第四章 磷 光 和 发 光 光 度 法
Phosphorescence and Luminescence Spectrometry
4.1 磷光
4.1.1 磷光的产生和磷光光谱激发态电子由 第一激发单重态 的 最低 振动能级以 系间窜跃 方式转至 第一激发三重态,再经过 振动弛豫,转至其 最低 振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射 磷光 。
固定激发光波长为其最大处，测不同波长下的磷光强度，得磷光光谱曲线。
。
三重态能级低于单重态 （ Hund规则 ）
激发三重态激发单重态基态
4.1 磷光磷光的产生涉及到激发 单重态 经 系间窜跃转至激发 三重态 （ S1 T1） 和由激发三重态经 禁阻跃迁 回到基态 （ T1 S0）,在动力学上处于不利的情况,所以很容易受其他辐射或无辐射跃迁的干扰而使磷光强度减弱,
甚至完全消失 。
T1 S0跃迁过程是自旋禁阻的,其发光速率较慢,约为 10-4— 100S,强度相对较弱 。
4.1 磷光
4.1.2 磷光的定性和定量分析类同于荧光的定性和定量分析定性：磷光光谱图定量：工作曲线法
4.1.3 磷光计与荧光计相似,在荧光计中,可以配上磷光分析附件 。
4.1 磷光与荧光计的区别：
A,液槽,低温装置 （ 杜瓦瓶 ）
B,斩波片,斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射,
从而 区别磷光和荧光 。
同相斩波时,测磷光和荧光总和异相斩波时,测磷光
4.1 磷光磷光仪
4.1 磷光
4.1.4 磷光实验技术
A.低温磷光法,置样品于液氮中，减少质点间的碰撞几率，以 减少无辐射跃迁 。
B.固体磷光法,可将溶剂除去,在薄层色谱板上进行斑点磷光分析 。
C.形成分子缔合物,表面活性剂与被测物质形成胶束合物,可 增强刚性,减少因碰撞而引起的能量损失 。
4.1 磷光
4.1.4 磷光实验技术
D.重原子效应,在 含有重原子的溶剂 如碘乙烷中,有利于系间窜跃,即 S1 T1跃迁,
使磷光得到加强 。 （ 与荧光相反 ）
E.敏化磷光,分析物质的激发三重态 T1将能量转移至能量受体的激发三重态 T’1,然后当受体从 T’1跃回至基态 S’0时,产生磷光 。
这种分析方法中,分析物本身不发磷光,
而是引发受体发磷光 。
4.2 化学发光由化学反应激发物质电子所产生的光辐射
4.2.1 化学发光的基本原理化学反应 提供足够的能量，使其中一种反应产物的分子的电子被激发，形成激发态分子。
激发态分子跃回基态时，就发出一定波长的光。
其发光强度随时间变化，并可得到较强的发光
（峰值）。
在合适的条件下，峰值与被分析物浓度成线性关系，可用于定量分析。
4.2 化学发光由于化学发光反应类型不同，发射光谱范围为 400 ~ 1400nm。
必要条件：
A,化学反应放出足够能量
B,能量用于产生激发态分子
C,有一定化学发光效率
4.2 化学发光
4.2.2 化学发光的定量分析化学发光反应效率?CL，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率?CE和激发态分子的发射效率?EM。
定义为：
CL =发射光子的分子数 / 参加反应的分子数
=?CEEM
4.2 化学发光化学发光反应的发光强度 ICL以单位时间内发射的光子数表示 。 它与化学发光反应的速率有关,而反应速率又与反应分子浓度有关 。 即
ICL（ t） =?CL? dc/dt
式中 ICL（ t）表示 t时刻的化学发光强度，
