第四章 酶的纯化和精制第一节 纯化方案设计第二节 纯化方法第三节 酶的纯度和产量第四节 酶的剂型与保存第一节 纯化方案设计一,分离纯化酶的原则：
设计酶的纯化方案时要考虑到应用，下列各点是应认真遵循的原则：
第一，要注意防止酶变性失效，这一点在纯化的后期更为突出。
第二，从理论上说，凡是用于蛋白质分离纯化的一切方法都同样适用于酶。
第三，酶具有催化活性，检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。
二,防止酶变性失效的方法,
(1)除了少数例外，所有操作都应在低温条件下进行，尤其是在有机溶剂存在的情况下更应特别小心。
(2)大多数酶在 pH<4或 pH>10的情况下不稳定，
故必须控制整个系统不要过酸过碱；同时要避免在调整 pH时产生局部酸碱过量的现象。
(3)酶和其它蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。
(4)重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。
整个纯化工作包括三个基本环节：抽提,纯化和精制 。
常用的抽提方法除细胞自溶外,还有有机溶剂或表面活性剂处理等化学方法；近年来为适应日益增多的胞内酶分离提纯的需要,发展和设计了不少细胞或菌体的破碎设备,如超声波振荡器,高压喷挤设备,匀浆装臵及振动球磨 。
第二节 纯化方法酶分离纯化工作是酶学研究的重要组成部分，亦是酶制剂工业生产的主要内容。要研究或使用一个酶，就得采用分离纯化方法去得到它。酶的化学本质是蛋白质
，所以用于蛋白质的分离纯化方法一般都适用于酶的分离纯化。此外，酶是具有催化功能的蛋白质，因此根据酶与底物、底物结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特异亲合力，可发展酶独特的亲合色谱技术。所有的分离纯化方法，都是根据被分离物质间不同的物理、化学和生物学性质的差异而设计出来的。 分离纯化生物大分子的方法很多，主要是利用它们之间特异性的差异：如分子大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷及对其他分子的亲和性等建立起来的。如果欲分离的目标分子是细胞内产物，首先涉及的是细胞的破碎。接下来的分离过程可分成粗分离和精制分离。
一,酶的抽提抽提的要求是将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。
1,预处理过去多用动物或植物的器官组织作为酶的来源，近年来则主要采用微生物作材料。但是不管什么原料，通常都需要先进行适当的预处理。例如，动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织；油质种子最好先用乙醚等脱脂；种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；微生物材料则应将菌体和发酵介质分离。经过这些处理后，材料须尽可能以非常新鲜的状态直接应用，否则就应将完整材料立即冰冻起来。
2,破细胞酶根据它的分布可分为细胞内酶和细胞外酶，根据它的存在状态，即是否与细胞内的颗粒体或膜结合，细胞内酶又可分为结酶与溶酶。细胞外酶没有破细胞问题；但是细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，
而且抽提效果也往往与细胞破碎程度有关。
至于结酶，还有一个切断它与颗粒体或膜的连结问题。
2.1丙酮干粉法,一般是先将材料粉碎或分散，
然后在 0℃ 以下的低温条件下,加入 5—10倍的
15～ 20℃ 的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，
最后低温干燥,研磨过筛。
优点,丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁
(膜 );另一方面由于丙酮是脂溶剂，这种处理有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰，有时这种处理还能使某些结酶易于溶解；此外，丙酮干粉含水量低，易于保存,
缺点,丙酮可能引起某些酶变性失效，有些酶则根本不能采用此法。
2.2自溶法,就是在适当的温度,pH条件下，
将浓的菌体悬破直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯或其它溶剂一起保温一定时间，使菌体自溶液化。
缺点,第一，自溶液中成份十分复杂。
第二，有破坏待分离酶的危险。
2.3 破细胞的手段,
动,植物材料：
通常用绞肉机作成组织糜，如果需要破碎得更彻底些，可用高速组织捣碎器捣碎，或者加砂研磨。
高速捣碎器操作简便、破碎效果好，但易引起局部温度过高，导致酶失效，故必须考虑酶的特点谨慎使用。加砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替砂时，要注意有时可能发生吸附变性。在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，还可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻融解处理，
量少时，某些组织还可采用匀浆器将细胞研磨破碎。
微生物材料,
不同的微生物材料处理的方法与难易程度也各有差异。
霉菌 材料比较容易，可通过机械剪切、研磨或加细胞壁溶解酶解决。
细菌,少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处理；大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法。
酵母细胞 壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在可采用的办法有,(1)细胞壁溶解酶处理法；
(2)盐振荡法；
(3)冷热破壁法。
3,抽提细胞破碎后，可采用两种 方式 进行抽提：
一是,普遍,抽提；
二是先后用不同溶剂进行选择性抽提。
3.1 抽提条件的选择,
由于大多数酶属于球蛋白类，因此一般部可以用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。
但抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶和其它物质的联系。需要考虑的因素有：
1.pH； 2.盐； 3.温度； 4.其它。
a,pH
首先应考虑酶的酸碱稳定性，选择的 pH不应超出酶的稳定范围；
其次从最佳的抽提效果着眼，最好远离待抽提酶的等电点。也就是说，酸性蛋白质宜用碱性溶液抽提，碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如，
肌肉甘油醛 —3—磷酸脱氢酶以稀碱抽提时产量较高，胰蛋白酶选用 0.25N硫酸。
第三，在某些情况下抽提还要兼顾到有利于切断酶和细胞内其它成分间可能的联系，从这点考虑以选用 pH4—6为佳。
b,盐大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以抽提液一被采用 等渗盐溶液 。最普通的加 0.020—0.050M的磷酸缓冲液、
0.15MNaCl等。焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲有助于切断酶和其它物质的连系，并有络合某些金属的作用，因此用得也很多。
少数情况用水抽提 效果亦佳，如霉菌脂肪酶的抽提，这可能与低渗可破坏细胞结构有关,
c,其它在破细胞后，某些亚细胞结构也往往受到损伤，
这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。
为此，有时还需要在抽提液中加入某些物质。
例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟；为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、惰性蛋白和底物等。
抽提液的用量：
通常采用原料量的 l—5倍，有时为了抽提效果好些，要反复抽提，液量可能大些。
4,固体成份除去：
抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多可用离心法或压滤法除去。植物原料的抽提液在冷室中放臵过夜往往就会自动澄清。某些情况下，
在抽提液离心时加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙胶等物质,有助于除去悬浮的胶体物质。
二,浓缩抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低,所以在进行纯化前须先加以浓缩。常用的浓缩方法有：
1,蒸发； 2,超过滤；
3,胶过滤； 4,冰冻浓缩；
5,其它
1 蒸发减压蒸发 浓缩除了效率低、费时外，有时还要加热，同时也可能产生泡沫，因此对稳定性差的酶不适宜。另外，蒸发过程可能产生增色现象，达也影响产品质量。
超蒸发法,即让暖空气流通过冷的酶溶液表面,或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳。
薄膜蒸发 浓缩法（现在多采用的方式），即使待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的液膜，同时使之与大面积热空气接触，其中水分就能瞬时蒸发而达到浓缩的目的。
由于水分蒸发时能带走部分热量，所以只要真空条件好，酶在浓缩过程中实际受到的热作用并不太强，可用于热敏性酶类的浓缩。薄膜蒸发浓缩器有三种 形式,升膜、降膜和刮板。对于较粘稠的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩也往往会带来增色现象。
2 超过滤在加压情况下，将待浓缩溶液通过一层只容许水分子和小分子选择性地透过的微孔超滤膜,而酶等大分子被滞留,从而达到浓缩目的的一种有效方法。
