第三章 荧 光 光 度 法
Fluorescence Spectrometry
分子荧光：分子价电子跃迁原子荧光：原子外层电子跃迁
X— 荧光：原子内层电子跃迁
3.1 荧光的产生分子在辐射能的照射下，电子跃迁至 单重激发态,并以 无辐射弛豫方式 回到 第一 单重激发态的 最低振动能级,由此再跃回 基态或基态中其它振动能级时 所发出的光。
3.1 荧光的产生基态 和 激发态单重态 和 三重态,单重态 的分子具有 抗磁性三重态 的分子有 顺磁性跃迁分为：辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）
基态：电子自旋配对,
多重度 =2s+1=1,为单重态,以 S0表示 。
激发单重态：分子吸收能量,电子自旋仍然配对,
为单重态,称为激发单重态,以 S1,S2… 表示激发三重态：分子吸收能量,电子自旋不再配对,
为三重态,称为激发三重态,以 T1,T2…,表示 。
三重态能级低于单重态 （ Hund规则 ）
3.1 荧光的产生
3.1.1 荧光产生的必要条件
A、有吸收结构
B,入射光频率 =特征频率
C、有高的荧光效率
3.2 荧光光谱曲线激发光谱,固定发射波长,改变激发波长,测荧光强度和激发光波长的关系 。
荧光光谱,固定激发波长 为最大激发波长处,
测不同波长时的荧光强度 。
荧光光谱,选择合适的激发波长（根据物质激发光谱曲线来确定），固定激发光波长，然后测定不同波长时所发射的荧光强度。
3.2 荧光光谱曲线
* 激发光谱曲线和其吸收曲线可能相同，但性质不同。
* 荧光光谱较激发光谱而言，位于长波。
I 激发光谱荧光（发射）光谱
λ
3.3 荧光的影响因素
A,荧光效率 （ 量子产率 ）?
= 发射荧光的分子数 / 激发分子总数
B,分子结构
是否有共轭双键体系,共轭高,荧光效率高
是否有刚性平面结构,刚性平面使荧光效率高
取代基类型,给电子基团使荧光增强,吸电子基团使荧光减弱
3.3 荧光的影响因素
C,溶剂的影响增大溶剂的极性使荧光增强含重原子的溶剂 （ e.g,CBr4） 使荧光减弱
D,荧光猝灭激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用,使能量转移,荧光强度减弱甚至消失
E,温度影响温度上升,荧光减弱
3.4 定量分析
F =?KI0CL = K’CL
,荧光效率,K：仪器常数，
C：浓度,I0：吸收光强
3.4 定量分析分光法与荧光法定量比较
UV-VIS分光法 荧光法定量基础 A = lgI0/I F? C
两个较大信号 叠加在很小背景
I0和 I的微小差别 值上的荧光信号灵敏度 与? 有关 与 有关检测限 10-6-10-9 10-9-10-12
3.5 荧光光度计与 UV-VIS的两个差异,
A.90?角接收光信号 —— 去除透射
B.两个单色器 （ 选择激发光单色器,分离荧光单色器 ） —— 去除杂散光第一单色器或滤光片 记录仪第二单色器或滤光片荧光光源激发样品池
3.5 荧光光度计
3.5.1 光源
A,白炽灯：钨灯,卤钨灯
B,气体放电灯：氢,氙,汞,
常用 氙 灯 （ 波长,200-700nm）
C,激光光源
3.5 荧光光度计
3.5.2 单色器闪耀光栅
3.5.3 检测器光电倍增管
3.6 实验技术
3.6.1 经常用标准基准物质校正仪器波长
3.6.2 选择溶剂由于偶极,氢键作用,激发光谱和发射光谱发生位移,增大溶剂极性可使荧光强度增强 。
3.6 实验技术
3.6.3 浓度效应 （ 内滤效应 ）
荧光物质浓度大时,光强与浓度不成线性关系 。
原因：
A,发光集中在一边 B,自吸收效应
3.6.4 温度的影响低温荧光
3.7 荧光法的应用
3.7.1同步荧光法对多组分的测定混合物荧光光谱比较复杂不易分开 。 使激发和发射光波长保持一固定差距,对试样进行扫描,获得荧光信号 。
