，振摇 2分钟，静臵 1.5小时，分取氯仿层，臵含 0.5g无水硫酸钠的具塞试管中，振摇，静臵，取上清液，
照分光光度法（附录 ⅤA ），在 410nm的波长处分别测定吸收度（ A对 ＝ 0.454,A供 ＝ 0.445），计算，即得。
本品每片含黄杨宁以环维黄杨星 D(C26H46N2O)计，应为标示量的 90.0%～ 110.0％。
（ 1）求算供试液的浓度
（ 2）求算供试品的含量（标示量％）
59
【 注 】 环维黄杨星 D无紫外吸收，故本法采用 酸性染料比色法
= 96.5％
C供 （ mg/ml） × 10-3 × 50ml × 平均片重 （ mg）
取样量（ mg） × 标示量（ mg）
含量 = × 100%
BH+ + In-
BH+ In-生物碱盐阳离子溴麝香草酚蓝阴离子有色络合物
（ 溶于氯仿 λ max 410nm ）
缓冲液 （ pH6.8）
定量生成
C供 （ μ g/ml） =（ A供 /A对 ） C对 = 9.8
60
3、标准曲线法原理配制一系列不同浓度（ Ci）的对照品溶液（ 5～ 7份 ），在相同条件下分别测其吸收度 (Ai)，以 A为纵坐标，浓度 C为横坐标绘制 A-C曲线,即得 标准曲线 （又称工作曲线）。在相同条件下测定供试品的 A,从标准曲线上查出与之对应的 C，即可求出浓度和含量。亦可将一系列对照品溶液的 C与相应的 A进行一元线性回归，求出 回归方程 （相关系数 r≥0.999 ），将供试品溶液的 A代入回归方程，算出被测成分的浓度和含量。
61
特点 本法多用于可见分光光度法，由于影响显色反应的因素较多，有的仪器单色光纯度较差，故测定时应用对照品同时操作。本法适用于批量样品的分析，当仪器和测定条件固定时，曲线可多次使用。
C
A
A-C曲 线
A= a + b C
62
实例 益心酮片总黄酮的含量测定本品为山楂叶经提取总黄酮制成的片剂。
对照品溶液的制备 精密称取经 120℃ 干燥至恒重的芦丁对照品 25mg臵 50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处 理使溶解，
放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取 20ml，臵 50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每 1ml含无水芦丁
0.20mg）。
63
标准曲线的制备 精密量取对照品溶液 1.0 ml,2.0 ml、
3.0 ml,4.0 ml,5.0 ml,6.0 ml，分别臵 25ml量瓶中，
各 加水至 6ml，加 5%亚硝酸钠溶液 1ml，使混匀，放臵 6分钟。
加 10%硝酸铝溶液 1ml，摇匀，放臵 6分钟，加 10%硝酸铝溶液 1ml，摇匀，放臵 6分钟，加氢氧化钠试液 10ml，再加水至刻度，摇匀，放臵 15分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法（中国药典附录 V B），在 500nm为波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
64
测定法 取本品 20片，除去包衣，精密称定 0.2100g，研成细粉，精密称取 0.5315g（约相当于 5片的重量），精密加入稀乙醇 25ml，密塞，摇匀，超声处理 5分钟，静臵 3小时以上，滤过，
精密量取滤液 4ml，臵 50ml量瓶中，用水稀释到刻度，摇匀，
再精密量取 2ml，臵 25ml量瓶中，照标准曲线臵备项下的方法，
自,加水至 6ml”起，依法测定吸收度,A = 0.362，并取同样量的供试品溶液，加水至 25ml作空白。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算每片总黄酮含量（以无水芦丁计）。
,中国药典,规定本品每片含黄酮以无水芦丁（ C27H30O16）计，
不得少于 25.0mg。
① 标准曲线的制备？ ② 计算供试溶液浓度？
③ 计算每片总黄酮含量？
65
份号 1 2 3 4 5 6
C
（ mg/ml）
0.008 0.016 0.024 0.032 0.040 0.048
A 0.102 0.202 0.305 0.406 0.510 0.627
..
.
