核酸的生物合成第一节 DNA的生物合成第二节 RNA的生物合成第三节 基因工程的简介
DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在 DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过 DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自 DNA转录给 RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。
中 心 法 则 1964-1970 劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌 RNA病毒病毒（复制）复制转录
DNA RNA 蛋白质翻译逆转录
1958年，遗传信息的单向
Reverse
transcription
中心法则的遗传流向有 5条途径
1,DNA→DNA,DNA复制
（以 DNA为模板合成 DNA）
2,RNA →RNA,RNA复制
（以 RNA为模板合成 RNA）
3,DNA → RNA,DNA转录
（以 DNA为模板合成 RNA）
4,RNA → DNA,反 (逆 )转录
（以 RNA为模板合成 DNA）
5,RNA → Protein,翻译复制,亲代 DNA或 RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代 DNA或 RNA的过程。
转录,以 DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给 RNA,形成一条与 DNA
链互补的 RNA的过程。
翻译,亦叫转译，以 mRNA为模板，将
mRNA的密码解读成蛋白质的 AA顺序的过程。
逆转录,以 RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成 DNA的过程。
第一节 DNA的生物合成一,DNA的半保留复制二,与 DNA复制有关的酶和蛋白质三,DNA的复制过程四,逆转录五,DNA的损伤修复一,DNA的半保留复制定义,由亲代 DNA生成子代 DNA时，每个新形成的子代 DNA中，一条链来自亲代 DNA,而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫 半保留复制半保留复制的实验证据,1958年 Meselson和
Stahl用同位素 15N标记大肠杆菌 DNA,首先证明了 DNA的半保留复制。
15N-DNA的密度大于 14N-DNA的密度
DNA的半保留复制的生物学意义：
DNA的半保留复制表明 DNA在代谢上的稳定性,保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。
DNA在代谢上的稳定性并非指 DNA是一种惰性物质。
二、与 DNA复制有关的酶和蛋白质原料,四种脱氧核苷三磷酸（ dATP,dGTP、
dCTP,dTTP)
模板,以 DNA的两条链为模板链，合成子代 DNA。
引物,一小段 RNA(或 DNA） 为引物，在大肠杆菌中,DNA的合成需要一段 RNA链作为 引物。
催化因子
1.引物合成酶（引发酶）,此酶以 DNA为模板合成一段 RNA,这段 RNA作为合成 DNA的引物（ Primer)。 实质是以 DNA为模板的 RNA聚合酶 。
2.DNA聚合酶,以 DNA为模板的 DNA合成酶，其催化反应的特点 （ 1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物；（ 2）
反应需要有模板的指导；（ 3）反应需要有 3?-OH存在；
（ 4） DNA链的合成方向为 5 3?
N3? 5?
5? OOH PPP-O-CH2
OH
生物大分子合成：
底物、酶、
能量,模板
P329需要模板的例证
（ 5） DNA聚合酶的反应可以利用 DNA双链作为模板和引物，亦可以单链 DNA作为模板和引物
（ 6） DNA的体外聚合必须加入少量的 DNA才能进行。 DNA在提取过程中易形成切口
（ nick） 或缺口（ gap）,则加入的 DNA一条链作为模板而另一条链可作为引物。
原核生物中的 DNA聚合酶在大肠杆菌中发现有三种 DNA聚合酶（ 用突变株研究其功能 ）：
⑴ DNA聚合酶 Ⅰ,单体酶,多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是 O-二氮杂菲），多功能酶。 它具有 5 3?聚合酶功能 （对脱氧核苷酸的选择）； 3’? 5’ 外切酶活性 （对双链无作用，
校对功能。 但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）
及 5’? 3’ 外切酶活性 （双链有效，主要是对 DNA损伤的修复，
以及在 DNA复制时 RNA引物切除及其空隙的填补）；在 DNA链的 3
形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与 dNTP之间的焦磷酸基交换。
⑵ DNA聚合酶 Ⅱ,多亚基酶,聚合作用，但聚合活力很低；
具有 3’? 5’ 外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的 DNA损伤中起作用。
⑶ DNA聚合酶 Ⅲ,是原核生物 DNA复制的主要聚合酶,该酶由 10种亚基组成，其中?,?,?形成全酶的核心酶 。具有 5’?3’ DNA聚合酶活性（?亚基，
速率高）； 具有 3’? 5’ 外切酶（?亚基） 的校对功能，提高 DNA复制的保真性；还具有 5’? 3’
外切酶活性（单链有效，其意义未知）。
（ 4） DNA聚合酶 IV和 V,1999年发现，当 DNA严重损伤时，诱导产生。
DNA聚合酶 Ⅰ DNA聚合酶 Ⅱ DNA聚合酶 Ⅲ
亚基数目 1（单体酶） ＞ 1（多亚基酶 ） ＞ 1（多亚基酶）
5’ 3’ 聚合活性 + 中 + 很低 + 很高
3‘ 5’ 外切活性 + + +
（保护 DNA复制的忠实性 fidelity）
5‘ 3’外切活性 + - -
主要是对 DNA损伤的修复；以及在 DNA复制时切除 RNA引物并填补其留下的空隙。
修复紫外光引起的 DNA损伤
DNA 复制的主要聚合酶，还具有
3’ -5‘ 外切酶的校对功能，提高 DNA复制的保真性在真核细胞内有五种 DNA聚合酶 （与细菌 DNA
聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）
α β γ δ
ε
定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核
3‘ -5’
外切 - - + +
+
酶活性功能引物合成修复作用线粒体 DNA
的复制核 DNA
的复制修复作用
3,DNA连接酶（ 1967年发现）,若双链 DNA中一条链有切口，一端是 3’ -OH,另一端是 5‘ -磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。
但是它不能将两条游离的 DNA单链连接起来。
大肠杆菌和其它细菌的 DNA连接酶要求 NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求 ATP提供能量。 T4噬菌体的 DNA连接酶 不仅能在模板链上连接 DNA和 DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链 DNA。
3‘ 5‘
3‘5‘
OH P
连接酶的反应机制,
酶 + NAD+(ATP) 酶 -AMP + 烟酰胺单核苷酸 （ PPi）
酶 -AMP + P-5‘-DNA 酶 + AMP-P-5’-DNA
DNA-3’-OH + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-O-P-5’-
DNA+AMP
DNA连接酶 在 DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用拓扑异构酶?,使 DNA一条链发生断裂和再连接 。 作用是松解负超螺旋,反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。
