第六章 酶分析在生产实践和基础理论研究中往往离不开生化分析，而酶分析是其中一个重要方面。酶分析包括两种类型,一种是以酶为分析对象的分析，这就是通常所说的 ‘ 酶活力测定,；一种是以酶为分析工具或分析试剂的分析，一般可称为,酶法分析,。前者的目的在于检知样品中某种酶的含量或活性，后者则主要用于测定与生物学有关的样品中酶以外其它物质的含量。
二者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化化学反应为基础,通过酶反应速度的测定而检测相应物质的含量。
第一节 酶活力测定酶的含量和活性水平可通过特定系统的酶 (促 )反应速度而加以测定。
在进行这种测定时可采用两种 方式,
一是测定完成一定量反应所需耍的时间；
二是测定单位时间内的酶促反应量。
前者常称为终点法，后者称为动力学法。
一 终点法这是在特定条件下，将样品中要检测的酶作用一定量的底物，然后根据反应进行到某一程度
(即达到某一指标 )所需要的时间长短来估计酶活力的一种方法。例如，工业生产 α -淀粉酶时就是采用这种方法,
二 动力学法
1.原理这种测定法的原理是，在一定的条件下，酶反应速度和酶浓度成正比，因此测定酶反应速度就可求得酶浓度。
2,反应条件选择反应条件的基本要求是，所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定的酶浓度是影响反应速度的唯一因素外，其它因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平。
确定反应条件时应考虑以下因素,
(1)底物；（ 2） pH值；（ 3）温度；
(4)辅助因子； (5)样品。
三、测定方法测定方法有取样法和连续法。
取样法 是在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。
连续法 则是基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接，
连续观察的方法。显然从准确性和测定效率看连续法比较好。
常用的一些测定方法：
1 化学法
2 光学法,(1)光吸收测定法 ;
(2)荧光测定法 ;
(3)旋光测定法
3 电化学测定法,(1)离子选择性电极测定法 ;
(2)氧电极测定法 ;
(3)细电流电位测定法 ;
(4)电流测定法
1.化学法这是一种取样法，停止酶反应通常采用添加酶的变性剂的办法，或加热使酶失效停止反应。
优点：
(i)它不需要特殊仪器；
(ii）几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出具体的捡定方法；
(iii)由于色源底物和荧光源底物的发展，可在原来的底物分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。
缺点,化学法工作量大；本身包含一定的误差，
对速度快的反应常不易得到十分准确的结果，所以不是理想的测定方法。
2 光学法
(1)光吸收测定法原理,产物和底物在某一波长或波段上，有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。
光吸收测定法应用的 范围 很广，几乎所有氧化还原酶都可用此法规定。还有那些催化双键饱和化或双键形成的酶反应，以及那些催化环状结构变化的酶反应。
特点,灵敏度高简便易行，测定可在较短的时间内完成。
(2)荧光测定法荧光测定法也是一种连续观测方法,原理,如果酶反应的底物与产物之一具有荧光，那末荧光变化的速度可代表酶反应速度。
可以应用此法测定的酶反应有两类,
（ 1）脱氢酶等反应，它们的底物本身在酶反应过程就有荧光变化。（ 2）利用荧光源底物的酶反应。
优点,是灵敏度极高，它比光吸收测定法还要高 2-
3个数量级，因此特别适于酶量或底物量极低时的快速酶分析。
(3)旋光测定法某些酶反应过程常伴随着旋光变化，在没有其它更好的方法可用时，可考虑旋光测定法。
旋光法的 缺点 是准确度和灵敏度不高，待测物浓度至少比光吸收法要求的大 2个数量级。
酶反应过程中高比旋的蛋白质分子可能发生旋光变化，导致测定精确度下降。此外，旋光测定法操作也不甚方便，故一般少用。
3．电化学测定法这也是一类连续分析法，灵敏度和准确度都很高，可和光学方法相比；而且即使测定系统中有某些物质污染，也不会影响结果。
但是要求一定的仪器设备。
（ 1)离子选择性电极测定法最普通的是以玻璃电极测定酸度 (pH)的变化，
可用于产酸反应的测定。
此法操作简单，但有两个缺点,
一是随着反应的进行,pH不断变．酶活力也发生变化；
二是测定系统的 pH依赖于介质的缓冲能力，
