第十四章基因重组和基因工程授课教师 郑志 竑第一节 DNA的重组
DNA Recombination
一、同源重组发生在同源序列间的重组称为 同源重组 (homologous recombination)，又称 基本重组 。是最基本的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
二、细菌的基因转移与重组
（一） 接合作用 (conjugation),当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒 DNA从一个细胞 (细菌 )转移至另一细胞（细菌）,
这种类型的 DNA转移称为 接合作用 。
质粒,细菌染色体外的环状双链 DNA分子。
可接合质粒，如 F 因子 (F factor)
（二） 转化作用 (transformation),通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
（三） 转导作用 (transduction),当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的 DNA转移及基因重组即为转导作用 。
第二节 重组 DNA技术一、重组 DNA技术相关概念
（一） DNA克隆（也称基因克隆或重组 DNA）
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质 DNA与载体 DNA接合成具有自我复制能力的 DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一 DNA分子。
生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、
酶工程、细胞工程等基因工程 ----实现基因克隆所采用的方法及相关的工作称基因工程,
又称重组 DNA工艺学。
目的,1、分离获得某一感兴趣的基因或 DNA序列
2、获得感兴趣基因的表达产物 (蛋白质 )
（二） 工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶 I
逆转录酶
T4DNA 连接酶
碱性磷酸酶
末端转移酶
Taq DNA聚合酶限制性核酸内切酶 (restriction
endonuclease),识别 DNA的特异序列,
并在识别位点或其周围切割双链 DNA
的一类内切酶。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
BamHⅠ
Ⅱ 类酶识别序列特点 — 回文结构
BamHⅠ
GTC
CAG
G
CCTAG
GATCC
G+
GGATCC
CCTAGG
HindⅡ
GTCGAC
CAGCTG
GAC
CTG+
平端切口 粘端切口
（三）目的基因（又称外源 DNA）
cDNA：经反转录合成的、与 RNA
（ mRNA或病毒 RNA）互补的单链 DNA。
基因组 DNA,在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体 DNA（染色体 DNA）和线粒体 DNA的全部序列。
（四）基因载体（克隆载体）,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。
常用载体,质粒 DNA、噬菌体 DNA、病毒 DNA
克隆载体 (cloning vector)：为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意设计的载体 。
表达载体 (expression vector)：为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体 。
二、重组 DNA技术基本原理及步骤
1、目的基因的获取
2、基因载体的选择与构建
3、目的基因与载体的拼接
4、重组 DNA分子导入受体细胞
5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子（转化子）
（一）目的基因的获取
1、化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。
2、基因组 DNA文库 (genomic DNA library)
组织或细胞染色体 DNA
基因片断克隆载体重组 DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组 DNA文库,
存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组 DNA的集合。
3,cDNA文库,以 mRNA为模板，利用反转录酶合成与 mRNA互补的 DNA，再复制成双链 cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得 cDNA文库
（ cDNA library）。
组织或培养细胞 载 体
mRNA
cDNA
cDNA与载体连接导入大肠杆菌鉴定 cDNA文库的克隆数与特征
（二）克隆载体的选择常用载体,质粒 DNA、噬菌体 DNA、病毒 DNA
载体的选择标准：
能自主复制；
具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
有克隆位点（外源 DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
分子量小，以容纳较大的外源 DNA。
（三）外源基因与载体的连接
1、粘性末端连接：
同一限制酶切割位点连接
配伍末端连接
2、平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端
3、同聚物加尾连接由末端转移酶作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
4、人工接头：
由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。
（四）重组 DNA导入受体菌：
受体菌条件,安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态导入方式,转化 (transformation)
转染 (transfection)
感染 (infection)
（五）重组体的筛选
1、直接选择：
抗药性标记选择插入失活法标志补救分子杂交法：
原位杂交,Southern印迹原位杂交
2、非直接选择法：
免疫学方法：如免疫化学方法酶免检测法
重组 DNA技术简单概括为：
,分、切、接、转、筛,
第三节重组 DNA技术与医学的关系
（一）疾病基因的发现与克隆
（二）生物制药
（三）基因诊断
（四）基因治疗
（五）遗传病的预防小 结
自然界基因转移伴发重组的形式有多种。
细菌的基因转移包括接合、转化、转导作用等，在这些过程中不同 DNA分子间发生的共价连接即为重组。
重组 DNA（基因克隆）技术是应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体 DNA接合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子，经扩增提取获得大量同一 DNA分子。
重组 DNA技术的基本过程可概括为,分、