拓扑异构酶 Π,使 DNA两条链发生断裂和再连接。 当引入负超螺旋 时需要由 ATP提供能量，同复制有关。
二者共同控制 DNA的拓扑结构。
5、解螺旋酶 （解链酶）,通过水解 ATP将 DNA两条链打开。 E.coli中的 rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶 I,II,III。 每解开一对碱基需要水解 2个 ATP分子。
4,拓扑异构酶,催化 DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在 DNA
重组修复和其他转变方面起重要作用。
除连环数不同外其它性质均相同的 DNA分子称为拓扑异构体，
引起拓扑异构体反应的酶称为 拓扑异构酶
6.其它蛋白因子：
⑴单链结合蛋白 (SSB-single-strand binding
protein),稳定已被解开的 DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
⑵引发前体,它由多种蛋白质 dnaA,dnaB,dnaC,n,n’,n’’
和 i组成。 引发前体再与引发酶结合组装成引发体 。
引发体可以沿模板链 5’? 3’ 方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位臵上即可引发 RNA引物的合成。
移动和引发均需要 ATP提供能量,n’蛋白具有 ATP酶的活力。引发体的移动与 复制叉 移动的方向相同，与 冈崎片段 的合成方向相反。
rep蛋白沿 3 ’?5’ 移动，而解螺旋酶 I,II、
III沿 5 ’?3’ 移动 。
三,DNA的复制过程,（以大肠杆菌为例）
双链的解开
RNA引物的合成
DNA链的延伸切除 RNA引物，填补缺口，连接相邻的 DNA片段
1、双链的解开一些概念：
DNA的复制有特定的起始位点，叫做 复制原点 。
常用 ori(或 o） 表示。许多生物的复制原点都是富含 A,T的区段。
大肠杆菌染色体 DNA以及真核生物的细胞器 DNA
为双链环状，只有 一个 复制原点，而真核生物染色体 DNA是线性双链分子，含有 许多 复制起点。
从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫 复制子（基因组独立进行复制的单位） 。
复制原点 由 DnaA蛋白识别,在原点由 DnaB蛋白
（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链 (DNA双链的解开还需 DNA拓扑异构酶 Π,SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。
DNA复制 进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点 (growth point),叫 复制叉 。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为 复制体（ replisome）
复制叉复制叉复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链
3’5’
3’ 5’
DNA的双向复制
(1)复制的起始
① 互相缠绕的双链母本 DNA,复制从特定的位置 (复制原点 Ori or O)开始，该位置常是富含 A,T区段。
②首先 DNA解螺旋酶 (DnaB)打开局部双链,SSB与每条单链结合,稳定单链并防止 DNA复性 ;然后在 DNA
旋转酶 （ TOPⅡ )的作用下，使螺旋 DNA局部变成松弛态。
③ 起始因子、引物酶,DNA聚合酶 等随后结合，复制开始。
引发体在复制叉上移动，沿模板链 5’ 3’
的方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始位点,DnaB蛋白活化引物合成酶。引发 RNA
引物的合成。 领头链 先引发开始合成，以原来一条
DNA单链为模板（ 3’? 5’ ),按 5’? 3’ 的方向合成一段 RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至 10个核苷酸，
在引物的 5’ 端含 3个磷酸残基（ 引物酶的底物是核苷三磷酸 ）,3’ 端为游离的羟基。
（ 2） RNA引物的合成在 DNA聚合酶 Ш 的催化下，
以四种脱氧核糖核苷 5’ -
三磷酸为底物，在 RNA引物的 3’ 端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。 DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。
领头链
随后链
冈崎片段
半不连续复制冈崎模型
（ 3） DNA链的延伸领头链 — 在 DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。
随后链 — 在 DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的 DNA链。
半不连续复制 — 在 DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。
发现（ 1968）：
同位素实验,3HdT? 短时间内为 DNA小片段?一段时间后?检测到 DNA大片段。当用 DNA连接酶的变异株时，检测到大量 DNA片段的积累。 —— 证明 DNA复制中有小片段合成。
测定 DNA小片段，远远大于合成 DNA的一半。 由于 U替代 dT,被尿嘧啶 -N-糖基酶切除。
在缺少尿嘧啶 -N-糖基酶的突变植株中,检测到一半 3H标记出现在小片段（ 冈崎片段 ）中。
冈崎片段在 DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成 53?的多个短片段，
这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。
冈崎片段,真核生物中 100-200个核苷酸（核小体的 DNA单位）。原核生物中 1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。
蛋白 Mr 亚基数 功能
SSB 75600 4 结合单链 DNA
DnaB蛋白 (解螺旋酶 ) 300000 6 DNA解螺旋,引物体成分引物酶 (DnaG蛋白 ) 60000 1 RNA引物合成,引物体成分
DNA聚合酶 Ⅲ 900000 18~20 新链延长
DNA聚合酶 I 103000 1 除去引物,填充缺口
DNA连接酶 74000 1 连接
DNA旋转酶 (DNA拓扑异构酶 Ⅱ ) 400000 4 超螺旋参与链的延伸阶段的蛋白质和酶均以 5/→3 /方向形成前导链和滞后链当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其 3’ -OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。 复制叉移动到终止区即停止复制 （大肠杆菌有一个终止区） 。 这时会发生一系列变化,在 DNA聚合酶 Ⅰ 催化下切除 RNA引物 ； 留下的空隙由
DNA聚合酶 Ⅰ 催化合成一段 DNA填补上 ； 在 DNA连接酶 作用下，连接相邻的 DNA链； 修复掺入 DNA链的错配碱基 ；以 修复方式填补 终止区 50-100bp的空缺。这样以两条亲代 DNA
链为模板，各自形成一条新的 DNA互补链。结果是形成了两个 DNA双股螺旋分子。
（ 4）切除 RNA引物，填补缺口，连接相邻的 DNA
片段（复制终止）
真核生物中 DNA的复制特点
1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，
多复制子。
2、冈崎片段长约 200bp.
3,真核生物 DNA复制速度比原核慢。
4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；
而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。
5、真核生物有多种 DNA聚合酶。
6、真核生物线性染色体两端有 端粒 结构，防止染色体间的末端连接。由 端粒酶 负责新合成链 5?RNA引物切除后的填补，
亦保持 端粒 的一定长度 。
复制叉复制叉终止区端粒结构
3? 5?
