第三章 酶的生产
第一节 菌种选育
第二节 酶的生产方式
第三节 培养基
第四节 灭菌
第五节 发酵过程的控制
第六节 酶的工业提取
第七节 酶的 改造与模拟第一节 菌种选育一 菌样采集二 富集三 菌种纯化和分离四 新种性能的测试五 高产菌株的选育
1 诱变育种
2 基因重组育种第二节 酶的生产方式固体发酵法又称为麸曲培养法，该法是利用麸皮和米糠为主要原料，添加豆饼等，加水拌成半固体状态，供微生物生长和产酶用。适合于霉菌酶的生产。常用的有浅盘法、转桶法和厚层通气法。
液体发酵法有液体表面发酵和液体深层发酵，后者常用。
第三节 培养基培养基是供微生物生长,繁殖和代谢的需要及合成酶的营养物质 。 培养基成分和配比合适与否 。 对微生物的生长,酶的生物合成和提取工艺,甚至最后对成品的产量和质量都会产生相当大的影响 。 良好的培养基配比可以充分发挥生产菌种合成酶的能力,使之获得最大的生产效果 。 一个优良的发酵培养基,通常要经过长期生产实践的考验,并不断予以改进才能确立 。 而且培养基的配比,决不是一成不变的,
它随着生产实践的不断进展,原料来源及成 本,
菌种不断更新与发酵条件的不断改进而随时加以调整或改变 。
一、培养基的营养要求水,碳源,氮源,无机盐和生长素,它们被称为微生物培养基 的五要素 。
1.水 培养基需要以水为介质,微生物的生长必须有水,水是组成微生物细胞的主要成份 。
水在培养基中的主要功用有：
（ 1） 水是良好的溶剂 。
（ 2） 水是生活细胞中一切反应的媒介物 。
（ 3） 水能维持细胞中的渗透压 。
（ 4） 水是热的良好导体 。
发酵所用的水主要为自来水,还有深井水和江河水等 。
2.碳源碳源是用来供给微生物细胞生命活动所需要的能量和构成菌体细胞以及各种代谢产物的物质基础 （ 代谢产物中的碳架 ） 。 因此,碳源不仅需要量大,而且是主要的营养要素,是酶制剂发酵的主要 原料之一 。 大量的农副产物是主要的有机碳原料 。 微生物的营养类 型不同,
对碳源要求也不同 。
3,氮源氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素 。 微生物细胞的原生质是由蛋白质,核酸,脂类和水组成的,酶自身亦为蛋白质 。 因此,氮源是必不可少的重要原料 。 氮的来源可分为无机氮 （ 硫酸氨,尿素等 ） 和有机氮,豆饼,
花生饼粉等农副产物则是常用的有机氮源,其他还有鱼粉,蛋白陈等 。
4.无机盐和微量元素主要元素 --磷、硫、镁、钾、钙等。
微量元素 —铁、锰、锌、铜等。
5.生长因子和产酶促进剂凡能调节微生物代谢活动的微量有机物，都称为生长因子，一般指 B族维生素。
如果添加少量物质，就能显著增加酶的产量，
这些物质通常称为产酶促进剂。大部分是诱导物或者表面活性剂。诱导剂一般是底物或者底物类似物。
二、培养基的种类
1 斜面培养基 能够使菌种生长繁殖快、健壮，不容易引起菌种变异。
2 种子培养基 供菌种生长和繁殖用。营养要丰富和完全，但营养物质的浓度又不可以太高，以免影响种子的质量，因为种子的质量是决定发酵成败的关键之一。
3 发酵培养基 供菌种生长和发酵产物合成用，要求营养适当丰富和完全，适合菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在较短的周期内发挥产酶菌合成发酵产物的能力；同时要注意成本和粮耗。发酵培养基还要配合发酵装备、培养工艺和通气搅拌性能而选择。
三培养基的选择以前用单因子实验法，就是根据摇瓶、小罐中做实验，确定效果好坏，以及是否合适推广到发酵罐中。浪费时间，劳动量较大。现在使用正交实验法，有二因子、三因子和多因子的正交设计，效果好，速度快，减少了实验次数，提高了工作效率。
四选择原料的依据对于工业上大规模投入生产的原料，除了工艺要求外，还要考虑生产管理和经济上的要求五发酵生产的主要原材料山芋干,玉米粉,黄豆饼粉,麸皮第四节 灭菌二,空气过滤除菌
1.介质除菌机理 沉降作用,扩散作用,惯性撞击作用,阻拦作用,静电引力 。
2.空气过滤除菌的工艺流程由高空采集的空气经粗过滤器,进入空压机 。 空压机出口的空气一般要控制压力 2.0 kg/cm2以上,此时温度为 120～ 150℃,进入空气贮罐,经二次空气冷却和分离,温度降到 10～ 25℃,除去油和水,
再经热交换器加热至 30℃ 左右 （ 或不用热交换器,
则前面冷却温度可高些 ）,最后通过空气总过滤器和分过滤器 除菌,从而获得清洁,压力,温度和流量都符合工艺要求的无菌空气 。
3.空气过滤介质棉花 -活性炭为介质的空气总过滤器涂树脂的超细玻璃纤维纸为介质的空气分过滤器 。
新材料：
1烧结材料过滤介质
2高效过滤器
3绝对过滤器
4富氧空气除菌新思路 —膜法富氧三,防止染菌的检查杂菌的方法
1.污染途径原料、种子、无菌空气和设备。
2杂菌污染原因及防治
3噬菌体的危害和防止措施第五节发酵过程的控制一,发酵过程中的代谢变化
1与代谢变化有关的参数
1）物理参数：温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、
溶解氧等。
2）化学参数：基质浓度,pH值、酶活力。
3）生物参数：菌体形态，菌体浓度等。