优点,没有热破坏，没有相变化，保持原来的离子强度和 pH。只要膜选择适当,浓缩过程还可能同时进行粗分,此外成本也不高,已渐渐为人们所采用。超过滤可用于小量样品,也可用于工业生产规模。
注意,超滤膜有干型和湿型两种，后者必须保持于溶液中。
3 胶过滤这是利用葡聚糖凝胶 sephdex G—25或 G—
50等能吸水膨润、而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的浓缩。通常采用,静态,方式，即将干胶直接加入样品溶液（干胶用量可根据胶的吸水量计算），胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分离浓缩的酶液。胶过滤浓缩法的优点是，条件温和，
操作简便，也没有 pH与离子强度等的改变。
4 冰冻浓缩原理,溶液相对纯水融点升高,冰点降低。这有两种方式：
1.先将溶液冻成冰块。然后使之缓缓融解，这样几乎不含蛋白质和酶的冰块就浮于液面,而酶等则融解并集中于下层溶液 (约为原体积的 1／ 4);
2.让酶溶液缓缓冻凝，尔后移去水形成的冰块,
问题,浓缩过程可能会发生离子强度与 pH的变化,从而导致酶失效；其次是需要大功率的致冷设备,
5,其它还有聚乙二醇等浓缩法，它们一般只适用小量样品，而且往往成本很高。
三,酶的纯化在抽提液中,除了待纯化的酶外,通常不可避免地杂有其它 小分子和大分子物质,其中小分子杂质在以后的纯化步骤中一般会自然地除去,因此比较容易解决 ;大分子物质包括 核酸,粘多糖和其它蛋白质,核酸和粘多糖往往干扰以后的纯化,特别是细菌等的抽提液中常会有大量核酸,最好设法预先除去,核酸可加硫酸链霉素,聚乙烯亚胺,色精蛋白或 MnCl2等使之沉淀移去,必要时也可使用核酸酶,粘多糖则常用醋酸铅,乙醇,丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决,有时也可用酶。这些杂质移除后,余下的是杂蛋白,
纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作,就是要将酶从杂蛋白中分离出来,
（一）纯化方法的选择为了获得理想的分离效果应注意：
第一，工作前应对所要纯化的 酶的理化性质 (溶解度、分子大小和解离特性 )以及酶的稳定性等有一个较全面的了解，这样就可知道应选择哪些办法与条件，避免哪些处理，
以及了解在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。
第二，判断选择的方法与条件是否适当，
始终应以 活力 测定为准则。一个好的步骤应该是 比活力 (纯度 )提高多,总活力 回收高
（回收率高），而且重现性好。一般地说，
纯化过程不宜重复相同的步骤和方法，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。
第三，要严格控制操作条件，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、总的蛋白浓度下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，
酶的稳定性亦越小，就更应注意 防止变性 。
（二） 酶的纯化方法现行的方法 （根据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的）：
1 根据溶解度的不同；
2 根据分子大小的差别；
3 根据解离电学性质的特点；
4 利用稳定性的差异；
5 基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用的特点。
实际有许多方法中往往包含两种或两种以上的因素在同时起作用。
（三） 根据溶解度建立的纯化方法
1.盐析法 ;
2.有机溶剂沉淀法 ;
3.共沉淀法 ;
4.选择性沉淀法 ;
5.等电点沉淀法
1 盐析法盐析法是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。
盐析法的 原理,球蛋白类在低的盐浓度溶液中，它的溶解度随盐的离子强度升高而增大，
表现,盐溶,特性。但是当盐浓度继续升高，
超过某一上限值时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别,盐析,沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。
盐析应考虑下述因素：
(1)pH
(2)盐
(3)温度
(4)蛋白质浓度
(5)其它
(1)pH
控制 pH可以提高纯化效果，一般 pH可选择的范围不大，大多数情况下，盐析的适宜 pH接近于待纯化酶的等电点。有些情况，酶和杂蛋白能形成某种结合，从而干扰盐析分离，此时如控制 pH＜ 5
或＞ 6，使它们带相同电荷以减少络合物形成，这样盐析效果常会有所改善，但应注意酶在这种条件下的稳定性与盐的溶解度。
(2)盐在纯化的最初阶段，盐的性质产生的影响不一定很明显，仅是随着酶溶液纯度的提高，盐的特征效应就可能突出出来。实践表明，就阳离子来说，一价盐通常比二价盐有效；而阴离子则相反，
二价盐比一价盐好。符合这种条件的盐有硫酸铵、
硫酸钠等。硫酸铵最常用，它的最大优点是溶解度大，溶解的温度系数小 (0℃,706克／升； 25℃,
767克／升 )即使在低温下的溶解度范围内，几乎所有蛋白质都能盐析出来。
(3)温度从酶的稳定性和溶解度看，盐析温度一般以控制 ℃ 在 30左右为宜。
(4)蛋白质浓度这是一个很重要的因素，它一方面能影响盐析效果的重现性，因为蛋白浓度不同，分级分离纳范围也往往会发生变动；另一方面，蛋白浓度在 100μ g/ml以下，盐析一般很因难，有时甚至根本不能形成沉淀。在 200μ g—1mg／ ml范围内，沉淀虽能生成，但时间校长，而且回收率往往不高。为了获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在 1mg／ ml以上。
(5)其它盐析沉淀通常至少要近一小时才能完成，
沉淀可通过离心或压滤和母液分离。盐浓度低时，离心比较容易，而过滤较难；盐浓度高时，需要高速离心，但过滤较易。
盐析法的 优点,简便、安全 (大多数酶在高浓度盐溶液中相当稳定 )、重现性好。
缺点,分辨率低，纯度提高不显著，同时为了下一步纯化有时还需脱盐。
2.有机溶剂沉淀法原理,不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。有机溶剂在这个过程的主要作用是降低溶液的介电常数，
因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，
加入有机溶剂，蛋白质分子问的引力增加，溶解度降低。有机溶剂的另一作用是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。但是有机溶剂的浓度和蛋白质溶解度之间目前还没有一个可用的关系式。
有机溶剂沉淀法应考虑的因素是：
(1)温度
(2)pH
(3)离子强度
(4)有机溶剂
(1)温度这是非常重要的因素，因为大多数蛋白质遇到有机溶剂都很不稳定，特别是温度较高的情况 (例如室温 )
下，极易变性失效，故操作过程通常应控制在 0℃ 以下。而且有机溶剂必须预先冷却到 -15—-20℃,然后在搅拌下缓慢地加入。沉淀析出后应尽快地在低温下离心分离，获得的沉淀也应立即用冷的缓冲液溶解，
以降低有机溶剂浓度。
个别情况下，酶对有机溶剂比较稳定，此时操作可在较高温度 (例如室温 )下进行，这样有利于除去较多的杂蛋白。
(2)pH
蛋白质在等电点的溶解度最低，有机溶剂沉淀通常也多选在尽可能靠近待纯化酶的等电点 pH条件下进行。如肌肉酶的分离在
pH6.5效果一般较好,pH调整可用 0.05M的缓冲液。
(3)离子强度中性盐大多能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。在进行有机溶剂分级沉淀时，如果添加适当浓度的中性盐，如 5—10％的硫酸铵，往往有助于提高分离效果。但盐的浓度一般不宜超过 0.05M，否则沉淀不好，甚至沉淀全无，同时有机溶剂耗费也大。
(4)有机溶剂丙酮的分离效果一般最好，引起失效的情况与程度也较少 (小 )。除了丙酮外，乙醇和甲醇等也常用 。
3 共沉淀法原理,这是利用离子型表面活性剂如 SDS(十二烷基磺酸钠 )、非离子型聚合物如聚乙二醇、聚乙烯亚胺以及丹宁酸、硫酸链霉素等，在一定条件下能与蛋白质直接或间接形成络合物，使蛋白质沉淀析出．然后再用适当方法使需要的酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化目的的方法 。
4 选择性沉淀法原理,某些多聚电解质如聚丙烯酸、硫酸糊精以及磷、砷、硅的钨、钼、钒等的杂多酸常能在极低的浓度条件下，选择性地和某种或某类酶结合沉淀析出，其选择性的机制尚不清楚。
以聚丙烯酸 (PAA)为例，它的分子量近 9000或近
300,000的聚合物对某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有选择性沉淀效果，故可用于这些酶的纯化,
5 等电点沉淀法原理,蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小，
当其它条件相同时，分子间的引力以蛋白质处于等电点状态最大，因而容易析出沉淀。
不过由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，故沉淀往往不完全，一般很少单独使用，更多的是作为其它沉淀法中的一个组合条件。但是，这种方法有时可用于对付杂蛋白种类较多的样品，因为将这种样品的 pH调整至某一值后，不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉淀，也可使处于等电点两侧带相反电荷的杂质形成复合物而沉淀，从而可除去大量杂蛋白。
（四） 根据分子大小的建立纯化方法：
１,胶过滤 (层析 )法；
２,筛膜分离法；
３,超离心法分离。
１,胶过滤 (层析 )法原理,必须以层析的方式进行．柱中填充分子筛介质,