3?5?
端粒结构端粒酶是含 RNA的逆转录酶
DNA复制的其它方式大肠杆菌双链环状 DNA的复制 （一个复制起点，
双向复制）
真核细胞线状染色体 DNA的复制方式 （多个复制起点，双向复制）
单向滚环式复制 （噬菌体?X174DNA— 单链环状）
3?
D-环式复制方式 （线粒体双链环状 DNA,两条链的复制起点不同位臵，且复制不同步）
定义,以 RNA为模板，按照 RNA中的核苷酸顺序合成 DNA称为逆转录，由 逆转录酶 催化进行。
1970年 Temin和 Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病 RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌 RNA病毒都含有逆转录酶。
用特异抑制物（放线菌素 D） 能抑制致癌 RNA病毒的复制，而对一般 RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素 D专门抑制以 DNA为模板的反应，可见致癌
RNA病毒的复制过程必然涉及到 DNA。 所以 Temin于
1964年提出前病毒的假说。
四、逆转录
+ RNA+DNA- RNA+DNA-
DNA+
病毒 RNA的逆转录过程 （以前病毒形式引起整合到宿主细胞 DNA中而使细胞恶性转化）
单链病毒 RNA RNA-DNA杂交分子 双链 DNA（ 前病毒）
逆转录酶 逆转录酶
逆转录酶是多功能酶，兼有 3种酶的活性：
RNA指导的 DNA聚合酶活性
DNA指导的 DNA聚合酶活性
核糖核酸酶 H的活性，专一水解 RNA-DNA杂交分子中的 RNA,可沿 5’?3’ 和 3’?5’ 两个方向起核酸外切酶的作用。
逆转录酶也和 DNA聚合酶一样，沿 5’?3’ 方向合成 DNA,并要求短链 RNA作引物。
cDNA,几乎所有真核生物 mRNA分子的 3‘ 末端都有一段 polyA,当加入寡聚 dT作为引物时,mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的
DNA,称为 cDNA。
逆转录酶发现的理论和实践意义：
不能把? 中心法则? 绝对化，遗传信息也可以从
RNA传递到 DNA。 促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。
1983年，发现人类免疫缺陷病毒（ human immune deficience
virus,HIV）,感染 T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired immunodeficiency
syndrome,AIDS）
五,DNA的损伤修复
DNA的损伤,DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏 DNA的双螺旋结构。从而影响 DNA的复制，并使 DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。
– 若 DNA的损伤或错配得不到修复，会导致 DNA突变。其主要形式：
一个或几个碱基被臵换
插入一个或几个碱基
一个或多个碱基对缺失
DNA的损伤修复 —— 四种修复途径,光复活,切除修复、复组修复和诱导修复（亦称暗修复）。
光复活,400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上 TT（ CC CT） 二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）
切除修复,将 DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶,DNA聚合酶,DNA外切酶,DNA连接酶均参与。（发生在 DNA
复制前）
重组修复 （发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。 P349
诱导修复,造成 DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为 应急反应（ SOS
response）。 此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的 DNA聚合酶。所以会有 2种结果：修复或 变异（进化） 。
第二节 RNA的生物合成一,RNA聚合酶二,RNA的转录过程三,转录后加工四,RNA的复制一、概念转录,以 DNA的一条链为模板在 RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与 DNA链的一定区段互补的 RNA链的过程称为转录。
以四种核糖核苷三磷酸酸（ NTP） 为底物，形成 3?,5?
-磷酸二酯键相连接。
转录的不对称性,在 RNA的合成中,DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。
反义链（无意义链，负链）：在 RNA的转录中，用作模板的 DNA链称为反义链。
有义链（编码链，正链）在 RNA的转录中，不作为模板的 DNA链称为有义链。
RNA聚合酶,大肠杆菌的 RNA聚合酶 全酶由 5种亚基
α 2ββ ’?σ 组成,σ 因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与
β ’βα 2分离,没有 σ,?亚基的酶称为核心酶 —— 只催化链的延长，对起始无作用。
五种亚基的功能分别为：
α 亚基,与启动子结合功能。
β 亚基,含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二酯键。
亚基：在全酶中存在，功能不清楚。
β ’ 亚基,与 DNA模板结合功能。
σ 亚基,识别起始位点。
一,RNA聚合酶
真核细胞的 RNA聚合酶酶类 分布 产物 α -鹅膏蕈碱对酶的作用分子量 反应条件
Ⅱ
I
Ⅲ
核仁核质核质
rRNA
5.8SrRNA
18SrRNA
28SrRNA
mRNA
tRNA
5SrRNA
不抑制低浓度抑制高浓度抑制
500 000
~700 000
~700 000
_
低离子强度,要求 Mg2+或 Mn2+
高离子强度高 Mn2+浓度
RNA聚合酶的特点：
1、反应底物,NTP,DNA为模板,Mg2+促进聚合反应。
RNA聚合酶不需要引物，合成方向 53?。
2、真核生物与原核生物的 RNA聚合酶结构不同（具体说明）。
3,利福平 抑制原核生物 RNA聚合酶活性； α -鹅膏蕈碱抑制真核生物 RNA聚合酶活性。
RNA的转录过程,（以大肠杆菌为例）
起始位点的识别转录起始链的延伸转录终止二,RNA的转录过程
（ 1）起始位点的识别
RNA的合成不需要引物 。体外实验证明，不含 σ 亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有 σ 亚基时就会选择正确的起点。 σ 亚基起着识别 DNA分子上的起始信号（ 启动子 —— 指 RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段 DNA序列）
的作用。 启动子的结构至少由三部分组成,-35序列提供了 RNA
聚合酶全酶识别的信号； -10序列是酶的紧密结合位点（富含
AT碱基，利于双链打开）；第三部分是 RNA合成的起始点。
AACTGT ATATTA
TTGACA TATAAT
+1
转录起始点
5’ 3’
3’ 5’
35序列
Sextama
框
10序列