AA＝ － 0.00045＋ 10.8696C (r＝ 0.9998)
C ＝ 0.092A ＋ 0.0000413
C（ mg/ml） ＝ 0.092× 0.3620＋ 0.0000413＝ 0.03335
C× 25ml× 50ml× 25ml× 0.105g/片
2ml× 4ml× 0.5315g含量 (mg/片 ) = = 25.7
66
计算分光光度法 （有多组分存在时）
等吸收双波长消去法，导数光谱法等仪器与溶剂的要求校正测定波长；杂散光检查；溶剂的检查
67
定义 薄层扫描法（ TLCS）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量分析的方法。
特点 具有分离分析双重功能。与高效液相色谱法比较，具有多通道 效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。目前随着制板、点样、展开等操作的仪器化及仪器性能的改进，该法检测的灵敏度，结果的精密度与准确度均大大提高，在中药及其制剂检验中，已成为重要的分析方法。,中国药典,中有 32个中成药品种采用该法进行含测。
三、薄层扫描法
68
测定方式
（ 1）吸收法 适用于有 紫外（可见） 吸收的成分，
较常用。该法又可采用反射法或透射法测定。理论上讲，透射法比反射法优越，但实际工作中 常用反射法,因为紫外光不能通过玻板。
（ 2）荧光法 适用于有 荧光性质 的成分，例如小檗碱等。该法 仅采用反射法 测定，其灵敏度比吸收法高
69
方法学考察：
1、工作曲线：确定一点还是两点法定量
2、分离度,应大于 1.0
3、重复性,RSD应不大于 3.0％，需显色的应不大于
5.0％
4、准确度,95％～ 105％之间，测量数据为 5 ～ 6个
5、统计检验,F检验与 t检验
70
含量测定方法（外标法）
TLCS含量测定有 外标法 和 内标法,中国药典仅采用 外标法 。
1.原理 外标法系将一定量的供试品溶液和对照品溶液 分别 点加在同一块薄层板上，展开，显色，定位，扫描被测成分和对照品斑点，测得相应的吸收度或荧光强度积分值，根据定量关系，计算出被测成分的含量。
2.类型 根据对照品标准曲线性质的不同，外标法又分为 外标一点法 和 外标两点法 。
若标准曲线通过原点，采用外标一点法。
若标准曲线不通过原点，采用外标两点法。
71
外标一点法的直线方程,C = F A F 为斜率外标两点法的直线方程：
21 FAFC
12
12
1 AA
CCF
12
2112
2 AA
CACAF
、
F1为斜率 F2为截距
72
3.操作步骤
（ 1）对照品溶液的制备
（ 2）供试品溶液的制备
（ 3）点样在薄层板的起始线上，将定量的样品液点成一条状，点样时应避免任何损失。在板的两边，点上对照品作为定位剂，然后，在选好的溶剂中层开，斑点要集中，不应有拖尾现象。
一般要求使用 市售 薄层板。
73
① 外标一点法：
至少 6个原点对照品（ R） 2个 （ 同一质量 ）,2R
供试品（ S） 4个 （ 同一质量 ）分 2组,2S1 2S2
② 外标两点法：
至少 8个原点对照品（ R） 4个 分 2组 大质量 的 2个,2R1
小质量 的 2个,2R2
供试品（ S） 4个（ 同一质量 ）分 2组,2S1 2S2
对照品与供试品应交叉点加在同一块薄层板上，目的在于消除各种误差。测定时应保证供试品原点的量在线性范围内，
必要时可适当 调整 供试品溶液的点样量。
74
外标两点法外标一点法
75
（ 4）展开
（ 5）显色定位 供试品色谱中待测斑点的比移值
（ Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。
（ 6）扫描 应 沿展开方向 扫描，不得横向扫描。
（ 7）含量计算
76
实例 九分散中士的宁的含量测定九分散是由马钱子粉、麻黄、乳香和没药等制成。
马钱子粉中含有士的宁、番木鳖碱等生物碱，具生理活性但也有毒性，故需控制马钱子含量。中国药典规定按干燥品计每包含马钱子以士的宁计应为 4.5～
5.5mg。
供试品溶液的制备 取本品 10包，混合研匀。精密称取 2g臵具塞锥形瓶中，精密加氯仿 20ml与浓氨试液 1ml，轻轻摇匀，称重，于室温下放臵 24小时，再称重，补足氯仿减失的重量，充分振摇，滤过。精密
77
量取滤液 10ml，用硫酸溶液（ 3→300 ）分次提取，
至生物碱提尽，合并硫酸液，臵另一分液漏斗中，
加浓氨试液使呈碱性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，残渣中精密加氯仿 5ml使溶解，