用于生物大分子分离的分子筛介质是具有 一定孔径的球状凝胶物质,层析柱中装入某种孔径的凝胶物质以后,再加入待纯化样品,然后用适当的溶剂或缓冲液使该样品自上而下地扩展,这样,样品中的各种分子就将按其分子大小表现不同的层析性态而分离,大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内,它们只能沿胶粒间隙扩展,因而,走,的是一条较
,直,的,路,,表现出较快的移动速度 ;反之,小于凝胶孔径的分子,由于它们能自由进出胶粒内外,按照分子热运动的规律,其运动轨迹,迂回曲折,,因此,表现较慢的下移速度,所以只要待纯化样品通过一定长度的层析柱后,不同大小的分子就将按先后顾序依次流出,彼此分开,
胶过滤 (层析 )法原理胶过滤 (层析 )法应考虑的因素,
(1)胶的选择（葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶） ;
(2)柱层析的过程与要求；
(3)胶过滤中胶的用量（与样品体积有关） ;
(4)其它有关问题 (样品，洗脱液，胶的再生与保存）．
(1)胶的选择作为分子筛的凝胶是由亲水的线状聚合物通过交联剂交联、或通过聚合物自身缔合组成具有网眼结构的胶粒物质。网眼 孔径大小 由交联程度或聚合物的浓度决定。最常用的凝胶有,
(i) 葡聚糖凝胶
(ii) 聚丙烯酰胺凝胶
(iii)琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶,
这是分子量从几万到几十万的葡聚糖通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质。可用于分离分子量 1000—500,000的分子。以商品 Sephdex
G—为例,G—以后的数字为胶膨润时吸水量的 10
倍，如Ｇ —25就表示该胶物质每 1g能吸水 2.5m1，
这个数字越大说明吸水量越高，孔径也越大，更适于分离较大的分子,此外,还有 Sephdex LH —，
是兼具亲脂性和亲水性的凝胶，可用于脂类化合物的分离； Sephacyl S—可用于水溶液和有机溶剂系统，或高浓度氢键解离试剂存在的系统．
各种葡聚糖凝胶 G
(2)柱层析的基本过程与要求过程,层析介质的平衡；装柱；加样；扩展 (包括洗涤和洗脱 )以及与此同时进行流出液成分 (蛋白质或酶活性 )的检测和分部收集。
分离效果的标准,分辨率高，回收率高；稀释度小和速度快。其中分辨率可用 Rs权衡：
Rs＝两峰带间距离／峰带宽当 Rs＝ 1.2时，通常认为基本上达到了分离要求,
胶过滤法的特点,
不受 pH、盐和温度等的影响；操作条件温和、简便，勿需特殊的再生处理，
适于各种分子的分离．
2.筛膜分离法原理,筛膜分离法也即超过滤分离法，它是利用微孔超滤膜仅能选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的一类方法。
特点,它操作比较简单，条件也温和，但是只能达到粗分的要求。
3 超离心分离法原理,这是利用样品中不同大小的分子在相对离心力场达 80,000一 250，
000g的条件下分布不同而进行分离纯化的一种方法。
应用,此法主要用于病毒、细胞颗粒体等的制备，对分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳，分辨率不高而且费时,
五,根据解离电学性质的特点建立的纯化方法,
1.吸附交换 (层析 )法 ;
2.电泳法 ;
3.聚焦层析法。
1 吸附交换 (层析 )分离法这是最常用的一类纯化方法。
原理,利用待纯化样品中不同的分子和吸附剂间的吸附与解吸性质的不同而达到分离。这类分离或以静态吸附方式进行，或以层析吸附方式进行。
过程,有三个主要环节：加样吸附、洗涤和洗脱。实际上每一个环节都包含目的酶和杂蛋白的分离，因此是一种十分有效的纯化方法。
吸附交换分离法原理示意吸附剂,根据吸附机制的不同可分为三种类型：
1.“传统,的物理吸附剂 ;
2.羟基磷灰石 ;
3.离子交换吸附剂。
(1)物理吸附传统的物理吸附剂常用的有 白土、氧化铝和磷酸钙胶 等。其中白土是以硅酸铝为主要成分的具有强吸附力的一类粘土，包括皂土、高岭土和活性白土等；氧化铝根据制备方法不同有多种成品，
磷酸钙胶可从氧化钙和磷酸三钠直接制备。
物理吸附的原理,
一般认为它是由于吸附剂界面分子和样品分子间相互作用的范德华力所引起；因而选择性不强预见性较小，往往需要通过实验加以确定。
这类吸附剂应用很早，但没有得到更大的发展，
原因可能也就在于此。
(2)羟基磷灰石吸附：
近年来应用羟基磷灰石作为吸附剂的日期增多，它是一种微晶型的磷酸钙制品。
原理,
一般认为是，这种晶体表面的钙离子能和蛋白质的负电性基团相互作用，而磷酸基团则能和正电性基团结合。如果在系统中有对钙亲和力更强的离子 (如柠檬酸盐 )存在时，
羟基磷灰石对蛋白质的吸附能力就会显著下降，但是其它盐如 NaCl等，即使浓度很高，也不会影响蛋白质的负电性基团和钙之间的结合。反之，这些盐可以大大降低正电性基团的作用，也就是说在盐浓度很高的溶液，羟基磷灰石可用来吸附酸性或中性蛋白，而排除碱性蛋白，这样就可以省去吸附前的脱盐透析平衡。羟基磷灰石对蛋白质的吸附容量比较高，在一般吸附操作条件下约 50克／升床体积。
(3)离子交换吸附原理,这类吸附是在蛋白质的解离基团与离子交换剂的解离基团之间的解离交换过程中进行的。由于各种蛋白质和离子交换剂在不同条件下有相应不同的解离状态，因此通过选择适当的交换剂、
控制交换和洗脱条件，就可将酶和杂蛋白分离开来。
分类,离子交换剂包括两个部分：载体和离子交换基团。
常用的吸附剂有：离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶。离子交换树脂是以交联的聚苯乙烯树脂等为载体，再导入相应的解离基团而成 ;离子交换纤维素是目前酶的纯化工作中用得最多的交换剂，它是以亲水的纤维素为载体，在引入相应的交换基团后制成的 ; 离子交换凝胶以葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为载体，
导入相应的交换基团后制成。
按离子交换基团分类,
离子交换基 团 是交换剂表现功能的基础，它的性质决定交换剂的类型与强弱。
带阳电荷解离基的交换剂在离子交换过程中能吸附荷阴电的离子，故称为 阴离子交换剂 ；反之，带阴电荷解离基的交换剂可对付荷阳电离子，称为 阳离子交换剂 。
离子交换剂的选择依据：
首先是待分离酶 (或蛋白 )的 稳定性 ;
其次是 强型和弱型交换剂的选择 ;
第三是 交换容量,交换容量有两方面的含义,一为总的交换容量；一为实效交换容量。前者是指每克干离子交换剂上带有的总交换基数目，其中包括潜在的交换基；后者是指特定的实验条件下实际可用于交换的交换基数目 ;
第四是 流速,纤维素柱的流速一般低于凝胶。
待分离酶 (或蛋白 )的稳定性的选择,
(i)如果待分离的酶在低于其 pI的 pH条件下稳定，则可选用阳离子交换剂 ;
(ii)如果待分离的酶在高于其 pI的 pH条件下稳定，则采用阴离子交换剂 ;
(iii)如果待分离的酶在高于和低于其 pI
的 pH条件下都稳定，则两种交换剂都可以考虑。
交换剂类型的选择,
(i)如果待分离酶的 pI偏向极端 (小于 6或大于 9)一般应考虑强型交换剂，因强型交换基能在广泛的 pH范围内保持解离状态，
而弱型的交换基的解离和 pH条件密切相关 ;
弱型阳离子交换剂在 pH6以下，阴离子交换刘在 pH9以上开始不带电荷失去交换能力。
(ii)如果待分离的酶既可应用强型交换剂，也可用弱型交换剂，但是酶不稳定，
此时应优先考虑选择弱型。
优点,离子交换吸附法是目前仅次于盐析的一种常用的纯化方法。它的适用面广，几乎所有的蛋白都可用此法分离；其次是它具有很高的分辨率和回收率。
2 电泳分离法原理,这是根据各种蛋白质解离、
电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度不同而进行纯化的一类方法。
特点,这类方法可以达到很高的分辨效果，但在实验放大和样品回收方面有一定困难，因此目前主要用于蛋白质的分析和小规模制备。
常用的电泳方法可大致分为以下几种类型：
(1)自由界面电泳它需要复杂的设备，而且待分离物质往往不能完全分开，故现在仅用于纯酶均一性的检定。
(2)区带电泳这是在惰性支持物上进行的一类电泳分离分析法。和前一类相比，它具有简便灵活，
无对流扩散，可达到完全分离等优点。
区带电泳分类,
第一种最简单的是膜电泳，它以滤纸、醋酸纤维素薄膜为支持物，简易快速，但分离量很低，
只能用于蛋白质粗分析。
第二种区带电泳是粉末电泳，常用的支持物为淀粉与醇化的纤维素。
第三种是凝胶电泳，这种电泳兼具分子筛效应，
因而可达到很高的分辨率。早期用的支持物为淀粉胶，近年来主要应用聚丙烯酰胺凝胶，这种胶能更严格地控制胶孔径。
SDS-PAGE
(3)等电聚焦电泳这是利用两性电解质载体 --一种多乙烯多胺与丙烯酸加合反应得到的同系多异构体混合物，
它们具有相近的 pK值与 pI值 —在电场作用下能形成连续平滑的 pH梯度，待分离样品中各组份在电泳过程中，又能按照各自的等电点聚焦到相应的 pH梯度位臵上从而达到分离目的。
等电聚焦图谱
3 聚焦层析特点,聚焦层析是根据蛋白质的等电点差别进行层析分离的纯化方法。它不需要特别的聚焦电泳装臵，
但兼具等电聚焦电泳的高分辨率和柱层析的简便性两种特点。
原理,当用特定的多缓冲液滴定和淋洗填装在层折柱中的特定多缓冲交换剂时，随着这种缓冲液的扩展，
就会在层析柱中自上而下地建立起 pH梯度；而该层析柱中的蛋白质也将随多缓冲液的扩展按各自的等电点聚焦于相应的 pH区段，并随扩展过程 pH梯度的逐渐下移而下移，最后分别从层析柱先后洗出，达到分离纯化的目的。
六．利用稳定性的差异建立的纯化方法,
选择性变性法就是根据酶和杂蛋白在某种条件下稳定性的差别，而采取的一类可一举除去大量杂蛋白的简便纯化方法。
1.选择性热变性法 ;
2.选择性酸碱变性法 ;
3.选择性表面变性法。
1 选择性热变性如果待分离的酶相当耐热，那末就可在严格控制的条件下，将酶溶液迅速升温到它稳定的温度 (如 50-70℃),并保温一定时间 (如 5-15分钟 )，而后迅速冷却，这样大量不耐热的杂蛋白就将变性析出，离心除去后，酶的比活力就将大大提高，而总活力损失很少或者根本不损失，有时甚至还可能有所提高。