Pribnow
框
（ 2）转录起始
RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是 GTP
或 ATP,很少是 CTP,不用 UTP。 所形成的 启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物,第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点,σ 亚基就会被释放脱离核心酶。
因子仅与起始有关,RNA的合成一旦开始,
便被释放
E
-35 -10 pppG或 pppA
5‘
5‘
3‘
3‘
模板链
（ 3） RNA链的延伸
DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与 DNA
结合比较松弛，可沿 DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的
RNA链的 3’ -OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从 5’?3’
（ 4）转录终止在 DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的 DNA序列称为终止子（ terminators),它能使 RNA聚合酶停止合成 RNA
并释放出 RNA。
需要 ρ 因子（ 终止因子,协助 RNA聚合酶识别终止信号）帮助,ρ 因子能与 RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止 RNA聚合酶向前移动，
于是转录终止，并释放出已转录完成的 RNA链。
不依赖于 ρ 因子。强终止子序列有两个明显的特征：（ 1 ）在终止点之前具有一段富含 G-C
的回文区域。（ 2）富含 G-C的区域之后是一连串的 dA碱基序列，它们转录的 RNA链的末端为一连串 U（ 连续 6个） 。
弱终止子：
缺少回文结构强终止子,
有回文结构新合成的 RNA分子中典型的回文结构（发夹结构）
有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称为通读（ readthrough）
能够引起抗 终止作用的蛋白质称为 抗 终止因子 （ antitermination factors）
RNA生物合成的抑制剂
1、嘌呤和嘧啶类似物,人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。如
N
N
N
H
N
N H 2
NH2
SH
SH
作为代谢拮抗物抑制合成酶类或直接掺到核酸分子中，形成异常 RNA
或 DNA。
N
N
N
H
N
N H 2
NH2
N
N
N
H
N
N H 2
NH2
OH
N
NH
N
H
O
O
FN
N
N
H
N
N H 2
NH2
2,DNA模板功能的抑制物,可以与 DNA模板结合，抑制其复制和转录
（ 1）烷化剂,使 DNA发生烷基化，发生在 G-N7,A-N1,N3
N7 ； C-N1。 易引起嘌呤的水解，在 DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。
（ 2）放线菌素,放线菌素 D与 DNA形成非共价的复合物，
抑制其模板功能（低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制）。具有类似作用的还有色霉素 A3,橄榄霉素、光神霉素。
（ 3）嵌入染料,可插入双链 DNA分子相邻的碱基对之间，
一般具有芳香族发色团。溴化乙锭（ EB） 是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测 DNA和 RNA。 与 DNA结合后抑制其复制和转录。
3,RNA聚合酶抑制物
（ 1）利福霉素,抑制细菌 RNA聚合酶活性 。 利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。
（ 2）利链霉素：与细菌 RNA聚合酶?亚基结合，抑制转录过程中 RNA链的延长反应。
（ 3）?-鹅膏蕈碱：抑制真核生物 RNA聚合酶活性。
三,RNA的转录后加工在细胞内，由 RNA聚合酶合成的原初转录物
（ primary transcript） 往往需要一系列的变化，包括链的裂解,5?和 3?末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的 RNA分子。此过程总称为 RNA的成熟 或称为 RNA的转录后加工。
1,mRNA前体的加工,
原核生物 的 mRNA转录后 一般 不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的 mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。
真核生物 mRNA（ 半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为 核内不均一 RNA（ heterogeneous nuclear
RNA,hnRNA),需要进一步进行加工修饰转化为 mRNA。
加工包括：
（ 1） hnRNA被剪接，把内含子 （ DNA上非编码序列） 转录序列剪掉，把 外显子 （ DNA上的编码序列） 转录序列 拼接 上 (真核生物一般为不连续基因 )。
（ 2） 3’ 端添加 polyA,尾巴? ；
（ 3） 5’ 端连接? 帽子? 结构（ m7G5?ppp5?NmpNp-）；
（ 4） 分子内部的核苷酸甲基化修饰。
2,tRNA前体的加工：
原核与真核生物的 tRNA转录后都需要加工。包括：
（ 1）由核酸内切酶切除前体上 3?和 5?端上多余的核苷酸；
（ 2）由核酸外切酶逐个在 3?切去附加序列，进行修剪。
（ 3） 3’ 端添加 CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。
（接受活化 AA）
（ 4） 核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。
原核与真核生物的 rRNA转录后也都需要进行加工。
原核：刚转录的 rRNA为 30S,先在特定的碱基上进行甲基化（核糖 2?-羟基）修饰，后逐步裂解（核酸酶的切割）。
真核,45S（ 哺乳动物）,38S（ 果蝇）,37S（ 酵母）
P16
P23
P5
16S
23S
5S（ 一般不含甲基化）
28S
18S
5.8S
3,rRNA前体的加工：
45S
或 38S 37S
26S
17S
5.8S
真核 rRNA的甲基化程度比原核高 （ 核糖 2?-羟基）
rRNA原初转录物研究四膜虫 rRNA前体的拼接时发现 ribozyme
两个阶段
（ 1）其单链 RNA可充当 mRNA,利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白 和复制酶的 β 亚基。
（ 2）复制酶的 β 亚基可与来自寄主细胞的亚基 α?δ 自动装配成 RNA复制酶,可进行 RNA的复制，以分子中单链 RNA为模板（正链），复制出一条新的 RNA链
（负链），再复制出 正链,与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。
某些 RNA病毒可以以自身 RNA为模板进行复制。
5? RNA-
5?
3?
3?
RNA+
释放 释放
3? 5? 3?
3?
5?
5?
