第五章 酶和细胞的固定化第一节 固定化技术第二节 固定化酶的制备第三节 固定化酶的性质第四节 固定化酶的应用第五节 固定化细胞的应用第一节 固定化技术酶催化剂具有很多的优点,专一性强,
反应条件温和,反应速度较快 。 但是也有一些弱点,例如：
1.游离的溶液酶,在反应过程中会随着产品一起流失,这不仅造成了酶的损失,
增加了生产费用,而且随产品流出的酶又会影响产品的质量；
2.溶液酶反应后,分离困难,无法重复利用；
3.溶液酶十分脆弱,稳定性极差,往往使用不久就变性或者失去活性 。
上世纪 50年代末期,出现了固定化酶技术
（ 1953） 。
1971年第一届国际酶工程会议上,正式建议采用
,固定化酶,（ immobi－ lized enzyme） 的名称 。
固定化酶,是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以回收重复使用 。
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开；
②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；
③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；
④酶反应过程能够加以严格控制；
⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
⑤较游离酶更适合于多酶反应；
①可以增加产物的收率，提高产物的质量；
③酶的使用效率提高，成本降低。
第二节 固定化酶的制备一,制备固定化酶遵循基本原则：
（ 1） 必须注意维持酶的催化活性及专一性 。
（ 2） 固定化应该有利于生产自动化,连续化 。
（ 3） 固定化酶应有最小的空间位阻,尽可能不妨碍酶与底物的接近,以提高产品的产量 。
（ 4） 酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于重复使用 。
（ 5） 固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物,产物或反应液发生化学反应 。
（ 6） 固定化酶成本要低,以利于工业使用 。
二,酶的固定化方法酶的固定化方法很多,但对任何酶都适用的方法是没有的 。 酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类,大体可概括为四种类型：
1.吸附法； 2.共价偶联法； 3.交联法 ;
4.包埋法
1,吸附法包括 物理吸附 和 离子交换吸附法 。
(1)物理吸附法这是通过氢键、疏水键和 π -电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法,
常用的载体有高岭土、皂土、硅胶、磷酸钙胶、
氧化铝及微孔玻璃等无机吸附剂，和纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂,
特点,无机吸附剂的吸附量一般很低,常小于 1
毫克蛋白 /克吸附剂,少数情况可达 17毫克蛋白 /
克吸附剂,有机吸附剂的吸附容量通常高一些,例如,火棉胶对木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶以及葡萄糖 — 6— 磷酸脱氢酶的吸附容量可达 70毫克蛋白 /厘米 2膜 ;胶原膜对 b— β — 果糖呋喃糖苷酶、
溶菌酶、脲酶以及青霉素酰胺酶等的吸附容量可达 50毫克蛋白 /克胶原膜,无机吸附剂的另一缺点是常易使某些酶发生吸附变性,而有机吸附剂一般不会产生这种情况，故更受人们注意。
(2)离子交换吸附法这是指在适宜的 pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到酶的固定化的方法。
常用的交换剂有,CM— 纤维素,DEAE／纤维素、
DEAE— 葡聚糖凝胶等；其它还有各种合成的离子交换树脂等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，通常为 50— 150毫克蛋白／克载体。第一批商品固定化酶就是将氨基酸酰化酶吸附于
DEAE— 纤维素和吸附于 DEAE— 葡聚糖作成的。此外,DEAE— 纤维素吸附的 α — 淀粉酶、蔗糖酶也已作成商品固定化酶。
吸附法的优点,
操作简便，条件温和，吸附刘可再生反复使用。
缺点,
酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的 pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下解吸脱落。
提高吸附容量和酶与载体间的吸附力有以下几种途径：
第一,控制好吸附与操作条件，这包括选择大吸附容量的载体；合理地控制酶量与载体量，
适当地升高酶蛋白浓度；将载体进行一定的分散处理；处理好吸附容量与流体力学间的关系；
同时在整个吸附与使用过程中使用适宜的 pH、
温度和底物浓度以及较低的离子强度。
第二,是开发新的载体。例如，使用 N—
烃基琼脂糖衍生物，它们能强力地吸附等电点处于酸性区的酶，如黄嘌呤氧化酶、
脲酶等，结合牢固程度甚至可经受 1MNaClN
洗脱,因为这种吸附是借助静电力和疏水键等多种力协同发挥作用。又如近年来广泛使用的亲和吸附剂等。
第三,是根据载体性质对酶进行适当的化学修饰。 例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等可先和丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚物进行共价偶联；淀粉葡萄糖苷酶可先将它和乙烯与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚物进行共价偶联。这样修饰后得到的酶的多聚阴离子衍生物，再用