作为供试品溶液。
对照品溶液的制备 取士的宁对照品，加氯仿制成每 1ml含 0.4mg的溶液，作为对照品溶液。
78
测定法 吸取上述两种溶液各 5μ l,分别 点于同一硅胶 GF254薄层板上，以甲苯 -丙酮 -乙醇 -浓氨试液。
（ 16∶12∶1∶4 ）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长,λ s=
254nm,λ R= 325nm,测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。已知,AR＝
19663.07,As＝ 20617.25,取样量 2.098g。
解答问题,①采用外标一点法还是外标两点法？
②采用什么方法显色定位？③计算每包药品中马钱子的含量。（保留两位有效数字）
79
① 求出供试品斑点中士的宁的质量
②求出供试品中士的宁的含量含量（ mg/包） = Ms X 稀释倍数 X 标示重量取样量
= 0.0021mg X 5ml X 20ml X 2.5g/包0.005ml X 10ml X 2.098g
= 5.0（ mg/包 ）
Ms = MR X = 5 μl x 0.4 μg/ μl x = 2.1μgAsA
R 19663.07
20617.25
80
实例 枳实导滞丸中橙皮苷的含量测定本品系由 枳实,大黄和黄连等八味药材制成的水丸。中国药典规定按干燥品计算，每 1g含枳实以橙皮苷（ C28H34O15） 计，不得少于 20.0mg。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约
0.5g，精密称定（ 0.5124g），臵索氏提取器中，加甲醇 90ml，加热回流 4小时，趁热滤过至 100ml 量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗液与滤液合并，放冷，
加甲醇至刻度，摇匀，精密量取 5ml,臵 250ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
81
对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品，加甲醇制成每 1ml 含 0.05mg的溶液，作为对照品溶液。
测定法 精密吸取供试品溶液 5μ l、对照品溶液
2μ l与 5μ l,分别点于同一 聚酰胺薄膜 上，以甲醇为展开剂，展开，展距约 3cm,取出，晾干，喷以
1％三氯化铝的甲醇溶液，放臵 3 小时，在 紫外光灯
(365nm) 下定位。 上机进行 荧光 扫描，激发波长：
330nm,线性 扫描，测量供试品与对照品荧光强度的积分值 ［ AR(2μ l) = 885.7,AR (5μ l) = 979.4
AS = 835.6］，计算，即得。
82
★ ① 聚酰胺 TLC分离黄酮类成分效果较好故选之。
②橙皮苷与 AlCl3反应显色，在 330nm紫外光下发射较强的 绿色荧光 （波长,500nm）。
★ 回答问题,①本法采用的是吸收测定法还是荧光测定法？外标一点法还是外标两点法？透射法还是反射法？直线扫描还是锯齿扫描？光源是什么？
②求算枳实（橙皮苷）的含量（保留三位有效数字），并判断是否符合药典规定。
83
★ 含量计算
① 求算出斑点中橙皮苷的质量？
)1098.1(0198.0
/05.02/05.0
)7.8854.979(
)7.8856.835)(25(
)(
))((
5
1
12
112
mgg
mlmglmlmg
ll
CVC
AA
AAVV
M
s
84
② 求算出枳实（橙皮苷）在药品中的含量
6.38
5 1 2 4.01055
100.1105.21098.1
)/
3
555
gll
llmg
M
mlmg
S
－
＝
取样量稀释倍数含量（
85
四、气相色谱法工作原理 加热分析样品使其气化，由载气带入色谱柱，由于各组分在固定相与载气间 分配系数不同,
故在色谱柱中 移动速度不同,经一段时间后彼此得到分离，再依次被载气带入检测器，将各组分的浓度或质量转换成电信号并记录成色谱图，根据色谱图的 峰高或峰面积 而进行定量分析。
系统适应性试验：
理论塔板数、分离度、拖尾因子、重复性
86
脑力清丸中冰片的含量测定色谱条件及系统适用性试验,以聚乙二醇（ PEG） -20M为固定相，涂布浓度为 10%；柱温为 120℃,理论板数按龙脑峰计算应不低于 1900，龙脑峰与内标物质峰的分离度应大于 2。