RNA+ RNA+
RNA-
RNA-及 RNA+的合成方向均为 5‘ 3’
不同的 RNA病毒复制方式不同四,RNA的复制第三节 基因工程简介
DNA重组技术指将不同的 DNA片段按人们的设计方案定向连接，并在特定受体细胞中与载体一起得到复制与表达 （ 70年代，基于 DNA限制新性内切酶,DNA连接酶的发现）。
基因工程主要包括两个步骤,
获得目的基因，取得基因的载体，使二者进行体外重组。
将重组的 DNA转化到受体的活细胞中去，改变受体细胞的遗传特性。
一、目的基因的制备二、基因载体载体必须具备的条件 （易于引入受体细胞、在受体 细胞中可以复制、易于鉴定和筛选、）
目前常用的载体,质粒、噬菌体（?噬菌体、噬菌体 M13）
三,DNA的重组重组体 DNA的连接将重组 DNA引入受体细胞（转化）
重组体的筛选
DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在 DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过 DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自 DNA转录给 RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。
中 心 法 则 1964-1970 劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌 RNA病毒病毒（复制）复制转录
DNA RNA 蛋白质翻译逆转录
1958年，遗传信息的单向
Reverse
transcription
中心法则的遗传流向有 5条途径
1,DNA→DNA,DNA复制
（以 DNA为模板合成 DNA）
2,RNA →RNA,RNA复制
（以 RNA为模板合成 RNA）
3,DNA → RNA,DNA转录
（以 DNA为模板合成 RNA）
4,RNA → DNA,反 (逆 )转录
（以 RNA为模板合成 DNA）
5,RNA → Protein,翻译复制,亲代 DNA或 RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代 DNA或 RNA的过程。
转录,以 DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给 RNA,形成一条与 DNA
链互补的 RNA的过程。
翻译,亦叫转译，以 mRNA为模板，将
mRNA的密码解读成蛋白质的 AA顺序的过程。
逆转录,以 RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成 DNA的过程。
第一节 DNA的生物合成一,DNA的半保留复制二,与 DNA复制有关的酶和蛋白质三,DNA的复制过程四,逆转录五,DNA的损伤修复一,DNA的半保留复制定义,由亲代 DNA生成子代 DNA时，每个新形成的子代 DNA中，一条链来自亲代 DNA,而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫 半保留复制半保留复制的实验证据,1958年 Meselson和
Stahl用同位素 15N标记大肠杆菌 DNA,首先证明了 DNA的半保留复制。
15N-DNA的密度大于 14N-DNA的密度
DNA的半保留复制的生物学意义：
DNA的半保留复制表明 DNA在代谢上的稳定性,保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。
DNA在代谢上的稳定性并非指 DNA是一种惰性物质。
二、与 DNA复制有关的酶和蛋白质原料,四种脱氧核苷三磷酸（ dATP,dGTP、
dCTP,dTTP)
模板,以 DNA的两条链为模板链，合成子代 DNA。
引物,一小段 RNA(或 DNA） 为引物，在大肠杆菌中,DNA的合成需要一段 RNA链作为 引物。
催化因子
1.引物合成酶（引发酶）,此酶以 DNA为模板合成一段 RNA,这段 RNA作为合成 DNA的引物（ Primer)。 实质是以 DNA为模板的 RNA聚合酶 。
2.DNA聚合酶,以 DNA为模板的 DNA合成酶，其催化反应的特点 （ 1）以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物；（ 2）
反应需要有模板的指导；（ 3）反应需要有 3?-OH存在；
（ 4） DNA链的合成方向为 5 3?
N3? 5?
5? OOH PPP-O-CH2
OH
生物大分子合成：
底物、酶、
能量,模板
P329需要模板的例证
（ 5） DNA聚合酶的反应可以利用 DNA双链作为模板和引物，亦可以单链 DNA作为模板和引物
（ 6） DNA的体外聚合必须加入少量的 DNA才能进行。 DNA在提取过程中易形成切口
（ nick） 或缺口（ gap）,则加入的 DNA一条链作为模板而另一条链可作为引物。
原核生物中的 DNA聚合酶在大肠杆菌中发现有三种 DNA聚合酶（ 用突变株研究其功能 ）：
⑴ DNA聚合酶 Ⅰ,单体酶,多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是 O-二氮杂菲），多功能酶。 它具有 5 3?聚合酶功能 （对脱氧核苷酸的选择）； 3’? 5’ 外切酶活性 （对双链无作用，
校对功能。 但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）
及 5’? 3’ 外切酶活性 （双链有效，主要是对 DNA损伤的修复，
以及在 DNA复制时 RNA引物切除及其空隙的填补）；在 DNA链的 3
形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与 dNTP之间的焦磷酸基交换。
⑵ DNA聚合酶 Ⅱ,多亚基酶,聚合作用，但聚合活力很低；
具有 3’? 5’ 外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的 DNA损伤中起作用。
⑶ DNA聚合酶 Ⅲ,是原核生物 DNA复制的主要聚合酶,该酶由 10种亚基组成，其中?,?,?形成全酶的核心酶 。具有 5’?3’ DNA聚合酶活性（?亚基，
速率高）； 具有 3’? 5’ 外切酶（?亚基） 的校对功能，提高 DNA复制的保真性；还具有 5’? 3’
外切酶活性（单链有效，其意义未知）。
（ 4） DNA聚合酶 IV和 V,1999年发现，当 DNA严重损伤时，诱导产生。
DNA聚合酶 Ⅰ DNA聚合酶 Ⅱ DNA聚合酶 Ⅲ
亚基数目 1（单体酶） ＞ 1（多亚基酶 ） ＞ 1（多亚基酶）
5’ 3’ 聚合活性 + 中 + 很低 + 很高
3‘ 5’ 外切活性 + + +
（保护 DNA复制的忠实性 fidelity）
5‘ 3’外切活性 + - -
主要是对 DNA损伤的修复；以及在 DNA复制时切除 RNA引物并填补其留下的空隙。
修复紫外光引起的 DNA损伤
DNA 复制的主要聚合酶，还具有
3’ -5‘ 外切酶的校对功能，提高 DNA复制的保真性在真核细胞内有五种 DNA聚合酶 （与细菌 DNA
聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）
α β γ δ
ε
定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核
3‘ -5’
外切 - - + +
+
酶活性功能引物合成修复作用线粒体 DNA
的复制核 DNA
的复制修复作用
3,DNA连接酶（ 1967年发现）,若双链 DNA中一条链有切口，一端是 3’ -OH,另一端是 5‘ -磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。
但是它不能将两条游离的 DNA单链连接起来。
大肠杆菌和其它细菌的 DNA连接酶要求 NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求 ATP提供能量。 T4噬菌体的 DNA连接酶 不仅能在模板链上连接 DNA和 DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链 DNA。
3‘ 5‘
3‘5‘
OH P
连接酶的反应机制,
酶 + NAD+(ATP) 酶 -AMP + 烟酰胺单核苷酸 （ PPi）
酶 -AMP + P-5‘-DNA 酶 + AMP-P-5’-DNA
DNA-3’-OH + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-O-P-5’-
DNA+AMP
