细菌多糖、脂多糖及其蛋白质结合疫苗第一节 概论
细菌的荚膜是细菌侵袭机体的物质基础，丧失了荚膜的细菌往往会失去侵袭能力。多糖是构成细菌荚膜的主要成分，荚膜多糖是多种侵袭性细菌表面的一种抗原物质，同时也是一种重要的保护性抗原。
用化学方法纯化的细菌荚膜多糖组分疫苗是
20世纪 80年代以来疫苗发展的重要成就之一，
它和乙型肝炎基因工程疫苗一样，均为组分疫苗，是第二次疫苗革命的标志。
细菌多糖疫苗对肺炎和流行性脑膜炎的预防效果十分显著，但这类疫苗对儿童，尤其是婴幼儿的免疫效果却很差。
如果用化学的方法将细菌多糖与蛋白质偶联起来，就可以克服这个缺点，例如 b型嗜血流感杆菌多糖一蛋白质结合疫苗的临床试验证明，它可为婴幼儿提供安全、有效和持久的免疫保护力。
脂多糖和细菌荚膜多糖的相似之处是都具有致病性，
不同的是荚膜多糖本身没有毒性，而脂多糖是一种对动物和人体具有很大毒性的热稳定物质。
脂多糖和脂寡糖不仅是革兰氏阴性细菌细胞表面的一种主要抗原，而且经实验研究证明也是一种保护性抗原。
将脂多糖作为疫苗或结合疫苗的组成部分，首先要剔除有毒性的类脂 A，然后再与蛋白质载体连接而成结合疫苗。 例如痢疾杆菌脱毒脂多糖一蛋白质结合疫苗能诱发很好的免疫反应和产生有效的免疫保护效果。
第二节 细菌多糖、脂多糖及其与蛋白质的结合
荚膜存在于很多侵袭性细菌表面，与细菌的侵袭力密切相关。
荚膜多糖细菌荚膜的主要成分，也是一种重要的保护性抗原。
用化学方法纯化的细菌美膜多糖组分疫苗来预防传染病，是疫苗发展史中的重要成就之一，其中已在全世界广泛使用的多糖疫苗有流行性脑膜炎球菌的
A,C,Y和 W135等 4价多糖疫苗，以及肺炎双球菌
23价多糖疫苗。
大量临床试验的结果表明，接种多糖疫苗以后的副反应十分罕见，并且对于预防和控制成人和大年龄儿童的相应感染方面的效果显著，大大降低了发病率。 例如我国研究人员曾应用 A群脑膜炎球菌多糖疫苗对 1岁以上的儿童进行现场使用的效果考核，其保护率为 80％－ 90％。
临床试验显示，免疫后血清中的多糖抗体如能达到一定的浓度，就会有免疫保护力。因此特异性多糖抗体的水平可作为评价多糖疫苗效力的一项客观指标。 以 b型嗜血流感杆菌为例，能预防感染的最低血清抗体浓度为 0.15μg/mL。实际上通常以 1μg/mL作为满意的血清抗体浓度。
临床试验发现，多糖疫苗诱导免疫反应的效果与接种者的年龄呈明显的正相关，即年龄小于 2岁的婴幼儿对多糖疫苗的免疫应答十分低下或甚至缺乏。 问题的严重性恰恰在于，
这个年龄组的细菌感染率是最高的。 以美国的 b
型嗜血流感杆菌的感染为例，在未推广接种多糖一蛋白质结合疫苗以前，小于 2岁年龄组的感染率高达 87％，发病率随年龄的增加而下降。
造成上述现象的原因在于细菌多糖属非胸腺依赖性抗原。因此多糖疫苗具有以下特点：
①在幼小动物或婴幼儿体内只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应，免疫反应随年龄的增长而增强。
②产生低亲和力的抗体，主要为 IgM抗体。
③只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆和免疫增强效应。
④容易产生免疫耐受。
⑤普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强的作用。
第三节 细菌多糖结合疫苗
1.结合疫苗的特点 与细菌多糖疫苗相比，
细菌多糖结合疫苗为 TD抗原，其诱导的免疫应答类型不同于 TI抗原，从而优于
TI抗原的免疫效果。
①能增强婴幼儿对细菌多糖的免疫反应。重复接种能产生记忆性免疫增强作用，使主要为 IgG的抗细菌多糖抗原的抗体水平剧增，
对婴幼儿接种后能产生较为持久的免疫保护力。
② 细菌的多糖一蛋白质结合疫苗可成为二价疫苗。这是因为结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白质载体的抗体反应。例如于 1987年经过美国 FDA审核后批准上市的 b型嗜血流感杆菌多糖和白喉类毒素偶联的疫苗能够同时预防流感和白喉这两种传染病。
③能增强老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人对细菌多糖抗原的免疫反应。老年人的免疫功能随年龄的增大而下降，因此对细菌多糖的免疫应答能力很差。例如肺炎是老年人的常见病，肺炎多糖和蛋白质的结合疫苗就可以增强疫苗对老年人的免疫保护力。
结合疫苗也可使一些缺乏对细菌多糖抗原产生免疫反应的个体产生高效价的抗多糖抗原的抗体。
④ 结合疫苗具有载体蛋白质的效应。事先或同时接种蛋白质载体会刺激 T淋巴细胞的增殖，
因而能增强结合疫苗的免疫原性。
目前推荐使用联合疫苗，例如白喉、破伤风、百日咳加上 b型嗜血流感杆菌多糖结合疫苗。它的优点是既能增强多糖抗原的免疫原性，又能减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的皮肉之痛和家长的精神负担。
2.载体的选择必须选择安全有效的蛋白质作为结合疫苗的载体。这种蛋白质必须对人体没有毒性，也不会引起变态反应，同时又能增强多糖的免疫原性。 目前使用的载体主要为相关蛋白质，例如现成的白喉和破伤风类毒素疫苗，经基因突变发生减毒的白喉毒素以及细菌的外膜蛋白质等，而且已经用于临床。
蛋白质载体也可以源于与多糖同一的致病菌，
例如 b型嗜血流感杆菌多糖偶联疫苗可以用该菌的外膜蛋白质作为载体；肺炎多糖偶联疫苗时以用肺炎的溶血素蛋白质作载体，其优点是能具有对不同型别的肺炎球菌感染有交叉免疫保护效果。
还有一些细菌的毒素蛋白质也可作为载体，例如霍乱毒素、霍乱毒素的 B亚单位和大肠杆菌的不耐热肠毒素，因为它们具有佐剂的效应。
结台疫苗的类型
1.以细菌的种类来区分，可分为 呼吸道病原菌的结合疫苗 和 肠道病原菌的结合疫苗 两大类。前者包括 b型嗜血流感杆菌、流行性脑膜炎双球菌和肺炎双球菌；后者则包括痢疾杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌等。
2.若以细菌的组分来区分，可分为 荚膜多糖结合疫苗和 脂多糖结合疫苗 。前者包括凡是有荚膜的细菌，可以是呼吸道的肺炎双球菌荚膜，也可以是肠道的沙门氏菌；
后者则包括许多肠道和呼吸道的革兰氏阴性细菌。