2 酸碱变性法如果能严格地将酶溶液控制在酶稳定的 pH
范围内用酸碱处理一定时间，进行选择性变性，同样也可达到有效的纯化目的。
和选择性热变性相比，酸碱变性应用得不多，主要原因可能在于操作较为复杂，而且纯化效果较差。
3 表面变性法利用酶溶液和惰性液体 (如氯仿 )混合振荡，造成选择性表面变性来制备过氧化氢酶、醇脱氢酶和 α -淀粉酶等。振荡处理后通常分成三层：上层为未变性蛋白；第二层为乳浊状变性蛋白；下层为氯仿。这种处理时间不宜长，否则将导致所有蛋白质变性。
七 根据专一的亲和作用建立的纯化方法
1,亲和层析法 ;
2,亲和电泳法
1 亲和层析法亲和层析法是据生物分子间某种特有的亲和力而建立的一种新型纯化方法。
原理,酶和它的底物 (包括辅助因子 )、底物类似物或竞争性抑制剂通常都具有较高的亲和力，能专一而可逆地形成酶 —配基络合物。因此，如果将这类配基偶联固定于样品中，那么，它就能迅速而有选择性地将相应的酶分子从溶液中分离出来，达到和其它杂蛋白分离的目的，这就是亲和吸附。
2,亲和电泳法,
亲和电泳法是将亲和层析和聚丙烯酰胺胶电泳结合在一起的高分子分离分析方法。
原理,当相应的亲和配基共价偶联于电泳胶 (即载体，通常多用聚丙烯酰胺 )上以后，由于具有亲和作用的待分离分析成份和配基具有结合力，在电泳过程中不会移动，而不具亲和性的成份将按各自的电泳速度而分离开来。
八 结晶所谓 结晶,是指分子通过氢键、离子键或分子间力，按规则且周期性排列的一种固体形式。
由于各种分子形成结晶的条件不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，也是一种酶和杂蛋白分离纯化的手段。
为了获得纯净、粒大、收得率高的结晶应注意,
(1)酶溶液应该达到相当的纯度 除了少数例外，不纯的溶液是不能得到结晶的。
(2)酶的浓度要恰到好处 一般以 1—5％
为宜，不宜小于 0.2％，浓度高虽然较易结晶，但如果过于饱和，只能获得大量微晶，
难以形成大晶体。
结晶方法：
1.盐析结晶
2.有机溶剂结晶
3.透析平衡结晶
4.等电点结晶九,浓缩与干燥
1.浓缩 真空浓缩
2.干燥方法
真空干燥
冷冻干燥
喷雾干燥
气流干燥
吸附干燥第三节 酶的纯度和产量一 活力测定在酶的抽提和纯化过程中，为了了解所选择的方法和条件是否适宜，每一步骤前后都应进行酶的活力测定，作出总活力与比活力的比较。
如何进行酶的活力测定：
(1)如果待分离的酶已有报导，可参考它所采用的测定方法和条件；
(2)如果需要另建新的测定系统，那么就得先对该酶的作用、动力学性质等有所了解，
据此来选择合适的底物和底物浓度、以及最适的反应 pH和温度等，同时确定一种相应的测定方法。
测酶活时的注意事项,
一是测定用的酶反应时间应选择在酶反应的初速度范围内；
二是测定用的酶量必须和测得的活性有线性关系。
纯化过程中的酶活力测定还应考虑三个问题：
(1)由于测定工作量校大，而且有时,立等,结果，
所以要求测定方法快速、简便，而准确度在一定程度上比较次要，甚至可容许 5—10％的误差，故常用分光光度法、电学测定法等测定 ;
(2)由于分离纯化过程可能丢失辅助因子，因此有时需要在反应系统中加入相应的物质，如煮沸过的抽提液、
辅酶、盐或半脱氨酸等；
(3)由于纯化过程中引入的某些物质可能对酶的反应和测定有影响或干扰，故有时还应在测定前进行透析或加入螯合剂等。
测定酶活力的表示方法,
酶的活力通常采用国际酶学委员会规定的单位表示，但是在纯化工作中，为了方便，也可采用自行规定的单位，如直接以光密度值表示,
从酶的活力测定得到的直接结果是样品中酶的浓度，即单位数／毫升。
由此进一步算出样品中总的单位数，即 总活力 ;以及单位重量的蛋白质中酶的单位数，即 比活力,如单位数／毫克蛋白，或单位数／毫克蛋白氮。
测蛋白含量常用的方法有：
(1)紫外吸收法，此法简便快速，不损耗样品，
但干扰因素很多；
(2) 双缩脲法,较简单；
(3)酚试剂法,较复杂，但灵敏度、准确度都比较高。
(4)蛋白质通常采用凯氏定氮法。
一般比活力愈高，酶的纯度也较好，但是它不能说明实际的纯净程度是多少。
二 纯化方法与条件的比较标准在酶的分离工作中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后酶的 得率或回收率 (y)；
比活力则用于计算某一纯化步骤的纯化效果，即 纯度的提高 (e)。
y(收率 ) = ——————————某步骤前的总活力某步骤后的总活力
e(纯度提高 ) = ——————————某步骤前的比活力某步骤后的比活力抽提或纯化某步中，如果有多种方法或条件可供选择时，一般采用下式进行权衡：
loge＝ logE·logy／ logY
e和 y分别表示用某种方法或条件进行一次纯化后纯度的提高与回收率； G和 Y分别表示用上述方法或条件重复多次后总的纯度提高与总的回收率，这两项是推算出来的。
例如，有 A,B二种方法或条件可供选择，
用 A法重复 n次以后可得到 Ea和 Ya；以 Ea为标准，用 B法要得到同样的 Ea，需要重复 n
次，由此就可算出相应的 Yb．比较 Ya和 Yb
就能作出判断。
三 纯度的标准纯度提高和回收率的鉴定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，
为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度鉴定。
酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法,
1．溶解度法这是老方法，由于所需样品量较大，已很少采用．
2.电泳法常用的有 醋酸纤维素薄膜电泳,聚丙烯酰胺不连续胶电泳 和 聚焦胶电泳,特别是后二者有极高的分辨力。
3.超离心法在高达 65,000rpm的离心力场情况下观测离心谱带，根据沉降峰带是否分裂、是否有
,肩,,是否对称等可以作出均一与否的判断。
4．免疫学法纯化的酶样品在琼脂胶上与相应的抗体进行免疫反应，根据得到的沉降线可以判断样品的纯度。如果此法以免疫电泳的方式进行，则更为灵敏。
第四节 酶的剂型与保存为适应各种需要，并考虑到经济和应用效果，
酶制剂常以四种剂型供应：
1.液体酶制剂
2.固体粗酶制剂
3.纯酶制剂
4.固定化酶制剂一,液体酶制剂制备与应用,这包括 稀酶液 和 浓缩酶液 。一般在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩。只适于就近的某些工业部门如纺织工业等直接应用．
特点,比较经济，但不稳定，而且成份繁杂,
二,固体粗酶制剂制备与应用,这类制剂有的是发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成；有的是发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成 ;有的则加材淀粉等填充料。这些制剂多用于皮革软化脱毛、水解纤维素等方面。
这类制剂中也有的是在发酵液或抽提液除去杂质，
并经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物等生产的酶制剂。
特点,固体粗酶制剂便于运输和短期保存，成本也不高。
三,纯酶制剂用途,包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。
用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位重量的酶制剂中酶活性达到一定单位数。用作基因工程的工具酶则要求不含非专一性的核酸酶，
或完全不含核酸酶。作为蛋白质结构分析对象的酶必须,绝对,纯净，而注射用的医用酶则应设法除去热源类物质。
热源类物质：
定义,是染菌后细菌分泌出来的一类类毒素，带有这类物质的制剂注射到动物体后，能引起体温升高。热源物质属于糖蛋白，分子量在十万以上，
因细菌来源不同有小的差异。
特点,热源物质对热相当稳定，往往要通过长时间高温作用，例如 180-220℃,二小时以上的处理才会分解；同时很耐酸，不过在碱中，例如 pH＞
10，四十八小时的作用下会逐渐破坏；热源物质对氧化剂十分敏感，在新鲜配制的洗液中一小时就可将它除去。
为了解决热源问题，可采取以下措施：
(1)吸附 可用 DEAE纤维素等阴离子交换剂、
磷酸钙、氧化铝凝胶等吸附除去这类物质，也可用活性炭，但它的专一性不高。
(2)亲和分离 有人已分离出热源抗体，将它作成亲和吸附剂可用以专一地除去热源物质 ;另外也可用凝集素作成的亲和柱将它吸附除掉。
(3)选择适宜的纯化方法 热源物质具有亲有机溶剂的特点，因此通过有机溶剂获得的产品，
热源物质比例较高，而盐析产品则少些。
四,提高酶的稳定性获得酶制剂后需提高酶的稳定性，延长其有效期。
影响酶的稳定性有以下几种因素：
(1)温度
(2)pH和缓冲液
(3)酶蛋白浓度
(4)氧
(1)温度大多数酶可在低温条件下 (0-4℃ )使用,处理和保存,有些酶可在 -20℃ 冻结保存,如微球菌核酸酶等,大多数酶则否,而加入甘油或多元醇有保护作用,
(2)pH和缓冲液大多数酶仅在各自特定的 pH范围内稳定,超越此范围则迅速失效,但是少数低分子量的酶如溶菌酶、核糖核酸酶等在酸性 pH条件下相当稳定,
缓冲液的种类也会影响酶的稳定性,例如 Tris— HCl
缓冲液在 pH7.5以下缓冲能力较弱,而且有时会抑制某些酶的活性,此外,有些酶在磷酸缓冲液中冻结会引起失活也应注意。
(3)酶蛋白浓度酶的稳定性虽因酶性质和纯度而异,但一般酶蛋白在高浓度时较为稳定,而在低浓度时则易于解离、吸附或易发生表面变性而失效。
(4)氧某些酶可能由于巯基氧化而易在空气逐渐失活,
为了保证有较高的稳定性，除了应避免不适宜的条件外，最常用的办法是加入某些 稳定试剂：
(1)底物、抑制剂和辅酶这是现在广泛采用的一些物质，如用 L-谷氨酸可稳定 N-甲基谷氨酸合成酶，它的作用可能是通过降低局部的能级水，使处于不稳定状态的扭曲部份转入稳定状态。
(2)SH—保护剂可用的有谷肮甘肽、二巯基乙醇 (但易自动氧化 ).
