卡 介 苗讲授内容
卡介苗的研制和使用
卡介苗的临床试验
造成卡介苗保护效力差异的主要因素
卡介苗对控制结核病的作用
分枝杆菌的 DNA转移
分枝杆菌的载体系统
外源基因在 BCG中的表达讲授内容
人型结核杆菌在 BCG的表达
结核杆菌蛋白抗原是新型结核疫苗研制的依据
结核杆菌的分泌型蛋白
结核杆菌短期培养的滤过后蛋白
具有保护作用的结核杆菌分泌蛋白
结核杆菌亚单位疫苗
结核 DNA疫苗一、卡介苗的研制和使用法国科学家 Calmette和 Guerin于 1908年从患结核性乳腺炎的奶牛身上分离到牛型结核杆菌，在含胆汁的土豆甘油液体培养基中作连续传代培养的减毒试验。
他们将细菌每 3个星期传代 1次，在传了 39代以后，结核杆菌的菌落形态已发生了改变。
在传代的过程中，他们不断地测试细菌的毒力，直至经过 230次的传代和 13年持之以恒的工作，终于在 1921
年经动物实验证明这株牛型结核杆菌失去了毒力。更重要的是，如果用这种细菌感染牛、豚鼠、小鼠、恒河猴和猩猩都不能恢复其毒力，而且在 30天以后用牛型或人结核杆菌毒株进行攻击，动物都获得了保护。
这个菌苗被称作为卡介苗 (BCG)。
卡介苗首先于 1921年在法国对 1名新生儿进行试验，在他出生后的第 3天、第 5天和第 7天给予口服卡介苗。这名婴儿的母亲在其出生后不久死于结核病，以后他就和患有结核病的外祖母一起生活。然而由于接种了卡介苗，他一生都没有得结核病。
Calmette在 1927年发表了长达 7年的卡介苗临床试验结果。
他从 1921— 1927年，对 969名儿童口服接种卡介苗，
这些儿童的母亲大多数都患有结核病，或者他们的家庭成员中有人患有结核病。经过长期观察，在这些儿童中的结核病死亡率只有 3,9％，然而在没有接种卡介苗的儿童中的结核病死亡率却高达 32,6％。 1928年以后，
卡介苗在全世界广泛使用。
至今已在 182个国家和地区，对 40多亿的儿童接种了卡介苗。根据 WHO扩大计划免疫的要求，现在每年仍有
1亿多的新生儿接种卡介苗。
卡介苗菌种在早期是通过培养的方法进行传代和保存的。这种方法一直沿用到 20世纪 60年代，结果造成卡介苗菌种之间的差异性极大。表现在：
菌落的形态不同，培养基上活菌数的差异，生化成分和活性、抗药性,对动物和人体的免疫原性以及对动物的 毒力 等都有不同。
1960年以后，冻干技术使得全世界的实验室都可以制备一大批卡介苗的种子，然后用同一批的种子菌苗来生产卡介苗，最多不能超过 4代。这种方法保证了卡介苗的稳定性。
丹麦哥本哈根的国立血清研究所承担了对卡介苗进行国际性质量控制的任务。该所的卡介苗哥本哈根株源于 1931年法国巴斯德研究所的第
423代卡介苗。现在世界上普遍使用的 3个卡介苗菌种分别是：美国格兰素 (Glaxo— 1077)BCG，
它是哥本哈根菌株的第 1 077代培养物；日本东京 (Tokyo— 172)BCG，它来源于法国 1925年的种子 BCG；还有法国巴斯德 (Pasteur—
1173P2)BCG。当今世界上使用的卡介苗中,90
％以上是用这 3种 BCG作为种子来生产的。
卡介苗在早期是通过口服途径免疫的，这种方法在某些地方一直延续到 20世纪 50年代。
在口服卡介苗的 4h以内,Calmette等观察到血液中有卡介苗菌。这意味着疫苗可引起全身反应，并能粘附或进入小肠的 M细胞中去。现在的电镜技术可显示在口服卡介苗的兔子肠道淋巴组织的 M细胞中有卡介苗细菌。然而由于胃酸的作用，口服卡介苗的活菌数往往会减少 1
－ 2个对数值，这样就需要口服很大的剂量而造成卡介苗的安全性问题。
GALT Structure
Initiation of Gut Responses
例如口服大剂量卡介苗和子宫颈淋巴结病的发生高度相关，而且会对婴儿的中耳造成具损伤性的感染。在中止口服的方法以前，对皮下和皮内注射以及皮上划痕的方法进行了比较。
结果表明，皮下注射会引起脓肿；而皮上划痕的方法虽然比皮内注射来得方便和快速，但是需要高浓度的卡介苗，而且难以确定正确的接种剂量。因而皮内接种卡介苗的方法得以广泛使用。
接种卡介苗以后两个星期开始产生结核菌素的阳性反应,6— 12个星期达到高峰。反应的强度和卡介苗的菌种、活菌数以及接种对象的年龄、健康情况和家族基因背景等都有关系。如果接种卡介苗
2— 3个月以后，结核菌素反应仍呈阴性，则需要重新接种。儿童接种卡介苗后的结核菌素阳性反应的皮肤硬结大小在 3— 19mm，并随着时间而消退，
绝大部分的儿童在接种卡介苗 10年以后都转成阴性反应。
结核菌素实验虽然接种卡介苗以后会引起结核菌素的阳性反应，然而临床试验证明这种反应的强度与疫苗对结核感染的免疫保护效果没有关系。由于结核菌素皮肤试验难以区别是由卡介苗还是结核杆菌自然感染引起的反应，对临床的结核病诊断带来困难，因而在一些发达国家，例如美国和荷兰从不对新生儿接种卡介苗。
在这些国家，卡介苗只用于对和结核病人有密切接触的高危险人群，或者对膀胱癌患者进行免疫治疗。
卡介苗的安全性曾在 1930年受到质疑，因为在德国的 Lubeck发生了 72名儿童因为口服卡介苗而患结核病死亡。事故调查证实这些儿童误服了保存在实验室的结核杆菌，并不是卡介苗。至今全世界已有 40多亿人接种过卡介苗，因而这是世界上最安全的疫苗之一。
然而值得注意的是，虽然卡介苗对免疫系统健全的人来说是十分安全的，但是对免疫缺陷者则可以是致命的。例如一个患艾滋病的儿童在接种卡介苗 4个月以后，产生发热、淋巴结炎和腹泻等症状，
结果在淋巴结和脑脊液中分离到了卡介苗菌，其症状经过抗痨治疗后得到了改善。
这对流行艾滋病的发展中国家来说，要特别引起警惕。由于 WHO推行的扩大计划免疫的疫苗包括卡介苗，因而不能给患有艾滋病的儿童接种，因为在接种卡介苗后，有造成全身播散性卡介苗疾病和导致死亡的危险。
二、卡介苗的临床试验卡介苗的临床效力试验进行了数十次，光是随机抽样和设有未接种对照组的大规模临床试验就有 17次。其中 8次试验的结果具有一定的代表性。
根据效力试验的好和差，大体可以分为 3组：
第一组的临床试验有 3次，卡介苗的保护力都在 70％以上。第一次大规模的卡介苗临床试验始于 1935年，对象是北美的 8个印第安人部落中 0— 20岁的结核菌素皮试阴性的儿童和青少年。
卡介苗由美国费城的亨利菲利普研究所生产，
进行了 9— 11年的随访。
试验结果证明，在 1 457名未接种卡介苗的人群中有 238人患了结核病；然而在 1 551名接种了卡介苗的人群中只有 64人患结核病。卡介苗的免疫保护力达到了 75％，结核病的死亡率降低了 82％。
第二次试验是在美国芝加哥的一所医院进行的。从 1937— 1948年，总共有 3 381名婴儿在这所医院出生。
对这些婴儿用美国 Tice公司的卡介苗进行随机免疫并随访了 l2-23年。
结果在 1 665名未接种免疫的儿童中有 59人得了肺结核；然而在 1 716名接种了卡介苗的儿童中，却只有 16人患肺结核。卡介苗的免疫保护力达到 75％。
第三次卡介苗临床试验于 1950---1952年在英国进行。观察对象都是 14— 16岁的在校学生，
其中 1,4万名结核菌素皮试阴性的学生接种了卡介苗，还有 1,33万名学生未接种卡介苗作为对照。
5年以后，卡介苗的免疫保护力达到 84％。
15年以后，在未免疫接种的对照组中有 243
人患肺结核；然而在接种了卡介苗的学生中却只 56人得肺结核，疫苗的保护力是 77％。
第二组的临床试验有 2次，显示了卡介苗中等程度的免疫保护效果。
其中一次是于 1949年在波多黎各进行的。在
1-18岁的观察对象中，有 5,1万人接种了卡介苗，另外 2,7万人作为未免疫接种的对照。经过 19年的随访，结果在未免疫组中有 73名患肺结核，而免疫组中也有 93人患肺结核，卡介苗的免疫保护力只有 29％。
另外一次于 1950---1955年在印度南部进行的卡介苗现场试验中，有 5000名儿童接种了疫苗,6000名儿童作为未接种对照。经过 15年的随访，卡介苗的免疫保护力只有 20％。
第三组的临床试验有 3次，卡介苗的免疫保护效果很差或无效。
一次是于 1947年在美国佐治亚州进行的，对象是 6-17岁的儿童和青少年。 2500名接种了卡介苗,2300名是未接种疫苗对照组。经过 20年的观察，对照组中有 3人患肺结核，而接种疫苗组中却有 5人患肺结核，卡介苗的免疫保护力成了负数。
另外一次试验是于 1950年在佐治亚州和阿拉巴马州进行的，接种疫苗组有 1,7万人，
未接种疫苗的对照组有 1,8万人。经过 14年的观察，前者有 26人患肺结核，后者有 32人得肺结核，卡介苗的免疫保护力只有 6％。
有史以来规模最大的临床试验，由印度医学研究学会、
WHO和美国公共卫生部共同主持。
临床试验于 1968年在印度南部的 Chingleput地区进行，
当地人口一共有 36万，其中 26万人参与了临床试验。出生
1个月以内的婴儿除外，其余的不管年龄或结核菌素皮试反应的结果如何，随机分成 6组。 4组人群分别接种两种不同的冻干卡介苗和两种不同的剂量；另外 2组作为未免疫的对照组。
经过 10年的随访，研究结果于 1979年发表，即两种卡介苗的两种剂量都没有显示出高于未免疫接种对照组的对于肺结核的免疫保护效果。这场世界上最大的卡介苗现场试验不但没有解决问题，反而使得卡介苗的免疫保护力变得更加模棱两可。
为了进一步证实卡介苗的效力，同时避免大规模现场试验费用高、难度大和耗时长的问题，
WHO组织了十几次以病例为参考的临床试验。这些试验都在一些结核病发病率比较高的发展中国家进行，例如，缅甸、印度尼西亚、斯里兰卡、
阿根廷、巴西和卡麦隆等国家。
以前进行的随机取样的大规模现场试验，以结核杆菌感染为参考来计算卡介苗的免疫保护力；
而以病例为参考的临床试验则以患结核病为参考来计算。例如，在缅甸、斯里兰卡和阿根廷的临床试验中，均以住院治疗的结核病人数作参考来统计卡介苗的免疫保护力。
虽然二者的试验和计算方法都不一样，但是试验的结果却大同小异。这十几次试验同样显示了卡介苗对肺结核免疫保护力在不同国家之间的显著差异性，从 2％ — 84％不等。
此外,WHO还在小范围内进行了数次针对与结核病人有密切接触史的儿童进行了卡介苗的免疫保护力临床试验。这些与儿童有密切接触的病人都是经过结核杆菌培养为阳性而确诊的。试验结果证明卡介苗对肺结核的免疫保护力在 53％ — 74％之间。
经过对 10次随机取样的大规模现场试验和 8
次以结核病例为参考的临床试验结果进行综合分析，统计结果表明卡介苗对肺结核的免疫保护力大约在 50％左右。
然而这只是一种理论上的计算统计数字，
实际上如根据全球每年的新发病人数来估计，
卡介苗预防肺结核的作用十分有限。 Styblo等认为只有 10％ — 15％的保护力。
根据人类消灭天花的经验，
疫苗的免疫保护力必须达到 80％
以上才有可能预防这种传染病并进一步加以控制和消灭。因此卡介苗的效果显然不尽如意，研制和开发新的结核病疫苗也就势在必行。
三、造成卡介苗保护效力差异的主要原因用卡介苗来预防肺结核已超过了半个世纪，各种大大小小的临床试验也进行了数十次，然而试验结果显示的卡介苗对肺结核的免疫保护力是 0～ 80％，差异极大。造成这种情况的原因至今仍不清楚，但可能和下述
6个方面的原因有关。
1.非结核分枝杆菌感染人类暴露于环境中的非结核分枝杆菌可以造成对结核菌素的低度敏感性，也就具备了对结核杆菌感染的免疫抵抗力。
这种情况主要发生在热带和亚热带地区，
例如在印度南部地区可以分离到 20多种不同的非结核分枝杆菌；而在欧洲和北美洲，非结核分枝杆菌在环境中比较少。
在美国和印度的南部地区，皮试调查的结果表明这些地区的人群对非结核分枝杆菌的敏感性很高。在 8次大规模随机取样的现场试验中，有 5次试验就是在这些地区进行的，卡介苗对肺结核的免疫保护力很低。
然而另外 3次试验是在英国和美国的北方地区进行的，卡介苗的免疫保护力都在 70％以上。
如果非结核分枝杆菌的感染已经在人体内引起了对结核菌感染的某种程度的免疫力，那么就很难显示出再接种卡介苗以后对预防结核病的显著免疫保护力，因为 BCG和它们有许多共同的抗原，可以拮抗 BCG诱导免疫保护反应。
在非结核菌分枝杆菌中又有不同的菌属，
有的可以增强免疫力，有的却适得其反。例如，
M,vacae可以增强卡介苗的免疫保护力，而
M,scrofulaceum则可以降低卡介苗的效力。
