1
8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度一,灵敏度的表示方法,摩尔吸光系数 (?)
A=? b c? =A/bc (L·mol-1·cm-1)
越大,灵敏度越高,
104～ 5× 104 为中等灵敏度 ;
>105为高灵敏度 ;? <104为低灵敏度,
2
例 1 邻二氮菲光度法测铁
(Fe)=1.0mg/L,b=2cm,A=0.38
计算?和解,c(Fe)=1.0 mg/L=1.0× 10-3/55.85
=1.8× 10-5mol/L
1%
1cmE
×
4 - 1 - 1
-5
0,38= = 1,1 10 L m o l cm
2 1,8 10
3
c =1.0mg/L=1.0× 10-3 g /1000mL
= 1.0× 10-4g/100mL
bc1%1cmA= E
1% m 431c -= 0,38 /2,0 10 = 1,9 10E
1%1cm 53= 1 0 = 1,1 1 0 / 5 5,8 5 =o 1,9 1 0r E / M?
4
二,准确度 —仪器测量误差光度计的读数误差一般为
0.2～ 2％ (ΔT),
由于 T与浓度 c
不是线性关系，
故不同浓度时的 ΔT引起的误差不同。
100
80
60
40
20
0
T%
c1?c2?c3
T
T
T-透光率读数误差
c
c1
c1
c2
c2
c3
c3> <
5
10
8
6
4
2
0 20 40 60 800.7 0.4 0.2 0.1 AT%
Er
r
0.43 4
lg
( 0.01 )
cTE
c T T
T
(36.8)
0.434
浓度测量的相对误差与 T(或 A)
的关系实际工作中，应控制 T在 10～ 70％,
A在 0.15～ 1.0之间 (调 c,b,?)
6
8.4 显色反应与分析条件的选择
：：
：
：
助色团 － NH2，－ OH，－ X （孤对电子） ne
8.4.1 显色剂与显色反应
O
生色团,－ N＝ N－，－ N＝ O，
OC=S,－ N （共轭双键） πe
无机显色剂,SCN- [Fe(SCN)]2+
H2O2 [TiO·H2O2]2+
有机显色剂,
7
有机显色剂
CH3－ C－ C－ CH3
HO－ N N－ OH
＝ ＝
NN
OH
COOH
SO3H
OO型：
N
N N OH
OH
ON型,PAR
NH NH
N
S
NS型,
双硫腙
NN型,丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸
8
显色反应的选择
*灵敏度高,一般 ε >104
*选择性好
*显色剂在测定波长处无明显吸收。
对照性好,?λ max>60 nm,
*反应生成的有色化合物 组成恒定，稳定 。
*显色条件易于控制,重现性好 。
9
8.4.2 显色条件的确定
c(R) c(R) c(R)
1,显色剂用量 （ c(M),pH一定）
Mo(SCN)32+ 浅红
Mo(SCN)5 橙红
Mo(SCN)6- 浅红
Fe(SCN)n3-n
10
2,显色反应酸度 （ c(M),c(R)一定）
pH1<pH<pH2
pH
11
邻二氮菲－亚铁反应完全度与 pH的关系
Fe2++3R
R ( H )Fe ( A )
33
33
3
[ F e R ]
'
[ F e '] [ R ']
3
3 F e ( A ) R ( H )
[ F e R ]lg lg lg 3 lg 3 lg [ R ' ]
[ F e ']
H＋H＋A柠檬酸
c(R)≈[R′]=10-4mol·L-1
β3＝ 1021.3β3 FeR3
12
3[F e R ]lg
[ F e ]?