3.若以多糖的分子大小来区分，可分为 多糖结合疫苗和 寡糖结合疫苗 。前者的大分子多糖可来源于细菌的荚膜多糖或者来源于水解脱毒的肠道细菌脂多糖；后者的小分子寡糖主要来源于水解脱毒的脂寡糖，当然也可以来源于进一步降解的多糖或脂多糖。
结合疫苗的连接模式和方法从理论上讲，就某一种多糖抗原而言，可以制备无数种不同的结合疫苗。结合疫苗中的多糖可以是大分子的多糖或脂多糖，也可以是中等或小分子的寡糖；即便是多糖，可以是自然分离的多糖，也可以是经过修饰或衍化的多糖。载体的种类也很多，
可以是相关或无关的天然蛋白质载体，也可以是经过修饰的变异体。
多糖与蛋白质载体结合的广泛选择性
结合疫苗的连接方法种类繁多，概括而言，
其连接模式大致可分为两种。第一种是末端连接模式（ single－ ended condensation
medel）；第二种是交叉连接模式（ cross-
linked condensation model)。
末端连接模式模拟一些天然糖蛋白的结构特征，即在一个载体蛋白质上可连接一定数量的糖链，每一条糖链上只有一个末端位点与蛋白质结合，蛋白质载体与糖链的关系与放射状的太阳光相似。（见下图）
糖链可长可短，其数量可多可少。
糖链与蛋白质载体可直接连接，也可通过小分子桥梁连接。
交叉连接模式该模式的每一个载体蛋白质或每一条糖链都可以有多个相互连接的位点，所产生的结合疫苗形成网状交联体。（见图）。
随着糖链长度的延伸，连接位点的增加，结合疫苗交联体的相对分子质量也会相应变大，其三维空间结构也将更为复杂。
（ 1） Pasteur Merieux Connaught公司制备方法
b型流感杆菌多糖结合疫苗使用 白喉类毒素
（ DT）作为载体,和经过加热处理的小分子 核糖醇磷酸盐多聚体（ PRP） 结合。
化学合成,b型流感杆菌多糖结合疫苗
PRP缺乏末端醛基或可反应的核基，不能和载体直接结合。
首先要藉水溶性碳二亚胺（ EDC）的作用在载体中引进含双功能基团的亲核物质己二酰肼形成载体酰肼衍生物。
PRP经溴化氰活化后，再与载体酰肼衍生物结合，形成结合疫苗。
动物和临床试验的结果证明，该结合疫苗安全有效，美国 FDA于 1987年批准了可在
18个月龄以上的儿童中使用这种结合疫苗，
这是最早被批准用于临床的多糖结合疫苗。
（ 2） Wyeth－ Lederle公司制备方法变异后无毒的白喉类毒素（ CRMl97）作为载体首先将 PRP用酸水解成大约 20个单位的小分子寡糖。
然后使用还原氨基法，通过 Schiff碱基的中间媒体，
形成糖与蛋白质的结合。
该结合疫苗的安全性和免疫效果与前一种结合疫苗的非常相似，目前已在全美国的大部分地区用于临床。
（ 3) Meck Sharp and Dohme制备方法采用 B群流行性脑膜炎球菌的外膜蛋白质作为载体，经中间媒体与 PRP结合。
先将多糖和蛋白质分别衍生，再经过新形成的氨基酸而结合。该疫苗具有以下特点：首先，
合成步骤多，而且涉及有机化学合成，但是每一个步骤都可以进行质量检测，这对于日后疫苗的质量控制非常有益；其次，该疫苗含有脑膜炎球菌的外膜蛋白，因此期望这种结合疫苗能达到多糖和蛋白质抗原的双价疫苗的效果。
该疫苗的临床试验结果与前两种结合疫苗不同，只需对婴儿接种 1次或 2次就能产生高效价的抗体，而前两种结合疫苗则至少需要接种 3次才能产生高效价的抗体。推测可能与 OMP载体效应有关。
（ 4）由于多糖的抗原性是由其中众多的重复单位所决定，化学结合可采用末端连接或糖链上的多位点连接法。但是像脂寡糖这些小分子的寡糖缺失重复的多糖链，为避免化学修饰损害其抗原性，只能采用缓和的末端连接方法。
用经酸水解脱毒的脑膜炎球菌的脂寡糖，通过双功能基团己二酰肼（ ADH）连接到破伤风类毒素上形成结合疫苗。
首先在寡糖的还原末端按基上，藉水溶性碳二亚胺的缩合作用引进 己二酰肼,形成寡糖衍生物（ AH
－ OS），
随后再利用该衍生物上另一端游离的 酰肼 基功能基团与破伤风类毒素上的核基结合。
上述两步反应都形成肽键。
影响结合疫苗免疫原性的因素
①载体蛋白质的种类。数量以及是否在其他疫苗中应用；
②多糖与蛋白质在结合疫苗中的比例及其连接方式；
③致病性细菌多糖血清型的多寡，例如肺炎双球菌有几十种不同的致病性多糖抗原血清型，而在嗜血流感杆菌中，只有 b型菌才具有致病件；
④体内已有的对载体蛋白质及多糖的免疫力，例如从母体获得的抗体，或因接触感染。交叉感染，以及预防接种产生的抗体；
⑤ 多糖的物理性状，例如多糖或寡糖的分子大小、糖链重复单位的多寡以及交叉连接的空间构象；
⑥ 是否含有未结合的多糖及其含量的多少；
⑦ 佐剂的使用；
⑧ 免疫接种的次数，以及接种者的年龄、接种的历史和健康状况。
第三节 脱毒脂多糖－蛋白质结合疫苗脂多糖最初是由 Pfeiffer发现，并从霍乱弧菌分离而得。脂多糖是一种对动物和人体具有毒性的热稳定物质，为了区别于由细菌分泌的热不稳定性外毒素，故取名为内毒素。由于其化学成分含有脂质和多糖或寡糖，故也称脂多糖或脂寡糖。
一、细菌脂多糖的结构特点脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要成分。
其基本结构由 3个部分组成（见图）：类脂 A,10
个左右单糖组成的寡糖核心区、以及 O一特殊链，后者也称重复单位多糖链。
二,抗原性、毒性和免疫保护性肠道革兰氏阴性杆菌脂多糖的抗原性在于由 2－ 8个单糖的重复单位组成的 O一特殊链，并决定该细菌的脂多糖型别。呼吸道革兰氏阴性杆菌脂寡糖的抗原性则由寡糖决定。
脂多糖和脂寡糖的毒性和它们的生物学活性均源自于类脂 A，它可引起感染革兰氏阴性杆菌以后的内毒素休克；可以刺激抗体的产生；刺激免疫反应和增强机体对感染和肿瘤的抵抗力；可作用于单核细胞、吞噬细胞。多型性白细胞,B和 T淋巴细胞、以及血管内皮细胞，产生一系列细胞因子，引起各种对机体有益或有害的生物学反应。
脂多糖作为结合疫苗的组成部分，
必须要将其毒性的类脂 A剔除。
脂多糖和脂寡糖不仅是革兰氏阴性细菌细胞表面的一种主要抗原，而且经大量实验室及临床试验显示，它们也是一种保护性抗原。
以 b型嗜血流感杆菌为例，动物实验的结果显示，小鼠的抗脂寡糖单克隆抗体具有调理及杀菌作用，并能提高攻击后小鼠肺内清除细菌的能力。
人的抗脂寡糖抗体具有在体外的杀菌效应。
小鼠抗流脑脂寡糖的单克隆抗体具有杀菌作用，