这也许可用以解释为何在阿根廷的两个地区，
卡介苗的免疫保护力仍会有显著的差异。
2.内源性和外源性的结核杆菌感染在发达国家的成年人患结核病往往是来自肺部结核原发灶的结核杆菌复染。而在发展中国家，
由于结核病的发病率高，外源性的结核杆菌感染是造成结核病传播的主要原因。
动物试验证明，卡介苗能有效地防止结核杆菌从肺部的原发灶播散到其他器官，例如肝脏和脾脏。卡介苗的作用可能是减少内源性结核菌的复燃和播散，却不能预防外源性的结核杆菌感染。这样或许可以解释为何卡介苗在发达国家的现场试验结果要比在发展中国家的结果要好。
3.卡介苗的菌株差异在这数十次的临床试验中，使用了 6种不同的卡介苗。只有在印度的 Chingleput使用了冻干的卡介苗，其余的试验用的都是新鲜制备的菌苗。
卡介苗之间不同的免疫原性、活菌数差异和效力有可能造成临床试验的显著差异。
4.结核杆菌的毒力差异卡介苗在动物试验中能有效地保护动物抵抗具强毒的结核杆菌的攻击。然而在印度
Chingleput的临床试验中，从结核病人分离到的结核杆菌对豚鼠的毒力却很低。有学者认为卡介苗可能对这种印度南部结核杆菌的变异菌株没有保护力。
5.人群基因背景的差异动物试验证明，小鼠对卡介苗的免疫反应是由其第 1号染色体上的基因进行调控的；而在人体这种反应则是由第 2号染色体上的基因来调控。因而有可能卡介苗的临床试验在某一种人群中的免疫保护力会比在另一种人群中的要高。虽然试验结果并没有看到这种差异，然而人群基因背景的差异对卡介苗免疫保护力的影响还需要进一步进行研究和观察。
6.现场临床试验方法的差异由于这些临床试验于不同的国家和地区，在不同的研究和组织者的指导之下，经历了 40年
(1935— 1975)的过程，因而在试验方法和质量上的差异对卡介苗效力的影响是容易理解和显而易见的。
这些众多的问题中，最主要的是结核病人的诊断标准不同而造成卡介苗效力的偏差。例如，
在某些发展中国家的临床试验中规定，只有具有结核病临床症状的试验对象才对其进一步拍胸片检查，结果造成卡介苗免疫保护力的偏差。因为不少结核病人有肺部病灶，但在临床上并不一定有症状。
而在英国和美国北方的临床试验中，对所有参加试验的对象都作胸片检查，并且是全肓渎片，
即读片人对其对象的清况一无所知。
综上所述，影响卡介苗临床试验结果的因素是多方面的，但结论是至少卡介苗不是预防肺结核的理想疫苗，
研究和开发新的结核疫苗势在必行，
而以往卡介苗现场试验的各种经验和教训对今后新疫苗的临床试验具有很高价值的借鉴作用 。
四、卡介苗对结核病控制的作用对于绝大多数的传染病来说，如果能研制出一种有效的疫苗，再加上全球性的免疫接种计划能得以有效的执行，那么这种传染病就有可能从地球卜被消灭。例如天花和牛痘苗，以及小儿麻痹症和脊髓灰质炎糖丸，就是两个典型的例子。
很显然，卡介苗并不是预防肺结核的有效疫苗。因为卡介苗的使用已超过了半个世纪，接种过卡介苗的人数也已超过了 40亿，然而至今没有一个国家或地区有消灭结核病的可能性，甚至肺结核的发病率还有回升的趋势。
尽管如此，由于卡介苗对于预防肺结核可能有一定的免疫保护作用，加上其经过长期验证的安全性，以及生产容易和价格低廉等优点,WHO仍然积极推行在发展中国家广泛接种卡介苗的计划。
发展中国家结核病的发病率比较高，快速诊断的条件比较差，化学治疗不彻底，抗药性结核杆菌的流行使得治疗效果不理想，因而对刚出生的婴儿尽早接种卡介苗对于控制结核病还是有一定效果的。实际上肺结核主要发生于成年人；在儿童和青少年中比较少，这和新生儿接种卡介苗的作用是分不开的。
必须强调卡介苗对防止结核杆菌的播散，预防结核性脑膜炎和粟粒性结核等重症结核病的免疫保护力是十分显著和无可置疑的。
在数十次卡介苗的临床试验中，卡介苗对脑膜炎和粟粒性结核的免疫保护力都很好，其保护力在随机取样的大规模现场试验中波动于 65％～
95％之间，平均是 86％；而在以病例为参考的临床试验中波动于 61％～ 84％之间，平均是 75％。
由此可见，卡介苗功不可没，数十年来，它拯救了数百万儿童的生命。
虽然卡介苗对预防肺结核的效果并不肯定，
但仅就预防脑膜炎和粟粒性结核这一点来说，在发展中国家继续推行广泛接种卡介苗的计划也是有其积极意义的。
在发达国家中，结核病的发病率比较低。而卡介苗对肺结核的免疫保护力又不理想，因此倾向于逐步停止对新生儿接种卡介苗：美国的儿童从未接种过卡介苗。
对结核病的控制主要是通过控制结核病传染源和对高危险儿童和成年人定期作结核菌素皮试来进行。
对于皮试阳性的对象用异烟肼进行预防性治疗。
对不能服用异烟肼，又不能避免和活动性结核病人接触的对象，尤其是和具抗药性的结核病人接触，则必须接种卡介苗作为预防措施。
对于和结核病人有密切接触的医护人员，以往并不主张接种卡介苗。然而，近年来发生了多次医院内条件致病菌的爆发流行，其中有些还是具有抗药性的结核杆菌，
美国疾病控制中心 (CDC)已建议对这些医护人员接种卡苗。
对于感染艾滋病毒者，接种卡介苗需要慎重。 1991年，
有学者对 64名由感染了艾滋病病毒的母亲生下的婴儿和
130名健康母亲的新生儿都接种了卡介苗：
经过 40个月的观察，前者有 24％的儿童感染淋巴腺炎，后者也有 18％的感染率，差异不明显。所有的病例全部自愈，没有发生 1例播散性卡介苗感染。
看起来似乎卡介苗对感染艾滋病病毒的儿童也安全。然而也有报道感染艾滋病病毒的儿童在接种卡介苗以后，可以从该儿童的淋巴结和脑脊液中分离到卡介苗菌。
鉴于卡介苗对感染艾滋病病毒者的副作用并不是十分显著，而这种病人感染结核病的危险性又很大,WHO建议可对无症状的感染艾滋病毒者接种卡介苗来预防肺结核；
而不能给有症状的艾滋病患者接种卡介苗。
最近有报道，通过基因突变方法构建的营养缺陷性的
BCG能够保留其在动物试验中的免疫保护效果，却不能在有免疫缺陷的 SCID(severe combined
immunedeficiency)小鼠中增殖。这个试验结果给感染艾滋病毒者，甚至艾滋病人带来了使用安全性 BCG预防结核病的希望。
五、分枝杆菌的 DNA转移长期以来,BCG作为一种疫苗，它的免疫原性和安全性得到了验证，并在理论和实践上提供了研究重组多价疫苗的有利条件。然而因为 BCG生长缓慢,20— 24h才分裂一次，需要 2— 4个星期才能在固体培养基上看到菌落，
再加上由糖脂构成的蜡样细胞壁造成了外源基因的转化和抗生素选择的障碍，使得分子生物学技术在分枝杆菌中的应用远远落后于其他的细菌。
这种状况自 20世纪 90年代才开始得以改善。
用分枝杆菌噬菌体来转移 DNA的方法首先在生长速度比较快的 M,smegmatis获得成功，然而转化的效率比较低，每毫克 DNA只能获得 103-104噬菌斑单位。后来发现了 M.smegmatis高效转化率的突变株，并采用了电击法宋转移基因，使得每毫克 DNA可 M,smegmatisMC2155突变株中获得 106的重组子，而在 BCG中也可获得 105的重组子。这种技术上的革新极大地促进和推动了分枝杆菌的基因和遗传学的研究。
六、分枝杆菌的载体系统虽然分枝杆菌的噬菌体对转移外源基因是最有效的，但是质粒 DNA有其可在大肠杆菌中进行复制、加工、制备和简便易行等优点。天然的质粒只存在于生长快速的分枝杆菌中，但是经过改造的穿梭质粒则可以在大肠杆菌或生长缓慢的分枝杆菌内进行独立于染色体的自我复制。这种穿梭质粒是将 M,fortuitum 5kb的 pAL5000质粒和大肠杆菌的质粒重组后构建的。
多拷贝的穿梭质粒可以在分枝杆菌中因为其数量多而达到大量外源基因的表达，但却不稳定而容易丢失。如果将分枝杆菌噬菌体的插入酶和核心基因顺序与大肠杆菌的质粒 DNA重组，这种穿梭质粒失去了在分枝杆菌中自我复制的能力，却能插入到分枝杆菌的染色体中间去，虽然只有 1个拷贝，却十分稳定。
七、外源基因在 BCG中的表达由于半个多世纪的实践证明了卡介苗的安全性以及接种卡介苗以后的持久免疫效果，因而卡介苗成了表达外源基因的理想载体，并以此来构建预防其他传染病的活疫苗。
经过多年的努力,Stover等科学家成功地构建了可以在 BCG中表达外源基因的质粒。这种质粒具有分枝杆菌和大肠杆菌的复制子 (ori M和 ColEori)，因而既能在 BCG
中复制义能在大肠杆菌中复制；它还具备用于选择的链霉素抗性基因、多处克隆酶切点和转录中止核酸序列。
十分重要的是，他们将分枝杆菌热休克蛋白基因
(hsp60或 hsp70)的高效启动子装配在这种质粒中，使得这种质粒不但能高效地转化 BCG，而且能在 BCG中表达大量外源基因的蛋白质产物。
此外，他们还用分枝杆菌噬菌体为基础改造的载体将外源基因插入到 BCG的染色体中去而获得稳定的表达；并以结核杆菌 19X103脂蛋白基因为基础构建了可以表达脂蛋白质的载体系统。这些表达系统可以使外源基因的产物表达在 BCG的胞浆中、细胞膜上或者分泌到细胞外。许多病毒、细菌和寄生虫的抗原已经成功地在 BCG中获得了表达并作为疫苗在动物实验中显示了有效的免疫保护效果。
八、人型结核杆菌基因在 BCG中的表达卡介苗在经历了 13个年头和 230次的传代才失去了毒力而成为目前唯一的预防结核病的减毒活疫苗。然而卡介苗对肺结核的免疫保护力并不理想，因而推测 BCG在传代过程中虽然达到了减低结核杆菌毒力的目的，但是却在同时也丢失了某些具有免疫保护性抗原的基因。在分子生物学技术日新月异的今天使得这种推测得到了证明。
研究结果发现，与原始亲代结核杆菌在失去毒力以前的基因库 相比较,BCG丢失了 3个不同长短的
DNA序列,RD1(9.5kb),RD2(10.7kb)和
RD3(9.3Lb)。
对 RDl的 DNA序列进行分析，结果显示在这段序列中有 8个编码蛋白的可读框 (ORF)，其中有 1个是结核杆菌的重要保护性抗原的基因，即 ESAT6。这是结核杆菌的一种分泌性蛋白质，并在动物试验中被反复证明具有抵抗强毒结核杆菌攻击的保护性抗原。
对 RD2的 DNA序列的分析，结果显示在 RD2中有 11个编码蛋白质的 ORF。其中有编码 MPT64和 CFP21蛋白质的基因，这些也都是结核杆菌的分泌性蛋白质，在动物试验中被证明是重要的免疫保护性抗原。
RD3也至少有 10个以上的 ORF，它的丢失和卡介苗减毒的关系尚在研究之中。
综上所述，正因为卡介苗在传代过程中丢失了相当多的重要基因，而且这种突变又十分稳定，所以它的毒力不会回升或回复。
由于卡介苗源自牛型结核杆菌，而且在减毒过程中又丢失了一些重要的基因，这可能是卡介苗在临床试验中对于人型结核杆菌肺结核病的免疫保护力不够理想的主要原因。
对于人结核杆菌的保护性抗原的研究自 20世纪
90年代以来已经有了很大的进展，这些抗原主要是结核杆菌的分泌性蛋白质，可以从结核杆菌培养物的上清液中进行提取和纯化。
目前结核杆菌的 19X103和 38X103的脂蛋白质已经在
BCG中获得了高效表达，对于其他一些结核杆菌保护性抗原的基因在 BCG中的表达也正在进行尝试。
另外还有采用加强 BCG免疫原性的策略，即利用基因工程技术在 BCG中表达白介素 2(IL-2)，这种经过基因重组的 BCG可以提高其在动物试验中的免疫保护效果。
这是很值得进一步进行深入研究的方向。
除了 BCG以外，用于预防天花的牛痘
(Vaccinia virus)也是一种经过长期临床验证的安全性十分可靠的疫苗。痘苗病毒可以像 BCG一样作为载体来表达其他微生物的保护性抗原。结核杆菌 19X103和 38X103
的脂蛋白基因都成功地在痘苗病毒中获得高效表达，并在动物实验中显示了较好的免疫保护力 。
结核杆菌染色体的全部 DNA序列已经在 1998年完成测定而发表。结核杆菌大约有 4000个基因，各种各样的蛋白质有数千种：简单地可以将这些蛋白质分为两大类。
九、结核杆菌蛋白抗原是新型结核疫苗研制的依据
1.分泌性蛋白质结核杆菌在体外培养的最初几天直接分泌出许多蛋白质并且在培养基中大量积聚。但在菌体内仅有微量存在。
另外一些分泌性蛋白质是由细菌在生长期间从细胞外壁逐渐释放到细菌的培养液中去的，这些蛋白质的浓度在培养期间持续增加
2.体细胞蛋白质包括细菌本身的结构蛋白质，例如细菌的表面抗原 ;
以及细菌的胞浆抗原，后者由死菌释放，表现为在细菌对数生长晚期，这类蛋白质突然以高浓度出现于培养基中。
从研制和开发结核病新疫苗的目的出发，
结核杆菌的体细胞蛋白质和分泌性蛋白质都有可能成为新疫苗的研究对象 !