(3)其它首先是低分子 无机离子,如 Ca2+能保护 α -淀粉酶，
Mn2+能稳定溶菌酶,C1-能稳定透明质酸酶等，它们的作用机理可能是防止酶链伸展。其次是 表面活性剂,例如许多酶配制于 1％的苯烷水溶液中，即使在室温条件下其催化活力也能维持相当长的时间,再则是 高分子化合物 如血清白蛋白、多元醇等,特别是甘油和蔗糖是近年来常用的低温保存添加剂。此外，
某些情况下，丙酮、乙醇等 有机溶剂 也显示一定的稳定作用。最后为了 防止微生物污染，可加入甲苯、
苯甲酸和百里酚等,它们对大多数酶没有不良影响。
设计酶的纯化方案时要考虑到应用，下列各点是应认真遵循的原则：
第一，要注意防止酶变性失效，这一点在纯化的后期更为突出。
第二，从理论上说，凡是用于蛋白质分离纯化的一切方法都同样适用于酶。
第三，酶具有催化活性，检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。
二,防止酶变性失效的方法,
(1)除了少数例外，所有操作都应在低温条件下进行，尤其是在有机溶剂存在的情况下更应特别小心。
(2)大多数酶在 pH<4或 pH>10的情况下不稳定，
故必须控制整个系统不要过酸过碱；同时要避免在调整 pH时产生局部酸碱过量的现象。
(3)酶和其它蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。
(4)重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性,微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。
整个纯化工作包括三个基本环节：抽提,纯化和精制 。
常用的抽提方法除细胞自溶外,还有有机溶剂或表面活性剂处理等化学方法；近年来为适应日益增多的胞内酶分离提纯的需要,发展和设计了不少细胞或菌体的破碎设备,如超声波振荡器,高压喷挤设备,匀浆装臵及振动球磨 。
第二节 纯化方法酶分离纯化工作是酶学研究的重要组成部分，亦是酶制剂工业生产的主要内容。要研究或使用一个酶，就得采用分离纯化方法去得到它。酶的化学本质是蛋白质
，所以用于蛋白质的分离纯化方法一般都适用于酶的分离纯化。此外，酶是具有催化功能的蛋白质，因此根据酶与底物、底物结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特异亲合力，可发展酶独特的亲合色谱技术。所有的分离纯化方法，都是根据被分离物质间不同的物理、化学和生物学性质的差异而设计出来的。 分离纯化生物大分子的方法很多，主要是利用它们之间特异性的差异：如分子大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷及对其他分子的亲和性等建立起来的。如果欲分离的目标分子是细胞内产物，首先涉及的是细胞的破碎。接下来的分离过程可分成粗分离和精制分离。
一,酶的抽提抽提的要求是将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。
1,预处理过去多用动物或植物的器官组织作为酶的来源，近年来则主要采用微生物作材料。但是不管什么原料，通常都需要先进行适当的预处理。例如，动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织；油质种子最好先用乙醚等脱脂；种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；微生物材料则应将菌体和发酵介质分离。经过这些处理后，材料须尽可能以非常新鲜的状态直接应用，否则就应将完整材料立即冰冻起来。
2,破细胞酶根据它的分布可分为细胞内酶和细胞外酶，根据它的存在状态，即是否与细胞内的颗粒体或膜结合，细胞内酶又可分为结酶与溶酶。细胞外酶没有破细胞问题；但是细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，
而且抽提效果也往往与细胞破碎程度有关。
至于结酶，还有一个切断它与颗粒体或膜的连结问题。
2.1丙酮干粉法,一般是先将材料粉碎或分散，
然后在 0℃ 以下的低温条件下,加入 5—10倍的
15～ 20℃ 的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，
最后低温干燥,研磨过筛。
优点,丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁
(膜 );另一方面由于丙酮是脂溶剂，这种处理有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰，有时这种处理还能使某些结酶易于溶解；此外，丙酮干粉含水量低，易于保存,
缺点,丙酮可能引起某些酶变性失效，有些酶则根本不能采用此法。
2.2自溶法,就是在适当的温度,pH条件下，
将浓的菌体悬破直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯或其它溶剂一起保温一定时间，使菌体自溶液化。
缺点,第一，自溶液中成份十分复杂。
第二，有破坏待分离酶的危险。
2.3 破细胞的手段,
动,植物材料：
通常用绞肉机作成组织糜，如果需要破碎得更彻底些，可用高速组织捣碎器捣碎，或者加砂研磨。
高速捣碎器操作简便、破碎效果好，但易引起局部温度过高，导致酶失效，故必须考虑酶的特点谨慎使用。加砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替砂时，要注意有时可能发生吸附变性。在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，还可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻融解处理，
量少时，某些组织还可采用匀浆器将细胞研磨破碎。
微生物材料,
不同的微生物材料处理的方法与难易程度也各有差异。
霉菌 材料比较容易，可通过机械剪切、研磨或加细胞壁溶解酶解决。
细菌,少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处理；大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法。
酵母细胞 壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在可采用的办法有,(1)细胞壁溶解酶处理法；
(2)盐振荡法；
(3)冷热破壁法。
3,抽提细胞破碎后，可采用两种 方式 进行抽提：
一是,普遍,抽提；
二是先后用不同溶剂进行选择性抽提。
3.1 抽提条件的选择,
由于大多数酶属于球蛋白类，因此一般部可以用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。
但抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶和其它物质的联系。需要考虑的因素有：
1.pH； 2.盐； 3.温度； 4.其它。
a,pH
首先应考虑酶的酸碱稳定性，选择的 pH不应超出酶的稳定范围；
其次从最佳的抽提效果着眼，最好远离待抽提酶的等电点。也就是说，酸性蛋白质宜用碱性溶液抽提，碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如，
肌肉甘油醛 —3—磷酸脱氢酶以稀碱抽提时产量较高，胰蛋白酶选用 0.25N硫酸。
第三，在某些情况下抽提还要兼顾到有利于切断酶和细胞内其它成分间可能的联系，从这点考虑以选用 pH4—6为佳。
b,盐大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以抽提液一被采用 等渗盐溶液 。最普通的加 0.020—0.050M的磷酸缓冲液、
0.15MNaCl等。焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲有助于切断酶和其它物质的连系，并有络合某些金属的作用，因此用得也很多。
少数情况用水抽提 效果亦佳，如霉菌脂肪酶的抽提，这可能与低渗可破坏细胞结构有关,
c,其它在破细胞后，某些亚细胞结构也往往受到损伤，
这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。
为此，有时还需要在抽提液中加入某些物质。
例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟；为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、惰性蛋白和底物等。
抽提液的用量：
通常采用原料量的 l—5倍，有时为了抽提效果好些，要反复抽提，液量可能大些。
4,固体成份除去：
抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多可用离心法或压滤法除去。植物原料的抽提液在冷室中放臵过夜往往就会自动澄清。某些情况下，
在抽提液离心时加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙胶等物质,有助于除去悬浮的胶体物质。
二,浓缩抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低,所以在进行纯化前须先加以浓缩。常用的浓缩方法有：
1,蒸发； 2,超过滤；
3,胶过滤； 4,冰冻浓缩；
5,其它
1 蒸发减压蒸发 浓缩除了效率低、费时外，有时还要加热，同时也可能产生泡沫，因此对稳定性差的酶不适宜。另外，蒸发过程可能产生增色现象，达也影响产品质量。
超蒸发法,即让暖空气流通过冷的酶溶液表面,或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳。
薄膜蒸发 浓缩法（现在多采用的方式），即使待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的液膜，同时使之与大面积热空气接触，其中水分就能瞬时蒸发而达到浓缩的目的。
由于水分蒸发时能带走部分热量，所以只要真空条件好，酶在浓缩过程中实际受到的热作用并不太强，可用于热敏性酶类的浓缩。薄膜蒸发浓缩器有三种 形式,升膜、降膜和刮板。对于较粘稠的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩也往往会带来增色现象。