并能对裸鼠提供免疫保护作用。
三、脱毒方法目前主要有两种对脂多糖或脂寡糖的脱毒方法，
脱毒后的产物可以作为结合疫苗糖的组分，并可安全地用于临床。
第一种为弱酸处理法，例如用 1％的乙酸煮沸
2－ 3 h，该方法的原理是通过切断寡糖上的 KdO
与类脂 A上的葡糖胺的连接，把类脂 A分子完全除掉。
第二种方法为弱碱处理法，例如用低浓度的氢氧化钠或无水肼，在 37℃ 处理 2－ 3 h。此法通过切断 O酯连接的脂肪酸，把多达 4个脂肪酸链从类脂 A上去除，因而可使其毒性下降 5 000
－ 25 000倍。
上述两种方法均适合于对脂多糖和脂寡糖的脱毒，但第二种方法更适用于脂寡糖，因为弱碱法能较好地保留脂寡糖的免疫原性。
第四节 肺炎球菌荚膜多糖疫苗肺炎球菌是具有荚膜的革兰氏阳性球菌。肺炎球菌感染可以引发肺炎、脑膜炎和中耳炎等多种疾病。在抗生素问世以前，肺炎球菌对人类的危害性很少有其他的病原菌能与之相提并论，因为 70％以上肺炎球菌菌血症的住院病人会转归死亡。
肺炎球菌多糖疫苗的临床研究始于 20世纪 30年代。采用化学方法可将由多糖多聚体组成的肺炎荚膜多糖抗原纯化出来，用作疫苗的主要成分。经与严格的对照组相比，发现 2价,3价和 4价多糖疫苗的免疫效果显著。随后，两个 6价多糖疫苗正式商品化，并投人临床应用。
同一时期，抗生素的伟大发现，尤其是青霉素对肺炎球菌感染的奇特疗效使得肺炎球菌多糖疫苗的研究成为昙花一现。到了 50年代，肺炎球菌多糖疫苗因在市场卜无人问津而被迫退出市场。
1964年，抗生素对肺炎球菌性疾病治疗作用的传奇神话被 Austrian和 GOld的临床病例分析报告击碎。
他们分析了 1952年至 1962年的 2 000个肺炎球菌性肺炎病例，发现近 25％的菌血症患者死亡，老年人的死亡率最高,60岁以上菌血症患者的死亡率高达 50％。
因此，多价肺炎疫苗的研究又重新纳入正常轨道。
临床试验的结果表明，多糖疫苗预防肺炎的免疫保护率可高达 76％－ 92％，对 2岁以上儿童中耳炎的发生具有明显的免疫保护作用。
14价肺炎球菌多糖疫苗于 1977年正式获照上市。随着研究的不断深人,23价多糖疫苗取代了 14价多糖疫苗。
据美国疾病控制和预防中心的调查报告,23价多糖疫苗至少代表了 85％一 90％致病性肺炎球菌的血清型。
肺炎球菌荚膜多糖抗原所诱导产生的血清型特异性抗体具有调理吞噬细胞、活化补体以杀伤肺炎球菌的作用。特异性抗体的水平在接种疫苗后的第一周内开始升高，并可在健康成人中持续
5年之久。
临床和流行病学研究发现容易遭受肺炎球菌攻击的高危人群为 65岁以上的老年人或患有某些慢性疾病超过 2年以上的病人。这些高危人群应该选用 23价肺炎球菌多糖疫苗,5年以后至少复种一次。另外,65岁以前接种的老人，应在 65岁或 65
岁以后再复种一次。
第五节 伤寒沙门氏菌荚膜多糖疫苗伤寒沙门氏杆菌在土壤或水中可存活数月。人类是伤寒沙门氏杆菌的唯一宿主。伤寒的传播主要通过消化道途径。目前，在世界大部分地区，伤寒仍然是一个严重影响人类健康的疾病，每年估计有
1600万病例和大约 60万的患者死亡。治疗伤寒主要靠抗生素，而耐药菌株的不断出现给临床的治疗带来了更大的困难。
沙门氏杆菌是一类革兰氏阴性杆菌，属于肠道杆菌科。细菌的表面包被着一层多糖，即荚膜。沙门氏菌具有复杂的抗原构造，一般可分为 3类抗原：① Vi抗原或表面抗原，即荚膜多糖；② O抗原或细胞壁抗原，是细胞壁的脂多糖，即内毒素；③ H或鞭毛抗原，是一种蛋白质抗原。
不同菌株都有荚膜多糖，它具有抗吞噬作用和保护细菌避免相应抗体在补体参与下的溶菌作用。同时，它可以保护细菌在血液中生存，从而导致败血症。特异性的抗荚膜多糖抗体可以通过活化补体而杀灭伤寒沙门氏杆菌。
20世纪 50年代,Landy发现，用荚膜多糖抗原免疫小鼠能对伤寒沙门氏杆菌的感染具有免疫保护效果。然而当时用乙酸处理为主的工艺制备的纯化 Vi多糖疫苗却没有产生所期望的免疫保护反应，国外的很多研究结果都报告 Vi
多糖疫苗无效。
直到 80年代才经过研究而证明造成 Vi多糖疫苗无效的原因是提取多糖的方法有问题，乙酸处理会使得 Vi多糖变性，从而导致多糖抗原性的丢失。
1984年，美国国立卫生研究院的 Robbins教授与法国 Pasteur Merieux Connaught公司合作，
对 Vi多糖疫苗的生产工艺进行改进，使用溴化十六烷基三甲基氨处理 Vi多糖，得到的非变性多糖可显示良好的免疫原性，从而使第一个商品化的伤寒荚膜多糖疫苗在 1989年问世。
伤寒荚膜多糖疫苗通常是经肌肉注射或皮下深部注射的一次性免疫接种。作为高危人群，建议 3
年后复种一次。
临床试验的结果表明，注射此疫苗后,90
％以上的个体可以在血清中产生至少升高 4倍以上的抗荚膜多糖抗体，这种抗体的水平可以维持 3年之久。但伤寒荚膜多糖疫苗在 2－ 3年后再次接种时，没有免疫记忆反应出现，诱生的特异性抗体水平与首次接种时相近。
伤寒多糖疫苗在伤寒疫区免疫保护的观察全世界共有 2 200万人接种了伤寒荚膜多糖疫苗。其中仅有 6人发生了伤寒感染，而且有 2人的血培养为阴性，另外 2人则是在 3年以前接种的疫苗，
因而只有 2人才能真正被判定为伤寒荚膜多糖疫苗的免疫保护失败。所以从实际效果来看，伤寒荚膜多糖疫苗的免疫保护力要远比上述的临床试验的结果更为理想。从总体上来讲，伤寒荚膜多糖疫苗是安全的，无论是成年人还是儿童，仅有注射局部区域的疼痛，有时伴有短暂的轻度至中度的红斑和硬结，但是没有严重的全身性副反应。
伤寒荚膜多糖疫苗也有它的缺陷之处：
1,不能在 2岁以下的儿童体内产生免疫保护反应。
2,没有对再次接种疫苗的免疫记忆反应，因为它是多糖，是 T淋巴细胞非依赖性抗原。
为了克服这些缺点，荚膜多糖结合疫苗是希望所在。如将伤寒荚膜多糖与破伤风类毒素结合，在给动物接种以后会产生再次接种的免疫记忆反应，即特异性抗体的水平显著高于初次接种后的抗体滴度。目前，伤寒荚膜多糖结合疫苗已经进人了临床试验阶段。
第六节 流行性脑膜炎球菌疫苗柰瑟氏脑膜炎菌系 G-球菌。常见居住于人鼻粘膜的非致病性球菌，没有荚膜包裹；
而从血液或脑脊液中新鲜分离得到的致病性细菌则为典型的荚膜球菌。荚膜多糖是对流脑菌进行血清群分类的基础，根据该菌的两种主要外膜蛋白质和脂多糖的特征，又对进一步将该菌分成不同的血清型、血清亚型和免疫型。目前公认，流脑菌可分为 18个血清型,13种血清亚型和 12种脂多糖免疫型。