DNA连接酶 在 DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用拓扑异构酶?,使 DNA一条链发生断裂和再连接 。 作用是松解负超螺旋,反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。
拓扑异构酶 Π,使 DNA两条链发生断裂和再连接。 当引入负超螺旋 时需要由 ATP提供能量，同复制有关。
二者共同控制 DNA的拓扑结构。
5、解螺旋酶 （解链酶）,通过水解 ATP将 DNA两条链打开。 E.coli中的 rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶 I,II,III。 每解开一对碱基需要水解 2个 ATP分子。
4,拓扑异构酶,催化 DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在 DNA
重组修复和其他转变方面起重要作用。
除连环数不同外其它性质均相同的 DNA分子称为拓扑异构体，
引起拓扑异构体反应的酶称为 拓扑异构酶
6.其它蛋白因子：
⑴单链结合蛋白 (SSB-single-strand binding
protein),稳定已被解开的 DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
⑵引发前体,它由多种蛋白质 dnaA,dnaB,dnaC,n,n’,n’’
和 i组成。 引发前体再与引发酶结合组装成引发体 。
引发体可以沿模板链 5’? 3’ 方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位臵上即可引发 RNA引物的合成。
移动和引发均需要 ATP提供能量,n’蛋白具有 ATP酶的活力。引发体的移动与 复制叉 移动的方向相同，与 冈崎片段 的合成方向相反。
rep蛋白沿 3 ’?5’ 移动，而解螺旋酶 I,II、
III沿 5 ’?3’ 移动 。
三,DNA的复制过程,（以大肠杆菌为例）
双链的解开
RNA引物的合成
DNA链的延伸切除 RNA引物，填补缺口，连接相邻的 DNA片段
1、双链的解开一些概念：
DNA的复制有特定的起始位点，叫做 复制原点 。
常用 ori(或 o） 表示。许多生物的复制原点都是富含 A,T的区段。
大肠杆菌染色体 DNA以及真核生物的细胞器 DNA
为双链环状，只有 一个 复制原点，而真核生物染色体 DNA是线性双链分子，含有 许多 复制起点。
从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫 复制子（基因组独立进行复制的单位） 。
复制原点 由 DnaA蛋白识别,在原点由 DnaB蛋白
（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链 (DNA双链的解开还需 DNA拓扑异构酶 Π,SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。
DNA复制 进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点 (growth point),叫 复制叉 。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为 复制体（ replisome）
复制叉复制叉复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链
3’5’
3’ 5’
DNA的双向复制
(1)复制的起始
① 互相缠绕的双链母本 DNA,复制从特定的位置 (复制原点 Ori or O)开始，该位置常是富含 A,T区段。
②首先 DNA解螺旋酶 (DnaB)打开局部双链,SSB与每条单链结合,稳定单链并防止 DNA复性 ;然后在 DNA
旋转酶 （ TOPⅡ )的作用下，使螺旋 DNA局部变成松弛态。
③ 起始因子、引物酶,DNA聚合酶 等随后结合，复制开始。
引发体在复制叉上移动，沿模板链 5’ 3’
的方向移动，与复制叉移动的方向相同，识别合成的起始位点,DnaB蛋白活化引物合成酶。引发 RNA
引物的合成。 领头链 先引发开始合成，以原来一条
DNA单链为模板（ 3’? 5’ ),按 5’? 3’ 的方向合成一段 RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。引物长度约为几个至 10个核苷酸，
在引物的 5’ 端含 3个磷酸残基（ 引物酶的底物是核苷三磷酸 ）,3’ 端为游离的羟基。
（ 2） RNA引物的合成在 DNA聚合酶 Ш 的催化下，
以四种脱氧核糖核苷 5’ -
三磷酸为底物，在 RNA引物的 3’ 端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。 DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。两条链方向相反。
领头链
随后链
冈崎片段
半不连续复制冈崎模型
（ 3） DNA链的延伸领头链 — 在 DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。
随后链 — 在 DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的 DNA链。
半不连续复制 — 在 DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。
发现（ 1968）：
同位素实验,3HdT? 短时间内为 DNA小片段?一段时间后?检测到 DNA大片段。当用 DNA连接酶的变异株时，检测到大量 DNA片段的积累。 —— 证明 DNA复制中有小片段合成。
测定 DNA小片段，远远大于合成 DNA的一半。 由于 U替代 dT,被尿嘧啶 -N-糖基酶切除。
在缺少尿嘧啶 -N-糖基酶的突变植株中,检测到一半 3H标记出现在小片段（ 冈崎片段 ）中。
冈崎片段在 DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成 53?的多个短片段，
这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。
冈崎片段,真核生物中 100-200个核苷酸（核小体的 DNA单位）。原核生物中 1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。
蛋白 Mr 亚基数 功能
SSB 75600 4 结合单链 DNA
DnaB蛋白 (解螺旋酶 ) 300000 6 DNA解螺旋,引物体成分引物酶 (DnaG蛋白 ) 60000 1 RNA引物合成,引物体成分
DNA聚合酶 Ⅲ 900000 18~20 新链延长
DNA聚合酶 I 103000 1 除去引物,填充缺口
DNA连接酶 74000 1 连接
DNA旋转酶 (DNA拓扑异构酶 Ⅱ ) 400000 4 超螺旋参与链的延伸阶段的蛋白质和酶均以 5/→3 /方向形成前导链和滞后链当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其 3’ -OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。 复制叉移动到终止区即停止复制 （大肠杆菌有一个终止区） 。 这时会发生一系列变化,在 DNA聚合酶 Ⅰ 催化下切除 RNA引物 ； 留下的空隙由
DNA聚合酶 Ⅰ 催化合成一段 DNA填补上 ； 在 DNA连接酶 作用下，连接相邻的 DNA链； 修复掺入 DNA链的错配碱基 ；以 修复方式填补 终止区 50-100bp的空缺。这样以两条亲代 DNA
链为模板，各自形成一条新的 DNA互补链。结果是形成了两个 DNA双股螺旋分子。
（ 4）切除 RNA引物，填补缺口，连接相邻的 DNA
片段（复制终止）
真核生物中 DNA的复制特点
1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，
多复制子。
2、冈崎片段长约 200bp.
3,真核生物 DNA复制速度比原核慢。
4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；
而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。
5、真核生物有多种 DNA聚合酶。
6、真核生物线性染色体两端有 端粒 结构，防止染色体间的末端连接。由 端粒酶 负责新合成链 5?RNA引物切除后的填补，
亦保持 端粒 的一定长度 。
复制叉复制叉终止区端粒结构
3? 5?