2 超过滤在加压情况下，将待浓缩溶液通过一层只容许水分子和小分子选择性地透过的微孔超滤膜,而酶等大分子被滞留,从而达到浓缩目的的一种有效方法。
优点,没有热破坏，没有相变化，保持原来的离子强度和 pH。只要膜选择适当,浓缩过程还可能同时进行粗分,此外成本也不高,已渐渐为人们所采用。超过滤可用于小量样品,也可用于工业生产规模。
注意,超滤膜有干型和湿型两种，后者必须保持于溶液中。
3 胶过滤这是利用葡聚糖凝胶 sephdex G—25或 G—
50等能吸水膨润、而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的浓缩。通常采用,静态,方式，即将干胶直接加入样品溶液（干胶用量可根据胶的吸水量计算），胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分离浓缩的酶液。胶过滤浓缩法的优点是，条件温和，
操作简便，也没有 pH与离子强度等的改变。
4 冰冻浓缩原理,溶液相对纯水融点升高,冰点降低。这有两种方式：
1.先将溶液冻成冰块。然后使之缓缓融解，这样几乎不含蛋白质和酶的冰块就浮于液面,而酶等则融解并集中于下层溶液 (约为原体积的 1／ 4);
2.让酶溶液缓缓冻凝，尔后移去水形成的冰块,
问题,浓缩过程可能会发生离子强度与 pH的变化,从而导致酶失效；其次是需要大功率的致冷设备,
5,其它还有聚乙二醇等浓缩法，它们一般只适用小量样品，而且往往成本很高。
三,酶的纯化在抽提液中,除了待纯化的酶外,通常不可避免地杂有其它 小分子和大分子物质,其中小分子杂质在以后的纯化步骤中一般会自然地除去,因此比较容易解决 ;大分子物质包括 核酸,粘多糖和其它蛋白质,核酸和粘多糖往往干扰以后的纯化,特别是细菌等的抽提液中常会有大量核酸,最好设法预先除去,核酸可加硫酸链霉素,聚乙烯亚胺,色精蛋白或 MnCl2等使之沉淀移去,必要时也可使用核酸酶,粘多糖则常用醋酸铅,乙醇,丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决,有时也可用酶。这些杂质移除后,余下的是杂蛋白,
纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作,就是要将酶从杂蛋白中分离出来,
（一）纯化方法的选择为了获得理想的分离效果应注意：
第一，工作前应对所要纯化的 酶的理化性质 (溶解度、分子大小和解离特性 )以及酶的稳定性等有一个较全面的了解，这样就可知道应选择哪些办法与条件，避免哪些处理，
以及了解在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。
第二，判断选择的方法与条件是否适当，
始终应以 活力 测定为准则。一个好的步骤应该是 比活力 (纯度 )提高多,总活力 回收高
（回收率高），而且重现性好。一般地说，
纯化过程不宜重复相同的步骤和方法，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。
第三，要严格控制操作条件，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、总的蛋白浓度下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，
酶的稳定性亦越小，就更应注意 防止变性 。
（二） 酶的纯化方法现行的方法 （根据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的）：
1 根据溶解度的不同；
2 根据分子大小的差别；
3 根据解离电学性质的特点；
4 利用稳定性的差异；
5 基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用的特点。
实际有许多方法中往往包含两种或两种以上的因素在同时起作用。
（三） 根据溶解度建立的纯化方法
1.盐析法 ;
2.有机溶剂沉淀法 ;
3.共沉淀法 ;
4.选择性沉淀法 ;
5.等电点沉淀法
1 盐析法盐析法是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。
盐析法的 原理,球蛋白类在低的盐浓度溶液中，它的溶解度随盐的离子强度升高而增大，
表现,盐溶,特性。但是当盐浓度继续升高，
超过某一上限值时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别,盐析,沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。
盐析应考虑下述因素：
(1)pH
(2)盐
(3)温度
(4)蛋白质浓度
(5)其它
(1)pH
控制 pH可以提高纯化效果，一般 pH可选择的范围不大，大多数情况下，盐析的适宜 pH接近于待纯化酶的等电点。有些情况，酶和杂蛋白能形成某种结合，从而干扰盐析分离，此时如控制 pH＜ 5
或＞ 6，使它们带相同电荷以减少络合物形成，这样盐析效果常会有所改善，但应注意酶在这种条件下的稳定性与盐的溶解度。
(2)盐在纯化的最初阶段，盐的性质产生的影响不一定很明显，仅是随着酶溶液纯度的提高，盐的特征效应就可能突出出来。实践表明，就阳离子来说，一价盐通常比二价盐有效；而阴离子则相反，
二价盐比一价盐好。符合这种条件的盐有硫酸铵、
硫酸钠等。硫酸铵最常用，它的最大优点是溶解度大，溶解的温度系数小 (0℃,706克／升； 25℃,
767克／升 )即使在低温下的溶解度范围内，几乎所有蛋白质都能盐析出来。
(3)温度从酶的稳定性和溶解度看，盐析温度一般以控制 ℃ 在 30左右为宜。
(4)蛋白质浓度这是一个很重要的因素，它一方面能影响盐析效果的重现性，因为蛋白浓度不同，分级分离纳范围也往往会发生变动；另一方面，蛋白浓度在 100μ g/ml以下，盐析一般很因难，有时甚至根本不能形成沉淀。在 200μ g—1mg／ ml范围内，沉淀虽能生成，但时间校长，而且回收率往往不高。为了获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在 1mg／ ml以上。
(5)其它盐析沉淀通常至少要近一小时才能完成，
沉淀可通过离心或压滤和母液分离。盐浓度低时，离心比较容易，而过滤较难；盐浓度高时，需要高速离心，但过滤较易。
盐析法的 优点,简便、安全 (大多数酶在高浓度盐溶液中相当稳定 )、重现性好。
缺点,分辨率低，纯度提高不显著，同时为了下一步纯化有时还需脱盐。
2.有机溶剂沉淀法原理,不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。有机溶剂在这个过程的主要作用是降低溶液的介电常数，
因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，
加入有机溶剂，蛋白质分子问的引力增加，溶解度降低。有机溶剂的另一作用是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。但是有机溶剂的浓度和蛋白质溶解度之间目前还没有一个可用的关系式。
有机溶剂沉淀法应考虑的因素是：
(1)温度
(2)pH
(3)离子强度
(4)有机溶剂
(1)温度这是非常重要的因素，因为大多数蛋白质遇到有机溶剂都很不稳定，特别是温度较高的情况 (例如室温 )
下，极易变性失效，故操作过程通常应控制在 0℃ 以下。而且有机溶剂必须预先冷却到 -15—-20℃,然后在搅拌下缓慢地加入。沉淀析出后应尽快地在低温下离心分离，获得的沉淀也应立即用冷的缓冲液溶解，
以降低有机溶剂浓度。
个别情况下，酶对有机溶剂比较稳定，此时操作可在较高温度 (例如室温 )下进行，这样有利于除去较多的杂蛋白。
(2)pH
蛋白质在等电点的溶解度最低，有机溶剂沉淀通常也多选在尽可能靠近待纯化酶的等电点 pH条件下进行。如肌肉酶的分离在
pH6.5效果一般较好,pH调整可用 0.05M的缓冲液。
(3)离子强度中性盐大多能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。在进行有机溶剂分级沉淀时，如果添加适当浓度的中性盐，如 5—10％的硫酸铵，往往有助于提高分离效果。但盐的浓度一般不宜超过 0.05M，否则沉淀不好，甚至沉淀全无，同时有机溶剂耗费也大。
(4)有机溶剂丙酮的分离效果一般最好，引起失效的情况与程度也较少 (小 )。除了丙酮外，乙醇和甲醇等也常用 。
3 共沉淀法原理,这是利用离子型表面活性剂如 SDS(十二烷基磺酸钠 )、非离子型聚合物如聚乙二醇、聚乙烯亚胺以及丹宁酸、硫酸链霉素等，在一定条件下能与蛋白质直接或间接形成络合物，使蛋白质沉淀析出．然后再用适当方法使需要的酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化目的的方法 。
4 选择性沉淀法原理,某些多聚电解质如聚丙烯酸、硫酸糊精以及磷、砷、硅的钨、钼、钒等的杂多酸常能在极低的浓度条件下，选择性地和某种或某类酶结合沉淀析出，其选择性的机制尚不清楚。
以聚丙烯酸 (PAA)为例，它的分子量近 9000或近
300,000的聚合物对某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有选择性沉淀效果，故可用于这些酶的纯化,
5 等电点沉淀法原理,蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小，
当其它条件相同时，分子间的引力以蛋白质处于等电点状态最大，因而容易析出沉淀。
不过由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，故沉淀往往不完全，一般很少单独使用，更多的是作为其它沉淀法中的一个组合条件。但是，这种方法有时可用于对付杂蛋白种类较多的样品，因为将这种样品的 pH调整至某一值后，不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉淀，也可使处于等电点两侧带相反电荷的杂质形成复合物而沉淀，从而可除去大量杂蛋白。
（四） 根据分子大小的建立纯化方法：
１,胶过滤 (层析 )法；
２,筛膜分离法；
３,超离心法分离。
１,胶过滤 (层析 )法原理,必须以层析的方式进行．柱中填充分子筛介质,