pH3～ 8为适宜的酸度范围
13
3,显色温度及显色时间另外，还有介质条件、有机溶剂、
表面活性剂等
T1(℃ )
T2(℃ )
t(min)
A
14
8.4.3 干扰及消除
Co2＋,Fe3+ Co
2+
FeF63- Co(SCN)2 (蓝 )
⑴ NaF SCN－
Co2+
Fe2+,Sn4+
(2)Sn2+ Co(SCN)
2
SCN－
测 Co2＋ (含 Fe3+),(掩蔽法 )
1.化学法
15
Co2+,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
CoR,ZnR
NiR,FeR
CoR,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
钴试剂 R H+
测 Co2＋,(生成络合物性质不同 )
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，
则需采取分离法。
测 Fe3＋,(控制 pH)
Fe3+,Cu2+ FeSS （紫红）Cu2+pH 2.5 SS
16
2,物理法
—选择适当的测定波长
515 655 415 500
钍 -偶氮砷 III 钴 -亚硝基红盐
A A
络合物络合物试剂试剂
17
1,仅络合物有吸收,溶剂 作参比。
如 phen—Fe2+ 标准曲线
2.待测液也有吸收,被测液 作参比。
如 测汽水中的 Fe
3,显色剂或其他试剂也有吸收,空白溶液 作参比例,邻二氮菲光度法测 Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含 Li2CO3样品的所有试剂 。
4,干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：
1） 掩蔽被测组分,再加入显色剂，作参比,
2） 加入等量干扰组分 到空白溶液中,作参比,
-- 选择适当的参比溶液
18
8.5 吸光光度法的应用
1,单一组分测定
1) 金属离子,Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂
2) 磷的测定,DNA中含 P～ 9.2%,RNA中含 P～ 9.5%,
可得核酸量,
H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄 (?小 )
磷钼 (V)蓝 (?大 )
Sn2+
19
3) 蛋白质测定 —溴甲酚绿、考马司亮蓝等
4) 氨基酸测定 —茚三酮 (紫色化合物 )
5) 水质检测,NH4+,NO2-,Mn2+,Fe2+、
SO42-,Hg2+----
6) 药物含量测定 —比吸光系数定量；荷移光谱法测定,
7) 紫外吸收 (UV),NO2-,NO3-,SO42-、
SO32-,CO32-,SCN-、酪氨酸、色氨酸、
苯丙氨酸、蛋白质等。
20
2,多组分的测定
x?1,?y?1,?x?2,?y?2由 x,y标液在?1,?2处分别测得
a) 在?1处测组分 x,在?2处测组分 y
b) 在?1处测组分 x; 在?2处测总吸收,扣除 x吸收,可求 y
c) x,y组分不能直接测定
A1=?x?1bcx+?y?1bcy(在?1处测得 A1)
A2 =?x?2bcx+?y?2bcy(在?2处测得 A2)
21
3,光度滴定
NaOH滴定 对硝基酚 pKa=7.15
间硝基酚 pKa=8.39
pKa
=1.24
V1 V2 V(NaOH)/mL
对硝基酚间硝基酚 酸形均无色,
碱形均黄色
22
典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。
Vsp
滴定剂吸收
Vsp
被滴物吸收
Vsp
滴定剂与待测物均吸收
Vsp
产物吸收
23
4,络合物组成的测定
(1)摩尔比法,固定 cM,改变 cR
1:1 3:1
c(R)/c(M)
A
1.0 2.0 3,0
24
(2)等摩尔连续变化法,
M:R=1:1
0.5 0.33
cM/c cM/c
M:R=1:2
M R M R nn?
MR (c c c ） 常数
25
表观形成常数的测定 (设 M,R均无吸收 )
0.5
cM/c
M:R=1:1
A0
A
0
0
-= A A
A?
c(M)=c(R)=c
)?
2
[ M R ] ( 1 - 1 -= = =
[ M ] [ R ]
cK
cc c
MmRn型?
26
5.一元弱酸离解常数的测定 p330
HL H＋ ＋ L
HL
HL L= [ H L ] + [ L ]
KccA
KK
+ L
++
a
aa
(HL)[ H ] ( H L )=+
+ [ H ] + [ H ]
Ka＝ [H+][L]/[HL]
高酸度下，几乎全部以 HL存在，可测得 AHL＝ εHL·c(HL)；
低酸度下，几乎全部以 L存在，可测得 AL ＝ εL·c(HL).
代入整理：
AAK
A A
+HL
a L
-= [ H ]
-
[HL]
[L]
L
HL
AA
K AAa
-
p = p H + l g -或配制一系列 c相同,pH不同的溶液,测 A.