蛋白质是高缓冲性物质，粗的待测样品中往往包含大量惰性蛋白，因而难以保证恒定的缓冲强度，测定结果不易准确。
(2)氧电极测定法这是极谱分析、或者说电解分析的一种应用。其 原理 是，如果给水溶液中的电极加上一定电压，那末其中的溶解物质就会在电极上进行氧化还原反应，从而产生电解电流，
测定这种电流就可以知道溶质的浓度。各种物质产生电极反应所需要加的电极电压是不同的，因此可以进行选择性测定。
(3)细电流电位测定法此法的 原理 是，如果反应的底物和产物在化学性质上不同，那末在一个细小稳定的电流下，两个极化的铂电极间电位也不同，因此测定这种电位变化的速度可代表酶反应的速度。
(4)电流测定法这种测定法是把两个电极浸入分析样品中，其间维持一恒定电压，这样反应过程中电流的变化速度将反映酶反应的速度。
四 测定
l 测定对象和一般化学反应一样，酶反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，因此在理论上二者皆可以，但是在实际上，由于在酶反应系统中，使用的底物浓度都很大，而反应时间很短，底物的减少量仅仅占总量的很小百分数，故不易准确测定，反之，产物从无到有，只要测定方法灵敏，就可以准确测定，所以还是产物分析为好。
2,测定初速度反应速度可以用单位时间内产物或底物的变化量表示。如果将测得的产物或底物变化量对时间作图，可获得酶应应进程曲线，曲线的斜率就代表酶反应速度。
真正能代表酶催化活性的是反应初始阶段的速度，即反应初速度。
大多数酶的反应进程曲线表明，在酶反应的最初阶段里，底物或产物的变化量一般随反应时间而线性地增加，反应速度恒定但是反应时间延长，这条曲线会逐渐地弯曲下来,斜率发生改变，反应速度下降。其 原因 是，底物浓度在下降，产物在增加,逆反应从无到有逐渐变得显著起来，同时酸、碱、热等也在馒慢地使酶失效。因此，这种情况下测得的反应速度已是一种表现的、多种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性。所以真正能代表酶催化活性的是反应初始阶段的速度，即反应初速度。
进程曲线可以通过连续测定得到，也可通过在间隔时间取样测定后绘制，它至少应由三个时间点组成：零时点、适当选择的时间间隔 (取决于具体的反应和测定方法 )以及二倍于这个间隔的点。并且要求在这种时间范围内反应量不超过底物总量的 20％。
3 测定要达到的要求酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定求得酶的浓度或含量，因此，测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。
要达到该测定要求，最基本的是必须测定反应初速度。
第二节 酶法分析酶法分析是一种以酶为分析工具 (或试剂 )的分析，分析的对象可以是酶的底物、辅酶、活化剂甚至酶的抑制剂。在进行这类分析时，先要根据分析对象选择适它的,工具酶,,然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来检知它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中，除了底物可以采用总变量分析法外，其它都只能用动力学分析法。
一 动力学分析法：
原理,通过条件控制，分别使底物、辅酶、活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度就需具有确定的比例关系，这样测定酶反应的速度就可求知它们的浓度。
条件,和酶活力测定的基本相同，但其所用的酶量必须一定，除了相应的被测因素的浓度应控制在限速水平以外，其它反应成份均须保证处于恒定和最适。
二 总变量分析法又称为平衡法或终点法。
原理,是根据被测物质的性质，选择适宜的
,分析工具酶,对该物质进行作用，然后在反应完成后，借助物理化学方法测其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。它仅适用于底物的测定，应用时应考虑两个问题，即工具酶的用量与反应的平衡点。
终点法操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反应于 1级反应水平。因为这样可以使反应迅速达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反应；
减少工具酶的用员。
(2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。
(3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到终点。