例如结核杆菌 65X103的热休克蛋白质 (heat
shock protein ) GroEL是一种体细胞蛋白质。它在动物试验中显示出很好的抵抗结核杆菌感染的免疫保护力。
然而热休克蛋白质的序列在不同的菌属，甚至与真核细胞的同类蛋白质之间也有很高的同源性。
作为人用疫苗的话，会有很高的危险性。
例如,Brennan等对结核杆菌结合肝素的血凝素蛋白质 HBHA(heparin binding hemagglutinin)进行过深入的研究：这是一种细菌的表面蛋白质，参与结核杆菌粘附于上皮细胞的致病过程，然而用这种蛋白质作为亚单位疫苗或 DNA疫苗在动物的实验结果并不理想，它们不能使得动物获得显著的免疫保护力。
Orme等于 1988年的动物试验结果表明，给动物接种死的结核杆菌只能引起短暂的免疫反应，却不能像活的结核杆菌那样刺激机体产生具有免疫保护性的细胞免疫反应。
提示我们，结核杆菌在体内生长、繁殖、感染和致病的过程中分泌的某些蛋白质能被机体的免疫系统识别而产生持久的免疫反应和有效的免疫保护力。
十、结核杆菌的分泌性蛋白质自从 Koch于 1882年发现引起结核病的结核杆菌以来，科学家们对结核杆菌分泌性蛋白质的研究就一直没有停止过。这些基础研究工作的目的是想了解病原菌对人类或动物的致病机理；病原菌的分泌性蛋白质与宿主免疫系统之间的相互作用；以及寻找敏感和特异的诊断方法，例如皮肤试验和血清学检查。
Koch于 1891年报告了他制备旧结核菌素的方法：
将结核杆菌在含有甘油的培养基中培养,8个星期后，
在培养上清液中会有很多结核杆菌在生长和复制过程中分泌出来的蛋白质，然后经热灭活和浓缩而制成旧结核菌素。 Koch开始以为这种结核菌素可能对治疗结核病会有效果，结果大失所望。
但是他的重要发现是给感染结核的动物或病人注射这种结核菌素的 24— 48h以后，在注射的部位会发生有特有的皮肤红肿反应，当时被称为“郭霍现象”，这个方法很快被临床广泛用于对结核病的特异诊断。
当今用于皮试的结核菌素衍生物
PPD(tuberculin purified protein derivative)是将旧结核菌素过滤后再用硫酸铵加以沉淀而获得的纯度较高的结核杆菌分泌性蛋白质。
由于卡介苗对于肺结核的免疫保护力不够理想，
近十几年以来，研究者们把注意力集中到结核杆菌分泌性蛋白质和免疫保护力之间的关系上十一、结核杆菌短期培养物的过滤后蛋白质
Andersen将结核杆菌 H37Rv在改良的 Sauton液体培养基中作摇床培养，然后于不同的时间，将培养物的上清液经过离心和除菌过滤后进行浓缩。在经过蛋白质的定量测定以后，把于不同时间收获的等量的浓缩蛋白质在聚丙烯凝胶电泳 (SDS— PAGE)中作蛋白质条带的谱型分析。
结果：在结核杆菌摇床培养的 3天之内，难以测出细菌的分泌性蛋白质。从第 3天开始，先出现相对分子质量 22X103— 24X103和 45X103-50X103两个区域的蛋白质条带；到了第 5天，又增加了 6X103和
11x103两个小分子蛋白质以及 30X 103～ 35X 103
区域的多个蛋白质条带。随着时间的延长，蛋白质的条带越来越多。到了第 42天，各种相对分子质量大小不同的蛋白质已超过了 100种。
Andersen把不超过 5天的结核杆菌培养上清液中的蛋白质称为短期培养物的 过滤后蛋白质 (short- term
culture filtrates,ST— CF)，这些都是结核杆菌直接分泌到细胞外或者从细胞外膜分离出去的蛋白质，它们和结核杆菌的粘附、致病和诱导机体的免疫反应有十分密切的关系。
从第 7天开始，在结核杆菌培养物的上清液中出现了细菌胞浆内的蛋白质，例如 65x103的细菌热休克蛋白质。
说明此时已有部分结核杆菌开始自身裂解。
Andersen把这个时期的蛋白质称为长期培养物的过滤后蛋白质 (long-term culture filtrates)。这种蛋白质成分比较复杂，而且其中大部分蛋白质不是免疫保护性抗原。
Andersen为了进一步对结核杆菌的分泌性蛋白质进行深入研究，他将在 SDS— PAGE中的蛋白质按照相对分子质量的大小，分成 22个区带，再用电泳的方法将蛋白质分别从不同区带的凝胶中洗脱出来并加以浓缩。然后对这 22个区带的蛋白质分别在动物的体内和体外进行抗原的免疫原性和免疫保护力的试验研究。
Andersen先用 2.5× 103的结核杆菌 H37Rv从静脉感染 C57BL／ 6小鼠,2周后将淋巴细胞从脾脏分离出来，然后用相对分子质量不同的 ST— CF蛋白质在体外刺激淋巴细胞的增殖反应和诱导 IFN-γ。由于 IFN-γ能够抑制结核杆菌在巨噬细胞中的生长，而且和免疫保护力相关，因此可用以筛选 ST— CF中的保护性抗原。试验结果表明，能诱导高水平 IFN-γ的抗原主要是第 2,3,11,13和 14区带的分泌性蛋白质。淋巴细胞增殖反应的结果显示了极其相似的结果。
用单克隆抗体作进一步确定的结果证明 ESAT6、
MPT64,Ag85A和 AS95B等蛋白质是其中重要的保护性抗原。
Andersen用 100μg的 ST— CF加上佐剂二甲基三十六烷基铵氯化物 (dimethyl—
dioctadecylammoniun,DDA)给 C57BL／ 6J小鼠皮下免疫 3次后，再用结核杆菌 H37Rv从静脉进行攻击。
在试验中，给小鼠皮下接种 5X104CFU的 BCG作为阳性对照，同时还设立了只注射 DDA佐剂或 ST— CP的试验对照组。
结果显示 ST— CF加 DDA佐剂的免疫保护效果和 BCG相似，前者能使结核杆菌在脾脏中的数量与未免疫的对照组相比减低 1,24个对数值；
而后者可以降低 1,41个对数值。两者对降低结核杆菌在肺脏中数量的能力也十分接近，分别为
0,68和 0,67。然而不加 DDA佐剂的 ST— CP
则没有明显的免疫保护力，这说明 DDA佐剂具有显著的诱导细胞免疫的重要功能。
十二、具有免疫保护作用的结核杆菌分泌性蛋白质至今已对数十种结核杆菌分泌性蛋白质的基因序列和蛋白质功能有了比较深入的研究，
其中有些已经在动物实验中证明了它们的免疫保护作用。下述 8个种类的结核杆菌分泌性蛋白质是研究比较集中、实验结果重复性好和获得公认的具免疫保护力的抗原。
1.早期分泌性抗原靶 6 (early secretory antigen
target6,ESAT6)
这是结核杆菌在感染早期的分泌性蛋白质，也是 ST—
CF中的具免疫保护力的抗原，由于它在 SDS— PAGE中的泳动位置接近 6× 103，因此称为 ESAT6。 ESAT6是很重要的 T细胞抗原，可被感染了结核杆菌的动物或病人有免疫活性的 T淋巴细胞所识别，并产生高水平的 IFN-γ。
ESAT6也具有刺激 B细胞反应的抗原决定簇，
将 8个氨基酸多肽的表位与钥孔血蓝蛋白 (keyhole
limpet hemocyanin)偶联后免疫动物可以产生特异性抗体。卡介苗在其传代减毒过程中丢失了编码
ESAT6的基因，因而更显得 ESAT6蛋白质的重要性，
因为这很可能是卡介苗对肺结核免疫保护效果不理想的原因之一。
在前几年发表的文献中，不论是用 ESAT6作为亚单位疫苗还是用它的基因作为 DNA疫苗，在动物试验中的结果都显示出很好的免疫保护力，而且试验结果的重复性很好。
2,MPT64
结核杆菌的分泌性蛋白质，是结核杆菌 ST—
CF中的主要成分，可以占到结核杆菌培养基上清滤过液中蛋白质总量的 8％。 MPT64的相对分子质量为 24X103，它既能刺激细胞免疫反应，又能诱导体液免疫反应。
经过对 68名结核病人外周血淋巴细胞的测,MPT64
对人类 T淋巴细胞增殖反应和诱导 IFN-γ的表位在该蛋白质羧基端的 184— 228氨基酸残基区域；而 B细胞免疫反应的表位则在 124— 143氨基酸残基区域。
小鼠和豚鼠的动物试验结果都显示 MPT64有很高的抵抗结核杆菌感染的免疫保护力。
在早期的卡介苗菌株中有编码 MPT64蛋白质的基因，例如 Tokyo,Morau,Russia和 Sweden菌株；
但是在 Danish1331,Pasteur,Glaxo和 Tice的 BCG
中却没有 MPT64基因，这提示在卡介苗传代过程的后阶段丢失了编码 MFF64蛋白质的基因。
MPT64与 ESAT6有很多相同之处，它们都是结核杆菌的分泌性蛋白质，有很强的诱导细胞免疫的能力，
又同是卡介苗在传代过程中丢失的重要保护性抗原，
因而在结核病新疫苗的研制和开发过程中是必不可少的候选成分。
3.抗原 85复合蛋白质,
结核杆菌 ST— CF中早期的主要分泌性蛋白质，
含量十分丰富，它是由 3种相对分子质量十分接近，
而且抗原性有交叉的蛋白质所组成，即 Ag85A、
Ag85B和 Ag85C，也称 MPT44,MPT59和
MPT45，它们的相对分子质量分别是 32X103、
30X103和 30.5X103。 抗原 85复合蛋白质能和人的纤维结合蛋白质结合，这很可能与结核杆菌的致病机制有关。
Ag85A和 Ag85B都是免疫保护性抗原，而 Ag85C
则不能保护动物抵抗结核杆菌的感染。用编码 Ag85A
和 Ag85B的基因构建的 DNA疫苗显示了在动物试验中的免疫保护效果。
4,MPT63
结核杆菌 ST— CF中的一种比较丰富的蛋白质，
它的相对分子质量是 18X103。 MPT63能刺激 T淋巴细胞的免疫反应和诱导 IFN-γ的产生。在 Li等的报道中,MPT63 DNA疫苗在动物试验中具有和
MPT64及 ESAT6 DNA疫苗相似的抵抗结核杆菌感染的免疫保护力。
5.超氧化物歧化酶结核杆菌的 ST— CF中含大量的 SOD。这种酶与消除活性氧基团有关。 活性氧基团存在于吞噬溶酶体中，是杀灭细胞内微生物的重要毒性分子。 结核杆菌可将 SOD分泌出去后将活性氧基团消除，因而
SOD是结核杆菌的毒力致病因子。以此作为疫苗有可能抵消结核杆菌 SOD的作用，从而能使巨噬细胞更有效地将细菌杀灭。
6.DnaK,GroEL和 GroES蛋白质一类热休克或应激蛋白质。这种蛋白质的序列非常保守，在真核和原核细胞中都有相似的蛋白质。它们的功能是参与在细胞内蛋白质的折叠和装配，在外界温度上升或应激因子的作用下，它们的合成显著增加。由于这种蛋白质的含量高和制备容易，有可能作为结核的亚单位疫苗。但是动物实验的结果没有显示出有效的免疫保护力。然而有意思的是，用编码热休克蛋白质的基因构建的 DNA疫苗却在动物实验中显示了和 BCG接近的免疫保护力。
7.相对分子质量 19X103和 38X103脂蛋白质都是结核杆菌糖基化的类脂蛋白质。它们通过其分子中的类脂部分嵌合在细菌的细胞膜中，
因而只有少量的脂蛋白质会脱落到细菌的培养液中去。
Zhu等将编码这两种脂蛋白质的基因克隆到痘苗病毒中去，获得了很高的表达。然后用这两株表达结核杆菌脂蛋白质的基因重组疫苗免疫 C57BL
／ 6小鼠，用结核杆菌 H37Rv毒株进行攻击，结果获得了接近 BCG的免疫保护效果。
8.CFP系列蛋白质
Andersen用二维电泳法对结核杆菌 ST— CF蛋白质进行进一步的分离和纯化，并按照它们的相对分子质量分别命名为 CFPl7,CFP20,CFP21,CFP22,CFP25、
CFP28和 CFP29。其中 CFPl7,CFP20,CI~Y21、
CFP25和 CFP29都能诱导小鼠的免疫记忆细胞产生较高水平的 IFN-7和 DTH。在所有能引起免疫反应的 CFP蛋白质中，尤其是 CFP21的免疫原性最强，它对不同品系的小鼠，甚至豚鼠都能产生很强的免疫反应。
值得注意的是，在卡介苗传代过程中丢失的 10.7kb的
RD2核酸片段含有编码 CFP21的基因，因此这是继 ESAT6
和 MPT64后又一个研究结核亚单位疫苗和 DNA疫苗的重要目的基因。
十三、结核亚单位疫苗卡介苗在临床的使用已经超过了半个世纪，由于如下一些主要原因，寻求结核病新疫苗的研究一直没有停止过,
第一,BCG对肺结核的免疫保护效果只有 50％
左右，因而不是一个能够控制甚至消灭结核病的理想疫苗。
第二，由于 BCG和结核杆菌的抗原性十分相似，
使得用 PPD皮肤试验来诊断结核感染的方法在接种过卡介苗的人群中受到很大的限制，以至于一些发达国家的儿童从未接种过卡介苗或者准备逐步停止卡介苗的接种。
第三，由于艾滋病在全世界的蔓延而造成了卡介苗的安全性问题；因为接种卡介苗可能会在患有艾滋病的儿童中引起 BCG全身播散的危险性。
为了避免 BCG的这些缺陷，可以利用结核杆菌的具有免疫保护效果的蛋白质抗原作为预防结核病的亚单位疫苗。这种疫苗至少是安全的，而且还可以设法避免 PPD皮肤试验的假阳性反应。
结核亚单位疫苗的关键是怎么才能获得与卡介苗相似的免疫保护反应；而这个问题又和抗原的选择和剂量以及佐剂的使用密切相关。