2.生长代谢曲线
1）菌体生长阶段
2）产酶阶段
3）菌体自溶阶段二,影响产酶的重要条件
1.温度 菌体生长时需要降温，而发酵初期需要保温，一般来说，发酵温度比种子生长温度要偏高一些。
2.pH值 在酶制剂生产中，控制发酵液 pH值的方法，通常是调节培养基的原始 pH，掌握原料的配比，保持一定的 C/N；
或者添加缓冲剂使发酵液具有缓冲能力，也可以通过调节通气量，使发酵液的氧化还原电位差能维持在一定范围内。，
如果在发酵过程中,pH偏高通过添加糖和淀粉来调节，而 pH
过低通过添加氨来调节。
3.溶解氧 影响溶解氧的因素有搅拌、通风量和空气流速等。
4.泡沫
5.湿度三,发酵过程中的中间补料补料分为补糖，氮，无机盐和产酶促进剂，补全料和补水。
第六节 酶的工业提取一,发酵液预处理
1.加热
2.凝聚和絮凝 从目的物的带电性入手。如果添加酸或碱会改变 pH，改变粒子的电荷，如若电荷减少，
则有可能就会发生凝聚，比较容易过滤。
3.吸附在助滤剂 在过滤前添加助滤剂,是发酵液中的胶体物质吸附在助滤剂上，最有效的助滤剂有两种：硅藻土和珍珠岩 。
二,发酵液过滤
1.影响因素：滤液的性质、固体粒子的性质、固液比、
回收对象等。
2过滤设备：板框、转鼓真空、带式真空过滤机三,酶液浓缩常用的浓缩方法有真空浓缩和冷冻浓缩和超滤浓缩，超滤和反渗透是酶工业新近采用的技术。
四,盐析沉淀法
1机理盐析是利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低来进行的 。 因此,通过向含蛋白质的粗提液中加入不同浓度的盐,就可使蛋白质分别从溶液中沉淀出来,以达到分离 ﹑ 提纯的目的 。 这种在溶液 （ 一般是高分子溶液 ） 中加入大量的盐,使原溶解的物质析出沉淀的过程,称为盐析 。 盐析作用的主要原因是由于大量的盐溶入,使高分子物质去水化,从而降低了溶解度 。
当向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐时，会产生两种现象；
低盐情况下，随着中性盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大，称盐溶现象。但是，高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减少，发生了盐析作用。产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，盐离子部分中和了蛋白质的电性，
使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。盐析作用的另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露了疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。
2.盐析剂的选择 硫酸铵是好的选择。
3.影响盐析的因素
1）盐析剂加量的影响
2） pH的影响
3）温度的影响五,有机溶剂沉淀法
1.机理 靠 疏水基团的相互作用，沉淀和变性。
2.有机溶剂的选择工业一般采用乙醇，有机溶剂沉淀有一定的弊端，应用时应该尽量避免。
3.影响沉淀的因素
1）加量
2）温度 10~15℃
3） pH
六,酶的干燥干燥方法有烘房干燥、气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、振动干燥和真空冷冻干燥。以 α -淀粉酶为例。常采用喷雾干燥法，塔容积一般为 125m3，酶液进料量
500L/h，塔内空气流速为 0.25m/s，物料在塔内降落时间为 15~20s，日处理 10t发酵液。
三 组织培养近年来由于组织培养技术的迅速发展，已经显示某些动、植物来源的酶有可能通过组织培养的细胞获得，不过现阶段组织培养细胞主要 应用于 制备疫苗和激素等药物。
用来进行酶生产的组织培养和微生物发酵一样可以采用通气的液体培养方式，培养也要求供给适当的碳源、
氮源和无机盐等。植物细胞有时可能还需要加入其它一些有机物质，如肌醇、尼克酸等。许多酶的产量在组织培养的细胞中一般比原来的细胞分泌多，有些酶甚至能达到微生物的产酶水平。
优点,利用动、植物细胞，特别是利用动物细胞来生产食品工业用酶或医用酶可以避兔微生物毒素的污染。因此，如果有一天能解决组织细胞的大量培养问题，达将是一条十分有意义的生产途径,
第七节 酶的化学 改造与模拟通过化学合成来进行酶的生产还是比较遥远的事情。但是为适应生产实践的需要，
在采用微生物发酵生产酶的同时，人们正通过化学和生物的方法以各种方式进行酶的改造与模拟。
一 酶的改造就酶的改造而言，现在进行的工作有如下几个方面：
1.是设法使酶的活性结构加固，增加其稳定性,
2.通过化学修饰或酶法修饰改变酶的活性，其中包括某些调节酶在修饰后对效应物的反应性能的改变,
3.设法消除免疫原性或抗原性以利于医疗应用,
酶失效的四种原因,
(1)由于活性中心中特定的氨基酸被修饰；
(2)外界因素引起了立体障碍；
(3)酶蛋白变性引起高级结构改变；
(4)肽链被水解。
第一方面,
增加稳定性增加酶的稳定性的方法,