用于生物大分子分离的分子筛介质是具有 一定孔径的球状凝胶物质,层析柱中装入某种孔径的凝胶物质以后,再加入待纯化样品,然后用适当的溶剂或缓冲液使该样品自上而下地扩展,这样,样品中的各种分子就将按其分子大小表现不同的层析性态而分离,大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内,它们只能沿胶粒间隙扩展,因而,走,的是一条较
,直,的,路,,表现出较快的移动速度 ;反之,小于凝胶孔径的分子,由于它们能自由进出胶粒内外,按照分子热运动的规律,其运动轨迹,迂回曲折,,因此,表现较慢的下移速度,所以只要待纯化样品通过一定长度的层析柱后,不同大小的分子就将按先后顾序依次流出,彼此分开,
胶过滤 (层析 )法原理胶过滤 (层析 )法应考虑的因素,
(1)胶的选择（葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶） ;
(2)柱层析的过程与要求；
(3)胶过滤中胶的用量（与样品体积有关） ;
(4)其它有关问题 (样品，洗脱液，胶的再生与保存）．
(1)胶的选择作为分子筛的凝胶是由亲水的线状聚合物通过交联剂交联、或通过聚合物自身缔合组成具有网眼结构的胶粒物质。网眼 孔径大小 由交联程度或聚合物的浓度决定。最常用的凝胶有,
(i) 葡聚糖凝胶
(ii) 聚丙烯酰胺凝胶
(iii)琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶,
这是分子量从几万到几十万的葡聚糖通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质。可用于分离分子量 1000—500,000的分子。以商品 Sephdex
G—为例,G—以后的数字为胶膨润时吸水量的 10
倍，如Ｇ —25就表示该胶物质每 1g能吸水 2.5m1，
这个数字越大说明吸水量越高，孔径也越大，更适于分离较大的分子,此外,还有 Sephdex LH —，
是兼具亲脂性和亲水性的凝胶，可用于脂类化合物的分离； Sephacyl S—可用于水溶液和有机溶剂系统，或高浓度氢键解离试剂存在的系统．
各种葡聚糖凝胶 G
(2)柱层析的基本过程与要求过程,层析介质的平衡；装柱；加样；扩展 (包括洗涤和洗脱 )以及与此同时进行流出液成分 (蛋白质或酶活性 )的检测和分部收集。
分离效果的标准,分辨率高，回收率高；稀释度小和速度快。其中分辨率可用 Rs权衡：
Rs＝两峰带间距离／峰带宽当 Rs＝ 1.2时，通常认为基本上达到了分离要求,
胶过滤法的特点,
不受 pH、盐和温度等的影响；操作条件温和、简便，勿需特殊的再生处理，
适于各种分子的分离．
2.筛膜分离法原理,筛膜分离法也即超过滤分离法，它是利用微孔超滤膜仅能选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的一类方法。
特点,它操作比较简单，条件也温和，但是只能达到粗分的要求。
3 超离心分离法原理,这是利用样品中不同大小的分子在相对离心力场达 80,000一 250，
000g的条件下分布不同而进行分离纯化的一种方法。
应用,此法主要用于病毒、细胞颗粒体等的制备，对分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳，分辨率不高而且费时,
五,根据解离电学性质的特点建立的纯化方法,
1.吸附交换 (层析 )法 ;
2.电泳法 ;
3.聚焦层析法。
1 吸附交换 (层析 )分离法这是最常用的一类纯化方法。
原理,利用待纯化样品中不同的分子和吸附剂间的吸附与解吸性质的不同而达到分离。这类分离或以静态吸附方式进行，或以层析吸附方式进行。
过程,有三个主要环节：加样吸附、洗涤和洗脱。实际上每一个环节都包含目的酶和杂蛋白的分离，因此是一种十分有效的纯化方法。
吸附交换分离法原理示意吸附剂,根据吸附机制的不同可分为三种类型：
1.“传统,的物理吸附剂 ;
2.羟基磷灰石 ;
3.离子交换吸附剂。
(1)物理吸附传统的物理吸附剂常用的有 白土、氧化铝和磷酸钙胶 等。其中白土是以硅酸铝为主要成分的具有强吸附力的一类粘土，包括皂土、高岭土和活性白土等；氧化铝根据制备方法不同有多种成品，
磷酸钙胶可从氧化钙和磷酸三钠直接制备。
物理吸附的原理,
一般认为它是由于吸附剂界面分子和样品分子间相互作用的范德华力所引起；因而选择性不强预见性较小，往往需要通过实验加以确定。
这类吸附剂应用很早，但没有得到更大的发展，
原因可能也就在于此。
(2)羟基磷灰石吸附：
近年来应用羟基磷灰石作为吸附剂的日期增多，它是一种微晶型的磷酸钙制品。
原理,
一般认为是，这种晶体表面的钙离子能和蛋白质的负电性基团相互作用，而磷酸基团则能和正电性基团结合。如果在系统中有对钙亲和力更强的离子 (如柠檬酸盐 )存在时，
羟基磷灰石对蛋白质的吸附能力就会显著下降，但是其它盐如 NaCl等，即使浓度很高，也不会影响蛋白质的负电性基团和钙之间的结合。反之，这些盐可以大大降低正电性基团的作用，也就是说在盐浓度很高的溶液，羟基磷灰石可用来吸附酸性或中性蛋白，而排除碱性蛋白，这样就可以省去吸附前的脱盐透析平衡。羟基磷灰石对蛋白质的吸附容量比较高，在一般吸附操作条件下约 50克／升床体积。
(3)离子交换吸附原理,这类吸附是在蛋白质的解离基团与离子交换剂的解离基团之间的解离交换过程中进行的。由于各种蛋白质和离子交换剂在不同条件下有相应不同的解离状态，因此通过选择适当的交换剂、
控制交换和洗脱条件，就可将酶和杂蛋白分离开来。
分类,离子交换剂包括两个部分：载体和离子交换基团。
常用的吸附剂有：离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶。离子交换树脂是以交联的聚苯乙烯树脂等为载体，再导入相应的解离基团而成 ;离子交换纤维素是目前酶的纯化工作中用得最多的交换剂，它是以亲水的纤维素为载体，在引入相应的交换基团后制成的 ; 离子交换凝胶以葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为载体，
导入相应的交换基团后制成。
按离子交换基团分类,
离子交换基 团 是交换剂表现功能的基础，它的性质决定交换剂的类型与强弱。
带阳电荷解离基的交换剂在离子交换过程中能吸附荷阴电的离子，故称为 阴离子交换剂 ；反之，带阴电荷解离基的交换剂可对付荷阳电离子，称为 阳离子交换剂 。
离子交换剂的选择依据：
首先是待分离酶 (或蛋白 )的 稳定性 ;
其次是 强型和弱型交换剂的选择 ;
第三是 交换容量,交换容量有两方面的含义,一为总的交换容量；一为实效交换容量。前者是指每克干离子交换剂上带有的总交换基数目，其中包括潜在的交换基；后者是指特定的实验条件下实际可用于交换的交换基数目 ;
第四是 流速,纤维素柱的流速一般低于凝胶。
待分离酶 (或蛋白 )的稳定性的选择,
(i)如果待分离的酶在低于其 pI的 pH条件下稳定，则可选用阳离子交换剂 ;
(ii)如果待分离的酶在高于其 pI的 pH条件下稳定，则采用阴离子交换剂 ;
(iii)如果待分离的酶在高于和低于其 pI
的 pH条件下都稳定，则两种交换剂都可以考虑。
交换剂类型的选择,
(i)如果待分离酶的 pI偏向极端 (小于 6或大于 9)一般应考虑强型交换剂，因强型交换基能在广泛的 pH范围内保持解离状态，
而弱型的交换基的解离和 pH条件密切相关 ;
弱型阳离子交换剂在 pH6以下，阴离子交换刘在 pH9以上开始不带电荷失去交换能力。
(ii)如果待分离的酶既可应用强型交换剂，也可用弱型交换剂，但是酶不稳定，
此时应优先考虑选择弱型。
优点,离子交换吸附法是目前仅次于盐析的一种常用的纯化方法。它的适用面广，几乎所有的蛋白都可用此法分离；其次是它具有很高的分辨率和回收率。
2 电泳分离法原理,这是根据各种蛋白质解离、
电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度不同而进行纯化的一类方法。
特点,这类方法可以达到很高的分辨效果，但在实验放大和样品回收方面有一定困难，因此目前主要用于蛋白质的分析和小规模制备。
常用的电泳方法可大致分为以下几种类型：
(1)自由界面电泳它需要复杂的设备，而且待分离物质往往不能完全分开，故现在仅用于纯酶均一性的检定。
(2)区带电泳这是在惰性支持物上进行的一类电泳分离分析法。和前一类相比，它具有简便灵活，
无对流扩散，可达到完全分离等优点。
区带电泳分类,
第一种最简单的是膜电泳，它以滤纸、醋酸纤维素薄膜为支持物，简易快速，但分离量很低，
只能用于蛋白质粗分析。
第二种区带电泳是粉末电泳，常用的支持物为淀粉与醇化的纤维素。
第三种是凝胶电泳，这种电泳兼具分子筛效应，
因而可达到很高的分辨率。早期用的支持物为淀粉胶，近年来主要应用聚丙烯酰胺凝胶，这种胶能更严格地控制胶孔径。
SDS-PAGE
(3)等电聚焦电泳这是利用两性电解质载体 --一种多乙烯多胺与丙烯酸加合反应得到的同系多异构体混合物，
它们具有相近的 pK值与 pI值 —在电场作用下能形成连续平滑的 pH梯度，待分离样品中各组份在电泳过程中，又能按照各自的等电点聚焦到相应的 pH梯度位臵上从而达到分离目的。
等电聚焦图谱
3 聚焦层析特点,聚焦层析是根据蛋白质的等电点差别进行层析分离的纯化方法。它不需要特别的聚焦电泳装臵，
但兼具等电聚焦电泳的高分辨率和柱层析的简便性两种特点。
原理,当用特定的多缓冲液滴定和淋洗填装在层折柱中的特定多缓冲交换剂时，随着这种缓冲液的扩展，
就会在层析柱中自上而下地建立起 pH梯度；而该层析柱中的蛋白质也将随多缓冲液的扩展按各自的等电点聚焦于相应的 pH区段，并随扩展过程 pH梯度的逐渐下移而下移，最后分别从层析柱先后洗出，达到分离纯化的目的。
六．利用稳定性的差异建立的纯化方法,
选择性变性法就是根据酶和杂蛋白在某种条件下稳定性的差别，而采取的一类可一举除去大量杂蛋白的简便纯化方法。
1.选择性热变性法 ;
2.选择性酸碱变性法 ;
3.选择性表面变性法。
1 选择性热变性如果待分离的酶相当耐热，那末就可在严格控制的条件下，将酶溶液迅速升温到它稳定的温度 (如 50-70℃),并保温一定时间 (如 5-15分钟 )，而后迅速冷却，这样大量不耐热的杂蛋白就将变性析出，离心除去后，酶的比活力就将大大提高，而总活力损失很少或者根本不损失，有时甚至还可能有所提高。
2 酸碱变性法如果能严格地将酶溶液控制在酶稳定的 pH
范围内用酸碱处理一定时间，进行选择性变性，同样也可达到有效的纯化目的。