1.抗原的选择动物试验的结果一再证明，结核杆菌的活菌苗对动物的免疫保护力要明显高于死菌苗，这是因为结核杆菌分泌到菌体外的抗原在结核感染的初期阶段能被第一类辅助性 T细胞 (Thl)所识别而诱发有效的免疫保护反应。这个结果对亚单位疫苗抗原的选择提供了方向。
Andersen将结核杆菌 ST－ CF中的 100
多种蛋白质用 SDS-PAGE的方法按照相对分子量大小分成十几个组分评估其体外刺激淋巴细胞增殖反应和诱导 IFN-γ的能力，并进行比较。
这些淋巴细胞来源于用结核杆菌实验性感染的小鼠、牛和结核新病人：实验结果显示出令人吃惊的相似性。 ST－ CF中 6X103－
10x103的蛋白质能够诱导实验感染动物或病人的淋巴细胞产生最强的免疫反应和最高的
IFN-γ水平。
对这些相对分子质量 6X103— 10X103组分的蛋白质作进一步的分析，证实了 ESAT6是其中能够诱导细胞免疫反应的主要抗原。采用类似的方法以及用结核杆菌
H37Rv攻击的动物免疫保护试验，选择出 ESAT6、
MPT64,Ag95A和 Ag85B等抗原作为结核亚单位疫苗。
由于人结核病中有很大一部分是因为在原发病灶中的结核杆菌再激活而引起的，因而将结核杆菌在其休眠期表达的一些抗原，例如阿尔法结晶蛋白质 (α-crystallin)
和西格马因子 (sigma factor)也作为结核亚单位疫苗进行研究。选择结核杆菌在其感染不同时期表达或分泌的蛋白质作为亚单位疫苗有可能获得长期的免疫保护效果。
2.抗原的剂量亚单位疫苗必须和佐剂一起使用才有免疫效果。
而且抗原的剂量需要经过预试验以后才能确定。因为剂量太小或太大都不能诱导有效的免疫反应。
例如给小鼠免疫接种结核杆菌的 ST— CF蛋白质，当免疫剂量从 10 μg增加到 100 μg时，亚单位疫苗的免疫保护效果逐渐增强，但是当免疫剂量超过 100 μg的时候，免疫保护力反而会下降，与此同时,IFN-γ的水平明显下降，体内主导的免疫反应也由细胞免疫变成了体液免疫。
用纯化的单一蛋白质 ESAT6或多肽亚单位疫苗重复上述试验，获得的结果完全一样。
Power用不同剂量的 BCG免疫小鼠，同样证明了小剂量的 BCG能诱导以 Thl为主的细胞免疫，
而大剂量的 BCG却只能诱导 Th2的免疫反应，而且这种情况与接种的途径无关，不论是静脉、皮下或皮内接种，其结果都一样。
3.佐剂的种类结核杆菌是一种细胞内寄生的病原菌，因此理想的亚单位疫苗佐剂应该能够诱导以 Thl为主的免疫反应。
Andersen用结核杆菌的 ST— CF作为亚单位疫苗的抗原，加上不同的佐剂免疫小鼠，然后在攻击前测定动物体内的 IFN- γ和特异的抗体反应，以及攻击后小鼠肺脏和脾脏的 CFU计数作为免疫保护力的指标。
试验结果表明,DDA佐剂使得结核亚单位疫苗在小鼠体内诱导出 Th1的免疫反应，并且显示了比较理想的免疫保护效果。
皂角甙（ Quil-A Saponin）佐剂则不如 DDA，
对动物的免疫保护效果只达到 BCG的 50％。
当前唯一经批准可用于人体的氢氧化铝佐剂，
只能使结核亚单位疫苗诱导出以 IgGl抗体为主的
Th2免疫反应，而且对动物完全没有保护作用。
其他的佐剂，例如单磷酸类脂 A（ MPL）和不完全福氏佐剂（ FIA）等，不管是单独使用还是联合使用，都有不同程度的免疫保护效果。
Bosio用牛型结核菌的 ST— CF蛋白质加上不同的佐剂，也获得了相似的动物试验结果。但是至今没有一种佐剂能使结核亚单位疫苗超过或达到 BCG
对动物的免疫保护力。
说明结核亚单位疫苗对机体免疫反应的诱导有其局限性，例如它没有对杀伤性 T淋巴细胞的诱导作用。
十四、结核 DNA疫苗
DNA疫苗的作用机理是能让外源基因在真核细胞内表达，表达出来的蛋白质抗原和 MHC的 I类分子结合后被呈递到细胞的表面，再被 CD8＋ T淋巴细胞的受体识别而诱发 CTL的细胞毒反应，这对细胞内寄生的结核杆菌有很强的杀伤作用。
1996年 8月出版的,自然医学杂志,同时刊登了 Huygen和 Tascon两位博士各自分别完成的结核病 DNA疫苗的论文，至今日有大约 10种左右的结核
DNA疫苗在动物实验中获得了比较理想的效果。
1.构建 DNA疫苗的结核杆菌基因如何选择 DNA疫苗的基因是这项疫苗技术的关键。由于在结核病亚单位疫苗研究中积累的大量经验，证明结核杆菌在体外培养早期分泌的蛋白质是主要的抗结核保护性抗原，因此主要的结核 DNA疫苗都是将编码这些抗原的基因克隆到载体中构建而成的。
(1)Ag 85A基因 Huygen把结核杆菌的抗原 85A基因克 隆到美国 Merck公司的 V1J载体中构建了 DNA疫苗，
然后将 DNA在体外转染肌肉瘤细胞．证明了 DNA疫苗能够在真核细胞中表达结核杆菌的抗原 85A蛋白质；
给 Balb／ c和 C57BL／ 6小鼠肌肉注射 Ag85ADNA疫苗，能在小鼠体内诱发很强的体液和细胞免疫反应。
在抗体反应中,DNA疫苗刺激产生的 IgG1和 IgG2a
的抗体效价相似，而用不含 Ag85A基因的 V1J载体免疫的小鼠则不产生抗体反应；在细胞免疫反应中,DNA疫苗可以诱发很强的淋巴细胞的增殖反应和刺激 T细胞产生很高的 IL－ 2和 IFN-γ淋巴因子。
在末次免疫后的 3-10周，从呼吸道攻击 100
个结核杆菌 Erdman毒菌，一个月后解剖小鼠取其肺脏和脾脏计数活菌,DNA疫苗能取得和
BCG相似的免疫保护效果。
（ 2） Ag85B基因 抗原 85B和抗原 85A一样，
也是重要的结核杆菌免疫保护性抗原。 Li和
Kamath各自分别将 Ag95B基因克隆 pJW4303
载体中。用于免疫 C57BL／ 6小鼠，都获得了明显的特异性体液和细胞免疫反应。在用气雾攻击结核杆菌 H37Rv毒菌后，均获得了接近
BCG的免疫保护力； Kamath还将 Ag85B
DNA疫苗的免疫保护效果与 ESAT6和 MPT64
DNA疫苗同时作比较，免疫保护力从高到低依次为 Ag95B,ESAT6和 MPT64 DNA疫苗。
(3)ESAT6基因 ESAT6是结核杆菌早期分泌性蛋白质中诱导 T细胞免疫反应能力最强的蛋白质，因此选择 ESAT6基因来构建 DNA疫苗是理所当然的。 Li等在构建 ESAT6 DNA疫苗时，对能表达信号肽和不能表达信号肽的
DNA疫苗进行了比较。结果表明，这两种
ESAT6 DNA疫苗的免疫保护力都很高，而且试验的重复性很好。 BCG在传代过程中丢失了 ESAT6基因。因此 ESAT6 DNA疫苗在实验动物中显示出来的免疫保护效果进一步证明了
ESAT6基因的重要性。
(4)MPT64基因 MPT64蛋白质是具有很好免疫保护效果的结核亚单位疫苗之一，在部分 BCG疫苗的菌株中也丢失了 MPT64基因。
用 MPT64基因构建的 DNA疫苗在小鼠动物实验中也显示了接近 BCG的免疫保护效果。
(5)MPT63基因 MPT63蛋白质有很强的刺激
T淋巴细胞免疫反应的能力。 Li等将 MPT63基因克隆到 pJW4303载体中构建的 DNA疫苗也显示了较好的免疫保护效果。
(6)hsP65基因 结核杆菌的热休克蛋白质 (heat
shock protein)是细菌培养滤过液中含量最丰富的成分，其中的相对分子质量 65× 103蛋白质是结核杆菌的免疫保护性抗原，而且能表 65× 103
抗原的基因重组逆转录病毒疫苗在动物实验中也显示了很好的免疫保护效果。 Lowrie等将编码这个蛋白质的 hsp65基因克隆到 pcDNA3.0质粒中构建了 DNA疫苗。这种 DNA疫苗能在小鼠体内诱发以
Thl为主的免疫反应，抗体的效价比较低。 T细胞能产生大量的 IFN-γ 淋巴因子，但是 CTL的反应却比较微弱。
结果显示 hsP65 DNA疫苗在 3种品系的小鼠中都能获得接近 BCG的免疫保护效果。由于结核杆菌的 hsP65蛋白质和真核细胞的热休克蛋白质在序列上有很高的同源性，有理由担心这种
DNA疫苗可能会造成机体的自身免疫病，因而对这种 DNA疫苗的临床试验必须十分谨慎。
(7)相对分子质量 36× 103蛋白质基因
36× 103蛋白质富含脯氨酸抗原 (proline-
rich antigen,PRA)，也是一种结核杆菌的保护性抗原。 Tascon等将它的基因和相对分子质量 65× 103热休克蛋白质基因分别克隆到
pcDNA3.0载体中，然后对这两种 DNA疫苗同时进行小鼠动物试验。结果显示 36× 103 PRA
DNA疫苗引起的抗体免疫反应要比 hsp65 DNA
疫苗强，但是在 3个品系的小鼠动物试验中，
这种 DNA疫苗只对 CBA／ 10小鼠有免疫保护效果。
(8)相对分子质量 38× 103蛋白质基因 这种基因编码的结核杆菌 38× 103的糖脂蛋白质能引起活动性结核病人明显的 T细胞和抗体免疫反应。 Zhu等将该基因克隆到 pcDNA3.0载体中构建的 DNA疫苗可在 C57BL／ 6小鼠刺激产生
CD4+Thl和 CD8+T细胞反应以及高水平的 IFN-
γ 淋巴因子。末次免疫后 2周，从腹腔攻击
105结核杆菌 H37Rv毒菌。在攻击后 4周或 12周解剖动物取肺脏和脾脏作活菌计数，结果显示在攻击后 12周时测定的 38× 103 DNA疫苗的免疫保护力要比在 4周时的效果好。由于至今只有 1例关于这种 DNA疫苗的报告，因而其抗结核的免疫保护效果还需进一步验证。
2.DNA疫苗的小鼠动物试验结果结核杆菌染色体 DNA的完整序列已经于 1998年 6月发表，总共有 4000个基因，
其中 100— 200个是编码结核杆菌分泌性蛋白质的基因。应用 PCR技术来克隆结核杆菌的基因并不困难，因而用 DNA疫苗来筛选结核新疫苗候选者的策略应该是可行的。
DNA
疫苗小鼠品系抗体反应
（ IgG2a）
细胞免疫反应
IL-2 IL-4 IFN-γ CTL
攻击途径保护力
Ag85A C57BL/6 ++ +++ - +++ ++ 气雾 ++
BALB/C + ++ - ++ ++ 气雾 ++
Ag85B C57BL/6 ++ 未测 未测 ++ ++ 气雾 ++
ESAT6 C57BL/6 ++ ++ + + 未测 +++ 气雾 ++
MPT64 C57BL/6 ++ ++ + ++ 未测 气雾 ++
MPT63 C57BL/6 ++ ++ + ++ 未测 气雾 + +
65× 103 Parkes ＋＋ 未测 未测 +++ ++ 腹腔 ＋
CAB/B10 ++ 未测 未测 +++ ++ 腹腔 ＋
结核 DNA疫苗在小鼠动物试验的结果比较构建后的 DNA疫苗都要经过小鼠的动物实验来评估其免疫保护力 (上表 )，然后再进一步用豚鼠动物实验来验证和精选。
结核杆菌的 DNA疫苗是否一定要经过灵长类动物的实验才能进入临床试验的问题，尚无定论。迄今尚无有关结核 DNA
疫苗的灵长类动物实验报告。
3.结核病 DNA疫苗的研究方向结核 DNA疫苗的研究历史虽然很短，但是在小动物的试验研究结果还是十分令人鼓舞的。目前的研究重点还是在筛选不同的结核杆菌基因，然后在初步筛选出来的候选者中，
进一步在豚鼠试验中进行验证和精选，例如
Ag85A DNA疫苗在豚鼠实验中也显示了较好的免疫保护效果。
由于豚鼠是结核杆菌的敏感动物，
因而攻击后脏器中的活菌数可能在免疫组和对照组之间差异不大，但是以组织的病理改变作为指标，则可以显示出 DNA疫苗的免疫保护效果。
在众多结核 DNA疫苗的动物实验中，很少能够在动物试验中具有 BCG同样的，
甚至超过 BCG的免疫保护力。为了增强结核 DNA疫苗的免疫保护效果，目前有如下几个研究方向：
1.多价疫苗 结核杆菌蛋白质的成分很复杂，
保护性抗原的数量也很多，多价 DNA疫苗是一个可能会增强免疫保护力的研究方向。结核的多价 DNA疫苗可以是将多种有效的 DNA疫苗合在一起的混合物；也可以是将不同基因的特异性表位克隆在同一个载体上的单一 DNA疫苗。不同的基因表达不同的抗原，不同的抗原会刺激不同的免疫反应，如果这些反应能产生协同作用就会增强疫苗的免疫保护效果。
2.免疫调节因子 由于 IL-12和 IFN-γ等细胞因子具有对免疫反应的调节作用，例如使 DNA疫苗诱发偏向抗结核的 Thl免疫反应。因此将表达免疫调节因子的质粒当作佐剂和结核 DNA同时注射，有可能会提高疫苗的免疫保护力。
3.加速抗原的降解 如果将 DNA疫苗的基因和真核细胞的 ubiquitin基因融合后再注射，在体内表达的 ubiquitin能够加速抗原的降解，促进多肽和
MHC的 Ⅰ 类分子结合，诱发高效的 CTL活化，从而增强疫苗的免疫保护效果。
4.鼻内接种途径 从结核 DNA疫苗动物试验的初步结果分析，经肌肉接种疫苗以后，脾脏淋巴细胞产生的细胞因子水平要高于肺脏，但攻击的途径又主要是经呼吸道的气雾方法。如果给动物从鼻内接种脂质体 DNA疫苗，则释放的疫苗主要刺激肺脏的淋巴系统，从而可能在肺脏产生较高的细胞因子，从而提高疫苗的免疫力。