(1)选择相应的产酶菌如耐热菌，耐酸、碱菌；
(2)添加惰性蛋白、盐类、底物、辅酶等配体物质，
以及某些有机溶剂，如多聚醇等，并在低温下保存；
(3)添加强度变性剂，但这类方法目前还只行理论探索意义，其 原理 是酶的一级结构决定它们只选取在热力学上较稳定的特定的高级活性结构，因此当酶分子处于变性失效时，如果加入强度变性剂，使变性的酶分子进一步彻底松散，然后在需要活性酶的时候，再设法移去变性剂，使酶自然地恢复到活性结构；
(4)进行化学修饰，特别是进行分子内、分子间交联，
使成活性结构得到维持和加固,例如，用还原剂处理可以保持和恢复巯基酶的活性。
第二方面,
化学或酶法修饰化学修饰 可以针对活性中心部位，也可以在活性中心以外的残基上进行，而且后者可行性一般更大。但值得强调的是控制修饰条件十分重要，修饰后酶的活性可能上升，也可能下降，专一性以及对辅助因子的要求都可能改变。例如；用乙基马来酰亚胺修饰苹果酸的 SH基，可使其原有的脱羧酶活性与还原活性发生不同的变化。
酶的活性修饰 中，也可采用配基置换的办法。
例如，将羧肽酶活性必需的锌用钴取代，结果肽酶活性和酯酶活性比完全改变,
除了上述方法外，通过对酶进行 有限制的肽链水解 往往也能改变酶的活性。例如，天门冬氨酸酶用胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶等水解，结果使该酶的活性高了约千倍,
蛋白质工程的迅速发展，可以引入酶的预见性修饰与改造工作，这就是通过计算机技术将 x—衍射分析技术、蛋白质溶液构象研究技术与基因工程技术结合在一起进行的所谓 特定部位定向修饰 。例如,
将来源于枯草杆菌的酪氨酸 —tRNA合成酶的 35位半胱氨酸换成甘氨酸后，可增强该酶对 ATP的结合力,
第三方面,
消除免疫原性或抗原性用 小分子试剂进行修饰,例如，用亚硝酸脱去天门冬氨酰胺酶 N—末端异亮氨酸的氮基与赖氨酸的 ε —氮基后，酶的活力不变，
但它在体内半寿期比天然酶长两倍，疗效也显著提高。
用 水溶性大分子修饰,特别是应用聚乙二醇进行保护性修饰。例如，用聚乙二醇对尿酸酶修饰，可完全消除它的抗原性与免疫原性,减慢它们在动物血液循环中的清除速度,
修饰后酶的活力保存 15—45％。
二 酶的模拟就是根据酶作用原理研究模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成或生物方法制备高效,
高选择性,结构简单,较稳定的新型催化剂,
酶通过它的特定构象将有关氨基酸侧链基团组织在一起，形成具有高度选择性、降低反应活化能的活性结构，酶因此能表现其高效、高专一的催化特性。所以一般酶的模拟是以高分子聚合物、或络合了金属的高分子聚合物为母体，然后在适宜的部位引入相应的疏水或功能基团。
1．人工酶研究进展酶能在温和条件下高效，专一性地催化某些化学反应。设计合成象酶那样高效立体专一性的催化剂和完全理解酶的催化原理一直是科学家们追求的目标之一。
Pauling在 50 多年前就提出酶催化的基本原理,
分子识别和反应的过渡态。尽管生物学家和化学家在人工酶领域已经取得了一些进展，但仍不能运用 Pauling的过渡态理论创造出能与天然酶在催化效率、转换数和专一性相媲美的催化剂。
为了获得一个有效的酶模拟物，必需考虑以下两点：
①人工酶对过渡态的结合能力强于对底物的结合能力；
②人工酶在热力学和动力学上有利于产物的释放,
设计合成酶模拟物的最大挑战是必需理解酶选择性结合过渡态的原因。科学家已经做了大量的工作量阐述各种弱相互作用力对结合过渡态的贡献。
通常，参与过渡态结合的 弱相互作用力包括 静电相互作用、氢键、疏水相互作用和范德华力。因为酶在水相中催化，去溶剂效应和最终的焓变也是非常重要的因素。
酶和过渡态的相互作用复杂。 酶对过渡态的结合是一个动态过程 。具有活力的人工酶和合成受体的区别在于人工酶对底物的结合是一个动态的过程。 Kirby详细研究了丝氨酸蛋白酶的酰基转移步骤的酶动态结合,
在酰基转移过程中，过渡态的动态结合至少有 6个键的生成和破坏。
酶促反应过程中,酶对过渡态的结合不仅仅是普通的分子识别 。在酶活性中心,共价键的形成代表,动态,的相互结合作用 。酶在对过渡态的结合和稳定过程中,“动态,相互作用是非常关键的，这也是酶对底物和过渡态识别和结合的主要区别。
尽管酶催化是一个复杂的过程，但由于基因组学、
蛋白组学和功能基因组学的发展，人们对于蛋白质特别是酶有深入的了解。近年来，超分子科学的兴起为人工酶的发展注入新的活力。科学家们已经归纳总结出 人工模拟酶的一般规律。 在设计酶模型以前应当了解如下知识,
①酶活性中心的结构及酶 -底物复合物结构；
②酶的专一性及其同底物结合的方式和能力；
③反应的动力学及各中间体的知识。
理想的酶模型应当具有如下的品质,
①因非共价键相互作用是酶柔性与专一性的基础,
故酶模型应为底物提供良好的 结合部位 ；
②模型应提供形成离子键，氢键的可能性，以利于它以 适当方式 同底物 结合 ；
③催化基团必需与底物的官能团接近，以促使反应 定向发生 ；
④模型应具有足够的 水溶性,并在接近生理条件下保持催化活性。
2.人工酶的分类,
人工酶有不同的分类，我们根据学科的不同，将 人工酶分为两类,