校正因子测定,取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙醇制成每
1ml含 0.13mg的溶液，作为内标溶液。另取龙脑对照品 8mg，精密称定，臵 100ml量瓶中，加内标溶液使溶解，并稀释至刻度，
摇匀，精密吸取 2μl，注入气相色谱仪，计算校正因子。
测定法,取本品 30丸，研细，取约 1g，精密称定，臵具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液 25mL，密塞，称定重量，超声处理
（功率 250W，频率 50KHz） 30分钟，放冷，再称定重量，用内标溶液补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。吸取
2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。
本品每丸含冰片以龙脑（ C10H18O）计，不得少于 0.22mg。
87
实验条件的选择
1、固定相的选择,大多采用高分子多孔微球
(GDX)，用于分离水及含羟基 (醇 )化合物。
2、柱温的选择,P82
3、载气的选择,N2,H2是最常用的载气，流速为 20～ 80ml／
min。
4、气化室 (进样口 )温度,高于柱温 30～ 50℃
5、检测室温度,高于柱温 30℃ 左右或等于气化室温度
6、进样量,尽量减少进样量
7、检测器,氢焰离子化检测器 (FID)
88
测定法
1、内标法加校正因子求算校正因子
%/
%/
/
/
RR
SS
SS
RR
s
R
CA
CA
AW
AW
f
ff
待测组分含量测定 %% SsXX CAAfC
2、外标法
R
XRX
A
ACC
3、面积归一化法 %100%
i
ii
A
AC
4、标准溶液加入法
89
实例 十滴水软胶囊中樟脑含量的测定本品由樟脑、干姜、大黄、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中药制成,樟脑 是其主成分之一，具升华性，故采用气相色谱法，以樟脑为对照品，薄荷脑为内标物，对其进行含量测定。
1.色谱条件与系统适用性试验 以聚乙二醇（ PEG-20M）
为固定相，涂布浓度为 10%，柱温 150℃ 。理论塔板数按樟脑峰计算应不低于 2000，樟脑峰与内标物质峰的分离度应大于
2。
2.校正因子测定 精密称取樟脑对照品（ R） 50mg，臵
10ml量瓶中，精密加入薄荷脑内标物 (S)50mg,加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取 1～ 2μl,注入气相色谱仪，
AR=211948,As=215835，计算校正因子。
90
3.测定法 取本品内容物，混匀，取 0.8g，精密称定
（ 0.7956g），臵具塞试管中，用无水乙醇提取 5次，每次 4ml，
分取乙醇提取液，合并，转移至 25ml量瓶中，精密加入薄荷脑
125mg，使溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液 (i＋ s)。精密量取 1～ 2μl,注入气相色谱仪测定,Ai＝
108685,As＝ 123544，计算即得（保留两位有效数字 )。
★ 解答问题 ①本法属于气液分配 GC还是气固吸附 GC？ ②使用哪种载气？哪种检测器？ ③采用的是外标 -校正因子法还是内标 -校正因子法？ ④求算樟脑的含量。药典规定，本品每粒含樟脑不得少于 53mg。（平均粒重 0.425g／粒 ）
91
★ 求算校正因子 （ f）（保留四位有效数字 )
mlmgmlmgCAAfC s
s
i
i /87.4/51 2 3 5 4 4
1 0 8 6 8 51 0 8.1
★ 求算药品中樟脑的含量 （ mg／粒）
粒）粒含量＝ /(656.795 /42525/87.4 mgmg mgmlmlmg
★ 求算供试液中樟脑的浓度 Ci（ mg/ml）
108.1
)/5/(2 1 1 9 4 8
)/5/(2 1 5 8 3 5
)/(
)/(
mlmg
mlmg
CA
CAf
RR
ss
92
五,HPLC法 特别适合分析 组分复杂、含量较低 的样品，
在中药和中成药的检验中得到广泛的应用。
历版中国药典（一部）中 HPLC应用情况
0
200
400
600
800
1000
1200
1 9 9 5 年版 2 0 0 0 年版 2 0 0 5 年版应用品种数总品种数
916 992 1146