总之，较佳的结核 DNA疫苗的免疫保护率应该是达到或超过 BGG的水平。因此，如果小鼠和豚鼠的结核 DNA疫苗免疫效果显示其接近
BGG的水平，再经非灵长类动物的试验验证在证明安全的前提下，就有可能进入人临床试验。
目前美国 FDA批准上临床试验的 6种 DNA疫苗并不都有动物模型的验证，而且至今尚未发现对人体的不良反应。所以，批准结核 DNA疫苗临床试验的时间应该不远了。
思 考 题
研究机体对病原菌免疫防御机制应当分别从哪几方面入手？
基因工程亚单位疫苗与核酸疫苗在构成及诱导机体免疫反应方面有那些主要区别？
面对一种新发现的致病菌，研制疫苗应当在哪几个层次展开？疫苗分子设计应重点考虑哪几个问题？
卡介苗的研制和使用
卡介苗的临床试验
造成卡介苗保护效力差异的主要因素
卡介苗对控制结核病的作用
分枝杆菌的 DNA转移
分枝杆菌的载体系统
外源基因在 BCG中的表达讲授内容
人型结核杆菌在 BCG的表达
结核杆菌蛋白抗原是新型结核疫苗研制的依据
结核杆菌的分泌型蛋白
结核杆菌短期培养的滤过后蛋白
具有保护作用的结核杆菌分泌蛋白
结核杆菌亚单位疫苗
结核 DNA疫苗一、卡介苗的研制和使用法国科学家 Calmette和 Guerin于 1908年从患结核性乳腺炎的奶牛身上分离到牛型结核杆菌，在含胆汁的土豆甘油液体培养基中作连续传代培养的减毒试验。
他们将细菌每 3个星期传代 1次，在传了 39代以后，结核杆菌的菌落形态已发生了改变。
在传代的过程中，他们不断地测试细菌的毒力，直至经过 230次的传代和 13年持之以恒的工作，终于在 1921
年经动物实验证明这株牛型结核杆菌失去了毒力。更重要的是，如果用这种细菌感染牛、豚鼠、小鼠、恒河猴和猩猩都不能恢复其毒力，而且在 30天以后用牛型或人结核杆菌毒株进行攻击，动物都获得了保护。
这个菌苗被称作为卡介苗 (BCG)。
卡介苗首先于 1921年在法国对 1名新生儿进行试验，在他出生后的第 3天、第 5天和第 7天给予口服卡介苗。这名婴儿的母亲在其出生后不久死于结核病，以后他就和患有结核病的外祖母一起生活。然而由于接种了卡介苗，他一生都没有得结核病。
Calmette在 1927年发表了长达 7年的卡介苗临床试验结果。
他从 1921— 1927年，对 969名儿童口服接种卡介苗，
这些儿童的母亲大多数都患有结核病，或者他们的家庭成员中有人患有结核病。经过长期观察，在这些儿童中的结核病死亡率只有 3,9％，然而在没有接种卡介苗的儿童中的结核病死亡率却高达 32,6％。 1928年以后，
卡介苗在全世界广泛使用。
至今已在 182个国家和地区，对 40多亿的儿童接种了卡介苗。根据 WHO扩大计划免疫的要求，现在每年仍有
1亿多的新生儿接种卡介苗。
卡介苗菌种在早期是通过培养的方法进行传代和保存的。这种方法一直沿用到 20世纪 60年代，结果造成卡介苗菌种之间的差异性极大。表现在：
菌落的形态不同，培养基上活菌数的差异，生化成分和活性、抗药性,对动物和人体的免疫原性以及对动物的 毒力 等都有不同。
1960年以后，冻干技术使得全世界的实验室都可以制备一大批卡介苗的种子，然后用同一批的种子菌苗来生产卡介苗，最多不能超过 4代。这种方法保证了卡介苗的稳定性。
丹麦哥本哈根的国立血清研究所承担了对卡介苗进行国际性质量控制的任务。该所的卡介苗哥本哈根株源于 1931年法国巴斯德研究所的第
423代卡介苗。现在世界上普遍使用的 3个卡介苗菌种分别是：美国格兰素 (Glaxo— 1077)BCG，
它是哥本哈根菌株的第 1 077代培养物；日本东京 (Tokyo— 172)BCG，它来源于法国 1925年的种子 BCG；还有法国巴斯德 (Pasteur—
1173P2)BCG。当今世界上使用的卡介苗中,90
％以上是用这 3种 BCG作为种子来生产的。
卡介苗在早期是通过口服途径免疫的，这种方法在某些地方一直延续到 20世纪 50年代。
在口服卡介苗的 4h以内,Calmette等观察到血液中有卡介苗菌。这意味着疫苗可引起全身反应，并能粘附或进入小肠的 M细胞中去。现在的电镜技术可显示在口服卡介苗的兔子肠道淋巴组织的 M细胞中有卡介苗细菌。然而由于胃酸的作用，口服卡介苗的活菌数往往会减少 1
－ 2个对数值，这样就需要口服很大的剂量而造成卡介苗的安全性问题。
GALT Structure
Initiation of Gut Responses
例如口服大剂量卡介苗和子宫颈淋巴结病的发生高度相关，而且会对婴儿的中耳造成具损伤性的感染。在中止口服的方法以前，对皮下和皮内注射以及皮上划痕的方法进行了比较。
结果表明，皮下注射会引起脓肿；而皮上划痕的方法虽然比皮内注射来得方便和快速，但是需要高浓度的卡介苗，而且难以确定正确的接种剂量。因而皮内接种卡介苗的方法得以广泛使用。
接种卡介苗以后两个星期开始产生结核菌素的阳性反应,6— 12个星期达到高峰。反应的强度和卡介苗的菌种、活菌数以及接种对象的年龄、健康情况和家族基因背景等都有关系。如果接种卡介苗
2— 3个月以后，结核菌素反应仍呈阴性，则需要重新接种。儿童接种卡介苗后的结核菌素阳性反应的皮肤硬结大小在 3— 19mm，并随着时间而消退，
绝大部分的儿童在接种卡介苗 10年以后都转成阴性反应。
结核菌素实验虽然接种卡介苗以后会引起结核菌素的阳性反应，然而临床试验证明这种反应的强度与疫苗对结核感染的免疫保护效果没有关系。由于结核菌素皮肤试验难以区别是由卡介苗还是结核杆菌自然感染引起的反应，对临床的结核病诊断带来困难，因而在一些发达国家，例如美国和荷兰从不对新生儿接种卡介苗。
在这些国家，卡介苗只用于对和结核病人有密切接触的高危险人群，或者对膀胱癌患者进行免疫治疗。
卡介苗的安全性曾在 1930年受到质疑，因为在德国的 Lubeck发生了 72名儿童因为口服卡介苗而患结核病死亡。事故调查证实这些儿童误服了保存在实验室的结核杆菌，并不是卡介苗。至今全世界已有 40多亿人接种过卡介苗，因而这是世界上最安全的疫苗之一。
然而值得注意的是，虽然卡介苗对免疫系统健全的人来说是十分安全的，但是对免疫缺陷者则可以是致命的。例如一个患艾滋病的儿童在接种卡介苗 4个月以后，产生发热、淋巴结炎和腹泻等症状，
结果在淋巴结和脑脊液中分离到了卡介苗菌，其症状经过抗痨治疗后得到了改善。
这对流行艾滋病的发展中国家来说，要特别引起警惕。由于 WHO推行的扩大计划免疫的疫苗包括卡介苗，因而不能给患有艾滋病的儿童接种，因为在接种卡介苗后，有造成全身播散性卡介苗疾病和导致死亡的危险。
二、卡介苗的临床试验卡介苗的临床效力试验进行了数十次，光是随机抽样和设有未接种对照组的大规模临床试验就有 17次。其中 8次试验的结果具有一定的代表性。
根据效力试验的好和差，大体可以分为 3组：
第一组的临床试验有 3次，卡介苗的保护力都在 70％以上。第一次大规模的卡介苗临床试验始于 1935年，对象是北美的 8个印第安人部落中 0— 20岁的结核菌素皮试阴性的儿童和青少年。
卡介苗由美国费城的亨利菲利普研究所生产，
进行了 9— 11年的随访。
试验结果证明，在 1 457名未接种卡介苗的人群中有 238人患了结核病；然而在 1 551名接种了卡介苗的人群中只有 64人患结核病。卡介苗的免疫保护力达到了 75％，结核病的死亡率降低了 82％。
第二次试验是在美国芝加哥的一所医院进行的。从 1937— 1948年，总共有 3 381名婴儿在这所医院出生。
对这些婴儿用美国 Tice公司的卡介苗进行随机免疫并随访了 l2-23年。
结果在 1 665名未接种免疫的儿童中有 59人得了肺结核；然而在 1 716名接种了卡介苗的儿童中，却只有 16人患肺结核。卡介苗的免疫保护力达到 75％。
第三次卡介苗临床试验于 1950---1952年在英国进行。观察对象都是 14— 16岁的在校学生，
其中 1,4万名结核菌素皮试阴性的学生接种了卡介苗，还有 1,33万名学生未接种卡介苗作为对照。
5年以后，卡介苗的免疫保护力达到 84％。
15年以后，在未免疫接种的对照组中有 243
人患肺结核；然而在接种了卡介苗的学生中却只 56人得肺结核，疫苗的保护力是 77％。
第二组的临床试验有 2次，显示了卡介苗中等程度的免疫保护效果。
其中一次是于 1949年在波多黎各进行的。在
1-18岁的观察对象中，有 5,1万人接种了卡介苗，另外 2,7万人作为未免疫接种的对照。经过 19年的随访，结果在未免疫组中有 73名患肺结核，而免疫组中也有 93人患肺结核，卡介苗的免疫保护力只有 29％。
另外一次于 1950---1955年在印度南部进行的卡介苗现场试验中，有 5000名儿童接种了疫苗,6000名儿童作为未接种对照。经过 15年的随访，卡介苗的免疫保护力只有 20％。
第三组的临床试验有 3次，卡介苗的免疫保护效果很差或无效。
一次是于 1947年在美国佐治亚州进行的，对象是 6-17岁的儿童和青少年。 2500名接种了卡介苗,2300名是未接种疫苗对照组。经过 20年的观察，对照组中有 3人患肺结核，而接种疫苗组中却有 5人患肺结核，卡介苗的免疫保护力成了负数。
另外一次试验是于 1950年在佐治亚州和阿拉巴马州进行的，接种疫苗组有 1,7万人，
未接种疫苗的对照组有 1,8万人。经过 14年的观察，前者有 26人患肺结核，后者有 32人得肺结核，卡介苗的免疫保护力只有 6％。
有史以来规模最大的临床试验，由印度医学研究学会、
WHO和美国公共卫生部共同主持。
临床试验于 1968年在印度南部的 Chingleput地区进行，
当地人口一共有 36万，其中 26万人参与了临床试验。出生
1个月以内的婴儿除外，其余的不管年龄或结核菌素皮试反应的结果如何，随机分成 6组。 4组人群分别接种两种不同的冻干卡介苗和两种不同的剂量；另外 2组作为未免疫的对照组。
经过 10年的随访，研究结果于 1979年发表，即两种卡介苗的两种剂量都没有显示出高于未免疫接种对照组的对于肺结核的免疫保护效果。这场世界上最大的卡介苗现场试验不但没有解决问题，反而使得卡介苗的免疫保护力变得更加模棱两可。
为了进一步证实卡介苗的效力，同时避免大规模现场试验费用高、难度大和耗时长的问题，
WHO组织了十几次以病例为参考的临床试验。这些试验都在一些结核病发病率比较高的发展中国家进行，例如，缅甸、印度尼西亚、斯里兰卡、
阿根廷、巴西和卡麦隆等国家。
以前进行的随机取样的大规模现场试验，以结核杆菌感染为参考来计算卡介苗的免疫保护力；
而以病例为参考的临床试验则以患结核病为参考来计算。例如，在缅甸、斯里兰卡和阿根廷的临床试验中，均以住院治疗的结核病人数作参考来统计卡介苗的免疫保护力。
虽然二者的试验和计算方法都不一样，但是试验的结果却大同小异。这十几次试验同样显示了卡介苗对肺结核免疫保护力在不同国家之间的显著差异性，从 2％ — 84％不等。
此外,WHO还在小范围内进行了数次针对与结核病人有密切接触史的儿童进行了卡介苗的免疫保护力临床试验。这些与儿童有密切接触的病人都是经过结核杆菌培养为阳性而确诊的。试验结果证明卡介苗对肺结核的免疫保护力在 53％ — 74％之间。
经过对 10次随机取样的大规模现场试验和 8
次以结核病例为参考的临床试验结果进行综合分析，统计结果表明卡介苗对肺结核的免疫保护力大约在 50％左右。
然而这只是一种理论上的计算统计数字，
实际上如根据全球每年的新发病人数来估计，
卡介苗预防肺结核的作用十分有限。 Styblo等认为只有 10％ — 15％的保护力。
根据人类消灭天花的经验，
疫苗的免疫保护力必须达到 80％
以上才有可能预防这种传染病并进一步加以控制和消灭。因此卡介苗的效果显然不尽如意，研制和开发新的结核病疫苗也就势在必行。
三、造成卡介苗保护效力差异的主要原因用卡介苗来预防肺结核已超过了半个世纪，各种大大小小的临床试验也进行了数十次，然而试验结果显示的卡介苗对肺结核的免疫保护力是 0～ 80％，差异极大。造成这种情况的原因至今仍不清楚，但可能和下述
6个方面的原因有关。
1.非结核分枝杆菌感染人类暴露于环境中的非结核分枝杆菌可以造成对结核菌素的低度敏感性，也就具备了对结核杆菌感染的免疫抵抗力。
这种情况主要发生在热带和亚热带地区，
例如在印度南部地区可以分离到 20多种不同的非结核分枝杆菌；而在欧洲和北美洲，非结核分枝杆菌在环境中比较少。
在美国和印度的南部地区，皮试调查的结果表明这些地区的人群对非结核分枝杆菌的敏感性很高。在 8次大规模随机取样的现场试验中，有 5次试验就是在这些地区进行的，卡介苗对肺结核的免疫保护力很低。
然而另外 3次试验是在英国和美国的北方地区进行的，卡介苗的免疫保护力都在 70％以上。