27
MO吸收曲线
Aa(HL)
Ab
(L)
1
2
3
4
5
6A
b65
4
32
1A
a
350 400 450 500 550 600?/nm
A曲线 pH
1 1.10,1.38
2 2.65
3 3.06
4 3.48
5 3.98
6 5.53,6.80
由每份溶液的一对 pH,A，可求得一个 Ka,取平均值即可,
28
MO离解常数的测定作图法 LHLap p H l g AAK AA
H L L2AAA
AHL
3.32(pKa)
1 2 3 4 5 6
A
pH=pKa
pH
pHA 曲线
AL
L
HL
l g p HAAAA 曲线
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
3.0 4.0 pH
HL
L [ H L ]lg g [L ]l AAAA
3.34
29
6,双波长分光光度法消除干扰 (不要求 )
在?2,A?2 = Ax2+Ay2
在?1,A?1=Ax1+Ay1
A= A?2 - A?1
= Ax2+Ay2 –(Ax1+Ay1)
= Ax2 –Ax1
=?Ax
Ay2 ＝ Ay1
Ax =(?x2－?x1)bcx
消除了 y的干扰
X被测 Y干扰
2?1?1
Ay1
AX1
Ay2
AX2
A
/nm′
30
双波长分光光度法消除浑浊背景干扰
1?2
A
A?1 -A?2 = △ A
△ A∝ c
例 牛奶中微量
Fe的测定
31
7,导数分光光度法 (不要求 )
A~?图混合物导数光谱
0
1
2
3
4
A?
图
32
常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定
1.氢氯噻嗪,
2.硫酸双肼肽嗪
3,盐酸可乐定
4.常药降压片
250 290 330?
4
1
2
3
1
2
A
A
33
肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用 6％的
HClO4稀释，然后用 GDX100大孔树脂萃取，用二氯甲烷 5mL洗脱杀鼠剂,40℃
挥干，剩余物用 0.1mol·L-1NaOH4mL溶解后，紫外导数光谱测定。
A
2
2
d
d
A
0.0c
d
a
b
D
a.空白肝普通光谱
b.2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱
c.空白肝二阶导数光谱
d.2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱
34
8.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系,吸收曲线 —定性分析的基础 。
定量分析的基础 —朗伯 -比尔定律,A=?bc=-lgT 式中各参数的物理意义,定量计算 。
8.2 了解目视比色法,分光光度法的特点,分光光度计的基本部件 。
8.3 灵敏度的表示 —摩尔吸光系数的意义和计算 ；
准确度 —适宜的测量范围,偏离比尔定律的原因 。
8.4 显色反应及条件的确定,显色剂用量,酸度,时间,
温度,干扰及消除 。
8.5 应用,单一组分测定示例,多组分测定,光度滴定,
络合物组成的测定,酸碱离解常数的测定 。
第八章 小 结
35
8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度一,灵敏度的表示方法,摩尔吸光系数 (?)
A=? b c? =A/bc (L·mol-1·cm-1)
越大,灵敏度越高,
104～ 5× 104 为中等灵敏度 ;
>105为高灵敏度 ;? <104为低灵敏度,
2
例 1 邻二氮菲光度法测铁
(Fe)=1.0mg/L,b=2cm,A=0.38
计算?和解,c(Fe)=1.0 mg/L=1.0× 10-3/55.85
=1.8× 10-5mol/L
1%
1cmE
×
4 - 1 - 1
-5
0,38= = 1,1 10 L m o l cm
2 1,8 10
3
c =1.0mg/L=1.0× 10-3 g /1000mL
= 1.0× 10-4g/100mL
bc1%1cmA= E
1% m 431c -= 0,38 /2,0 10 = 1,9 10E
1%1cm 53= 1 0 = 1,1 1 0 / 5 5,8 5 =o 1,9 1 0r E / M?
4
二,准确度 —仪器测量误差光度计的读数误差一般为
0.2～ 2％ (ΔT),
由于 T与浓度 c
不是线性关系，
故不同浓度时的 ΔT引起的误差不同。
100
80
60
40
20
0
T%
c1?c2?c3
T
T
T-透光率读数误差
c
c1
c1
c2
c2
c3
c3> <
5
10
8
6
4
2
0 20 40 60 800.7 0.4 0.2 0.1 AT%
Er
r
0.43 4
lg
( 0.01 )
cTE
c T T
T
(36.8)
0.434
浓度测量的相对误差与 T(或 A)
的关系实际工作中，应控制 T在 10～ 70％,
A在 0.15～ 1.0之间 (调 c,b,?)