1950年以后，由 A群流脑菌引发的流行性脑膜炎在美国和大部分欧洲国家已很少见，而近半数以上的感染是由 B
群流脑菌引起的。但是在世界其他地区，
尤其是中国和中非地区,A群流脑菌仍然是引发流行性脑膜炎的主要菌群。
一、荚膜多糖疫苗流脑 A群和 C群荚膜多糖疫苗是由 Gotschlich等在 20世纪 60年代后期研制出来的。在多次大规模的临床试验中，这些疫苗已被证实能对成人提供极其有效的免疫保护效果。但是多糖疫苗对幼儿所产生的免疫保护力则会因年龄或使用的疫苗不同而产生很大的差异。
在芬兰进行的临床试验结果显示，如果用 A群多糖疫苗进行间隔 3个月的加强免疫，则能产生对 6个月龄婴儿的免疫保护效果。因此，通过定时加强免疫，可提高婴幼儿体内的抗 A群多糖抗体免疫反应，
并使抗体维持在保护性的水平。
二、荚膜多糖一蛋白质结合疫苗意大利 Sclavo公司制造的 A群与 C群流脑多糖结合疫苗已经历数次临床试验的考核，免疫效果良好。该疫苗选用从一株变异菌株制备的无毒性的白喉类毒素 CRM197。作为载体，分别与上述两种多糖结合，以氢氧化铝为佐剂。虽然这种结合疫苗的免疫效果在成人试验中不如经过改良的多糖疫苗好，但是却显著地提高了对婴幼儿的免疫保护效果。
三、去毒脂多糖结合疫苗脂多糖或脂寡糖是流脑菌免疫型分类的物质基础。
由于脂多糖的毒性以及其中某些血清型的分子结构与神经乙酸基团的相似性使得它作为疫苗受到限制。
大多数脂多糖含有一个末端五碳糖结构，
类似人体组织中的某种寡糖结构，因而可导致免疫耐受，引起人们对其免疫保护力的怀疑。
但是动物实验显示，小鼠抗脂多糖的单克隆抗体具有杀菌活性，并能对裸鼠提供免疫保护作用。
用碱水解法可去除脂多糖的部分脂质结构，
或用酸水解法可去除整个类脂 A分子，从而降低其毒性，可达到疫苗安全性的标准。将降解后的脂寡糖或寡糖与蛋白质载体共价结合，组成去毒脂多糖一蛋白质结合疫苗，但迄今尚未有关进人临床试验的报道。
第七节 b型嗜血流感杆菌疫苗
b型嗜血流感杆菌（ Hib）是一种革兰氏阴性短杆菌，常在人的咽部寄居，大多为无荚膜菌株，仅少数从咽部分离得到的菌株有荚膜。
b型嗜血流感杆菌是造成感染的主要病原菌。在小于 5岁的儿童中,95％的嗜血流感杆菌的感染是由 Hib引起的。
每 50－ 100例由 Hih造成感染中，有 30－ 60例为脑炎。
一、荚膜多糖疫苗
b型嗜血流感杆菌的荚膜多糖是核糖和核糖醇磷酸盐（ PRP）的多聚体。 Hib多糖疫苗对成人和大年龄儿童的免疫保护力良好。但对小于 2
岁的婴幼儿则缺乏免疫保护效果。
因此 1985年 FDA批准使用的 Hib多糖疫苗只适用于 2岁以上的儿童，或 18－ 23月龄处于高度感染威胁中的婴儿。
在接种 Hib多糖疫苗以后，特异性的抗 PRP
抗体如能达到 1.0μg/mL时，则具有长期的免疫保护作用；如果在 0,15－ 1.0μg/mL之间，只具有短暂的免疫保护效果。这两个数字已成为评估 ub
多糖疫苗免疫效力的客观指标。
用化学方法纯化的细菌荚膜多糖来预防传染病是第二次疫苗革命的重要成就之一。大规模临床试验的结果表明，接种多糖疫苗以后的副反应十分罕见，过敏反应等严重的副反应仅为 5 X 10－ 4左右。
Hib多糖疫苗在控制成人和大年龄儿童的相应感染方面的效果显著，大大降低了发病率。
二、荚膜多糖一蛋白质结合疫苗
Hih结合疫苗的研制成功是结合疫苗发展史上的一个里程碑。该疫苗于 1987
年经美国 FDA批准并开始用于临床，成功地保护了 2岁以下的婴幼儿人群，使得 b
型嗜血流感杆菌导致的发病率急剧下降。
目前美国市场上有 4个 Hib结合疫苗产品，它们在以下几个方面有不同之处，例如载体蛋白质的选择,PRP分子的大小、连接多糖和载体的
“桥梁”分子、去除游离多糖或蛋白质的方法等。
1.PRP－ DT是 Pasteur Merieux Connaught
公司的产品，其制备的基本步骤是先用水解法降低 PRP的相对分子质量，然后再与白喉类毒素
（ DT）结合，商品名为 PoHIBit；
2,PRP－ OMPC是 Merk公司的产品，其制备方法是将经过乙二酸处理的 PRP（相对分子质量大约是 80 000），与 B群流脑菌的外膜蛋白质结合，商品名为 PedvaxHIB
3,PRP－ TT是在 Robins教授领导的实验室提供的技术基础上，由 Pasteur Merieux公司制造的产品，由天然 PRP与破伤风类毒素结合而成，取名为 ActHIB或 OmniHIB；
4,Lederle－ Praxis公司的产品 HbOC，它与上述 3种产品的差别比较大,PRP经过高碘酸钠处理后成为相对分子质量仅为 3 400－ 11 000的寡糖，
选用的载体蛋白质是变异白喉类毒素 CRM197，商品名为 HibTITER。
上述疫苗均能诱发婴幼儿产生抗 PRP的抗体，但表现出不同免疫原性的差异。
HbOC初次免疫产生的抗 PRP抗体低于检测的水平；
在加强免疫后，抗体的水平可提高到 0.5μg/mL；在第 3
次免疫后则会达到 5μg/mL。
PRP－ OMPC的初次免疫就可使特异性抗体的水平达到 l～ 2μg/mL；加强免疫后就可达到 2－ 5μg/mL的水平，
但再次免疫并不能使抗体水平继续上升。
PRP－ TT的免疫反应效果与 HbOC相似。 PRP－ DT对婴儿的免疫保护力是 4种 Hib多糖一蛋白质偶联疫苗中效果最差的一种，在接种 3次疫苗以后的抗体水平也只能达
0.3μg/mL。
HbOC,PRP－ OMPC,PRP－
TT,PRP－ DT等疫苗已经在世界上许多国家应用。据统计，多糖一蛋白质结合疫苗已经使 5岁以下儿童的 Hib感染率减低了 95％，即从 1987年的 41X 10－ 5降低到 1993年的 2 X 10 － 5,显示了 Hib
多糖一蛋白质结合疫苗对婴幼儿卓越的免疫保护效果。
展 望
自 1987年 FDA批准第一个多糖结合疫苗－－ b型嗜血流感杆菌结合疫苗的临床应用以来，结合疫苗的研究工作已经成为了当今疫苗领域研究的热点之一。
现代免疫学关于抗原识别机制的基础研究成果无疑将大大促进结合疫苗的研究进展。
当今结合疫苗面临的载体蛋白数目有限，而多糖结合疫苗的种类层出不穷。导致 T细胞活化面临载体蛋白资源紧张，必然影响免疫效果。