化学酶模型和生物酶模型。
下面将介绍近几年来人工酶的一些新的发展思路、方法及原理,
(1)化学酶模型传统的模拟酶是设计合成具有类似酶催化残基官能团的大分子受体，主要包括,
1.环糊精酶模型,
2.环番酶模型,
3.分子印迹酶。
O
O H
H O
O H
O
O
O H
H O
O H
O
OO H
O H
O H
O
O
O H
O H
O H
O
O
O H
O H
H O
O
O
O H
O H
H O
O
O
O H
H O
H O
O
β -CD的分子式和结构表达式环糊精仿酶体系环糊精（ cyclodextrins）简称 CD，是环状低聚糖的总称，按所含 D-吡喃葡萄糖单元的个数，分为 α -CD
（ 6个葡萄糖单元）,β -CD（ 7个）,γ -CD（ 8个）。
每个 CD分子的仲羟基和伯羟基分布在空穴的边缘，具有亲水性，因而 CD在水中有一定的溶解度。同时，由于 CD外侧边缘亲水，而内腔是疏水的，它象酶一样提供了一个疏水的结合部位，既然它们包络的分子必须与空腔的大小，几何形状相匹配，使得 CD对底物具有一定的识别能力 能与各类客体形成超分子包合物，是仿酶研究中不可多得的半天然受体，通过选择性修饰得到的环糊精衍生物，由于结构和性质的进一步完善，
特别适合由于人工模拟酶开发 。特别是由于 CD本身无毒，更适合食品，药物的研究。
CD用于生物模拟化学，最早是由 Cramer 在 1965 年提出的，以后 Letsinger,Bender 等也进行了这方面的工作。
许多研究表明，利用 CD的包结作用进行有机反应时，具有酶反应的特征：反应位置的专一性（或特异性） ; 底物结构的专一性 ; 反应的对称特异性。
环糊精及其衍生物可以用来模拟转氨酶，氧化还原酶，
水解酶，超氧化物歧化酶（ SOD）,血红蛋白酶，葡萄糖氧化酶（ GOD）,抗坏血酸氧化酶等等。
例如，酶促反应最显著的特点是活性部位催化官能团的协同效应。在酶促反应中,His
常作为催化官能团。核糖核酸酶 A 利用 His-
12 和 His-119 催化水解 RNA,Breslow利用
β -CD 为酶模型，将两个咪唑引入 β -CD 的第一面模拟核糖核酸酶 A。
上图为模拟酶催化水解环状磷酸酯，它的 kcat 是
120× 10-5S-1,而非酶促反应 kuncat 是 1× 10-5S-1.该模拟酶具有很好的立体选择性,产物 1和 2的比率为 99:1.在
NaOH 水溶液中非酶促反应的产物是 1:1的混合物。同位素和动力学研究指出两个咪唑基团协同参与催化，一个充当酸催化剂，另一个充当碱催化剂。两个咪唑基在 β -
CD 上的相对位置对于催化也是非常重要的。只有两个咪唑基处于相邻位置时，模拟酶才有高催化效率和立体选择性。
环糊精模拟的水解酶桥联 CD是近年来发展的一类新型仿酶体系。它的两个（三个或者四个） CD及桥基上的功能基团构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能更好地模拟酶对底物的识别与催化功能。
S e S e
S e S e
6-SeCD
2-SeCD
罗贵民教授小组从酶的结构与机理出发,以 -Se-Se-为催化官能团，合成了 2-，
6-硒桥连 β -CD来模拟谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX),2-硒桥 β -CD(2-SCD)的 GPX活力是硒有机化合物 (Ebselen)的 7.5 倍。
2-SeCD比 Ebselen高 GPX活力的原因能被解释为：（ 1） 2-SeCD 能结合底物
GSH;(2)催化官能团 -Se-Se-的正确引入。
(2) 生物酶模型
1．抗体酶抗体酶又称催化抗体，是 Lerner和 Schultz在 20
世纪 80年代中期提出并发展起来的，它是酶学研究领域中的一个新方向。它将抗体的结合部位赋予酶的催化活性，为酶的人工模拟开辟了新的道路。自从抗体酶问世以来，抗体酶已成功催化了所有六种酶促反应。目前，较为成功的 制备方法包括,A.过渡态类似物法； B.熵阱法；
C.抗原 -抗体互补法； D.半合成法；
E.蛋白质工程法； F.抗体库法。
近年来，催化抗体领域的 重大进展,
反应性免疫,反应性免疫筛选抗体酶不同于传统的抗体酶筛选，它是利用化学反应活性而不是通过传统的对过渡态的结合来筛选抗体,
抗体库的使用,
2.进化酶酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计，
它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制和自然选择，在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。进化酶可分为定向进化酶和杂合进化酶。
定向进化是分子生物学和化学两学科相互渗透交叉的结果。通过定向进化 (单或多碱基的突变 ),许多天然酶已经被成功改造,通过体外定向进化,已经成功改造了酯酶，细胞色素 P450单加氧酶,
杂合酶不同于定向进化酶,它是通过结构域或亚结构域的重组来实现的，例如底物结构域、调节结构域、催化结构域。
通过这些相互独立的结构域之间的重组，