与分析物有关。 dc/dt是分析物参加反应的速率。
4.2 化学发光
4.2.3 鲁米诺 — 过氧化氢体系在 碱性介质 中，过氧化氢氧化鲁米诺，经不稳定桥式六元环过氧化物，形成激发态氨基苯二甲酸离子，经 辐射光能 转化成一般的氨基苯二甲酸盐。
O
O
N
N
NH 2O
O
NH
NH
NH 2 NH 2
O
O N
N
OH
OH
H 2 O 2OH -
OH -
NH 2
COO
_
COO
_ +
*NH 2
COO
_
COO
_
hv
Lum 碱性介质 氧化 不稳定桥式六元环过氧化物激发态氨基苯二甲酸氨基苯二甲酸 辐射
4.2 化学发光该反应可被一些痕量的过渡族金属离子 （ Co,
Cu,Ni,Cr,Fe） 所催化,或被一些金属离子
(Ag,Ti,Ce,Th)猝灭,可用于这些离子的检出 。
4.2.4 发光的测量仪器
A.进样装置和反应装置样品和试剂混合：分立取样式；流动注射式
B.检测器，光电倍增管
C.读出装置，显示屏，记录仪
4.3 生物发光生物体内的生物化学反应产生的发光
4.3.1 酶促反应 +发光反应三磷酸腺苷的测定,在荧光素酶和镁作用下,
ATP和荧光素反应,生成磷酸腺苷 AMP荧光素和荧光素酸的复合物,复合物与氧反应,产生化学发光 。
4.3 生物发光
4.3.2 细菌发光明亮发光杆菌的发光反应,FMNH2和 FMN之间的转化起到了传递氢的作用,FMNH2分子中有两个 -
NH-基，易于其它分子形成氢键。毒物分子可能与
FMNH2分子发生氢键结合，阻碍了氢的传递过程，从而干扰了正常的发光反应，致使发光减弱。
FMNH2 + RCHO + O2 细菌黄素酶黄素单核苷酸 FMN + RCOOH + H20 + hv
还原形式 黄素单核苷酸 495nm
氧化形式
4.3 生物发光
4.3.3 生物发光检测仪器同化学发光
Phosphorescence and Luminescence Spectrometry
4.1 磷光
4.1.1 磷光的产生和磷光光谱激发态电子由 第一激发单重态 的 最低 振动能级以 系间窜跃 方式转至 第一激发三重态,再经过 振动弛豫,转至其 最低 振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射 磷光 。
固定激发光波长为其最大处，测不同波长下的磷光强度，得磷光光谱曲线。
。
三重态能级低于单重态 （ Hund规则 ）
激发三重态激发单重态基态
4.1 磷光磷光的产生涉及到激发 单重态 经 系间窜跃转至激发 三重态 （ S1 T1） 和由激发三重态经 禁阻跃迁 回到基态 （ T1 S0）,在动力学上处于不利的情况,所以很容易受其他辐射或无辐射跃迁的干扰而使磷光强度减弱,
甚至完全消失 。
T1 S0跃迁过程是自旋禁阻的,其发光速率较慢,约为 10-4— 100S,强度相对较弱 。
4.1 磷光
4.1.2 磷光的定性和定量分析类同于荧光的定性和定量分析定性：磷光光谱图定量：工作曲线法
4.1.3 磷光计与荧光计相似,在荧光计中,可以配上磷光分析附件 。
4.1 磷光与荧光计的区别：
A,液槽,低温装置 （ 杜瓦瓶 ）
B,斩波片,斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射,
从而 区别磷光和荧光 。
同相斩波时,测磷光和荧光总和异相斩波时,测磷光
4.1 磷光磷光仪
4.1 磷光
4.1.4 磷光实验技术
A.低温磷光法,置样品于液氮中，减少质点间的碰撞几率，以 减少无辐射跃迁 。
B.固体磷光法,可将溶剂除去,在薄层色谱板上进行斑点磷光分析 。