3?5?
端粒结构端粒酶是含 RNA的逆转录酶
DNA复制的其它方式大肠杆菌双链环状 DNA的复制 （一个复制起点，
双向复制）
真核细胞线状染色体 DNA的复制方式 （多个复制起点，双向复制）
单向滚环式复制 （噬菌体?X174DNA— 单链环状）
3?
D-环式复制方式 （线粒体双链环状 DNA,两条链的复制起点不同位臵，且复制不同步）
定义,以 RNA为模板，按照 RNA中的核苷酸顺序合成 DNA称为逆转录，由 逆转录酶 催化进行。
1970年 Temin和 Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病 RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌 RNA病毒都含有逆转录酶。
用特异抑制物（放线菌素 D） 能抑制致癌 RNA病毒的复制，而对一般 RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素 D专门抑制以 DNA为模板的反应，可见致癌
RNA病毒的复制过程必然涉及到 DNA。 所以 Temin于
1964年提出前病毒的假说。
四、逆转录
+ RNA+DNA- RNA+DNA-
DNA+
病毒 RNA的逆转录过程 （以前病毒形式引起整合到宿主细胞 DNA中而使细胞恶性转化）
单链病毒 RNA RNA-DNA杂交分子 双链 DNA（ 前病毒）
逆转录酶 逆转录酶
逆转录酶是多功能酶，兼有 3种酶的活性：
RNA指导的 DNA聚合酶活性
DNA指导的 DNA聚合酶活性
核糖核酸酶 H的活性，专一水解 RNA-DNA杂交分子中的 RNA,可沿 5’?3’ 和 3’?5’ 两个方向起核酸外切酶的作用。
逆转录酶也和 DNA聚合酶一样，沿 5’?3’ 方向合成 DNA,并要求短链 RNA作引物。
cDNA,几乎所有真核生物 mRNA分子的 3‘ 末端都有一段 polyA,当加入寡聚 dT作为引物时,mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的
DNA,称为 cDNA。
逆转录酶发现的理论和实践意义：
不能把? 中心法则? 绝对化，遗传信息也可以从
RNA传递到 DNA。 促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。
1983年，发现人类免疫缺陷病毒（ human immune deficience
virus,HIV）,感染 T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired immunodeficiency
syndrome,AIDS）
五,DNA的损伤修复
DNA的损伤,DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏 DNA的双螺旋结构。从而影响 DNA的复制，并使 DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。
– 若 DNA的损伤或错配得不到修复，会导致 DNA突变。其主要形式：
一个或几个碱基被臵换
插入一个或几个碱基
一个或多个碱基对缺失
DNA的损伤修复 —— 四种修复途径,光复活,切除修复、复组修复和诱导修复（亦称暗修复）。
光复活,400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上 TT（ CC CT） 二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）
切除修复,将 DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶,DNA聚合酶,DNA外切酶,DNA连接酶均参与。（发生在 DNA
复制前）
重组修复 （发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。 P349
诱导修复,造成 DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为 应急反应（ SOS
response）。 此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的 DNA聚合酶。所以会有 2种结果：修复或 变异（进化） 。
第二节 RNA的生物合成一,RNA聚合酶二,RNA的转录过程三,转录后加工四,RNA的复制一、概念转录,以 DNA的一条链为模板在 RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原则，合成一条与 DNA链的一定区段互补的 RNA链的过程称为转录。
以四种核糖核苷三磷酸酸（ NTP） 为底物，形成 3?,5?
-磷酸二酯键相连接。
转录的不对称性,在 RNA的合成中,DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。
反义链（无意义链，负链）：在 RNA的转录中，用作模板的 DNA链称为反义链。
有义链（编码链，正链）在 RNA的转录中，不作为模板的 DNA链称为有义链。
RNA聚合酶,大肠杆菌的 RNA聚合酶 全酶由 5种亚基
α 2ββ ’?σ 组成,σ 因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与
β ’βα 2分离,没有 σ,?亚基的酶称为核心酶 —— 只催化链的延长，对起始无作用。
五种亚基的功能分别为：
α 亚基,与启动子结合功能。
β 亚基,含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二酯键。
亚基：在全酶中存在，功能不清楚。
β ’ 亚基,与 DNA模板结合功能。
σ 亚基,识别起始位点。
一,RNA聚合酶
真核细胞的 RNA聚合酶酶类 分布 产物 α -鹅膏蕈碱对酶的作用分子量 反应条件
Ⅱ
I
Ⅲ
核仁核质核质
rRNA
5.8SrRNA
18SrRNA
28SrRNA
mRNA
tRNA
5SrRNA
不抑制低浓度抑制高浓度抑制
500 000
~700 000
~700 000
_
低离子强度,要求 Mg2+或 Mn2+
高离子强度高 Mn2+浓度
RNA聚合酶的特点：
1、反应底物,NTP,DNA为模板,Mg2+促进聚合反应。
RNA聚合酶不需要引物，合成方向 53?。
2、真核生物与原核生物的 RNA聚合酶结构不同（具体说明）。
3,利福平 抑制原核生物 RNA聚合酶活性； α -鹅膏蕈碱抑制真核生物 RNA聚合酶活性。
RNA的转录过程,（以大肠杆菌为例）
起始位点的识别转录起始链的延伸转录终止二,RNA的转录过程
（ 1）起始位点的识别
RNA的合成不需要引物 。体外实验证明，不含 σ 亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有 σ 亚基时就会选择正确的起点。 σ 亚基起着识别 DNA分子上的起始信号（ 启动子 —— 指 RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段 DNA序列）
的作用。 启动子的结构至少由三部分组成,-35序列提供了 RNA
聚合酶全酶识别的信号； -10序列是酶的紧密结合位点（富含
AT碱基，利于双链打开）；第三部分是 RNA合成的起始点。
AACTGT ATATTA
TTGACA TATAAT
+1
转录起始点
5’ 3’
3’ 5’
35序列
Sextama
框
10序列
Pribnow
框
（ 2）转录起始
RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是 GTP
或 ATP,很少是 CTP,不用 UTP。 所形成的 启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物,第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点,σ 亚基就会被释放脱离核心酶。