6
8.4 显色反应与分析条件的选择
：：
：
：
助色团 － NH2，－ OH，－ X （孤对电子） ne
8.4.1 显色剂与显色反应
O
生色团,－ N＝ N－，－ N＝ O，
OC=S,－ N （共轭双键） πe
无机显色剂,SCN- [Fe(SCN)]2+
H2O2 [TiO·H2O2]2+
有机显色剂,
7
有机显色剂
CH3－ C－ C－ CH3
HO－ N N－ OH
＝ ＝
NN
OH
COOH
SO3H
OO型：
N
N N OH
OH
ON型,PAR
NH NH
N
S
NS型,
双硫腙
NN型,丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸
8
显色反应的选择
*灵敏度高,一般 ε >104
*选择性好
*显色剂在测定波长处无明显吸收。
对照性好,?λ max>60 nm,
*反应生成的有色化合物 组成恒定，稳定 。
*显色条件易于控制,重现性好 。
9
8.4.2 显色条件的确定
c(R) c(R) c(R)
1,显色剂用量 （ c(M),pH一定）
Mo(SCN)32+ 浅红
Mo(SCN)5 橙红
Mo(SCN)6- 浅红
Fe(SCN)n3-n
10
2,显色反应酸度 （ c(M),c(R)一定）
pH1<pH<pH2
pH
11
邻二氮菲－亚铁反应完全度与 pH的关系
Fe2++3R
R ( H )Fe ( A )
33
33
3
[ F e R ]
'
[ F e '] [ R ']
3
3 F e ( A ) R ( H )
[ F e R ]lg lg lg 3 lg 3 lg [ R ' ]
[ F e ']
H＋H＋A柠檬酸
c(R)≈[R′]=10-4mol·L-1
β3＝ 1021.3β3 FeR3
12
3[F e R ]lg
[ F e ]?
pH3～ 8为适宜的酸度范围
13
3,显色温度及显色时间另外，还有介质条件、有机溶剂、
表面活性剂等
T1(℃ )
T2(℃ )
t(min)
A
14
8.4.3 干扰及消除
Co2＋,Fe3+ Co
2+
FeF63- Co(SCN)2 (蓝 )
⑴ NaF SCN－
Co2+
Fe2+,Sn4+
(2)Sn2+ Co(SCN)
2
SCN－
测 Co2＋ (含 Fe3+),(掩蔽法 )
1.化学法
15
Co2+,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
CoR,ZnR
NiR,FeR
CoR,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
钴试剂 R H+
测 Co2＋,(生成络合物性质不同 )
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，
则需采取分离法。
测 Fe3＋,(控制 pH)
Fe3+,Cu2+ FeSS （紫红）Cu2+pH 2.5 SS
16
2,物理法
—选择适当的测定波长
515 655 415 500
钍 -偶氮砷 III 钴 -亚硝基红盐
A A
络合物络合物试剂试剂
17
1,仅络合物有吸收,溶剂 作参比。
如 phen—Fe2+ 标准曲线
2.待测液也有吸收,被测液 作参比。
如 测汽水中的 Fe
3,显色剂或其他试剂也有吸收,空白溶液 作参比例,邻二氮菲光度法测 Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含 Li2CO3样品的所有试剂 。
4,干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：
1） 掩蔽被测组分,再加入显色剂，作参比,
2） 加入等量干扰组分 到空白溶液中,作参比,
-- 选择适当的参比溶液
18
8.5 吸光光度法的应用
1,单一组分测定
1) 金属离子,Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂
2) 磷的测定,DNA中含 P～ 9.2%,RNA中含 P～ 9.5%,
可得核酸量,
H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄 (?小 )
磷钼 (V)蓝 (?大 )
Sn2+
19
3) 蛋白质测定 —溴甲酚绿、考马司亮蓝等
4) 氨基酸测定 —茚三酮 (紫色化合物 )
5) 水质检测,NH4+,NO2-,Mn2+,Fe2+、
SO42-,Hg2+----
6) 药物含量测定 —比吸光系数定量；荷移光谱法测定,
7) 紫外吸收 (UV),NO2-,NO3-,SO42-、
SO32-,CO32-,SCN-、酪氨酸、色氨酸、
苯丙氨酸、蛋白质等。
20
2,多组分的测定
x?1,?y?1,?x?2,?y?2由 x,y标液在?1,?2处分别测得
a) 在?1处测组分 x,在?2处测组分 y
b) 在?1处测组分 x; 在?2处测总吸收,扣除 x吸收,可求 y
c) x,y组分不能直接测定
A1=?x?1bcx+?y?1bcy(在?1处测得 A1)
A2 =?x?2bcx+?y?2bcy(在?2处测得 A2)
21
3,光度滴定
NaOH滴定 对硝基酚 pKa=7.15
间硝基酚 pKa=8.39
pKa
=1.24
V1 V2 V(NaOH)/mL
对硝基酚间硝基酚 酸形均无色,
碱形均黄色
22
典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。
Vsp
滴定剂吸收
Vsp
被滴物吸收
Vsp
滴定剂与待测物均吸收
Vsp
产物吸收
23
4,络合物组成的测定
(1)摩尔比法,固定 cM,改变 cR
1:1 3:1
c(R)/c(M)
A
1.0 2.0 3,0
24
(2)等摩尔连续变化法,
M:R=1:1
0.5 0.33
cM/c cM/c
M:R=1:2
M R M R nn?