获得比亲本功能具有更高效率的或者衍生出新功能的子代重组体,
第一节 菌种选育
第二节 酶的生产方式
第三节 培养基
第四节 灭菌
第五节 发酵过程的控制
第六节 酶的工业提取
第七节 酶的 改造与模拟第一节 菌种选育一 菌样采集二 富集三 菌种纯化和分离四 新种性能的测试五 高产菌株的选育
1 诱变育种
2 基因重组育种第二节 酶的生产方式固体发酵法又称为麸曲培养法，该法是利用麸皮和米糠为主要原料，添加豆饼等，加水拌成半固体状态，供微生物生长和产酶用。适合于霉菌酶的生产。常用的有浅盘法、转桶法和厚层通气法。
液体发酵法有液体表面发酵和液体深层发酵，后者常用。
第三节 培养基培养基是供微生物生长,繁殖和代谢的需要及合成酶的营养物质 。 培养基成分和配比合适与否 。 对微生物的生长,酶的生物合成和提取工艺,甚至最后对成品的产量和质量都会产生相当大的影响 。 良好的培养基配比可以充分发挥生产菌种合成酶的能力,使之获得最大的生产效果 。 一个优良的发酵培养基,通常要经过长期生产实践的考验,并不断予以改进才能确立 。 而且培养基的配比,决不是一成不变的,
它随着生产实践的不断进展,原料来源及成 本,
菌种不断更新与发酵条件的不断改进而随时加以调整或改变 。
一、培养基的营养要求水,碳源,氮源,无机盐和生长素,它们被称为微生物培养基 的五要素 。
1.水 培养基需要以水为介质,微生物的生长必须有水,水是组成微生物细胞的主要成份 。
水在培养基中的主要功用有：
（ 1） 水是良好的溶剂 。
（ 2） 水是生活细胞中一切反应的媒介物 。
（ 3） 水能维持细胞中的渗透压 。
（ 4） 水是热的良好导体 。
发酵所用的水主要为自来水,还有深井水和江河水等 。
2.碳源碳源是用来供给微生物细胞生命活动所需要的能量和构成菌体细胞以及各种代谢产物的物质基础 （ 代谢产物中的碳架 ） 。 因此,碳源不仅需要量大,而且是主要的营养要素,是酶制剂发酵的主要 原料之一 。 大量的农副产物是主要的有机碳原料 。 微生物的营养类 型不同,
对碳源要求也不同 。
3,氮源氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素 。 微生物细胞的原生质是由蛋白质,核酸,脂类和水组成的,酶自身亦为蛋白质 。 因此,氮源是必不可少的重要原料 。 氮的来源可分为无机氮 （ 硫酸氨,尿素等 ） 和有机氮,豆饼,
花生饼粉等农副产物则是常用的有机氮源,其他还有鱼粉,蛋白陈等 。
4.无机盐和微量元素主要元素 --磷、硫、镁、钾、钙等。
微量元素 —铁、锰、锌、铜等。
5.生长因子和产酶促进剂凡能调节微生物代谢活动的微量有机物，都称为生长因子，一般指 B族维生素。
如果添加少量物质，就能显著增加酶的产量，
这些物质通常称为产酶促进剂。大部分是诱导物或者表面活性剂。诱导剂一般是底物或者底物类似物。
二、培养基的种类
1 斜面培养基 能够使菌种生长繁殖快、健壮，不容易引起菌种变异。
2 种子培养基 供菌种生长和繁殖用。营养要丰富和完全，但营养物质的浓度又不可以太高，以免影响种子的质量，因为种子的质量是决定发酵成败的关键之一。
3 发酵培养基 供菌种生长和发酵产物合成用，要求营养适当丰富和完全，适合菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在较短的周期内发挥产酶菌合成发酵产物的能力；同时要注意成本和粮耗。发酵培养基还要配合发酵装备、培养工艺和通气搅拌性能而选择。
三培养基的选择以前用单因子实验法，就是根据摇瓶、小罐中做实验，确定效果好坏，以及是否合适推广到发酵罐中。浪费时间，劳动量较大。现在使用正交实验法，有二因子、三因子和多因子的正交设计，效果好，速度快，减少了实验次数，提高了工作效率。
四选择原料的依据对于工业上大规模投入生产的原料，除了工艺要求外，还要考虑生产管理和经济上的要求五发酵生产的主要原材料山芋干,玉米粉,黄豆饼粉,麸皮第四节 灭菌二,空气过滤除菌
1.介质除菌机理 沉降作用,扩散作用,惯性撞击作用,阻拦作用,静电引力 。
2.空气过滤除菌的工艺流程由高空采集的空气经粗过滤器,进入空压机 。 空压机出口的空气一般要控制压力 2.0 kg/cm2以上,此时温度为 120～ 150℃,进入空气贮罐,经二次空气冷却和分离,温度降到 10～ 25℃,除去油和水,
再经热交换器加热至 30℃ 左右 （ 或不用热交换器,
则前面冷却温度可高些 ）,最后通过空气总过滤器和分过滤器 除菌,从而获得清洁,压力,温度和流量都符合工艺要求的无菌空气 。
3.空气过滤介质棉花 -活性炭为介质的空气总过滤器涂树脂的超细玻璃纤维纸为介质的空气分过滤器 。
新材料：
1烧结材料过滤介质
2高效过滤器
3绝对过滤器
4富氧空气除菌新思路 —膜法富氧三,防止染菌的检查杂菌的方法
1.污染途径原料、种子、无菌空气和设备。
2杂菌污染原因及防治
3噬菌体的危害和防止措施第五节发酵过程的控制一,发酵过程中的代谢变化
1与代谢变化有关的参数
1）物理参数：温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、
溶解氧等。
2）化学参数：基质浓度,pH值、酶活力。