因为激发和发射光谱均一样的物质不多,因而可提高选择性和分辨率 。
3.7 荧光法的应用
Case 1：
对环境样品中 PAH的同步荧光测定苯并芘菲 萘 蒽 440
普 同 315 387 347 丁省通 步 472
荧 荧光 光
λ,nm λ,nm
3.7 荧光法的应用激发光谱 荧光光谱 激发 荧光 普通 同步
I 光谱 光谱 荧光 荧光
A=B A≠ B 可分 可分
λ
I
A≠ B A=B 不可分 可分
λ
3.7 荧光法的应用激发光谱 荧光光谱 激发 荧光 普通 同步光谱 光谱 荧光 荧光
A≠ B A≠ B 可分 可分
A=B A=B 不可分 不可分
I
I λ
λ
3.7 荧光法的应用
Case 2：
叶绿素 a和叶绿素 b的同步荧光分析叶绿素 a 叶绿素 b
叶绿素 a H+ 脱 Mg叶绿素 a
MW 893.48 MW592.67
N
N
N
N
Mg
CH CH2 CH3
C
H2
CH3
CH3CH3
CH3
CH2
CH2
O O CH3
CH3 CH3
3
OCOOCH
3
HH
N
N
N
N
Mg
CH CH2
C
H2
CH3
CH3CH3
CH3
CH2
CH2
O O CH3
CH3 CH3 3
OCOOCH
3
HH
CHO
3.7 荧光法的应用
C叶 a ＝ ka（ I未 － I酸 ）
C叶 b ＝ kb（ I未 － I酸 ）
（上述 2式经推导得出）
用标样 C叶 a和 C叶 b，测未酸化和酸化后的荧光强度 I，可得 ka,kb。再测未知样。
由于叶绿素 a和 b结构相似，普通荧光法无法分开，故采用同步荧光法。
3.7 荧光法的应用
3.7.2时间分辨荧光法脉冲光激发荧光体，形成激发态荧光群体，
激发群体随时间而衰变，记录讯号，进行积分。
激发衰减时间 t,ns
计数时间
3.7 荧光法的应用
3.7.2时间分辨荧光法得在固定波长下的荧光强度 -时间曲线及固定时间的荧光发射光谱。
1,用以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分进行分辨并分别测定。
2,通过调节延迟时间，可把不需要的信号有效地消除以提高信噪比。
灵敏度提高 3~4个数量级
Fluorescence Spectrometry
分子荧光：分子价电子跃迁原子荧光：原子外层电子跃迁
X— 荧光：原子内层电子跃迁
3.1 荧光的产生分子在辐射能的照射下，电子跃迁至 单重激发态,并以 无辐射弛豫方式 回到 第一 单重激发态的 最低振动能级,由此再跃回 基态或基态中其它振动能级时 所发出的光。
3.1 荧光的产生基态 和 激发态单重态 和 三重态,单重态 的分子具有 抗磁性三重态 的分子有 顺磁性跃迁分为：辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）
基态：电子自旋配对,
多重度 =2s+1=1,为单重态,以 S0表示 。
激发单重态：分子吸收能量,电子自旋仍然配对,
为单重态,称为激发单重态,以 S1,S2… 表示激发三重态：分子吸收能量,电子自旋不再配对,
为三重态,称为激发三重态,以 T1,T2…,表示 。
三重态能级低于单重态 （ Hund规则 ）
3.1 荧光的产生
3.1.1 荧光产生的必要条件
A、有吸收结构
B,入射光频率 =特征频率
C、有高的荧光效率
3.2 荧光光谱曲线激发光谱,固定发射波长,改变激发波长,测荧光强度和激发光波长的关系 。
荧光光谱,固定激发波长 为最大激发波长处,
测不同波长时的荧光强度 。
荧光光谱,选择合适的激发波长（根据物质激发光谱曲线来确定），固定激发光波长，然后测定不同波长时所发射的荧光强度。
3.2 荧光光谱曲线
* 激发光谱曲线和其吸收曲线可能相同，但性质不同。
* 荧光光谱较激发光谱而言，位于长波。
I 激发光谱荧光（发射）光谱
λ
3.3 荧光的影响因素
A,荧光效率 （ 量子产率 ）?