MR (c c c ） 常数
25
表观形成常数的测定 (设 M,R均无吸收 )
0.5
cM/c
M:R=1:1
A0
A
0
0
-= A A
A?
c(M)=c(R)=c
)?
2
[ M R ] ( 1 - 1 -= = =
[ M ] [ R ]
cK
cc c
MmRn型?
26
5.一元弱酸离解常数的测定 p330
HL H＋ ＋ L
HL
HL L= [ H L ] + [ L ]
KccA
KK
+ L
++
a
aa
(HL)[ H ] ( H L )=+
+ [ H ] + [ H ]
Ka＝ [H+][L]/[HL]
高酸度下，几乎全部以 HL存在，可测得 AHL＝ εHL·c(HL)；
低酸度下，几乎全部以 L存在，可测得 AL ＝ εL·c(HL).
代入整理：
AAK
A A
+HL
a L
-= [ H ]
-
[HL]
[L]
L
HL
AA
K AAa
-
p = p H + l g -或配制一系列 c相同,pH不同的溶液,测 A.
27
MO吸收曲线
Aa(HL)
Ab
(L)
1
2
3
4
5
6A
b65
4
32
1A
a
350 400 450 500 550 600?/nm
A曲线 pH
1 1.10,1.38
2 2.65
3 3.06
4 3.48
5 3.98
6 5.53,6.80
由每份溶液的一对 pH,A，可求得一个 Ka,取平均值即可,
28
MO离解常数的测定作图法 LHLap p H l g AAK AA
H L L2AAA
AHL
3.32(pKa)
1 2 3 4 5 6
A
pH=pKa
pH
pHA 曲线
AL
L
HL
l g p HAAAA 曲线
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
3.0 4.0 pH
HL
L [ H L ]lg g [L ]l AAAA
3.34
29
6,双波长分光光度法消除干扰 (不要求 )
在?2,A?2 = Ax2+Ay2
在?1,A?1=Ax1+Ay1
A= A?2 - A?1
= Ax2+Ay2 –(Ax1+Ay1)
= Ax2 –Ax1
=?Ax
Ay2 ＝ Ay1
Ax =(?x2－?x1)bcx
消除了 y的干扰
X被测 Y干扰
2?1?1
Ay1
AX1
Ay2
AX2
A
/nm′
30
双波长分光光度法消除浑浊背景干扰
1?2
A
A?1 -A?2 = △ A
△ A∝ c
例 牛奶中微量
Fe的测定
31
7,导数分光光度法 (不要求 )
A~?图混合物导数光谱
0
1
2
3
4
A?
图
32
常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定
1.氢氯噻嗪,
2.硫酸双肼肽嗪
3,盐酸可乐定
4.常药降压片
250 290 330?
4
1
2
3
1
2
A
A
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肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用 6％的
HClO4稀释，然后用 GDX100大孔树脂萃取，用二氯甲烷 5mL洗脱杀鼠剂,40℃
挥干，剩余物用 0.1mol·L-1NaOH4mL溶解后，紫外导数光谱测定。
A
2
2
d
d
A
0.0c
d
a
b
D
a.空白肝普通光谱
b.2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱
c.空白肝二阶导数光谱
d.2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱
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8.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系,吸收曲线 —定性分析的基础 。
定量分析的基础 —朗伯 -比尔定律,A=?bc=-lgT 式中各参数的物理意义,定量计算 。
8.2 了解目视比色法,分光光度法的特点,分光光度计的基本部件 。
8.3 灵敏度的表示 —摩尔吸光系数的意义和计算 ；
准确度 —适宜的测量范围,偏离比尔定律的原因 。
8.4 显色反应及条件的确定,显色剂用量,酸度,时间,
温度,干扰及消除 。
8.5 应用,单一组分测定示例,多组分测定,光度滴定,
络合物组成的测定,酸碱离解常数的测定 。
第八章 小 结
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