和选择性热变性相比，酸碱变性应用得不多，主要原因可能在于操作较为复杂，而且纯化效果较差。
3 表面变性法利用酶溶液和惰性液体 (如氯仿 )混合振荡，造成选择性表面变性来制备过氧化氢酶、醇脱氢酶和 α -淀粉酶等。振荡处理后通常分成三层：上层为未变性蛋白；第二层为乳浊状变性蛋白；下层为氯仿。这种处理时间不宜长，否则将导致所有蛋白质变性。
七 根据专一的亲和作用建立的纯化方法
1,亲和层析法 ;
2,亲和电泳法
1 亲和层析法亲和层析法是据生物分子间某种特有的亲和力而建立的一种新型纯化方法。
原理,酶和它的底物 (包括辅助因子 )、底物类似物或竞争性抑制剂通常都具有较高的亲和力，能专一而可逆地形成酶 —配基络合物。因此，如果将这类配基偶联固定于样品中，那么，它就能迅速而有选择性地将相应的酶分子从溶液中分离出来，达到和其它杂蛋白分离的目的，这就是亲和吸附。
2,亲和电泳法,
亲和电泳法是将亲和层析和聚丙烯酰胺胶电泳结合在一起的高分子分离分析方法。
原理,当相应的亲和配基共价偶联于电泳胶 (即载体，通常多用聚丙烯酰胺 )上以后，由于具有亲和作用的待分离分析成份和配基具有结合力，在电泳过程中不会移动，而不具亲和性的成份将按各自的电泳速度而分离开来。
八 结晶所谓 结晶,是指分子通过氢键、离子键或分子间力，按规则且周期性排列的一种固体形式。
由于各种分子形成结晶的条件不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，也是一种酶和杂蛋白分离纯化的手段。
为了获得纯净、粒大、收得率高的结晶应注意,
(1)酶溶液应该达到相当的纯度 除了少数例外，不纯的溶液是不能得到结晶的。
(2)酶的浓度要恰到好处 一般以 1—5％
为宜，不宜小于 0.2％，浓度高虽然较易结晶，但如果过于饱和，只能获得大量微晶，
难以形成大晶体。
结晶方法：
1.盐析结晶
2.有机溶剂结晶
3.透析平衡结晶
4.等电点结晶九,浓缩与干燥
1.浓缩 真空浓缩
2.干燥方法
真空干燥
冷冻干燥
喷雾干燥
气流干燥
吸附干燥第三节 酶的纯度和产量一 活力测定在酶的抽提和纯化过程中，为了了解所选择的方法和条件是否适宜，每一步骤前后都应进行酶的活力测定，作出总活力与比活力的比较。
如何进行酶的活力测定：
(1)如果待分离的酶已有报导，可参考它所采用的测定方法和条件；
(2)如果需要另建新的测定系统，那么就得先对该酶的作用、动力学性质等有所了解，
据此来选择合适的底物和底物浓度、以及最适的反应 pH和温度等，同时确定一种相应的测定方法。
测酶活时的注意事项,
一是测定用的酶反应时间应选择在酶反应的初速度范围内；
二是测定用的酶量必须和测得的活性有线性关系。
纯化过程中的酶活力测定还应考虑三个问题：
(1)由于测定工作量校大，而且有时,立等,结果，
所以要求测定方法快速、简便，而准确度在一定程度上比较次要，甚至可容许 5—10％的误差，故常用分光光度法、电学测定法等测定 ;
(2)由于分离纯化过程可能丢失辅助因子，因此有时需要在反应系统中加入相应的物质，如煮沸过的抽提液、
辅酶、盐或半脱氨酸等；
(3)由于纯化过程中引入的某些物质可能对酶的反应和测定有影响或干扰，故有时还应在测定前进行透析或加入螯合剂等。
测定酶活力的表示方法,
酶的活力通常采用国际酶学委员会规定的单位表示，但是在纯化工作中，为了方便，也可采用自行规定的单位，如直接以光密度值表示,
从酶的活力测定得到的直接结果是样品中酶的浓度，即单位数／毫升。
由此进一步算出样品中总的单位数，即 总活力 ;以及单位重量的蛋白质中酶的单位数，即 比活力,如单位数／毫克蛋白，或单位数／毫克蛋白氮。
测蛋白含量常用的方法有：
(1)紫外吸收法，此法简便快速，不损耗样品，
但干扰因素很多；
(2) 双缩脲法,较简单；
(3)酚试剂法,较复杂，但灵敏度、准确度都比较高。
(4)蛋白质通常采用凯氏定氮法。
一般比活力愈高，酶的纯度也较好，但是它不能说明实际的纯净程度是多少。
二 纯化方法与条件的比较标准在酶的分离工作中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后酶的 得率或回收率 (y)；
比活力则用于计算某一纯化步骤的纯化效果，即 纯度的提高 (e)。
y(收率 ) = ——————————某步骤前的总活力某步骤后的总活力
e(纯度提高 ) = ——————————某步骤前的比活力某步骤后的比活力抽提或纯化某步中，如果有多种方法或条件可供选择时，一般采用下式进行权衡：
loge＝ logE·logy／ logY
e和 y分别表示用某种方法或条件进行一次纯化后纯度的提高与回收率； G和 Y分别表示用上述方法或条件重复多次后总的纯度提高与总的回收率，这两项是推算出来的。
例如，有 A,B二种方法或条件可供选择，
用 A法重复 n次以后可得到 Ea和 Ya；以 Ea为标准，用 B法要得到同样的 Ea，需要重复 n
次，由此就可算出相应的 Yb．比较 Ya和 Yb
就能作出判断。
三 纯度的标准纯度提高和回收率的鉴定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，
为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度鉴定。
酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法,
1．溶解度法这是老方法，由于所需样品量较大，已很少采用．
2.电泳法常用的有 醋酸纤维素薄膜电泳,聚丙烯酰胺不连续胶电泳 和 聚焦胶电泳,特别是后二者有极高的分辨力。
3.超离心法在高达 65,000rpm的离心力场情况下观测离心谱带，根据沉降峰带是否分裂、是否有
,肩,,是否对称等可以作出均一与否的判断。
4．免疫学法纯化的酶样品在琼脂胶上与相应的抗体进行免疫反应，根据得到的沉降线可以判断样品的纯度。如果此法以免疫电泳的方式进行，则更为灵敏。
第四节 酶的剂型与保存为适应各种需要，并考虑到经济和应用效果，
酶制剂常以四种剂型供应：
1.液体酶制剂
2.固体粗酶制剂
3.纯酶制剂
4.固定化酶制剂一,液体酶制剂制备与应用,这包括 稀酶液 和 浓缩酶液 。一般在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩。只适于就近的某些工业部门如纺织工业等直接应用．
特点,比较经济，但不稳定，而且成份繁杂,
二,固体粗酶制剂制备与应用,这类制剂有的是发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成；有的是发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成 ;有的则加材淀粉等填充料。这些制剂多用于皮革软化脱毛、水解纤维素等方面。
这类制剂中也有的是在发酵液或抽提液除去杂质，
并经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物等生产的酶制剂。
特点,固体粗酶制剂便于运输和短期保存，成本也不高。
三,纯酶制剂用途,包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。
用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位重量的酶制剂中酶活性达到一定单位数。用作基因工程的工具酶则要求不含非专一性的核酸酶，
或完全不含核酸酶。作为蛋白质结构分析对象的酶必须,绝对,纯净，而注射用的医用酶则应设法除去热源类物质。
热源类物质：
定义,是染菌后细菌分泌出来的一类类毒素，带有这类物质的制剂注射到动物体后，能引起体温升高。热源物质属于糖蛋白，分子量在十万以上，
因细菌来源不同有小的差异。
特点,热源物质对热相当稳定，往往要通过长时间高温作用，例如 180-220℃,二小时以上的处理才会分解；同时很耐酸，不过在碱中，例如 pH＞
10，四十八小时的作用下会逐渐破坏；热源物质对氧化剂十分敏感，在新鲜配制的洗液中一小时就可将它除去。
为了解决热源问题，可采取以下措施：
(1)吸附 可用 DEAE纤维素等阴离子交换剂、
磷酸钙、氧化铝凝胶等吸附除去这类物质，也可用活性炭，但它的专一性不高。
(2)亲和分离 有人已分离出热源抗体，将它作成亲和吸附剂可用以专一地除去热源物质 ;另外也可用凝集素作成的亲和柱将它吸附除掉。
(3)选择适宜的纯化方法 热源物质具有亲有机溶剂的特点，因此通过有机溶剂获得的产品，
热源物质比例较高，而盐析产品则少些。
四,提高酶的稳定性获得酶制剂后需提高酶的稳定性，延长其有效期。
影响酶的稳定性有以下几种因素：
(1)温度
(2)pH和缓冲液
(3)酶蛋白浓度
(4)氧
(1)温度大多数酶可在低温条件下 (0-4℃ )使用,处理和保存,有些酶可在 -20℃ 冻结保存,如微球菌核酸酶等,大多数酶则否,而加入甘油或多元醇有保护作用,
(2)pH和缓冲液大多数酶仅在各自特定的 pH范围内稳定,超越此范围则迅速失效,但是少数低分子量的酶如溶菌酶、核糖核酸酶等在酸性 pH条件下相当稳定,
缓冲液的种类也会影响酶的稳定性,例如 Tris— HCl
缓冲液在 pH7.5以下缓冲能力较弱,而且有时会抑制某些酶的活性,此外,有些酶在磷酸缓冲液中冻结会引起失活也应注意。
(3)酶蛋白浓度酶的稳定性虽因酶性质和纯度而异,但一般酶蛋白在高浓度时较为稳定,而在低浓度时则易于解离、吸附或易发生表面变性而失效。
(4)氧某些酶可能由于巯基氧化而易在空气逐渐失活,
为了保证有较高的稳定性，除了应避免不适宜的条件外，最常用的办法是加入某些 稳定试剂：
(1)底物、抑制剂和辅酶这是现在广泛采用的一些物质，如用 L-谷氨酸可稳定 N-甲基谷氨酸合成酶，它的作用可能是通过降低局部的能级水，使处于不稳定状态的扭曲部份转入稳定状态。
(2)SH—保护剂可用的有谷肮甘肽、二巯基乙醇 (但易自动氧化 ).
(3)其它首先是低分子 无机离子,如 Ca2+能保护 α -淀粉酶，
Mn2+能稳定溶菌酶,C1-能稳定透明质酸酶等，它们的作用机理可能是防止酶链伸展。其次是 表面活性剂,例如许多酶配制于 1％的苯烷水溶液中，即使在室温条件下其催化活力也能维持相当长的时间,再则是 高分子化合物 如血清白蛋白、多元醇等,特别是甘油和蔗糖是近年来常用的低温保存添加剂。此外，
某些情况下，丙酮、乙醇等 有机溶剂 也显示一定的稳定作用。最后为了 防止微生物污染，可加入甲苯、
苯甲酸和百里酚等,它们对大多数酶没有不良影响。