如果非结核分枝杆菌的感染已经在人体内引起了对结核菌感染的某种程度的免疫力，那么就很难显示出再接种卡介苗以后对预防结核病的显著免疫保护力，因为 BCG和它们有许多共同的抗原，可以拮抗 BCG诱导免疫保护反应。
在非结核菌分枝杆菌中又有不同的菌属，
有的可以增强免疫力，有的却适得其反。例如，
M,vacae可以增强卡介苗的免疫保护力，而
M,scrofulaceum则可以降低卡介苗的效力。
这也许可用以解释为何在阿根廷的两个地区，
卡介苗的免疫保护力仍会有显著的差异。
2.内源性和外源性的结核杆菌感染在发达国家的成年人患结核病往往是来自肺部结核原发灶的结核杆菌复染。而在发展中国家，
由于结核病的发病率高，外源性的结核杆菌感染是造成结核病传播的主要原因。
动物试验证明，卡介苗能有效地防止结核杆菌从肺部的原发灶播散到其他器官，例如肝脏和脾脏。卡介苗的作用可能是减少内源性结核菌的复燃和播散，却不能预防外源性的结核杆菌感染。这样或许可以解释为何卡介苗在发达国家的现场试验结果要比在发展中国家的结果要好。
3.卡介苗的菌株差异在这数十次的临床试验中，使用了 6种不同的卡介苗。只有在印度的 Chingleput使用了冻干的卡介苗，其余的试验用的都是新鲜制备的菌苗。
卡介苗之间不同的免疫原性、活菌数差异和效力有可能造成临床试验的显著差异。
4.结核杆菌的毒力差异卡介苗在动物试验中能有效地保护动物抵抗具强毒的结核杆菌的攻击。然而在印度
Chingleput的临床试验中，从结核病人分离到的结核杆菌对豚鼠的毒力却很低。有学者认为卡介苗可能对这种印度南部结核杆菌的变异菌株没有保护力。
5.人群基因背景的差异动物试验证明，小鼠对卡介苗的免疫反应是由其第 1号染色体上的基因进行调控的；而在人体这种反应则是由第 2号染色体上的基因来调控。因而有可能卡介苗的临床试验在某一种人群中的免疫保护力会比在另一种人群中的要高。虽然试验结果并没有看到这种差异，然而人群基因背景的差异对卡介苗免疫保护力的影响还需要进一步进行研究和观察。
6.现场临床试验方法的差异由于这些临床试验于不同的国家和地区，在不同的研究和组织者的指导之下，经历了 40年
(1935— 1975)的过程，因而在试验方法和质量上的差异对卡介苗效力的影响是容易理解和显而易见的。
这些众多的问题中，最主要的是结核病人的诊断标准不同而造成卡介苗效力的偏差。例如，
在某些发展中国家的临床试验中规定，只有具有结核病临床症状的试验对象才对其进一步拍胸片检查，结果造成卡介苗免疫保护力的偏差。因为不少结核病人有肺部病灶，但在临床上并不一定有症状。
而在英国和美国北方的临床试验中，对所有参加试验的对象都作胸片检查，并且是全肓渎片，
即读片人对其对象的清况一无所知。
综上所述，影响卡介苗临床试验结果的因素是多方面的，但结论是至少卡介苗不是预防肺结核的理想疫苗，
研究和开发新的结核疫苗势在必行，
而以往卡介苗现场试验的各种经验和教训对今后新疫苗的临床试验具有很高价值的借鉴作用 。
四、卡介苗对结核病控制的作用对于绝大多数的传染病来说，如果能研制出一种有效的疫苗，再加上全球性的免疫接种计划能得以有效的执行，那么这种传染病就有可能从地球卜被消灭。例如天花和牛痘苗，以及小儿麻痹症和脊髓灰质炎糖丸，就是两个典型的例子。
很显然，卡介苗并不是预防肺结核的有效疫苗。因为卡介苗的使用已超过了半个世纪，接种过卡介苗的人数也已超过了 40亿，然而至今没有一个国家或地区有消灭结核病的可能性，甚至肺结核的发病率还有回升的趋势。
尽管如此，由于卡介苗对于预防肺结核可能有一定的免疫保护作用，加上其经过长期验证的安全性，以及生产容易和价格低廉等优点,WHO仍然积极推行在发展中国家广泛接种卡介苗的计划。
发展中国家结核病的发病率比较高，快速诊断的条件比较差，化学治疗不彻底，抗药性结核杆菌的流行使得治疗效果不理想，因而对刚出生的婴儿尽早接种卡介苗对于控制结核病还是有一定效果的。实际上肺结核主要发生于成年人；在儿童和青少年中比较少，这和新生儿接种卡介苗的作用是分不开的。
必须强调卡介苗对防止结核杆菌的播散，预防结核性脑膜炎和粟粒性结核等重症结核病的免疫保护力是十分显著和无可置疑的。
在数十次卡介苗的临床试验中，卡介苗对脑膜炎和粟粒性结核的免疫保护力都很好，其保护力在随机取样的大规模现场试验中波动于 65％～
95％之间，平均是 86％；而在以病例为参考的临床试验中波动于 61％～ 84％之间，平均是 75％。
由此可见，卡介苗功不可没，数十年来，它拯救了数百万儿童的生命。
虽然卡介苗对预防肺结核的效果并不肯定，
但仅就预防脑膜炎和粟粒性结核这一点来说，在发展中国家继续推行广泛接种卡介苗的计划也是有其积极意义的。
在发达国家中，结核病的发病率比较低。而卡介苗对肺结核的免疫保护力又不理想，因此倾向于逐步停止对新生儿接种卡介苗：美国的儿童从未接种过卡介苗。
对结核病的控制主要是通过控制结核病传染源和对高危险儿童和成年人定期作结核菌素皮试来进行。
对于皮试阳性的对象用异烟肼进行预防性治疗。
对不能服用异烟肼，又不能避免和活动性结核病人接触的对象，尤其是和具抗药性的结核病人接触，则必须接种卡介苗作为预防措施。
对于和结核病人有密切接触的医护人员，以往并不主张接种卡介苗。然而，近年来发生了多次医院内条件致病菌的爆发流行，其中有些还是具有抗药性的结核杆菌，
美国疾病控制中心 (CDC)已建议对这些医护人员接种卡苗。
对于感染艾滋病毒者，接种卡介苗需要慎重。 1991年，
有学者对 64名由感染了艾滋病病毒的母亲生下的婴儿和
130名健康母亲的新生儿都接种了卡介苗：
经过 40个月的观察，前者有 24％的儿童感染淋巴腺炎，后者也有 18％的感染率，差异不明显。所有的病例全部自愈，没有发生 1例播散性卡介苗感染。
看起来似乎卡介苗对感染艾滋病病毒的儿童也安全。然而也有报道感染艾滋病病毒的儿童在接种卡介苗以后，可以从该儿童的淋巴结和脑脊液中分离到卡介苗菌。
鉴于卡介苗对感染艾滋病病毒者的副作用并不是十分显著，而这种病人感染结核病的危险性又很大,WHO建议可对无症状的感染艾滋病毒者接种卡介苗来预防肺结核；
而不能给有症状的艾滋病患者接种卡介苗。
最近有报道，通过基因突变方法构建的营养缺陷性的
BCG能够保留其在动物试验中的免疫保护效果，却不能在有免疫缺陷的 SCID(severe combined
immunedeficiency)小鼠中增殖。这个试验结果给感染艾滋病毒者，甚至艾滋病人带来了使用安全性 BCG预防结核病的希望。
五、分枝杆菌的 DNA转移长期以来,BCG作为一种疫苗，它的免疫原性和安全性得到了验证，并在理论和实践上提供了研究重组多价疫苗的有利条件。然而因为 BCG生长缓慢,20— 24h才分裂一次，需要 2— 4个星期才能在固体培养基上看到菌落，
再加上由糖脂构成的蜡样细胞壁造成了外源基因的转化和抗生素选择的障碍，使得分子生物学技术在分枝杆菌中的应用远远落后于其他的细菌。
这种状况自 20世纪 90年代才开始得以改善。
用分枝杆菌噬菌体来转移 DNA的方法首先在生长速度比较快的 M,smegmatis获得成功，然而转化的效率比较低，每毫克 DNA只能获得 103-104噬菌斑单位。后来发现了 M.smegmatis高效转化率的突变株，并采用了电击法宋转移基因，使得每毫克 DNA可 M,smegmatisMC2155突变株中获得 106的重组子，而在 BCG中也可获得 105的重组子。这种技术上的革新极大地促进和推动了分枝杆菌的基因和遗传学的研究。
六、分枝杆菌的载体系统虽然分枝杆菌的噬菌体对转移外源基因是最有效的，但是质粒 DNA有其可在大肠杆菌中进行复制、加工、制备和简便易行等优点。天然的质粒只存在于生长快速的分枝杆菌中，但是经过改造的穿梭质粒则可以在大肠杆菌或生长缓慢的分枝杆菌内进行独立于染色体的自我复制。这种穿梭质粒是将 M,fortuitum 5kb的 pAL5000质粒和大肠杆菌的质粒重组后构建的。
多拷贝的穿梭质粒可以在分枝杆菌中因为其数量多而达到大量外源基因的表达，但却不稳定而容易丢失。如果将分枝杆菌噬菌体的插入酶和核心基因顺序与大肠杆菌的质粒 DNA重组，这种穿梭质粒失去了在分枝杆菌中自我复制的能力，却能插入到分枝杆菌的染色体中间去，虽然只有 1个拷贝，却十分稳定。
七、外源基因在 BCG中的表达由于半个多世纪的实践证明了卡介苗的安全性以及接种卡介苗以后的持久免疫效果，因而卡介苗成了表达外源基因的理想载体，并以此来构建预防其他传染病的活疫苗。
经过多年的努力,Stover等科学家成功地构建了可以在 BCG中表达外源基因的质粒。这种质粒具有分枝杆菌和大肠杆菌的复制子 (ori M和 ColEori)，因而既能在 BCG
中复制义能在大肠杆菌中复制；它还具备用于选择的链霉素抗性基因、多处克隆酶切点和转录中止核酸序列。
十分重要的是，他们将分枝杆菌热休克蛋白基因
(hsp60或 hsp70)的高效启动子装配在这种质粒中，使得这种质粒不但能高效地转化 BCG，而且能在 BCG中表达大量外源基因的蛋白质产物。
此外，他们还用分枝杆菌噬菌体为基础改造的载体将外源基因插入到 BCG的染色体中去而获得稳定的表达；并以结核杆菌 19X103脂蛋白基因为基础构建了可以表达脂蛋白质的载体系统。这些表达系统可以使外源基因的产物表达在 BCG的胞浆中、细胞膜上或者分泌到细胞外。许多病毒、细菌和寄生虫的抗原已经成功地在 BCG中获得了表达并作为疫苗在动物实验中显示了有效的免疫保护效果。
八、人型结核杆菌基因在 BCG中的表达卡介苗在经历了 13个年头和 230次的传代才失去了毒力而成为目前唯一的预防结核病的减毒活疫苗。然而卡介苗对肺结核的免疫保护力并不理想，因而推测 BCG在传代过程中虽然达到了减低结核杆菌毒力的目的，但是却在同时也丢失了某些具有免疫保护性抗原的基因。在分子生物学技术日新月异的今天使得这种推测得到了证明。
研究结果发现，与原始亲代结核杆菌在失去毒力以前的基因库 相比较,BCG丢失了 3个不同长短的
DNA序列,RD1(9.5kb),RD2(10.7kb)和
RD3(9.3Lb)。
对 RDl的 DNA序列进行分析，结果显示在这段序列中有 8个编码蛋白的可读框 (ORF)，其中有 1个是结核杆菌的重要保护性抗原的基因，即 ESAT6。这是结核杆菌的一种分泌性蛋白质，并在动物试验中被反复证明具有抵抗强毒结核杆菌攻击的保护性抗原。
对 RD2的 DNA序列的分析，结果显示在 RD2中有 11个编码蛋白质的 ORF。其中有编码 MPT64和 CFP21蛋白质的基因，这些也都是结核杆菌的分泌性蛋白质，在动物试验中被证明是重要的免疫保护性抗原。
RD3也至少有 10个以上的 ORF，它的丢失和卡介苗减毒的关系尚在研究之中。
综上所述，正因为卡介苗在传代过程中丢失了相当多的重要基因，而且这种突变又十分稳定，所以它的毒力不会回升或回复。
由于卡介苗源自牛型结核杆菌，而且在减毒过程中又丢失了一些重要的基因，这可能是卡介苗在临床试验中对于人型结核杆菌肺结核病的免疫保护力不够理想的主要原因。
对于人结核杆菌的保护性抗原的研究自 20世纪
90年代以来已经有了很大的进展，这些抗原主要是结核杆菌的分泌性蛋白质，可以从结核杆菌培养物的上清液中进行提取和纯化。
目前结核杆菌的 19X103和 38X103的脂蛋白质已经在
BCG中获得了高效表达，对于其他一些结核杆菌保护性抗原的基因在 BCG中的表达也正在进行尝试。
另外还有采用加强 BCG免疫原性的策略，即利用基因工程技术在 BCG中表达白介素 2(IL-2)，这种经过基因重组的 BCG可以提高其在动物试验中的免疫保护效果。
这是很值得进一步进行深入研究的方向。
除了 BCG以外，用于预防天花的牛痘
(Vaccinia virus)也是一种经过长期临床验证的安全性十分可靠的疫苗。痘苗病毒可以像 BCG一样作为载体来表达其他微生物的保护性抗原。结核杆菌 19X103和 38X103
的脂蛋白基因都成功地在痘苗病毒中获得高效表达，并在动物实验中显示了较好的免疫保护力 。
结核杆菌染色体的全部 DNA序列已经在 1998年完成测定而发表。结核杆菌大约有 4000个基因，各种各样的蛋白质有数千种：简单地可以将这些蛋白质分为两大类。
九、结核杆菌蛋白抗原是新型结核疫苗研制的依据
1.分泌性蛋白质结核杆菌在体外培养的最初几天直接分泌出许多蛋白质并且在培养基中大量积聚。但在菌体内仅有微量存在。
另外一些分泌性蛋白质是由细菌在生长期间从细胞外壁逐渐释放到细菌的培养液中去的，这些蛋白质的浓度在培养期间持续增加
2.体细胞蛋白质包括细菌本身的结构蛋白质，例如细菌的表面抗原 ;
以及细菌的胞浆抗原，后者由死菌释放，表现为在细菌对数生长晚期，这类蛋白质突然以高浓度出现于培养基中。
从研制和开发结核病新疫苗的目的出发，
结核杆菌的体细胞蛋白质和分泌性蛋白质都有可能成为新疫苗的研究对象 !