粘膜免疫与结合疫苗的问题。
细菌的荚膜是细菌侵袭机体的物质基础，丧失了荚膜的细菌往往会失去侵袭能力。多糖是构成细菌荚膜的主要成分，荚膜多糖是多种侵袭性细菌表面的一种抗原物质，同时也是一种重要的保护性抗原。
用化学方法纯化的细菌荚膜多糖组分疫苗是
20世纪 80年代以来疫苗发展的重要成就之一，
它和乙型肝炎基因工程疫苗一样，均为组分疫苗，是第二次疫苗革命的标志。
细菌多糖疫苗对肺炎和流行性脑膜炎的预防效果十分显著，但这类疫苗对儿童，尤其是婴幼儿的免疫效果却很差。
如果用化学的方法将细菌多糖与蛋白质偶联起来，就可以克服这个缺点，例如 b型嗜血流感杆菌多糖一蛋白质结合疫苗的临床试验证明，它可为婴幼儿提供安全、有效和持久的免疫保护力。
脂多糖和细菌荚膜多糖的相似之处是都具有致病性，
不同的是荚膜多糖本身没有毒性，而脂多糖是一种对动物和人体具有很大毒性的热稳定物质。
脂多糖和脂寡糖不仅是革兰氏阴性细菌细胞表面的一种主要抗原，而且经实验研究证明也是一种保护性抗原。
将脂多糖作为疫苗或结合疫苗的组成部分，首先要剔除有毒性的类脂 A，然后再与蛋白质载体连接而成结合疫苗。 例如痢疾杆菌脱毒脂多糖一蛋白质结合疫苗能诱发很好的免疫反应和产生有效的免疫保护效果。
第二节 细菌多糖、脂多糖及其与蛋白质的结合
荚膜存在于很多侵袭性细菌表面，与细菌的侵袭力密切相关。
荚膜多糖细菌荚膜的主要成分，也是一种重要的保护性抗原。
用化学方法纯化的细菌美膜多糖组分疫苗来预防传染病，是疫苗发展史中的重要成就之一，其中已在全世界广泛使用的多糖疫苗有流行性脑膜炎球菌的
A,C,Y和 W135等 4价多糖疫苗，以及肺炎双球菌
23价多糖疫苗。
大量临床试验的结果表明，接种多糖疫苗以后的副反应十分罕见，并且对于预防和控制成人和大年龄儿童的相应感染方面的效果显著，大大降低了发病率。 例如我国研究人员曾应用 A群脑膜炎球菌多糖疫苗对 1岁以上的儿童进行现场使用的效果考核，其保护率为 80％－ 90％。
临床试验显示，免疫后血清中的多糖抗体如能达到一定的浓度，就会有免疫保护力。因此特异性多糖抗体的水平可作为评价多糖疫苗效力的一项客观指标。 以 b型嗜血流感杆菌为例，能预防感染的最低血清抗体浓度为 0.15μg/mL。实际上通常以 1μg/mL作为满意的血清抗体浓度。
临床试验发现，多糖疫苗诱导免疫反应的效果与接种者的年龄呈明显的正相关，即年龄小于 2岁的婴幼儿对多糖疫苗的免疫应答十分低下或甚至缺乏。 问题的严重性恰恰在于，
这个年龄组的细菌感染率是最高的。 以美国的 b
型嗜血流感杆菌的感染为例，在未推广接种多糖一蛋白质结合疫苗以前，小于 2岁年龄组的感染率高达 87％，发病率随年龄的增加而下降。
造成上述现象的原因在于细菌多糖属非胸腺依赖性抗原。因此多糖疫苗具有以下特点：
①在幼小动物或婴幼儿体内只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应，免疫反应随年龄的增长而增强。
②产生低亲和力的抗体，主要为 IgM抗体。
③只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆和免疫增强效应。
④容易产生免疫耐受。
⑤普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强的作用。
第三节 细菌多糖结合疫苗
1.结合疫苗的特点 与细菌多糖疫苗相比，
细菌多糖结合疫苗为 TD抗原，其诱导的免疫应答类型不同于 TI抗原，从而优于
TI抗原的免疫效果。
①能增强婴幼儿对细菌多糖的免疫反应。重复接种能产生记忆性免疫增强作用，使主要为 IgG的抗细菌多糖抗原的抗体水平剧增，
对婴幼儿接种后能产生较为持久的免疫保护力。
② 细菌的多糖一蛋白质结合疫苗可成为二价疫苗。这是因为结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白质载体的抗体反应。例如于 1987年经过美国 FDA审核后批准上市的 b型嗜血流感杆菌多糖和白喉类毒素偶联的疫苗能够同时预防流感和白喉这两种传染病。
③能增强老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人对细菌多糖抗原的免疫反应。老年人的免疫功能随年龄的增大而下降，因此对细菌多糖的免疫应答能力很差。例如肺炎是老年人的常见病，肺炎多糖和蛋白质的结合疫苗就可以增强疫苗对老年人的免疫保护力。
结合疫苗也可使一些缺乏对细菌多糖抗原产生免疫反应的个体产生高效价的抗多糖抗原的抗体。
④ 结合疫苗具有载体蛋白质的效应。事先或同时接种蛋白质载体会刺激 T淋巴细胞的增殖，
因而能增强结合疫苗的免疫原性。
目前推荐使用联合疫苗，例如白喉、破伤风、百日咳加上 b型嗜血流感杆菌多糖结合疫苗。它的优点是既能增强多糖抗原的免疫原性，又能减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的皮肉之痛和家长的精神负担。
2.载体的选择必须选择安全有效的蛋白质作为结合疫苗的载体。这种蛋白质必须对人体没有毒性，也不会引起变态反应，同时又能增强多糖的免疫原性。 目前使用的载体主要为相关蛋白质，例如现成的白喉和破伤风类毒素疫苗，经基因突变发生减毒的白喉毒素以及细菌的外膜蛋白质等，而且已经用于临床。
蛋白质载体也可以源于与多糖同一的致病菌，
例如 b型嗜血流感杆菌多糖偶联疫苗可以用该菌的外膜蛋白质作为载体；肺炎多糖偶联疫苗时以用肺炎的溶血素蛋白质作载体，其优点是能具有对不同型别的肺炎球菌感染有交叉免疫保护效果。
还有一些细菌的毒素蛋白质也可作为载体，例如霍乱毒素、霍乱毒素的 B亚单位和大肠杆菌的不耐热肠毒素，因为它们具有佐剂的效应。
结台疫苗的类型
1.以细菌的种类来区分，可分为 呼吸道病原菌的结合疫苗 和 肠道病原菌的结合疫苗 两大类。前者包括 b型嗜血流感杆菌、流行性脑膜炎双球菌和肺炎双球菌；后者则包括痢疾杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌等。
2.若以细菌的组分来区分，可分为 荚膜多糖结合疫苗和 脂多糖结合疫苗 。前者包括凡是有荚膜的细菌，可以是呼吸道的肺炎双球菌荚膜，也可以是肠道的沙门氏菌；
后者则包括许多肠道和呼吸道的革兰氏阴性细菌。