3）生物参数：菌体形态，菌体浓度等。
2.生长代谢曲线
1）菌体生长阶段
2）产酶阶段
3）菌体自溶阶段二,影响产酶的重要条件
1.温度 菌体生长时需要降温，而发酵初期需要保温，一般来说，发酵温度比种子生长温度要偏高一些。
2.pH值 在酶制剂生产中，控制发酵液 pH值的方法，通常是调节培养基的原始 pH，掌握原料的配比，保持一定的 C/N；
或者添加缓冲剂使发酵液具有缓冲能力，也可以通过调节通气量，使发酵液的氧化还原电位差能维持在一定范围内。，
如果在发酵过程中,pH偏高通过添加糖和淀粉来调节，而 pH
过低通过添加氨来调节。
3.溶解氧 影响溶解氧的因素有搅拌、通风量和空气流速等。
4.泡沫
5.湿度三,发酵过程中的中间补料补料分为补糖，氮，无机盐和产酶促进剂，补全料和补水。
第六节 酶的工业提取一,发酵液预处理
1.加热
2.凝聚和絮凝 从目的物的带电性入手。如果添加酸或碱会改变 pH，改变粒子的电荷，如若电荷减少，
则有可能就会发生凝聚，比较容易过滤。
3.吸附在助滤剂 在过滤前添加助滤剂,是发酵液中的胶体物质吸附在助滤剂上，最有效的助滤剂有两种：硅藻土和珍珠岩 。
二,发酵液过滤
1.影响因素：滤液的性质、固体粒子的性质、固液比、
回收对象等。
2过滤设备：板框、转鼓真空、带式真空过滤机三,酶液浓缩常用的浓缩方法有真空浓缩和冷冻浓缩和超滤浓缩，超滤和反渗透是酶工业新近采用的技术。
四,盐析沉淀法
1机理盐析是利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低来进行的 。 因此,通过向含蛋白质的粗提液中加入不同浓度的盐,就可使蛋白质分别从溶液中沉淀出来,以达到分离 ﹑ 提纯的目的 。 这种在溶液 （ 一般是高分子溶液 ） 中加入大量的盐,使原溶解的物质析出沉淀的过程,称为盐析 。 盐析作用的主要原因是由于大量的盐溶入,使高分子物质去水化,从而降低了溶解度 。
当向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐时，会产生两种现象；
低盐情况下，随着中性盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大，称盐溶现象。但是，高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减少，发生了盐析作用。产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，盐离子部分中和了蛋白质的电性，
使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。盐析作用的另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露了疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。
2.盐析剂的选择 硫酸铵是好的选择。
3.影响盐析的因素
1）盐析剂加量的影响
2） pH的影响
3）温度的影响五,有机溶剂沉淀法
1.机理 靠 疏水基团的相互作用，沉淀和变性。
2.有机溶剂的选择工业一般采用乙醇，有机溶剂沉淀有一定的弊端，应用时应该尽量避免。
3.影响沉淀的因素
1）加量
2）温度 10~15℃
3） pH
六,酶的干燥干燥方法有烘房干燥、气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、振动干燥和真空冷冻干燥。以 α -淀粉酶为例。常采用喷雾干燥法，塔容积一般为 125m3，酶液进料量
500L/h，塔内空气流速为 0.25m/s，物料在塔内降落时间为 15~20s，日处理 10t发酵液。
三 组织培养近年来由于组织培养技术的迅速发展，已经显示某些动、植物来源的酶有可能通过组织培养的细胞获得，不过现阶段组织培养细胞主要 应用于 制备疫苗和激素等药物。
用来进行酶生产的组织培养和微生物发酵一样可以采用通气的液体培养方式，培养也要求供给适当的碳源、
氮源和无机盐等。植物细胞有时可能还需要加入其它一些有机物质，如肌醇、尼克酸等。许多酶的产量在组织培养的细胞中一般比原来的细胞分泌多，有些酶甚至能达到微生物的产酶水平。
优点,利用动、植物细胞，特别是利用动物细胞来生产食品工业用酶或医用酶可以避兔微生物毒素的污染。因此，如果有一天能解决组织细胞的大量培养问题，达将是一条十分有意义的生产途径,
第七节 酶的化学 改造与模拟通过化学合成来进行酶的生产还是比较遥远的事情。但是为适应生产实践的需要，
在采用微生物发酵生产酶的同时，人们正通过化学和生物的方法以各种方式进行酶的改造与模拟。
一 酶的改造就酶的改造而言，现在进行的工作有如下几个方面：
1.是设法使酶的活性结构加固，增加其稳定性,
2.通过化学修饰或酶法修饰改变酶的活性，其中包括某些调节酶在修饰后对效应物的反应性能的改变,
3.设法消除免疫原性或抗原性以利于医疗应用,
酶失效的四种原因,
(1)由于活性中心中特定的氨基酸被修饰；
(2)外界因素引起了立体障碍；
(3)酶蛋白变性引起高级结构改变；
(4)肽链被水解。