= 发射荧光的分子数 / 激发分子总数
B,分子结构
是否有共轭双键体系,共轭高,荧光效率高
是否有刚性平面结构,刚性平面使荧光效率高
取代基类型,给电子基团使荧光增强,吸电子基团使荧光减弱
3.3 荧光的影响因素
C,溶剂的影响增大溶剂的极性使荧光增强含重原子的溶剂 （ e.g,CBr4） 使荧光减弱
D,荧光猝灭激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用,使能量转移,荧光强度减弱甚至消失
E,温度影响温度上升,荧光减弱
3.4 定量分析
F =?KI0CL = K’CL
,荧光效率,K：仪器常数，
C：浓度,I0：吸收光强
3.4 定量分析分光法与荧光法定量比较
UV-VIS分光法 荧光法定量基础 A = lgI0/I F? C
两个较大信号 叠加在很小背景
I0和 I的微小差别 值上的荧光信号灵敏度 与? 有关 与 有关检测限 10-6-10-9 10-9-10-12
3.5 荧光光度计与 UV-VIS的两个差异,
A.90?角接收光信号 —— 去除透射
B.两个单色器 （ 选择激发光单色器,分离荧光单色器 ） —— 去除杂散光第一单色器或滤光片 记录仪第二单色器或滤光片荧光光源激发样品池
3.5 荧光光度计
3.5.1 光源
A,白炽灯：钨灯,卤钨灯
B,气体放电灯：氢,氙,汞,
常用 氙 灯 （ 波长,200-700nm）
C,激光光源
3.5 荧光光度计
3.5.2 单色器闪耀光栅
3.5.3 检测器光电倍增管
3.6 实验技术
3.6.1 经常用标准基准物质校正仪器波长
3.6.2 选择溶剂由于偶极,氢键作用,激发光谱和发射光谱发生位移,增大溶剂极性可使荧光强度增强 。
3.6 实验技术
3.6.3 浓度效应 （ 内滤效应 ）
荧光物质浓度大时,光强与浓度不成线性关系 。
原因：
A,发光集中在一边 B,自吸收效应
3.6.4 温度的影响低温荧光
3.7 荧光法的应用
3.7.1同步荧光法对多组分的测定混合物荧光光谱比较复杂不易分开 。 使激发和发射光波长保持一固定差距,对试样进行扫描,获得荧光信号 。
因为激发和发射光谱均一样的物质不多,因而可提高选择性和分辨率 。
3.7 荧光法的应用
Case 1：
对环境样品中 PAH的同步荧光测定苯并芘菲 萘 蒽 440
普 同 315 387 347 丁省通 步 472
荧 荧光 光
λ,nm λ,nm
3.7 荧光法的应用激发光谱 荧光光谱 激发 荧光 普通 同步
I 光谱 光谱 荧光 荧光
A=B A≠ B 可分 可分
λ
I
A≠ B A=B 不可分 可分
λ
3.7 荧光法的应用激发光谱 荧光光谱 激发 荧光 普通 同步光谱 光谱 荧光 荧光
A≠ B A≠ B 可分 可分
A=B A=B 不可分 不可分
I
I λ
λ
3.7 荧光法的应用
Case 2：
叶绿素 a和叶绿素 b的同步荧光分析叶绿素 a 叶绿素 b
叶绿素 a H+ 脱 Mg叶绿素 a
MW 893.48 MW592.67
N
N
N
N
Mg
CH CH2 CH3
C
H2
CH3
CH3CH3
CH3
CH2
CH2
O O CH3
CH3 CH3
3
OCOOCH
3
HH
N
N
N
N
Mg
CH CH2
C
H2
CH3
CH3CH3
CH3
CH2
CH2
O O CH3
CH3 CH3 3
OCOOCH
3
HH
CHO
3.7 荧光法的应用
C叶 a ＝ ka（ I未 － I酸 ）
C叶 b ＝ kb（ I未 － I酸 ）
（上述 2式经推导得出）
用标样 C叶 a和 C叶 b，测未酸化和酸化后的荧光强度 I，可得 ka,kb。再测未知样。
由于叶绿素 a和 b结构相似，普通荧光法无法分开，故采用同步荧光法。
3.7 荧光法的应用
3.7.2时间分辨荧光法脉冲光激发荧光体，形成激发态荧光群体，
激发群体随时间而衰变，记录讯号，进行积分。
激发衰减时间 t,ns
计数时间
3.7 荧光法的应用
3.7.2时间分辨荧光法得在固定波长下的荧光强度 -时间曲线及固定时间的荧光发射光谱。
1,用以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分进行分辨并分别测定。
2,通过调节延迟时间，可把不需要的信号有效地消除以提高信噪比。
灵敏度提高 3~4个数量级