3.若以多糖的分子大小来区分，可分为 多糖结合疫苗和 寡糖结合疫苗 。前者的大分子多糖可来源于细菌的荚膜多糖或者来源于水解脱毒的肠道细菌脂多糖；后者的小分子寡糖主要来源于水解脱毒的脂寡糖，当然也可以来源于进一步降解的多糖或脂多糖。
结合疫苗的连接模式和方法从理论上讲，就某一种多糖抗原而言，可以制备无数种不同的结合疫苗。结合疫苗中的多糖可以是大分子的多糖或脂多糖，也可以是中等或小分子的寡糖；即便是多糖，可以是自然分离的多糖，也可以是经过修饰或衍化的多糖。载体的种类也很多，
可以是相关或无关的天然蛋白质载体，也可以是经过修饰的变异体。
多糖与蛋白质载体结合的广泛选择性
结合疫苗的连接方法种类繁多，概括而言，
其连接模式大致可分为两种。第一种是末端连接模式（ single－ ended condensation
medel）；第二种是交叉连接模式（ cross-
linked condensation model)。
末端连接模式模拟一些天然糖蛋白的结构特征，即在一个载体蛋白质上可连接一定数量的糖链，每一条糖链上只有一个末端位点与蛋白质结合，蛋白质载体与糖链的关系与放射状的太阳光相似。（见下图）
糖链可长可短，其数量可多可少。
糖链与蛋白质载体可直接连接，也可通过小分子桥梁连接。
交叉连接模式该模式的每一个载体蛋白质或每一条糖链都可以有多个相互连接的位点，所产生的结合疫苗形成网状交联体。（见图）。
随着糖链长度的延伸，连接位点的增加，结合疫苗交联体的相对分子质量也会相应变大，其三维空间结构也将更为复杂。
（ 1） Pasteur Merieux Connaught公司制备方法
b型流感杆菌多糖结合疫苗使用 白喉类毒素
（ DT）作为载体,和经过加热处理的小分子 核糖醇磷酸盐多聚体（ PRP） 结合。
化学合成,b型流感杆菌多糖结合疫苗
PRP缺乏末端醛基或可反应的核基，不能和载体直接结合。
首先要藉水溶性碳二亚胺（ EDC）的作用在载体中引进含双功能基团的亲核物质己二酰肼形成载体酰肼衍生物。
PRP经溴化氰活化后，再与载体酰肼衍生物结合，形成结合疫苗。
动物和临床试验的结果证明，该结合疫苗安全有效，美国 FDA于 1987年批准了可在
18个月龄以上的儿童中使用这种结合疫苗，
这是最早被批准用于临床的多糖结合疫苗。
（ 2） Wyeth－ Lederle公司制备方法变异后无毒的白喉类毒素（ CRMl97）作为载体首先将 PRP用酸水解成大约 20个单位的小分子寡糖。
然后使用还原氨基法，通过 Schiff碱基的中间媒体，
形成糖与蛋白质的结合。
该结合疫苗的安全性和免疫效果与前一种结合疫苗的非常相似，目前已在全美国的大部分地区用于临床。
（ 3) Meck Sharp and Dohme制备方法采用 B群流行性脑膜炎球菌的外膜蛋白质作为载体，经中间媒体与 PRP结合。
先将多糖和蛋白质分别衍生，再经过新形成的氨基酸而结合。该疫苗具有以下特点：首先，
合成步骤多，而且涉及有机化学合成，但是每一个步骤都可以进行质量检测，这对于日后疫苗的质量控制非常有益；其次，该疫苗含有脑膜炎球菌的外膜蛋白，因此期望这种结合疫苗能达到多糖和蛋白质抗原的双价疫苗的效果。
该疫苗的临床试验结果与前两种结合疫苗不同，只需对婴儿接种 1次或 2次就能产生高效价的抗体，而前两种结合疫苗则至少需要接种 3次才能产生高效价的抗体。推测可能与 OMP载体效应有关。
（ 4）由于多糖的抗原性是由其中众多的重复单位所决定，化学结合可采用末端连接或糖链上的多位点连接法。但是像脂寡糖这些小分子的寡糖缺失重复的多糖链，为避免化学修饰损害其抗原性，只能采用缓和的末端连接方法。
用经酸水解脱毒的脑膜炎球菌的脂寡糖，通过双功能基团己二酰肼（ ADH）连接到破伤风类毒素上形成结合疫苗。
首先在寡糖的还原末端按基上，藉水溶性碳二亚胺的缩合作用引进 己二酰肼,形成寡糖衍生物（ AH
－ OS），
随后再利用该衍生物上另一端游离的 酰肼 基功能基团与破伤风类毒素上的核基结合。
上述两步反应都形成肽键。
影响结合疫苗免疫原性的因素
①载体蛋白质的种类。数量以及是否在其他疫苗中应用；
②多糖与蛋白质在结合疫苗中的比例及其连接方式；
③致病性细菌多糖血清型的多寡，例如肺炎双球菌有几十种不同的致病性多糖抗原血清型，而在嗜血流感杆菌中，只有 b型菌才具有致病件；
④体内已有的对载体蛋白质及多糖的免疫力，例如从母体获得的抗体，或因接触感染。交叉感染，以及预防接种产生的抗体；
⑤ 多糖的物理性状，例如多糖或寡糖的分子大小、糖链重复单位的多寡以及交叉连接的空间构象；
⑥ 是否含有未结合的多糖及其含量的多少；
⑦ 佐剂的使用；
⑧ 免疫接种的次数，以及接种者的年龄、接种的历史和健康状况。
第三节 脱毒脂多糖－蛋白质结合疫苗脂多糖最初是由 Pfeiffer发现，并从霍乱弧菌分离而得。脂多糖是一种对动物和人体具有毒性的热稳定物质，为了区别于由细菌分泌的热不稳定性外毒素，故取名为内毒素。由于其化学成分含有脂质和多糖或寡糖，故也称脂多糖或脂寡糖。
一、细菌脂多糖的结构特点脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要成分。
其基本结构由 3个部分组成（见图）：类脂 A,10
个左右单糖组成的寡糖核心区、以及 O一特殊链，后者也称重复单位多糖链。
二,抗原性、毒性和免疫保护性肠道革兰氏阴性杆菌脂多糖的抗原性在于由 2－ 8个单糖的重复单位组成的 O一特殊链，并决定该细菌的脂多糖型别。呼吸道革兰氏阴性杆菌脂寡糖的抗原性则由寡糖决定。
脂多糖和脂寡糖的毒性和它们的生物学活性均源自于类脂 A，它可引起感染革兰氏阴性杆菌以后的内毒素休克；可以刺激抗体的产生；刺激免疫反应和增强机体对感染和肿瘤的抵抗力；可作用于单核细胞、吞噬细胞。多型性白细胞,B和 T淋巴细胞、以及血管内皮细胞，产生一系列细胞因子，引起各种对机体有益或有害的生物学反应。
脂多糖作为结合疫苗的组成部分，
必须要将其毒性的类脂 A剔除。
脂多糖和脂寡糖不仅是革兰氏阴性细菌细胞表面的一种主要抗原，而且经大量实验室及临床试验显示，它们也是一种保护性抗原。
以 b型嗜血流感杆菌为例，动物实验的结果显示，小鼠的抗脂寡糖单克隆抗体具有调理及杀菌作用，并能提高攻击后小鼠肺内清除细菌的能力。
人的抗脂寡糖抗体具有在体外的杀菌效应。
小鼠抗流脑脂寡糖的单克隆抗体具有杀菌作用，