例如结核杆菌 65X103的热休克蛋白质 (heat
shock protein ) GroEL是一种体细胞蛋白质。它在动物试验中显示出很好的抵抗结核杆菌感染的免疫保护力。
然而热休克蛋白质的序列在不同的菌属，甚至与真核细胞的同类蛋白质之间也有很高的同源性。
作为人用疫苗的话，会有很高的危险性。
例如,Brennan等对结核杆菌结合肝素的血凝素蛋白质 HBHA(heparin binding hemagglutinin)进行过深入的研究：这是一种细菌的表面蛋白质，参与结核杆菌粘附于上皮细胞的致病过程，然而用这种蛋白质作为亚单位疫苗或 DNA疫苗在动物的实验结果并不理想，它们不能使得动物获得显著的免疫保护力。
Orme等于 1988年的动物试验结果表明，给动物接种死的结核杆菌只能引起短暂的免疫反应，却不能像活的结核杆菌那样刺激机体产生具有免疫保护性的细胞免疫反应。
提示我们，结核杆菌在体内生长、繁殖、感染和致病的过程中分泌的某些蛋白质能被机体的免疫系统识别而产生持久的免疫反应和有效的免疫保护力。
十、结核杆菌的分泌性蛋白质自从 Koch于 1882年发现引起结核病的结核杆菌以来，科学家们对结核杆菌分泌性蛋白质的研究就一直没有停止过。这些基础研究工作的目的是想了解病原菌对人类或动物的致病机理；病原菌的分泌性蛋白质与宿主免疫系统之间的相互作用；以及寻找敏感和特异的诊断方法，例如皮肤试验和血清学检查。
Koch于 1891年报告了他制备旧结核菌素的方法：
将结核杆菌在含有甘油的培养基中培养,8个星期后，
在培养上清液中会有很多结核杆菌在生长和复制过程中分泌出来的蛋白质，然后经热灭活和浓缩而制成旧结核菌素。 Koch开始以为这种结核菌素可能对治疗结核病会有效果，结果大失所望。
但是他的重要发现是给感染结核的动物或病人注射这种结核菌素的 24— 48h以后，在注射的部位会发生有特有的皮肤红肿反应，当时被称为“郭霍现象”，这个方法很快被临床广泛用于对结核病的特异诊断。
当今用于皮试的结核菌素衍生物
PPD(tuberculin purified protein derivative)是将旧结核菌素过滤后再用硫酸铵加以沉淀而获得的纯度较高的结核杆菌分泌性蛋白质。
由于卡介苗对于肺结核的免疫保护力不够理想，
近十几年以来，研究者们把注意力集中到结核杆菌分泌性蛋白质和免疫保护力之间的关系上十一、结核杆菌短期培养物的过滤后蛋白质
Andersen将结核杆菌 H37Rv在改良的 Sauton液体培养基中作摇床培养，然后于不同的时间，将培养物的上清液经过离心和除菌过滤后进行浓缩。在经过蛋白质的定量测定以后，把于不同时间收获的等量的浓缩蛋白质在聚丙烯凝胶电泳 (SDS— PAGE)中作蛋白质条带的谱型分析。
结果：在结核杆菌摇床培养的 3天之内，难以测出细菌的分泌性蛋白质。从第 3天开始，先出现相对分子质量 22X103— 24X103和 45X103-50X103两个区域的蛋白质条带；到了第 5天，又增加了 6X103和
11x103两个小分子蛋白质以及 30X 103～ 35X 103
区域的多个蛋白质条带。随着时间的延长，蛋白质的条带越来越多。到了第 42天，各种相对分子质量大小不同的蛋白质已超过了 100种。
Andersen把不超过 5天的结核杆菌培养上清液中的蛋白质称为短期培养物的 过滤后蛋白质 (short- term
culture filtrates,ST— CF)，这些都是结核杆菌直接分泌到细胞外或者从细胞外膜分离出去的蛋白质，它们和结核杆菌的粘附、致病和诱导机体的免疫反应有十分密切的关系。
从第 7天开始，在结核杆菌培养物的上清液中出现了细菌胞浆内的蛋白质，例如 65x103的细菌热休克蛋白质。
说明此时已有部分结核杆菌开始自身裂解。
Andersen把这个时期的蛋白质称为长期培养物的过滤后蛋白质 (long-term culture filtrates)。这种蛋白质成分比较复杂，而且其中大部分蛋白质不是免疫保护性抗原。
Andersen为了进一步对结核杆菌的分泌性蛋白质进行深入研究，他将在 SDS— PAGE中的蛋白质按照相对分子质量的大小，分成 22个区带，再用电泳的方法将蛋白质分别从不同区带的凝胶中洗脱出来并加以浓缩。然后对这 22个区带的蛋白质分别在动物的体内和体外进行抗原的免疫原性和免疫保护力的试验研究。
Andersen先用 2.5× 103的结核杆菌 H37Rv从静脉感染 C57BL／ 6小鼠,2周后将淋巴细胞从脾脏分离出来，然后用相对分子质量不同的 ST— CF蛋白质在体外刺激淋巴细胞的增殖反应和诱导 IFN-γ。由于 IFN-γ能够抑制结核杆菌在巨噬细胞中的生长，而且和免疫保护力相关，因此可用以筛选 ST— CF中的保护性抗原。试验结果表明，能诱导高水平 IFN-γ的抗原主要是第 2,3,11,13和 14区带的分泌性蛋白质。淋巴细胞增殖反应的结果显示了极其相似的结果。
用单克隆抗体作进一步确定的结果证明 ESAT6、
MPT64,Ag85A和 AS95B等蛋白质是其中重要的保护性抗原。
Andersen用 100μg的 ST— CF加上佐剂二甲基三十六烷基铵氯化物 (dimethyl—
dioctadecylammoniun,DDA)给 C57BL／ 6J小鼠皮下免疫 3次后，再用结核杆菌 H37Rv从静脉进行攻击。
在试验中，给小鼠皮下接种 5X104CFU的 BCG作为阳性对照，同时还设立了只注射 DDA佐剂或 ST— CP的试验对照组。
结果显示 ST— CF加 DDA佐剂的免疫保护效果和 BCG相似，前者能使结核杆菌在脾脏中的数量与未免疫的对照组相比减低 1,24个对数值；
而后者可以降低 1,41个对数值。两者对降低结核杆菌在肺脏中数量的能力也十分接近，分别为
0,68和 0,67。然而不加 DDA佐剂的 ST— CP
则没有明显的免疫保护力，这说明 DDA佐剂具有显著的诱导细胞免疫的重要功能。
十二、具有免疫保护作用的结核杆菌分泌性蛋白质至今已对数十种结核杆菌分泌性蛋白质的基因序列和蛋白质功能有了比较深入的研究，
其中有些已经在动物实验中证明了它们的免疫保护作用。下述 8个种类的结核杆菌分泌性蛋白质是研究比较集中、实验结果重复性好和获得公认的具免疫保护力的抗原。
1.早期分泌性抗原靶 6 (early secretory antigen
target6,ESAT6)
这是结核杆菌在感染早期的分泌性蛋白质，也是 ST—
CF中的具免疫保护力的抗原，由于它在 SDS— PAGE中的泳动位置接近 6× 103，因此称为 ESAT6。 ESAT6是很重要的 T细胞抗原，可被感染了结核杆菌的动物或病人有免疫活性的 T淋巴细胞所识别，并产生高水平的 IFN-γ。
ESAT6也具有刺激 B细胞反应的抗原决定簇，
将 8个氨基酸多肽的表位与钥孔血蓝蛋白 (keyhole
limpet hemocyanin)偶联后免疫动物可以产生特异性抗体。卡介苗在其传代减毒过程中丢失了编码
ESAT6的基因，因而更显得 ESAT6蛋白质的重要性，
因为这很可能是卡介苗对肺结核免疫保护效果不理想的原因之一。
在前几年发表的文献中，不论是用 ESAT6作为亚单位疫苗还是用它的基因作为 DNA疫苗，在动物试验中的结果都显示出很好的免疫保护力，而且试验结果的重复性很好。
2,MPT64
结核杆菌的分泌性蛋白质，是结核杆菌 ST—
CF中的主要成分，可以占到结核杆菌培养基上清滤过液中蛋白质总量的 8％。 MPT64的相对分子质量为 24X103，它既能刺激细胞免疫反应，又能诱导体液免疫反应。
经过对 68名结核病人外周血淋巴细胞的测,MPT64
对人类 T淋巴细胞增殖反应和诱导 IFN-γ的表位在该蛋白质羧基端的 184— 228氨基酸残基区域；而 B细胞免疫反应的表位则在 124— 143氨基酸残基区域。
小鼠和豚鼠的动物试验结果都显示 MPT64有很高的抵抗结核杆菌感染的免疫保护力。
在早期的卡介苗菌株中有编码 MPT64蛋白质的基因，例如 Tokyo,Morau,Russia和 Sweden菌株；
但是在 Danish1331,Pasteur,Glaxo和 Tice的 BCG
中却没有 MPT64基因，这提示在卡介苗传代过程的后阶段丢失了编码 MFF64蛋白质的基因。
MPT64与 ESAT6有很多相同之处，它们都是结核杆菌的分泌性蛋白质，有很强的诱导细胞免疫的能力，
又同是卡介苗在传代过程中丢失的重要保护性抗原，
因而在结核病新疫苗的研制和开发过程中是必不可少的候选成分。
3.抗原 85复合蛋白质,
结核杆菌 ST— CF中早期的主要分泌性蛋白质，
含量十分丰富，它是由 3种相对分子质量十分接近，
而且抗原性有交叉的蛋白质所组成，即 Ag85A、
Ag85B和 Ag85C，也称 MPT44,MPT59和
MPT45，它们的相对分子质量分别是 32X103、
30X103和 30.5X103。 抗原 85复合蛋白质能和人的纤维结合蛋白质结合，这很可能与结核杆菌的致病机制有关。
Ag85A和 Ag85B都是免疫保护性抗原，而 Ag85C
则不能保护动物抵抗结核杆菌的感染。用编码 Ag85A
和 Ag85B的基因构建的 DNA疫苗显示了在动物试验中的免疫保护效果。
4,MPT63
结核杆菌 ST— CF中的一种比较丰富的蛋白质，
它的相对分子质量是 18X103。 MPT63能刺激 T淋巴细胞的免疫反应和诱导 IFN-γ的产生。在 Li等的报道中,MPT63 DNA疫苗在动物试验中具有和
MPT64及 ESAT6 DNA疫苗相似的抵抗结核杆菌感染的免疫保护力。
5.超氧化物歧化酶结核杆菌的 ST— CF中含大量的 SOD。这种酶与消除活性氧基团有关。 活性氧基团存在于吞噬溶酶体中，是杀灭细胞内微生物的重要毒性分子。 结核杆菌可将 SOD分泌出去后将活性氧基团消除，因而
SOD是结核杆菌的毒力致病因子。以此作为疫苗有可能抵消结核杆菌 SOD的作用，从而能使巨噬细胞更有效地将细菌杀灭。
6.DnaK,GroEL和 GroES蛋白质一类热休克或应激蛋白质。这种蛋白质的序列非常保守，在真核和原核细胞中都有相似的蛋白质。它们的功能是参与在细胞内蛋白质的折叠和装配，在外界温度上升或应激因子的作用下，它们的合成显著增加。由于这种蛋白质的含量高和制备容易，有可能作为结核的亚单位疫苗。但是动物实验的结果没有显示出有效的免疫保护力。然而有意思的是，用编码热休克蛋白质的基因构建的 DNA疫苗却在动物实验中显示了和 BCG接近的免疫保护力。
7.相对分子质量 19X103和 38X103脂蛋白质都是结核杆菌糖基化的类脂蛋白质。它们通过其分子中的类脂部分嵌合在细菌的细胞膜中，
因而只有少量的脂蛋白质会脱落到细菌的培养液中去。
Zhu等将编码这两种脂蛋白质的基因克隆到痘苗病毒中去，获得了很高的表达。然后用这两株表达结核杆菌脂蛋白质的基因重组疫苗免疫 C57BL
／ 6小鼠，用结核杆菌 H37Rv毒株进行攻击，结果获得了接近 BCG的免疫保护效果。
8.CFP系列蛋白质
Andersen用二维电泳法对结核杆菌 ST— CF蛋白质进行进一步的分离和纯化，并按照它们的相对分子质量分别命名为 CFPl7,CFP20,CFP21,CFP22,CFP25、
CFP28和 CFP29。其中 CFPl7,CFP20,CI~Y21、
CFP25和 CFP29都能诱导小鼠的免疫记忆细胞产生较高水平的 IFN-7和 DTH。在所有能引起免疫反应的 CFP蛋白质中，尤其是 CFP21的免疫原性最强，它对不同品系的小鼠，甚至豚鼠都能产生很强的免疫反应。
值得注意的是，在卡介苗传代过程中丢失的 10.7kb的
RD2核酸片段含有编码 CFP21的基因，因此这是继 ESAT6
和 MPT64后又一个研究结核亚单位疫苗和 DNA疫苗的重要目的基因。
十三、结核亚单位疫苗卡介苗在临床的使用已经超过了半个世纪，由于如下一些主要原因，寻求结核病新疫苗的研究一直没有停止过,
第一,BCG对肺结核的免疫保护效果只有 50％
左右，因而不是一个能够控制甚至消灭结核病的理想疫苗。
第二，由于 BCG和结核杆菌的抗原性十分相似，
使得用 PPD皮肤试验来诊断结核感染的方法在接种过卡介苗的人群中受到很大的限制，以至于一些发达国家的儿童从未接种过卡介苗或者准备逐步停止卡介苗的接种。
第三，由于艾滋病在全世界的蔓延而造成了卡介苗的安全性问题；因为接种卡介苗可能会在患有艾滋病的儿童中引起 BCG全身播散的危险性。
为了避免 BCG的这些缺陷，可以利用结核杆菌的具有免疫保护效果的蛋白质抗原作为预防结核病的亚单位疫苗。这种疫苗至少是安全的，而且还可以设法避免 PPD皮肤试验的假阳性反应。
结核亚单位疫苗的关键是怎么才能获得与卡介苗相似的免疫保护反应；而这个问题又和抗原的选择和剂量以及佐剂的使用密切相关。
1.抗原的选择动物试验的结果一再证明，结核杆菌的活菌苗对动物的免疫保护力要明显高于死菌苗，这是因为结核杆菌分泌到菌体外的抗原在结核感染的初期阶段能被第一类辅助性 T细胞 (Thl)所识别而诱发有效的免疫保护反应。这个结果对亚单位疫苗抗原的选择提供了方向。
Andersen将结核杆菌 ST－ CF中的 100