第一方面,
增加稳定性增加酶的稳定性的方法,
(1)选择相应的产酶菌如耐热菌，耐酸、碱菌；
(2)添加惰性蛋白、盐类、底物、辅酶等配体物质，
以及某些有机溶剂，如多聚醇等，并在低温下保存；
(3)添加强度变性剂，但这类方法目前还只行理论探索意义，其 原理 是酶的一级结构决定它们只选取在热力学上较稳定的特定的高级活性结构，因此当酶分子处于变性失效时，如果加入强度变性剂，使变性的酶分子进一步彻底松散，然后在需要活性酶的时候，再设法移去变性剂，使酶自然地恢复到活性结构；
(4)进行化学修饰，特别是进行分子内、分子间交联，
使成活性结构得到维持和加固,例如，用还原剂处理可以保持和恢复巯基酶的活性。
第二方面,
化学或酶法修饰化学修饰 可以针对活性中心部位，也可以在活性中心以外的残基上进行，而且后者可行性一般更大。但值得强调的是控制修饰条件十分重要，修饰后酶的活性可能上升，也可能下降，专一性以及对辅助因子的要求都可能改变。例如；用乙基马来酰亚胺修饰苹果酸的 SH基，可使其原有的脱羧酶活性与还原活性发生不同的变化。
酶的活性修饰 中，也可采用配基置换的办法。
例如，将羧肽酶活性必需的锌用钴取代，结果肽酶活性和酯酶活性比完全改变,
除了上述方法外，通过对酶进行 有限制的肽链水解 往往也能改变酶的活性。例如，天门冬氨酸酶用胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶等水解，结果使该酶的活性高了约千倍,
蛋白质工程的迅速发展，可以引入酶的预见性修饰与改造工作，这就是通过计算机技术将 x—衍射分析技术、蛋白质溶液构象研究技术与基因工程技术结合在一起进行的所谓 特定部位定向修饰 。例如,
将来源于枯草杆菌的酪氨酸 —tRNA合成酶的 35位半胱氨酸换成甘氨酸后，可增强该酶对 ATP的结合力,
第三方面,
消除免疫原性或抗原性用 小分子试剂进行修饰,例如，用亚硝酸脱去天门冬氨酰胺酶 N—末端异亮氨酸的氮基与赖氨酸的 ε —氮基后，酶的活力不变，
但它在体内半寿期比天然酶长两倍，疗效也显著提高。
用 水溶性大分子修饰,特别是应用聚乙二醇进行保护性修饰。例如，用聚乙二醇对尿酸酶修饰，可完全消除它的抗原性与免疫原性,减慢它们在动物血液循环中的清除速度,
修饰后酶的活力保存 15—45％。
二 酶的模拟就是根据酶作用原理研究模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成或生物方法制备高效,
高选择性,结构简单,较稳定的新型催化剂,
酶通过它的特定构象将有关氨基酸侧链基团组织在一起，形成具有高度选择性、降低反应活化能的活性结构，酶因此能表现其高效、高专一的催化特性。所以一般酶的模拟是以高分子聚合物、或络合了金属的高分子聚合物为母体，然后在适宜的部位引入相应的疏水或功能基团。
1．人工酶研究进展酶能在温和条件下高效，专一性地催化某些化学反应。设计合成象酶那样高效立体专一性的催化剂和完全理解酶的催化原理一直是科学家们追求的目标之一。
Pauling在 50 多年前就提出酶催化的基本原理,
分子识别和反应的过渡态。尽管生物学家和化学家在人工酶领域已经取得了一些进展，但仍不能运用 Pauling的过渡态理论创造出能与天然酶在催化效率、转换数和专一性相媲美的催化剂。
为了获得一个有效的酶模拟物，必需考虑以下两点：
①人工酶对过渡态的结合能力强于对底物的结合能力；
②人工酶在热力学和动力学上有利于产物的释放,
设计合成酶模拟物的最大挑战是必需理解酶选择性结合过渡态的原因。科学家已经做了大量的工作量阐述各种弱相互作用力对结合过渡态的贡献。
通常，参与过渡态结合的 弱相互作用力包括 静电相互作用、氢键、疏水相互作用和范德华力。因为酶在水相中催化，去溶剂效应和最终的焓变也是非常重要的因素。
酶和过渡态的相互作用复杂。 酶对过渡态的结合是一个动态过程 。具有活力的人工酶和合成受体的区别在于人工酶对底物的结合是一个动态的过程。 Kirby详细研究了丝氨酸蛋白酶的酰基转移步骤的酶动态结合,
在酰基转移过程中，过渡态的动态结合至少有 6个键的生成和破坏。
酶促反应过程中,酶对过渡态的结合不仅仅是普通的分子识别 。在酶活性中心,共价键的形成代表,动态,的相互结合作用 。酶在对过渡态的结合和稳定过程中,“动态,相互作用是非常关键的，这也是酶对底物和过渡态识别和结合的主要区别。
尽管酶催化是一个复杂的过程，但由于基因组学、
蛋白组学和功能基因组学的发展，人们对于蛋白质特别是酶有深入的了解。近年来，超分子科学的兴起为人工酶的发展注入新的活力。科学家们已经归纳总结出 人工模拟酶的一般规律。 在设计酶模型以前应当了解如下知识,
①酶活性中心的结构及酶 -底物复合物结构；
②酶的专一性及其同底物结合的方式和能力；
③反应的动力学及各中间体的知识。
理想的酶模型应当具有如下的品质,
①因非共价键相互作用是酶柔性与专一性的基础,
故酶模型应为底物提供良好的 结合部位 ；
②模型应提供形成离子键，氢键的可能性，以利于它以 适当方式 同底物 结合 ；
③催化基团必需与底物的官能团接近，以促使反应 定向发生 ；
④模型应具有足够的 水溶性,并在接近生理条件下保持催化活性。
2.人工酶的分类,