并能对裸鼠提供免疫保护作用。
三、脱毒方法目前主要有两种对脂多糖或脂寡糖的脱毒方法，
脱毒后的产物可以作为结合疫苗糖的组分，并可安全地用于临床。
第一种为弱酸处理法，例如用 1％的乙酸煮沸
2－ 3 h，该方法的原理是通过切断寡糖上的 KdO
与类脂 A上的葡糖胺的连接，把类脂 A分子完全除掉。
第二种方法为弱碱处理法，例如用低浓度的氢氧化钠或无水肼，在 37℃ 处理 2－ 3 h。此法通过切断 O酯连接的脂肪酸，把多达 4个脂肪酸链从类脂 A上去除，因而可使其毒性下降 5 000
－ 25 000倍。
上述两种方法均适合于对脂多糖和脂寡糖的脱毒，但第二种方法更适用于脂寡糖，因为弱碱法能较好地保留脂寡糖的免疫原性。
第四节 肺炎球菌荚膜多糖疫苗肺炎球菌是具有荚膜的革兰氏阳性球菌。肺炎球菌感染可以引发肺炎、脑膜炎和中耳炎等多种疾病。在抗生素问世以前，肺炎球菌对人类的危害性很少有其他的病原菌能与之相提并论，因为 70％以上肺炎球菌菌血症的住院病人会转归死亡。
肺炎球菌多糖疫苗的临床研究始于 20世纪 30年代。采用化学方法可将由多糖多聚体组成的肺炎荚膜多糖抗原纯化出来，用作疫苗的主要成分。经与严格的对照组相比，发现 2价,3价和 4价多糖疫苗的免疫效果显著。随后，两个 6价多糖疫苗正式商品化，并投人临床应用。
同一时期，抗生素的伟大发现，尤其是青霉素对肺炎球菌感染的奇特疗效使得肺炎球菌多糖疫苗的研究成为昙花一现。到了 50年代，肺炎球菌多糖疫苗因在市场卜无人问津而被迫退出市场。
1964年，抗生素对肺炎球菌性疾病治疗作用的传奇神话被 Austrian和 GOld的临床病例分析报告击碎。
他们分析了 1952年至 1962年的 2 000个肺炎球菌性肺炎病例，发现近 25％的菌血症患者死亡，老年人的死亡率最高,60岁以上菌血症患者的死亡率高达 50％。
因此，多价肺炎疫苗的研究又重新纳入正常轨道。
临床试验的结果表明，多糖疫苗预防肺炎的免疫保护率可高达 76％－ 92％，对 2岁以上儿童中耳炎的发生具有明显的免疫保护作用。
14价肺炎球菌多糖疫苗于 1977年正式获照上市。随着研究的不断深人,23价多糖疫苗取代了 14价多糖疫苗。
据美国疾病控制和预防中心的调查报告,23价多糖疫苗至少代表了 85％一 90％致病性肺炎球菌的血清型。
肺炎球菌荚膜多糖抗原所诱导产生的血清型特异性抗体具有调理吞噬细胞、活化补体以杀伤肺炎球菌的作用。特异性抗体的水平在接种疫苗后的第一周内开始升高，并可在健康成人中持续
5年之久。
临床和流行病学研究发现容易遭受肺炎球菌攻击的高危人群为 65岁以上的老年人或患有某些慢性疾病超过 2年以上的病人。这些高危人群应该选用 23价肺炎球菌多糖疫苗,5年以后至少复种一次。另外,65岁以前接种的老人，应在 65岁或 65
岁以后再复种一次。
第五节 伤寒沙门氏菌荚膜多糖疫苗伤寒沙门氏杆菌在土壤或水中可存活数月。人类是伤寒沙门氏杆菌的唯一宿主。伤寒的传播主要通过消化道途径。目前，在世界大部分地区，伤寒仍然是一个严重影响人类健康的疾病，每年估计有
1600万病例和大约 60万的患者死亡。治疗伤寒主要靠抗生素，而耐药菌株的不断出现给临床的治疗带来了更大的困难。
沙门氏杆菌是一类革兰氏阴性杆菌，属于肠道杆菌科。细菌的表面包被着一层多糖，即荚膜。沙门氏菌具有复杂的抗原构造，一般可分为 3类抗原：① Vi抗原或表面抗原，即荚膜多糖；② O抗原或细胞壁抗原，是细胞壁的脂多糖，即内毒素；③ H或鞭毛抗原，是一种蛋白质抗原。
不同菌株都有荚膜多糖，它具有抗吞噬作用和保护细菌避免相应抗体在补体参与下的溶菌作用。同时，它可以保护细菌在血液中生存，从而导致败血症。特异性的抗荚膜多糖抗体可以通过活化补体而杀灭伤寒沙门氏杆菌。
20世纪 50年代,Landy发现，用荚膜多糖抗原免疫小鼠能对伤寒沙门氏杆菌的感染具有免疫保护效果。然而当时用乙酸处理为主的工艺制备的纯化 Vi多糖疫苗却没有产生所期望的免疫保护反应，国外的很多研究结果都报告 Vi
多糖疫苗无效。
直到 80年代才经过研究而证明造成 Vi多糖疫苗无效的原因是提取多糖的方法有问题，乙酸处理会使得 Vi多糖变性，从而导致多糖抗原性的丢失。
1984年，美国国立卫生研究院的 Robbins教授与法国 Pasteur Merieux Connaught公司合作，
对 Vi多糖疫苗的生产工艺进行改进，使用溴化十六烷基三甲基氨处理 Vi多糖，得到的非变性多糖可显示良好的免疫原性，从而使第一个商品化的伤寒荚膜多糖疫苗在 1989年问世。
伤寒荚膜多糖疫苗通常是经肌肉注射或皮下深部注射的一次性免疫接种。作为高危人群，建议 3
年后复种一次。
临床试验的结果表明，注射此疫苗后,90
％以上的个体可以在血清中产生至少升高 4倍以上的抗荚膜多糖抗体，这种抗体的水平可以维持 3年之久。但伤寒荚膜多糖疫苗在 2－ 3年后再次接种时，没有免疫记忆反应出现，诱生的特异性抗体水平与首次接种时相近。
伤寒多糖疫苗在伤寒疫区免疫保护的观察全世界共有 2 200万人接种了伤寒荚膜多糖疫苗。其中仅有 6人发生了伤寒感染，而且有 2人的血培养为阴性，另外 2人则是在 3年以前接种的疫苗，
因而只有 2人才能真正被判定为伤寒荚膜多糖疫苗的免疫保护失败。所以从实际效果来看，伤寒荚膜多糖疫苗的免疫保护力要远比上述的临床试验的结果更为理想。从总体上来讲，伤寒荚膜多糖疫苗是安全的，无论是成年人还是儿童，仅有注射局部区域的疼痛，有时伴有短暂的轻度至中度的红斑和硬结，但是没有严重的全身性副反应。
伤寒荚膜多糖疫苗也有它的缺陷之处：
1,不能在 2岁以下的儿童体内产生免疫保护反应。
2,没有对再次接种疫苗的免疫记忆反应，因为它是多糖，是 T淋巴细胞非依赖性抗原。
为了克服这些缺点，荚膜多糖结合疫苗是希望所在。如将伤寒荚膜多糖与破伤风类毒素结合，在给动物接种以后会产生再次接种的免疫记忆反应，即特异性抗体的水平显著高于初次接种后的抗体滴度。目前，伤寒荚膜多糖结合疫苗已经进人了临床试验阶段。
第六节 流行性脑膜炎球菌疫苗柰瑟氏脑膜炎菌系 G-球菌。常见居住于人鼻粘膜的非致病性球菌，没有荚膜包裹；
而从血液或脑脊液中新鲜分离得到的致病性细菌则为典型的荚膜球菌。荚膜多糖是对流脑菌进行血清群分类的基础，根据该菌的两种主要外膜蛋白质和脂多糖的特征，又对进一步将该菌分成不同的血清型、血清亚型和免疫型。目前公认，流脑菌可分为 18个血清型,13种血清亚型和 12种脂多糖免疫型。