三 酶标免疫分析原理,酶标免疫分析是以待测抗原 (或抗体 )和游标抗体 (或抗原 )的专一结合反应为基础，然后通过酶活力测定来确定抗原 (或抗体 )含量的一类分析法。
四 酶循环分析法酶循环分析法是在上述酶分析基础上，为适应神经生化等定量测定单个神经细胞中的酶及其它微量物质的需要，通过两种相关的酶反应组合、放大而发展起来的一种超微量分析法，
它具有极高的灵敏度，可测定 10-15克分子水平的生物物质。
原理,酶循环分析法是利用在专一性上相互关联的两种酶反应相互组合、循环，
使微量的酶活性或其它物质增幅放大以达到定量测定目的的分析方法。
6.3 固定化酶在酶分析中的应用近年来，固定化酶也已开始渗入到酶分析领域，并在迅速地扩展，从而有可能使酶分析达到简便化、连续化和自动化。
一 酶 (膜 )电极酶电极主要由选择性电极感应器和复盖在上面的酶膜组成。通过酶膜层的作用使底物转化为产物，然后再通过感应器进行检测。这种转化可用一级反应动力学关系描述。
优点,酶电极检测十分简便，而且灵敏度高，因此很可能得到普及和进一步发展。
近年来不仅有了各种酶电极，还出现了各种微生物电极、多功能电极等。
二 酶管感应分析器这是将酶固定于细管内壁，样品通过细管时与管壁接触进行酶反应，然后在细管出口处偶联感应分折仪，检测流出的产物浓度，再通过动力学关系求得待测物浓度的分析装臵。
6.4 酶分析的自动化问题所谓 酶分析自动化 就是指从清洗、加样、启动反应、测定、数据记录、计算处理直至提供结果等步骤，全部由仪器自动操作。有些仪器只能做到半自动，其结果计算需由人工处理。
要使酶分析自动化就必须使酶反应拟一级化，即除了被测因素外，其它都应保证过量、最适，这样酶反应速度与被测因素成比例。
实现测定的自动化有以下几种方法：
1.初速度法
2.固定浓度法（变时法）
3.固定时间法一 初速度法这种方法就是通过分析仪器自动添加反应试剂和样品，自动控制反应和检测反应，井自动绘制酶反应过程曲线的一种半自动方法。但从反应过程曲线求出反应初速度，
并换算成被测物的浓度还要靠人工进行。
二 固定浓度法又称变时法。
当底物浓度固定时，反应速度相对底物浓度或相对酶浓度作图有一线性关系，通过分析仪器自动测定反应物或反应产物变化 (物理化学性质变化 )达到其一固定值所需要的时间就可求得被测物的浓度。
三 固定时间法对于一个酶反应，在线性范围内选取一个恰当时间进行反应的检定，此时测得的反应 (产 )物变化无疑与酶浓度 (或其它被测物 )有线性比例关系，测定上述变化就可算出被测物的浓度。
二者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化化学反应为基础,通过酶反应速度的测定而检测相应物质的含量。
第一节 酶活力测定酶的含量和活性水平可通过特定系统的酶 (促 )反应速度而加以测定。
在进行这种测定时可采用两种 方式,
一是测定完成一定量反应所需耍的时间；
二是测定单位时间内的酶促反应量。
前者常称为终点法，后者称为动力学法。
一 终点法这是在特定条件下，将样品中要检测的酶作用一定量的底物，然后根据反应进行到某一程度
(即达到某一指标 )所需要的时间长短来估计酶活力的一种方法。例如，工业生产 α -淀粉酶时就是采用这种方法,
二 动力学法
1.原理这种测定法的原理是，在一定的条件下，酶反应速度和酶浓度成正比，因此测定酶反应速度就可求得酶浓度。
2,反应条件选择反应条件的基本要求是，所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定的酶浓度是影响反应速度的唯一因素外，其它因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平。
确定反应条件时应考虑以下因素,
(1)底物；（ 2） pH值；（ 3）温度；
(4)辅助因子； (5)样品。
三、测定方法测定方法有取样法和连续法。
取样法 是在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当的方法停止其反应后，再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。
连续法 则是基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接，
连续观察的方法。显然从准确性和测定效率看连续法比较好。
常用的一些测定方法：
1 化学法
2 光学法,(1)光吸收测定法 ;
(2)荧光测定法 ;
(3)旋光测定法
3 电化学测定法,(1)离子选择性电极测定法 ;
(2)氧电极测定法 ;
(3)细电流电位测定法 ;
(4)电流测定法