518
105
12
93
特点：
分离效能高、分析速度快及应用范围广适用于测定 挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物及离子型化合物，如蛋白质、氨基酸、生物碱、甾体、类脂、核酸、维生素及无机盐类。
94
色谱柱的选择,多选用 C18柱流动相的选择,
优级纯或光谱纯，脱气，过滤（ 0.45μm ）；
部分含水溶剂：
适用于分离中等极性、弱极性药物；
非水溶剂,分离疏水性物质缓冲溶液,适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质、肽及弱酸弱碱类化合物。
洗脱方式,等度洗脱与梯度洗脱检测器,UVD,FD,ELSD,DVD
95
操作注意事项
1.流动相需用微孔滤膜（ 0.45μm ） 滤过并脱气 才可使用。
2.开泵后，先打开 冲洗键（ PURGE） 进行泵排气。然后将流动相接入色谱柱充分冲洗平衡，待基线稳定后方可进样。
3.测试溶液需用微孔滤膜（ 0.45μm ）滤过。
4.使用键合硅胶柱，流动相的 pH值应控制在 2～ 8，否则色谱柱很容易损坏。
5.由于 C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于使用
C18柱的反相色谱系统，流动相中 有机溶剂的比例 通常应 不低于
5％。 否则 C18链的随机卷曲将导致组分保留值的改变，造成色谱系统的不稳定。
6.工作完毕，应先后用 水 和 甲醇 充分冲洗液路系统，尤其是使用了含盐的流动相，更应充分冲洗。
96
HPLC在药检中的一般步骤测试溶液制备 系统适应性试验数据处理 样品测定结果判断
97
（一）测试溶液的制备按各品种项下规定制备 对照品溶液 和供试品溶液。操作应严格规范,定量取样、提取、纯化、转移和稀释，避免
,跑、冒、滴、漏,。
（二）系统适应性试验
▲ 采用药品标准规定的对照品和条件对色谱系统进行试验考查，包括色谱柱的 理论板数,分离度,重复性 和 拖尾因子等四项指标。其中分离度和重复性更具实用意义。
▲ 用于药品检验的色谱系统，应符合药典对系统适应性试验的规定。否则应对色谱条件作出适当的调整，使其达到有关规定。
98
▲ 各品种项下规定的条件除 固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变 外，其余如 色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、
柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变,以达到系统适用性试验的规定。
99
1.色谱柱的理论板数（ n） 考察柱效
n值越大柱效越高
2R )
W
t5,5 4 (n
21
tR 保留时间
Wh/2 半高峰宽
★ 牛黄解毒片中黄芩的含量测定 理论塔板数按 黄芩苷峰 计算应不低于 3000。
★ 藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定理论板数按 厚朴酚峰 计算应不低于 5000。
100
2.分离度（ R） 考察分离效果
R值越大分离效果越好在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算 待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度 。除另有规定外，应 大于 1.5。
21
)(2
12
WW
tt
R RR
101
3.重复性 考察测量的精密度在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样 3～ 5次，
除另有规定外，其 峰面积 测量值的 相对标准偏差（ RSD） 应不大于 2.0％。
RSD计算公式
102
份号 1 2 3 4 5
A 20617.25 19663.07 19543.30 20412.41 19254.30
例取某对照品溶液 10μ l，连续进样 5次，记录各次色谱峰峰面积如下，试判断色谱系统重复性是否符合规定。
=19898.1
S=586.789
RSD=2.9% 不符合规定
X
103
4.拖尾因子（ T） 考察色谱峰的对称性
T 值越 接近于 1.0 色谱峰的 对称性越好,测量的 准确度越高 。
采用峰高法测量时，应检查待测峰的 T是否符合规定。除另有规定外,T应在 0.95～ 1.05之间。
1
05.0
2 d
W
T h?