1950年以后，由 A群流脑菌引发的流行性脑膜炎在美国和大部分欧洲国家已很少见，而近半数以上的感染是由 B
群流脑菌引起的。但是在世界其他地区，
尤其是中国和中非地区,A群流脑菌仍然是引发流行性脑膜炎的主要菌群。
一、荚膜多糖疫苗流脑 A群和 C群荚膜多糖疫苗是由 Gotschlich等在 20世纪 60年代后期研制出来的。在多次大规模的临床试验中，这些疫苗已被证实能对成人提供极其有效的免疫保护效果。但是多糖疫苗对幼儿所产生的免疫保护力则会因年龄或使用的疫苗不同而产生很大的差异。
在芬兰进行的临床试验结果显示，如果用 A群多糖疫苗进行间隔 3个月的加强免疫，则能产生对 6个月龄婴儿的免疫保护效果。因此，通过定时加强免疫，可提高婴幼儿体内的抗 A群多糖抗体免疫反应，
并使抗体维持在保护性的水平。
二、荚膜多糖一蛋白质结合疫苗意大利 Sclavo公司制造的 A群与 C群流脑多糖结合疫苗已经历数次临床试验的考核，免疫效果良好。该疫苗选用从一株变异菌株制备的无毒性的白喉类毒素 CRM197。作为载体，分别与上述两种多糖结合，以氢氧化铝为佐剂。虽然这种结合疫苗的免疫效果在成人试验中不如经过改良的多糖疫苗好，但是却显著地提高了对婴幼儿的免疫保护效果。
三、去毒脂多糖结合疫苗脂多糖或脂寡糖是流脑菌免疫型分类的物质基础。
由于脂多糖的毒性以及其中某些血清型的分子结构与神经乙酸基团的相似性使得它作为疫苗受到限制。
大多数脂多糖含有一个末端五碳糖结构，
类似人体组织中的某种寡糖结构，因而可导致免疫耐受，引起人们对其免疫保护力的怀疑。
但是动物实验显示，小鼠抗脂多糖的单克隆抗体具有杀菌活性，并能对裸鼠提供免疫保护作用。
用碱水解法可去除脂多糖的部分脂质结构，
或用酸水解法可去除整个类脂 A分子，从而降低其毒性，可达到疫苗安全性的标准。将降解后的脂寡糖或寡糖与蛋白质载体共价结合，组成去毒脂多糖一蛋白质结合疫苗，但迄今尚未有关进人临床试验的报道。
第七节 b型嗜血流感杆菌疫苗
b型嗜血流感杆菌（ Hib）是一种革兰氏阴性短杆菌，常在人的咽部寄居，大多为无荚膜菌株，仅少数从咽部分离得到的菌株有荚膜。
b型嗜血流感杆菌是造成感染的主要病原菌。在小于 5岁的儿童中,95％的嗜血流感杆菌的感染是由 Hib引起的。
每 50－ 100例由 Hih造成感染中，有 30－ 60例为脑炎。
一、荚膜多糖疫苗
b型嗜血流感杆菌的荚膜多糖是核糖和核糖醇磷酸盐（ PRP）的多聚体。 Hib多糖疫苗对成人和大年龄儿童的免疫保护力良好。但对小于 2
岁的婴幼儿则缺乏免疫保护效果。
因此 1985年 FDA批准使用的 Hib多糖疫苗只适用于 2岁以上的儿童，或 18－ 23月龄处于高度感染威胁中的婴儿。
在接种 Hib多糖疫苗以后，特异性的抗 PRP
抗体如能达到 1.0μg/mL时，则具有长期的免疫保护作用；如果在 0,15－ 1.0μg/mL之间，只具有短暂的免疫保护效果。这两个数字已成为评估 ub
多糖疫苗免疫效力的客观指标。
用化学方法纯化的细菌荚膜多糖来预防传染病是第二次疫苗革命的重要成就之一。大规模临床试验的结果表明，接种多糖疫苗以后的副反应十分罕见，过敏反应等严重的副反应仅为 5 X 10－ 4左右。
Hib多糖疫苗在控制成人和大年龄儿童的相应感染方面的效果显著，大大降低了发病率。
二、荚膜多糖一蛋白质结合疫苗
Hih结合疫苗的研制成功是结合疫苗发展史上的一个里程碑。该疫苗于 1987
年经美国 FDA批准并开始用于临床，成功地保护了 2岁以下的婴幼儿人群，使得 b
型嗜血流感杆菌导致的发病率急剧下降。
目前美国市场上有 4个 Hib结合疫苗产品，它们在以下几个方面有不同之处，例如载体蛋白质的选择,PRP分子的大小、连接多糖和载体的
“桥梁”分子、去除游离多糖或蛋白质的方法等。
1.PRP－ DT是 Pasteur Merieux Connaught
公司的产品，其制备的基本步骤是先用水解法降低 PRP的相对分子质量，然后再与白喉类毒素
（ DT）结合，商品名为 PoHIBit；
2,PRP－ OMPC是 Merk公司的产品，其制备方法是将经过乙二酸处理的 PRP（相对分子质量大约是 80 000），与 B群流脑菌的外膜蛋白质结合，商品名为 PedvaxHIB
3,PRP－ TT是在 Robins教授领导的实验室提供的技术基础上，由 Pasteur Merieux公司制造的产品，由天然 PRP与破伤风类毒素结合而成，取名为 ActHIB或 OmniHIB；
4,Lederle－ Praxis公司的产品 HbOC，它与上述 3种产品的差别比较大,PRP经过高碘酸钠处理后成为相对分子质量仅为 3 400－ 11 000的寡糖，
选用的载体蛋白质是变异白喉类毒素 CRM197，商品名为 HibTITER。
上述疫苗均能诱发婴幼儿产生抗 PRP的抗体，但表现出不同免疫原性的差异。
HbOC初次免疫产生的抗 PRP抗体低于检测的水平；
在加强免疫后，抗体的水平可提高到 0.5μg/mL；在第 3
次免疫后则会达到 5μg/mL。
PRP－ OMPC的初次免疫就可使特异性抗体的水平达到 l～ 2μg/mL；加强免疫后就可达到 2－ 5μg/mL的水平，
但再次免疫并不能使抗体水平继续上升。
PRP－ TT的免疫反应效果与 HbOC相似。 PRP－ DT对婴儿的免疫保护力是 4种 Hib多糖一蛋白质偶联疫苗中效果最差的一种，在接种 3次疫苗以后的抗体水平也只能达
0.3μg/mL。
HbOC,PRP－ OMPC,PRP－
TT,PRP－ DT等疫苗已经在世界上许多国家应用。据统计，多糖一蛋白质结合疫苗已经使 5岁以下儿童的 Hib感染率减低了 95％，即从 1987年的 41X 10－ 5降低到 1993年的 2 X 10 － 5,显示了 Hib
多糖一蛋白质结合疫苗对婴幼儿卓越的免疫保护效果。
展 望
自 1987年 FDA批准第一个多糖结合疫苗－－ b型嗜血流感杆菌结合疫苗的临床应用以来，结合疫苗的研究工作已经成为了当今疫苗领域研究的热点之一。
现代免疫学关于抗原识别机制的基础研究成果无疑将大大促进结合疫苗的研究进展。
当今结合疫苗面临的载体蛋白数目有限，而多糖结合疫苗的种类层出不穷。导致 T细胞活化面临载体蛋白资源紧张，必然影响免疫效果。
粘膜免疫与结合疫苗的问题。