多种蛋白质用 SDS-PAGE的方法按照相对分子量大小分成十几个组分评估其体外刺激淋巴细胞增殖反应和诱导 IFN-γ的能力，并进行比较。
这些淋巴细胞来源于用结核杆菌实验性感染的小鼠、牛和结核新病人：实验结果显示出令人吃惊的相似性。 ST－ CF中 6X103－
10x103的蛋白质能够诱导实验感染动物或病人的淋巴细胞产生最强的免疫反应和最高的
IFN-γ水平。
对这些相对分子质量 6X103— 10X103组分的蛋白质作进一步的分析，证实了 ESAT6是其中能够诱导细胞免疫反应的主要抗原。采用类似的方法以及用结核杆菌
H37Rv攻击的动物免疫保护试验，选择出 ESAT6、
MPT64,Ag95A和 Ag85B等抗原作为结核亚单位疫苗。
由于人结核病中有很大一部分是因为在原发病灶中的结核杆菌再激活而引起的，因而将结核杆菌在其休眠期表达的一些抗原，例如阿尔法结晶蛋白质 (α-crystallin)
和西格马因子 (sigma factor)也作为结核亚单位疫苗进行研究。选择结核杆菌在其感染不同时期表达或分泌的蛋白质作为亚单位疫苗有可能获得长期的免疫保护效果。
2.抗原的剂量亚单位疫苗必须和佐剂一起使用才有免疫效果。
而且抗原的剂量需要经过预试验以后才能确定。因为剂量太小或太大都不能诱导有效的免疫反应。
例如给小鼠免疫接种结核杆菌的 ST— CF蛋白质，当免疫剂量从 10 μg增加到 100 μg时，亚单位疫苗的免疫保护效果逐渐增强，但是当免疫剂量超过 100 μg的时候，免疫保护力反而会下降，与此同时,IFN-γ的水平明显下降，体内主导的免疫反应也由细胞免疫变成了体液免疫。
用纯化的单一蛋白质 ESAT6或多肽亚单位疫苗重复上述试验，获得的结果完全一样。
Power用不同剂量的 BCG免疫小鼠，同样证明了小剂量的 BCG能诱导以 Thl为主的细胞免疫，
而大剂量的 BCG却只能诱导 Th2的免疫反应，而且这种情况与接种的途径无关，不论是静脉、皮下或皮内接种，其结果都一样。
3.佐剂的种类结核杆菌是一种细胞内寄生的病原菌，因此理想的亚单位疫苗佐剂应该能够诱导以 Thl为主的免疫反应。
Andersen用结核杆菌的 ST— CF作为亚单位疫苗的抗原，加上不同的佐剂免疫小鼠，然后在攻击前测定动物体内的 IFN- γ和特异的抗体反应，以及攻击后小鼠肺脏和脾脏的 CFU计数作为免疫保护力的指标。
试验结果表明,DDA佐剂使得结核亚单位疫苗在小鼠体内诱导出 Th1的免疫反应，并且显示了比较理想的免疫保护效果。
皂角甙（ Quil-A Saponin）佐剂则不如 DDA，
对动物的免疫保护效果只达到 BCG的 50％。
当前唯一经批准可用于人体的氢氧化铝佐剂，
只能使结核亚单位疫苗诱导出以 IgGl抗体为主的
Th2免疫反应，而且对动物完全没有保护作用。
其他的佐剂，例如单磷酸类脂 A（ MPL）和不完全福氏佐剂（ FIA）等，不管是单独使用还是联合使用，都有不同程度的免疫保护效果。
Bosio用牛型结核菌的 ST— CF蛋白质加上不同的佐剂，也获得了相似的动物试验结果。但是至今没有一种佐剂能使结核亚单位疫苗超过或达到 BCG
对动物的免疫保护力。
说明结核亚单位疫苗对机体免疫反应的诱导有其局限性，例如它没有对杀伤性 T淋巴细胞的诱导作用。
十四、结核 DNA疫苗
DNA疫苗的作用机理是能让外源基因在真核细胞内表达，表达出来的蛋白质抗原和 MHC的 I类分子结合后被呈递到细胞的表面，再被 CD8＋ T淋巴细胞的受体识别而诱发 CTL的细胞毒反应，这对细胞内寄生的结核杆菌有很强的杀伤作用。
1996年 8月出版的,自然医学杂志,同时刊登了 Huygen和 Tascon两位博士各自分别完成的结核病 DNA疫苗的论文，至今日有大约 10种左右的结核
DNA疫苗在动物实验中获得了比较理想的效果。
1.构建 DNA疫苗的结核杆菌基因如何选择 DNA疫苗的基因是这项疫苗技术的关键。由于在结核病亚单位疫苗研究中积累的大量经验，证明结核杆菌在体外培养早期分泌的蛋白质是主要的抗结核保护性抗原，因此主要的结核 DNA疫苗都是将编码这些抗原的基因克隆到载体中构建而成的。
(1)Ag 85A基因 Huygen把结核杆菌的抗原 85A基因克 隆到美国 Merck公司的 V1J载体中构建了 DNA疫苗，
然后将 DNA在体外转染肌肉瘤细胞．证明了 DNA疫苗能够在真核细胞中表达结核杆菌的抗原 85A蛋白质；
给 Balb／ c和 C57BL／ 6小鼠肌肉注射 Ag85ADNA疫苗，能在小鼠体内诱发很强的体液和细胞免疫反应。
在抗体反应中,DNA疫苗刺激产生的 IgG1和 IgG2a
的抗体效价相似，而用不含 Ag85A基因的 V1J载体免疫的小鼠则不产生抗体反应；在细胞免疫反应中,DNA疫苗可以诱发很强的淋巴细胞的增殖反应和刺激 T细胞产生很高的 IL－ 2和 IFN-γ淋巴因子。
在末次免疫后的 3-10周，从呼吸道攻击 100
个结核杆菌 Erdman毒菌，一个月后解剖小鼠取其肺脏和脾脏计数活菌,DNA疫苗能取得和
BCG相似的免疫保护效果。
（ 2） Ag85B基因 抗原 85B和抗原 85A一样，
也是重要的结核杆菌免疫保护性抗原。 Li和
Kamath各自分别将 Ag95B基因克隆 pJW4303
载体中。用于免疫 C57BL／ 6小鼠，都获得了明显的特异性体液和细胞免疫反应。在用气雾攻击结核杆菌 H37Rv毒菌后，均获得了接近
BCG的免疫保护力； Kamath还将 Ag85B
DNA疫苗的免疫保护效果与 ESAT6和 MPT64
DNA疫苗同时作比较，免疫保护力从高到低依次为 Ag95B,ESAT6和 MPT64 DNA疫苗。
(3)ESAT6基因 ESAT6是结核杆菌早期分泌性蛋白质中诱导 T细胞免疫反应能力最强的蛋白质，因此选择 ESAT6基因来构建 DNA疫苗是理所当然的。 Li等在构建 ESAT6 DNA疫苗时，对能表达信号肽和不能表达信号肽的
DNA疫苗进行了比较。结果表明，这两种
ESAT6 DNA疫苗的免疫保护力都很高，而且试验的重复性很好。 BCG在传代过程中丢失了 ESAT6基因。因此 ESAT6 DNA疫苗在实验动物中显示出来的免疫保护效果进一步证明了
ESAT6基因的重要性。
(4)MPT64基因 MPT64蛋白质是具有很好免疫保护效果的结核亚单位疫苗之一，在部分 BCG疫苗的菌株中也丢失了 MPT64基因。
用 MPT64基因构建的 DNA疫苗在小鼠动物实验中也显示了接近 BCG的免疫保护效果。
(5)MPT63基因 MPT63蛋白质有很强的刺激
T淋巴细胞免疫反应的能力。 Li等将 MPT63基因克隆到 pJW4303载体中构建的 DNA疫苗也显示了较好的免疫保护效果。
(6)hsP65基因 结核杆菌的热休克蛋白质 (heat
shock protein)是细菌培养滤过液中含量最丰富的成分，其中的相对分子质量 65× 103蛋白质是结核杆菌的免疫保护性抗原，而且能表 65× 103
抗原的基因重组逆转录病毒疫苗在动物实验中也显示了很好的免疫保护效果。 Lowrie等将编码这个蛋白质的 hsp65基因克隆到 pcDNA3.0质粒中构建了 DNA疫苗。这种 DNA疫苗能在小鼠体内诱发以
Thl为主的免疫反应，抗体的效价比较低。 T细胞能产生大量的 IFN-γ 淋巴因子，但是 CTL的反应却比较微弱。
结果显示 hsP65 DNA疫苗在 3种品系的小鼠中都能获得接近 BCG的免疫保护效果。由于结核杆菌的 hsP65蛋白质和真核细胞的热休克蛋白质在序列上有很高的同源性，有理由担心这种
DNA疫苗可能会造成机体的自身免疫病，因而对这种 DNA疫苗的临床试验必须十分谨慎。
(7)相对分子质量 36× 103蛋白质基因
36× 103蛋白质富含脯氨酸抗原 (proline-
rich antigen,PRA)，也是一种结核杆菌的保护性抗原。 Tascon等将它的基因和相对分子质量 65× 103热休克蛋白质基因分别克隆到
pcDNA3.0载体中，然后对这两种 DNA疫苗同时进行小鼠动物试验。结果显示 36× 103 PRA
DNA疫苗引起的抗体免疫反应要比 hsp65 DNA
疫苗强，但是在 3个品系的小鼠动物试验中，
这种 DNA疫苗只对 CBA／ 10小鼠有免疫保护效果。
(8)相对分子质量 38× 103蛋白质基因 这种基因编码的结核杆菌 38× 103的糖脂蛋白质能引起活动性结核病人明显的 T细胞和抗体免疫反应。 Zhu等将该基因克隆到 pcDNA3.0载体中构建的 DNA疫苗可在 C57BL／ 6小鼠刺激产生
CD4+Thl和 CD8+T细胞反应以及高水平的 IFN-
γ 淋巴因子。末次免疫后 2周，从腹腔攻击
105结核杆菌 H37Rv毒菌。在攻击后 4周或 12周解剖动物取肺脏和脾脏作活菌计数，结果显示在攻击后 12周时测定的 38× 103 DNA疫苗的免疫保护力要比在 4周时的效果好。由于至今只有 1例关于这种 DNA疫苗的报告，因而其抗结核的免疫保护效果还需进一步验证。
2.DNA疫苗的小鼠动物试验结果结核杆菌染色体 DNA的完整序列已经于 1998年 6月发表，总共有 4000个基因，
其中 100— 200个是编码结核杆菌分泌性蛋白质的基因。应用 PCR技术来克隆结核杆菌的基因并不困难，因而用 DNA疫苗来筛选结核新疫苗候选者的策略应该是可行的。
DNA
疫苗小鼠品系抗体反应
（ IgG2a）
细胞免疫反应
IL-2 IL-4 IFN-γ CTL
攻击途径保护力
Ag85A C57BL/6 ++ +++ - +++ ++ 气雾 ++
BALB/C + ++ - ++ ++ 气雾 ++
Ag85B C57BL/6 ++ 未测 未测 ++ ++ 气雾 ++
ESAT6 C57BL/6 ++ ++ + + 未测 +++ 气雾 ++
MPT64 C57BL/6 ++ ++ + ++ 未测 气雾 ++
MPT63 C57BL/6 ++ ++ + ++ 未测 气雾 + +
65× 103 Parkes ＋＋ 未测 未测 +++ ++ 腹腔 ＋
CAB/B10 ++ 未测 未测 +++ ++ 腹腔 ＋
结核 DNA疫苗在小鼠动物试验的结果比较构建后的 DNA疫苗都要经过小鼠的动物实验来评估其免疫保护力 (上表 )，然后再进一步用豚鼠动物实验来验证和精选。
结核杆菌的 DNA疫苗是否一定要经过灵长类动物的实验才能进入临床试验的问题，尚无定论。迄今尚无有关结核 DNA
疫苗的灵长类动物实验报告。
3.结核病 DNA疫苗的研究方向结核 DNA疫苗的研究历史虽然很短，但是在小动物的试验研究结果还是十分令人鼓舞的。目前的研究重点还是在筛选不同的结核杆菌基因，然后在初步筛选出来的候选者中，
进一步在豚鼠试验中进行验证和精选，例如
Ag85A DNA疫苗在豚鼠实验中也显示了较好的免疫保护效果。
由于豚鼠是结核杆菌的敏感动物，
因而攻击后脏器中的活菌数可能在免疫组和对照组之间差异不大，但是以组织的病理改变作为指标，则可以显示出 DNA疫苗的免疫保护效果。
在众多结核 DNA疫苗的动物实验中，很少能够在动物试验中具有 BCG同样的，
甚至超过 BCG的免疫保护力。为了增强结核 DNA疫苗的免疫保护效果，目前有如下几个研究方向：
1.多价疫苗 结核杆菌蛋白质的成分很复杂，
保护性抗原的数量也很多，多价 DNA疫苗是一个可能会增强免疫保护力的研究方向。结核的多价 DNA疫苗可以是将多种有效的 DNA疫苗合在一起的混合物；也可以是将不同基因的特异性表位克隆在同一个载体上的单一 DNA疫苗。不同的基因表达不同的抗原，不同的抗原会刺激不同的免疫反应，如果这些反应能产生协同作用就会增强疫苗的免疫保护效果。
2.免疫调节因子 由于 IL-12和 IFN-γ等细胞因子具有对免疫反应的调节作用，例如使 DNA疫苗诱发偏向抗结核的 Thl免疫反应。因此将表达免疫调节因子的质粒当作佐剂和结核 DNA同时注射，有可能会提高疫苗的免疫保护力。
3.加速抗原的降解 如果将 DNA疫苗的基因和真核细胞的 ubiquitin基因融合后再注射，在体内表达的 ubiquitin能够加速抗原的降解，促进多肽和
MHC的 Ⅰ 类分子结合，诱发高效的 CTL活化，从而增强疫苗的免疫保护效果。
4.鼻内接种途径 从结核 DNA疫苗动物试验的初步结果分析，经肌肉接种疫苗以后，脾脏淋巴细胞产生的细胞因子水平要高于肺脏，但攻击的途径又主要是经呼吸道的气雾方法。如果给动物从鼻内接种脂质体 DNA疫苗，则释放的疫苗主要刺激肺脏的淋巴系统，从而可能在肺脏产生较高的细胞因子，从而提高疫苗的免疫力。
总之，较佳的结核 DNA疫苗的免疫保护率应该是达到或超过 BGG的水平。因此，如果小鼠和豚鼠的结核 DNA疫苗免疫效果显示其接近
BGG的水平，再经非灵长类动物的试验验证在证明安全的前提下，就有可能进入人临床试验。
目前美国 FDA批准上临床试验的 6种 DNA疫苗并不都有动物模型的验证，而且至今尚未发现对人体的不良反应。所以，批准结核 DNA疫苗临床试验的时间应该不远了。
思 考 题
研究机体对病原菌免疫防御机制应当分别从哪几方面入手？
基因工程亚单位疫苗与核酸疫苗在构成及诱导机体免疫反应方面有那些主要区别？
面对一种新发现的致病菌，研制疫苗应当在哪几个层次展开？疫苗分子设计应重点考虑哪几个问题？