人工酶有不同的分类，我们根据学科的不同，将 人工酶分为两类,
化学酶模型和生物酶模型。
下面将介绍近几年来人工酶的一些新的发展思路、方法及原理,
(1)化学酶模型传统的模拟酶是设计合成具有类似酶催化残基官能团的大分子受体，主要包括,
1.环糊精酶模型,
2.环番酶模型,
3.分子印迹酶。
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β -CD的分子式和结构表达式环糊精仿酶体系环糊精（ cyclodextrins）简称 CD，是环状低聚糖的总称，按所含 D-吡喃葡萄糖单元的个数，分为 α -CD
（ 6个葡萄糖单元）,β -CD（ 7个）,γ -CD（ 8个）。
每个 CD分子的仲羟基和伯羟基分布在空穴的边缘，具有亲水性，因而 CD在水中有一定的溶解度。同时，由于 CD外侧边缘亲水，而内腔是疏水的，它象酶一样提供了一个疏水的结合部位，既然它们包络的分子必须与空腔的大小，几何形状相匹配，使得 CD对底物具有一定的识别能力 能与各类客体形成超分子包合物，是仿酶研究中不可多得的半天然受体，通过选择性修饰得到的环糊精衍生物，由于结构和性质的进一步完善，
特别适合由于人工模拟酶开发 。特别是由于 CD本身无毒，更适合食品，药物的研究。
CD用于生物模拟化学，最早是由 Cramer 在 1965 年提出的，以后 Letsinger,Bender 等也进行了这方面的工作。
许多研究表明，利用 CD的包结作用进行有机反应时，具有酶反应的特征：反应位置的专一性（或特异性） ; 底物结构的专一性 ; 反应的对称特异性。
环糊精及其衍生物可以用来模拟转氨酶，氧化还原酶，
水解酶，超氧化物歧化酶（ SOD）,血红蛋白酶，葡萄糖氧化酶（ GOD）,抗坏血酸氧化酶等等。
例如，酶促反应最显著的特点是活性部位催化官能团的协同效应。在酶促反应中,His
常作为催化官能团。核糖核酸酶 A 利用 His-
12 和 His-119 催化水解 RNA,Breslow利用
β -CD 为酶模型，将两个咪唑引入 β -CD 的第一面模拟核糖核酸酶 A。
上图为模拟酶催化水解环状磷酸酯，它的 kcat 是
120× 10-5S-1,而非酶促反应 kuncat 是 1× 10-5S-1.该模拟酶具有很好的立体选择性,产物 1和 2的比率为 99:1.在
NaOH 水溶液中非酶促反应的产物是 1:1的混合物。同位素和动力学研究指出两个咪唑基团协同参与催化，一个充当酸催化剂，另一个充当碱催化剂。两个咪唑基在 β -
CD 上的相对位置对于催化也是非常重要的。只有两个咪唑基处于相邻位置时，模拟酶才有高催化效率和立体选择性。
环糊精模拟的水解酶桥联 CD是近年来发展的一类新型仿酶体系。它的两个（三个或者四个） CD及桥基上的功能基团构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能更好地模拟酶对底物的识别与催化功能。
S e S e
S e S e
6-SeCD
2-SeCD
罗贵民教授小组从酶的结构与机理出发,以 -Se-Se-为催化官能团，合成了 2-，
6-硒桥连 β -CD来模拟谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX),2-硒桥 β -CD(2-SCD)的 GPX活力是硒有机化合物 (Ebselen)的 7.5 倍。
2-SeCD比 Ebselen高 GPX活力的原因能被解释为：（ 1） 2-SeCD 能结合底物
GSH;(2)催化官能团 -Se-Se-的正确引入。
(2) 生物酶模型
1．抗体酶抗体酶又称催化抗体，是 Lerner和 Schultz在 20
世纪 80年代中期提出并发展起来的，它是酶学研究领域中的一个新方向。它将抗体的结合部位赋予酶的催化活性，为酶的人工模拟开辟了新的道路。自从抗体酶问世以来，抗体酶已成功催化了所有六种酶促反应。目前，较为成功的 制备方法包括,A.过渡态类似物法； B.熵阱法；
C.抗原 -抗体互补法； D.半合成法；
E.蛋白质工程法； F.抗体库法。
近年来，催化抗体领域的 重大进展,
反应性免疫,反应性免疫筛选抗体酶不同于传统的抗体酶筛选，它是利用化学反应活性而不是通过传统的对过渡态的结合来筛选抗体,
抗体库的使用,
2.进化酶酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计，
它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制和自然选择，在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。进化酶可分为定向进化酶和杂合进化酶。
定向进化是分子生物学和化学两学科相互渗透交叉的结果。通过定向进化 (单或多碱基的突变 ),许多天然酶已经被成功改造,通过体外定向进化,已经成功改造了酯酶，细胞色素 P450单加氧酶,
杂合酶不同于定向进化酶,它是通过结构域或亚结构域的重组来实现的，例如底物结构域、调节结构域、催化结构域。
通过这些相互独立的结构域之间的重组，
获得比亲本功能具有更高效率的或者衍生出新功能的子代重组体,