C.形成分子缔合物,表面活性剂与被测物质形成胶束合物,可 增强刚性,减少因碰撞而引起的能量损失 。
4.1 磷光
4.1.4 磷光实验技术
D.重原子效应,在 含有重原子的溶剂 如碘乙烷中,有利于系间窜跃,即 S1 T1跃迁,
使磷光得到加强 。 （ 与荧光相反 ）
E.敏化磷光,分析物质的激发三重态 T1将能量转移至能量受体的激发三重态 T’1,然后当受体从 T’1跃回至基态 S’0时,产生磷光 。
这种分析方法中,分析物本身不发磷光,
而是引发受体发磷光 。
4.2 化学发光由化学反应激发物质电子所产生的光辐射
4.2.1 化学发光的基本原理化学反应 提供足够的能量，使其中一种反应产物的分子的电子被激发，形成激发态分子。
激发态分子跃回基态时，就发出一定波长的光。
其发光强度随时间变化，并可得到较强的发光
（峰值）。
在合适的条件下，峰值与被分析物浓度成线性关系，可用于定量分析。
4.2 化学发光由于化学发光反应类型不同，发射光谱范围为 400 ~ 1400nm。
必要条件：
A,化学反应放出足够能量
B,能量用于产生激发态分子
C,有一定化学发光效率
4.2 化学发光
4.2.2 化学发光的定量分析化学发光反应效率?CL，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率?CE和激发态分子的发射效率?EM。
定义为：
CL =发射光子的分子数 / 参加反应的分子数
=?CEEM
4.2 化学发光化学发光反应的发光强度 ICL以单位时间内发射的光子数表示 。 它与化学发光反应的速率有关,而反应速率又与反应分子浓度有关 。 即
ICL（ t） =?CL? dc/dt
式中 ICL（ t）表示 t时刻的化学发光强度，
与分析物有关。 dc/dt是分析物参加反应的速率。
4.2 化学发光
4.2.3 鲁米诺 — 过氧化氢体系在 碱性介质 中，过氧化氢氧化鲁米诺，经不稳定桥式六元环过氧化物，形成激发态氨基苯二甲酸离子，经 辐射光能 转化成一般的氨基苯二甲酸盐。
O
O
N
N
NH 2O
O
NH
NH
NH 2 NH 2
O
O N
N
OH
OH
H 2 O 2OH -
OH -
NH 2
COO
_
COO
_ +
*NH 2
COO
_
COO
_
hv
Lum 碱性介质 氧化 不稳定桥式六元环过氧化物激发态氨基苯二甲酸氨基苯二甲酸 辐射
4.2 化学发光该反应可被一些痕量的过渡族金属离子 （ Co,
Cu,Ni,Cr,Fe） 所催化,或被一些金属离子
(Ag,Ti,Ce,Th)猝灭,可用于这些离子的检出 。
4.2.4 发光的测量仪器
A.进样装置和反应装置样品和试剂混合：分立取样式；流动注射式
B.检测器，光电倍增管
C.读出装置，显示屏，记录仪
4.3 生物发光生物体内的生物化学反应产生的发光
4.3.1 酶促反应 +发光反应三磷酸腺苷的测定,在荧光素酶和镁作用下,
ATP和荧光素反应,生成磷酸腺苷 AMP荧光素和荧光素酸的复合物,复合物与氧反应,产生化学发光 。
4.3 生物发光
4.3.2 细菌发光明亮发光杆菌的发光反应,FMNH2和 FMN之间的转化起到了传递氢的作用,FMNH2分子中有两个 -
NH-基，易于其它分子形成氢键。毒物分子可能与
FMNH2分子发生氢键结合，阻碍了氢的传递过程，从而干扰了正常的发光反应，致使发光减弱。
FMNH2 + RCHO + O2 细菌黄素酶黄素单核苷酸 FMN + RCOOH + H20 + hv
还原形式 黄素单核苷酸 495nm
氧化形式
4.3 生物发光
4.3.3 生物发光检测仪器同化学发光