切、接、转、筛,。
DNA Recombination
一、同源重组发生在同源序列间的重组称为 同源重组 (homologous recombination)，又称 基本重组 。是最基本的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
二、细菌的基因转移与重组
（一） 接合作用 (conjugation),当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒 DNA从一个细胞 (细菌 )转移至另一细胞（细菌）,
这种类型的 DNA转移称为 接合作用 。
质粒,细菌染色体外的环状双链 DNA分子。
可接合质粒，如 F 因子 (F factor)
（二） 转化作用 (transformation),通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
（三） 转导作用 (transduction),当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的 DNA转移及基因重组即为转导作用 。
第二节 重组 DNA技术一、重组 DNA技术相关概念
（一） DNA克隆（也称基因克隆或重组 DNA）
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质 DNA与载体 DNA接合成具有自我复制能力的 DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一 DNA分子。
生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、
酶工程、细胞工程等基因工程 ----实现基因克隆所采用的方法及相关的工作称基因工程,
又称重组 DNA工艺学。
目的,1、分离获得某一感兴趣的基因或 DNA序列
2、获得感兴趣基因的表达产物 (蛋白质 )
（二） 工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶 I
逆转录酶
T4DNA 连接酶
碱性磷酸酶
末端转移酶
Taq DNA聚合酶限制性核酸内切酶 (restriction
endonuclease),识别 DNA的特异序列,
并在识别位点或其周围切割双链 DNA
的一类内切酶。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
BamHⅠ
Ⅱ 类酶识别序列特点 — 回文结构
BamHⅠ
GTC
CAG
G
CCTAG
GATCC
G+
GGATCC
CCTAGG
HindⅡ
GTCGAC
CAGCTG
GAC
CTG+
平端切口 粘端切口
（三）目的基因（又称外源 DNA）
cDNA：经反转录合成的、与 RNA
（ mRNA或病毒 RNA）互补的单链 DNA。
基因组 DNA,在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体 DNA（染色体 DNA）和线粒体 DNA的全部序列。
（四）基因载体（克隆载体）,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。
常用载体,质粒 DNA、噬菌体 DNA、病毒 DNA
克隆载体 (cloning vector)：为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意设计的载体 。
表达载体 (expression vector)：为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体 。
二、重组 DNA技术基本原理及步骤
1、目的基因的获取
2、基因载体的选择与构建
3、目的基因与载体的拼接
4、重组 DNA分子导入受体细胞
5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子（转化子）
（一）目的基因的获取
1、化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。
2、基因组 DNA文库 (genomic DNA library)
组织或细胞染色体 DNA
基因片断克隆载体重组 DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组 DNA文库,
存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组 DNA的集合。
3,cDNA文库,以 mRNA为模板，利用反转录酶合成与 mRNA互补的 DNA，再复制成双链 cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得 cDNA文库
（ cDNA library）。
组织或培养细胞 载 体
mRNA
cDNA
cDNA与载体连接导入大肠杆菌鉴定 cDNA文库的克隆数与特征
（二）克隆载体的选择常用载体,质粒 DNA、噬菌体 DNA、病毒 DNA
载体的选择标准：
能自主复制；
具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
有克隆位点（外源 DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
分子量小，以容纳较大的外源 DNA。
（三）外源基因与载体的连接
1、粘性末端连接：
同一限制酶切割位点连接
配伍末端连接
2、平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端
3、同聚物加尾连接由末端转移酶作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
4、人工接头：
由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。
（四）重组 DNA导入受体菌：
受体菌条件,安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态导入方式,转化 (transformation)
转染 (transfection)
感染 (infection)
（五）重组体的筛选
1、直接选择：
抗药性标记选择插入失活法标志补救分子杂交法：
原位杂交,Southern印迹原位杂交
2、非直接选择法：
免疫学方法：如免疫化学方法酶免检测法
重组 DNA技术简单概括为：
,分、切、接、转、筛,
第三节重组 DNA技术与医学的关系
（一）疾病基因的发现与克隆
（二）生物制药
（三）基因诊断
（四）基因治疗
（五）遗传病的预防小 结
自然界基因转移伴发重组的形式有多种。
细菌的基因转移包括接合、转化、转导作用等，在这些过程中不同 DNA分子间发生的共价连接即为重组。
重组 DNA（基因克隆）技术是应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体 DNA接合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子，经扩增提取获得大量同一 DNA分子。
重组 DNA技术的基本过程可概括为,分、
切、接、转、筛,。