1.化学法这是一种取样法，停止酶反应通常采用添加酶的变性剂的办法，或加热使酶失效停止反应。
优点：
(i)它不需要特殊仪器；
(ii）几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出具体的捡定方法；
(iii)由于色源底物和荧光源底物的发展，可在原来的底物分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。
缺点,化学法工作量大；本身包含一定的误差，
对速度快的反应常不易得到十分准确的结果，所以不是理想的测定方法。
2 光学法
(1)光吸收测定法原理,产物和底物在某一波长或波段上，有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法。
光吸收测定法应用的 范围 很广，几乎所有氧化还原酶都可用此法规定。还有那些催化双键饱和化或双键形成的酶反应，以及那些催化环状结构变化的酶反应。
特点,灵敏度高简便易行，测定可在较短的时间内完成。
(2)荧光测定法荧光测定法也是一种连续观测方法,原理,如果酶反应的底物与产物之一具有荧光，那末荧光变化的速度可代表酶反应速度。
可以应用此法测定的酶反应有两类,
（ 1）脱氢酶等反应，它们的底物本身在酶反应过程就有荧光变化。（ 2）利用荧光源底物的酶反应。
优点,是灵敏度极高，它比光吸收测定法还要高 2-
3个数量级，因此特别适于酶量或底物量极低时的快速酶分析。
(3)旋光测定法某些酶反应过程常伴随着旋光变化，在没有其它更好的方法可用时，可考虑旋光测定法。
旋光法的 缺点 是准确度和灵敏度不高，待测物浓度至少比光吸收法要求的大 2个数量级。
酶反应过程中高比旋的蛋白质分子可能发生旋光变化，导致测定精确度下降。此外，旋光测定法操作也不甚方便，故一般少用。
3．电化学测定法这也是一类连续分析法，灵敏度和准确度都很高，可和光学方法相比；而且即使测定系统中有某些物质污染，也不会影响结果。
但是要求一定的仪器设备。
（ 1)离子选择性电极测定法最普通的是以玻璃电极测定酸度 (pH)的变化，
可用于产酸反应的测定。
此法操作简单，但有两个缺点,
一是随着反应的进行,pH不断变．酶活力也发生变化；
二是测定系统的 pH依赖于介质的缓冲能力，
蛋白质是高缓冲性物质，粗的待测样品中往往包含大量惰性蛋白，因而难以保证恒定的缓冲强度，测定结果不易准确。
(2)氧电极测定法这是极谱分析、或者说电解分析的一种应用。其 原理 是，如果给水溶液中的电极加上一定电压，那末其中的溶解物质就会在电极上进行氧化还原反应，从而产生电解电流，
测定这种电流就可以知道溶质的浓度。各种物质产生电极反应所需要加的电极电压是不同的，因此可以进行选择性测定。
(3)细电流电位测定法此法的 原理 是，如果反应的底物和产物在化学性质上不同，那末在一个细小稳定的电流下，两个极化的铂电极间电位也不同，因此测定这种电位变化的速度可代表酶反应的速度。
(4)电流测定法这种测定法是把两个电极浸入分析样品中，其间维持一恒定电压，这样反应过程中电流的变化速度将反映酶反应的速度。
四 测定
l 测定对象和一般化学反应一样，酶反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，因此在理论上二者皆可以，但是在实际上，由于在酶反应系统中，使用的底物浓度都很大，而反应时间很短，底物的减少量仅仅占总量的很小百分数，故不易准确测定，反之，产物从无到有，只要测定方法灵敏，就可以准确测定，所以还是产物分析为好。
2,测定初速度反应速度可以用单位时间内产物或底物的变化量表示。如果将测得的产物或底物变化量对时间作图，可获得酶应应进程曲线，曲线的斜率就代表酶反应速度。
真正能代表酶催化活性的是反应初始阶段的速度，即反应初速度。
大多数酶的反应进程曲线表明，在酶反应的最初阶段里，底物或产物的变化量一般随反应时间而线性地增加，反应速度恒定但是反应时间延长，这条曲线会逐渐地弯曲下来,斜率发生改变，反应速度下降。其 原因 是，底物浓度在下降，产物在增加,逆反应从无到有逐渐变得显著起来，同时酸、碱、热等也在馒慢地使酶失效。因此，这种情况下测得的反应速度已是一种表现的、多种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性。所以真正能代表酶催化活性的是反应初始阶段的速度，即反应初速度。
进程曲线可以通过连续测定得到，也可通过在间隔时间取样测定后绘制，它至少应由三个时间点组成：零时点、适当选择的时间间隔 (取决于具体的反应和测定方法 )以及二倍于这个间隔的点。并且要求在这种时间范围内反应量不超过底物总量的 20％。