W0.05h为 0.05峰高处的峰宽
d1为峰极大至峰前沿之间的距离
104
（三）上机测定按规定分别精密吸取一定量的对照液和供试液，注入色谱仪测定，记录色谱图和有关数据。
（四）数据处理和结果判断
（ 1） 利用 保留时间（ tR） 进行 定性 鉴别
（ 2） 利用 峰高（面积） 进行 含量 测定
（ 3）利用 特征峰 的 相对保留时间 和 峰面积比值 图谱鉴定等参数对药品进行 指纹图谱鉴定
105
实例 藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定本品由苍术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷等十味中药制成的液体制剂，每支装 10ml（标示装量） 。
其中厚朴为要药之一，故,中国药典,采用 HPLC，
以厚朴酚及和厚朴酚的 总量 为指标，控制厚朴的含量。
（ 1）色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇 -乙腈 -水（ 50:20:40）为流动相；检测波长 294nm。理论板数按厚朴酚峰计算应不低于 5000。
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（ 2）对照品溶液的制备取厚朴酚对照品适量，用甲醇溶解，制成对照品溶液（ 0.2mg/ml）。
取和厚朴酚对照品适量，用甲醇溶解，制成对照品溶（ 0.1mg/ml）。
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（ 3）供试品溶液的制备样品 5ml
供试液加盐酸 2滴氯仿振摇提取（ 10ml〓 3）
氯仿蒸干甲醇溶解精密稀释至 10ml
甲醇液精密吸取 5ml，臵 10ml量瓶中，加乙醇臵刻度摇匀
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（ 4）测定法精密吸取上述三种溶液各 10μl,分别注入液相色谱仪测定，根据对照品的峰面积（ AR厚,AR和）
以及供试品中被测成分的峰面积（ AS厚,AS和）计算厚朴的含量。本品每支含厚朴以厚朴酚
（ C18H18O2 ）及和厚朴酚（ C18H18O2）的 总量 计,不得少于 5.8mg。
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对照品色谱图供试品色谱图
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【 含量计算 】
① 分别求算供试液中厚朴酚、和厚朴酚的浓度（ mg/ml）
对供对供 A
A
CC
C对 为厚朴酚或和厚朴酚对照溶液的浓度；
A供 为供试品中厚朴酚或和厚朴酚的峰面积；
A对 为对照品厚朴酚或和厚朴酚的峰面积。
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② 分别求算药品中厚朴酚、和厚朴酚的含量（ mg/支）
含量 厚 （ mg/支） ＝ C供厚 （ mg/ml） × 10ml × 10ml× 标示装量（ ml/支）
5ml × 5ml （ 取样量）
含量 和 （ mg/支） ＝
C供和 （ mg/ml） × 10ml × 10ml× 标示装量（ ml/支）
5ml × 5ml （ 取样量）
③ 求算厚朴酚与和厚朴酚的总量含量 厚 （ mg/支） +总量（ mg/支） ＝ 含量 和 （ mg/支）
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六、荧光分析法基本原理 处于单重基态的分子吸收了光子的能量后，跃迁到单重激发态，其寿命约 10-6～ 10-9秒，可以直接发射共振荧光，也可以通过去活化机理先回到能级较低的低振动态，
然后再发射出剩下的能量而回至基态。
适用于,胺类、甾体、蛋白质、氨基酸、酶测定方法,直接荧光法、制备荧光法、化学引导荧光法、
荧光淬灭法、胶束增敏荧光法优缺点,灵敏度高（ 10-10～ 10-12g/ml），选择性好，干扰因素多，应用范围有限。
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七、原子吸收分光光度法原子光谱法,测量自由原子对特征谱线的吸收程度或发射强度，推测样品的元素组成和含量。
特点：
(1) 检出限低,10-10～ 10-14 g；
(2) 准确度高,1%～ 5%；
(3) 选择性高，一般情况下共存元素不干扰；
(4) 应用广，可测定 70多个元素（各种样品中）；
局限性：
难熔元素、非金属元素测定困难、不能同时多元素
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