因子仅与起始有关,RNA的合成一旦开始,
便被释放
E
-35 -10 pppG或 pppA
5‘
5‘
3‘
3‘
模板链
（ 3） RNA链的延伸
DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与 DNA
结合比较松弛，可沿 DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的
RNA链的 3’ -OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从 5’?3’
（ 4）转录终止在 DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的 DNA序列称为终止子（ terminators),它能使 RNA聚合酶停止合成 RNA
并释放出 RNA。
需要 ρ 因子（ 终止因子,协助 RNA聚合酶识别终止信号）帮助,ρ 因子能与 RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止 RNA聚合酶向前移动，
于是转录终止，并释放出已转录完成的 RNA链。
不依赖于 ρ 因子。强终止子序列有两个明显的特征：（ 1 ）在终止点之前具有一段富含 G-C
的回文区域。（ 2）富含 G-C的区域之后是一连串的 dA碱基序列，它们转录的 RNA链的末端为一连串 U（ 连续 6个） 。
弱终止子：
缺少回文结构强终止子,
有回文结构新合成的 RNA分子中典型的回文结构（发夹结构）
有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称为通读（ readthrough）
能够引起抗 终止作用的蛋白质称为 抗 终止因子 （ antitermination factors）
RNA生物合成的抑制剂
1、嘌呤和嘧啶类似物,人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。如
N
N
N
H
N
N H 2
NH2
SH
SH
作为代谢拮抗物抑制合成酶类或直接掺到核酸分子中，形成异常 RNA
或 DNA。
N
N
N
H
N
N H 2
NH2
N
N
N
H
N
N H 2
NH2
OH
N
NH
N
H
O
O
FN
N
N
H
N
N H 2
NH2
2,DNA模板功能的抑制物,可以与 DNA模板结合，抑制其复制和转录
（ 1）烷化剂,使 DNA发生烷基化，发生在 G-N7,A-N1,N3
N7 ； C-N1。 易引起嘌呤的水解，在 DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。
（ 2）放线菌素,放线菌素 D与 DNA形成非共价的复合物，
抑制其模板功能（低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制）。具有类似作用的还有色霉素 A3,橄榄霉素、光神霉素。
（ 3）嵌入染料,可插入双链 DNA分子相邻的碱基对之间，
一般具有芳香族发色团。溴化乙锭（ EB） 是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测 DNA和 RNA。 与 DNA结合后抑制其复制和转录。
3,RNA聚合酶抑制物
（ 1）利福霉素,抑制细菌 RNA聚合酶活性 。 利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。
（ 2）利链霉素：与细菌 RNA聚合酶?亚基结合，抑制转录过程中 RNA链的延长反应。
（ 3）?-鹅膏蕈碱：抑制真核生物 RNA聚合酶活性。
三,RNA的转录后加工在细胞内，由 RNA聚合酶合成的原初转录物
（ primary transcript） 往往需要一系列的变化，包括链的裂解,5?和 3?末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的 RNA分子。此过程总称为 RNA的成熟 或称为 RNA的转录后加工。
1,mRNA前体的加工,
原核生物 的 mRNA转录后 一般 不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的 mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。
真核生物 mRNA（ 半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为 核内不均一 RNA（ heterogeneous nuclear
RNA,hnRNA),需要进一步进行加工修饰转化为 mRNA。
加工包括：
（ 1） hnRNA被剪接，把内含子 （ DNA上非编码序列） 转录序列剪掉，把 外显子 （ DNA上的编码序列） 转录序列 拼接 上 (真核生物一般为不连续基因 )。
（ 2） 3’ 端添加 polyA,尾巴? ；
（ 3） 5’ 端连接? 帽子? 结构（ m7G5?ppp5?NmpNp-）；
（ 4） 分子内部的核苷酸甲基化修饰。
2,tRNA前体的加工：
原核与真核生物的 tRNA转录后都需要加工。包括：
（ 1）由核酸内切酶切除前体上 3?和 5?端上多余的核苷酸；
（ 2）由核酸外切酶逐个在 3?切去附加序列，进行修剪。
（ 3） 3’ 端添加 CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。
（接受活化 AA）
（ 4） 核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。
原核与真核生物的 rRNA转录后也都需要进行加工。
原核：刚转录的 rRNA为 30S,先在特定的碱基上进行甲基化（核糖 2?-羟基）修饰，后逐步裂解（核酸酶的切割）。
真核,45S（ 哺乳动物）,38S（ 果蝇）,37S（ 酵母）
P16
P23
P5
16S
23S
5S（ 一般不含甲基化）
28S
18S
5.8S
3,rRNA前体的加工：
45S
或 38S 37S
26S
17S
5.8S
真核 rRNA的甲基化程度比原核高 （ 核糖 2?-羟基）
rRNA原初转录物研究四膜虫 rRNA前体的拼接时发现 ribozyme
两个阶段
（ 1）其单链 RNA可充当 mRNA,利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白 和复制酶的 β 亚基。
（ 2）复制酶的 β 亚基可与来自寄主细胞的亚基 α?δ 自动装配成 RNA复制酶,可进行 RNA的复制，以分子中单链 RNA为模板（正链），复制出一条新的 RNA链
（负链），再复制出 正链,与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。
某些 RNA病毒可以以自身 RNA为模板进行复制。
5? RNA-
5?
3?
3?
RNA+
释放 释放
3? 5? 3?
3?
5?
5?
RNA+ RNA+
RNA-
RNA-及 RNA+的合成方向均为 5‘ 3’
不同的 RNA病毒复制方式不同四,RNA的复制第三节 基因工程简介
DNA重组技术指将不同的 DNA片段按人们的设计方案定向连接，并在特定受体细胞中与载体一起得到复制与表达 （ 70年代，基于 DNA限制新性内切酶,DNA连接酶的发现）。
基因工程主要包括两个步骤,
获得目的基因，取得基因的载体，使二者进行体外重组。
将重组的 DNA转化到受体的活细胞中去，改变受体细胞的遗传特性。
一、目的基因的制备二、基因载体载体必须具备的条件 （易于引入受体细胞、在受体 细胞中可以复制、易于鉴定和筛选、）
目前常用的载体,质粒、噬菌体（?噬菌体、噬菌体 M13）
三,DNA的重组重组体 DNA的连接将重组 DNA引入受体细胞（转化）
重组体的筛选