3 测定要达到的要求酶活力测定的目的就是要通过酶反应速度的测定求得酶的浓度或含量，因此，测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。
要达到该测定要求，最基本的是必须测定反应初速度。
第二节 酶法分析酶法分析是一种以酶为分析工具 (或试剂 )的分析，分析的对象可以是酶的底物、辅酶、活化剂甚至酶的抑制剂。在进行这类分析时，先要根据分析对象选择适它的,工具酶,,然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来检知它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中，除了底物可以采用总变量分析法外，其它都只能用动力学分析法。
一 动力学分析法：
原理,通过条件控制，分别使底物、辅酶、活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度就需具有确定的比例关系，这样测定酶反应的速度就可求知它们的浓度。
条件,和酶活力测定的基本相同，但其所用的酶量必须一定，除了相应的被测因素的浓度应控制在限速水平以外，其它反应成份均须保证处于恒定和最适。
二 总变量分析法又称为平衡法或终点法。
原理,是根据被测物质的性质，选择适宜的
,分析工具酶,对该物质进行作用，然后在反应完成后，借助物理化学方法测其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。它仅适用于底物的测定，应用时应考虑两个问题，即工具酶的用量与反应的平衡点。
终点法操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反应于 1级反应水平。因为这样可以使反应迅速达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反应；
减少工具酶的用员。
(2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。
(3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到终点。
三 酶标免疫分析原理,酶标免疫分析是以待测抗原 (或抗体 )和游标抗体 (或抗原 )的专一结合反应为基础，然后通过酶活力测定来确定抗原 (或抗体 )含量的一类分析法。
四 酶循环分析法酶循环分析法是在上述酶分析基础上，为适应神经生化等定量测定单个神经细胞中的酶及其它微量物质的需要，通过两种相关的酶反应组合、放大而发展起来的一种超微量分析法，
它具有极高的灵敏度，可测定 10-15克分子水平的生物物质。
原理,酶循环分析法是利用在专一性上相互关联的两种酶反应相互组合、循环，
使微量的酶活性或其它物质增幅放大以达到定量测定目的的分析方法。
6.3 固定化酶在酶分析中的应用近年来，固定化酶也已开始渗入到酶分析领域，并在迅速地扩展，从而有可能使酶分析达到简便化、连续化和自动化。
一 酶 (膜 )电极酶电极主要由选择性电极感应器和复盖在上面的酶膜组成。通过酶膜层的作用使底物转化为产物，然后再通过感应器进行检测。这种转化可用一级反应动力学关系描述。
优点,酶电极检测十分简便，而且灵敏度高，因此很可能得到普及和进一步发展。
近年来不仅有了各种酶电极，还出现了各种微生物电极、多功能电极等。
二 酶管感应分析器这是将酶固定于细管内壁，样品通过细管时与管壁接触进行酶反应，然后在细管出口处偶联感应分折仪，检测流出的产物浓度，再通过动力学关系求得待测物浓度的分析装臵。
6.4 酶分析的自动化问题所谓 酶分析自动化 就是指从清洗、加样、启动反应、测定、数据记录、计算处理直至提供结果等步骤，全部由仪器自动操作。有些仪器只能做到半自动，其结果计算需由人工处理。
要使酶分析自动化就必须使酶反应拟一级化，即除了被测因素外，其它都应保证过量、最适，这样酶反应速度与被测因素成比例。
实现测定的自动化有以下几种方法：
1.初速度法
2.固定浓度法（变时法）
3.固定时间法一 初速度法这种方法就是通过分析仪器自动添加反应试剂和样品，自动控制反应和检测反应，井自动绘制酶反应过程曲线的一种半自动方法。但从反应过程曲线求出反应初速度，
并换算成被测物的浓度还要靠人工进行。
二 固定浓度法又称变时法。
当底物浓度固定时，反应速度相对底物浓度或相对酶浓度作图有一线性关系，通过分析仪器自动测定反应物或反应产物变化 (物理化学性质变化 )达到其一固定值所需要的时间就可求得被测物的浓度。
三 固定时间法对于一个酶反应，在线性范围内选取一个恰当时间进行反应的检定，此时测得的反应 (产 )物变化无疑与酶浓度 (或其它被测物 )有线性比例关系，测定上述变化就可算出被测物的浓度。