DEAE— 纤维素或 DEAE— 葡聚糖吸附，结合力可大大增强，不仅吸附容量显著升高，而且相当稳定，使用寿命也延长。如其中的淀粉葡萄糖苷酶连续使用 3个星期活性都没有明显改变。
2,共价偶联法这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基闭进行偶联以制备固定化酶的方法。
特点,由于这样得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，因此它是目前应用和报导的最多的一类方法。不过，
共价偶联反应一般比较激烈应加以注意,
(1)共价偶联的固定化载体载体直接关系到固定化酶的形成和性质。一般地说，亲水载体在蛋白的结合量、固定化酶的活力和稳定性上都优于疏水载体，而且亲水基的存在可以减轻疏水基的有害影响。
理想的载体应具有的特点,具有亲水膨润性，结构疏松；表面积大；有一定的机械强度；带有在温和条件下可和酶的侧链基团进行共价偶联反应的功能基团；
同时最好没有或者很少有非专一性吸附活性。
常用的载体有,天然高分子衍生物如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等；也有合成的高聚物如聚丙烯酰胺、
多聚氨基酸、乙烯与顺丁烯二酸酐的共聚物 — 聚苯乙烯、尼龙等；还有无机载体如多孔玻璃等。天然高分子衍生物亲水性较好，但机械性能较差；反之聚苯乙烯、尼龙和玻璃等虽有较强的机械强度，但有疏水结构的缺点。
(2)偶联反应选择什么样的偶联反应取决于载体上的功能基团与酶分子上的非必需侧链基团。常用载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基和氨基等，酶分子上可用于偶联的基团包括：
游离氨基，游离羧基、酚羟基、巯基、咪唑基和羟基等。
载体的活化：通过一定的方法，在载体上引进一个活泼基团。
方法如下,1.重氮法
2.溴化氰法
3.叠氮法
4.烷化法
(3)偶联反应中的保护措施化学偶联反应一般比较激烈，为了减少酶在偶联过程中失效，可考虑如下措施：
1.选择适宜的固定化方法与相应的载体。
2.严格控制反应条件,提高反应的专一性。
3.应用可逆抑制剂或底物封闭或牵制酶的活性中心与必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。
这样就可得到高活性的固定化酶。
(4)酶的偶联量这个问题关系到单位载体上偶联的总酶量与,相对酶活力 ’ 间的平衡。
,相对酶活力,是指固定化酶和蛋白量与之相等的原酶的活力比。
影响,相对酶活力,因素,固定化载体、方法、
条件以及酶反应系统组成 。当上述因素一定时，还受 偶联量 影响；当偶联量超过一定水平后，由于过多的酶集中于载体的局部，可能造成空间位阻效应，
使部分的酶无法表现活性，故,相对酶活力,往往随偶联酶量的进一步增加而下降。在制备固定化酶时，重要的一点就是要平衡好二者的关系，这对其它类型的固定化方法也具有同样的意义。
3.交联法这是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子与载体间、或酶分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶的方法。
交联法操作简便，但交联反应往往比较激烈，
许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。
可采用保护措施：
1.在交联反应前先用抑制剂或底物进行专一性掩护；
2.在交联反应系统中添加惰性蛋白如血清白蛋白、明胶等。
双重固定法
4 包埋法这是将聚合物的单体和酶溶液混和后，
再借助聚合促进剂 (包括交联剂 )的作用进行聚合，使酶包埋于聚合物中以达到固定化酶方法。
由于酶本身一般不参与结合反应，因而比较安全。不过在化学聚合的过程中由于自由基的产生、放热以及酶和试剂间发生化学反应等，也往往可能导致酶失效，
故在选择包埋方法和控制条件时仍须注意。
包埋法有二种类型：
格型包埋和微囊型包埋。前者是将酶分子分散包埋在聚合的胶格中；后者是将一定量的酶溶液包在半透性的微孔膜内。
这两种方法都适用于底物和产物都是小分子的酶的固定。
二 固定化细胞通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，
制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。
在固定化酶发展的同时，固定化细胞的技术也在开发，其实际应用甚至超过了固定化酶。例如日本和欧美各国最大规模的高果糖浆生产大多是采用固定化细胞的酶柱工艺。
1.微生物细胞固定化
2.植物细胞固定化
3.动物细胞固定化
4.原生质体固定化固定化细胞受到重视的主要原因是：
(1)它可以大大降低成本，省去酶的分离纯化工作，减少酶的活性损失。这对于细胞内酶与不稳定的酶来说特别有意义，而且固定化细胞的制备与使用都比固定化酶简便。
(2)固定化细胞可以作为单一的酶发挥作用，
也可利用它包含的复合酶系完成部分的代谢或发酵过程，包括那些需要辅助因子参与的合成代谢过程。
细胞固定化的方法：
1.包埋，这是固定细胞最主要的方法。
2.吸附，固定化动植物细胞的主要方式，但是难于大规模生产。
第三节 固定化酶的性质由于固定化可能对酶本身和酶所处的环境产生一定的影响，因此固定化酶和游离酶表现有所不同，掌握这些性质对有效地应用固定化酶和研究酶的生物学作用都很重要。
一,固定化对酶活性及酶反应系统的影响固定化对酶活性及酶反应系统所产生的影响十分复杂，常因酶的种类、反应系统的组成、特别是固定化方法以及固定载体而显著不同。在大多数情况下，固定化酶的活力低于相同的游离酶，但也有些固定化不引起酶活力下降，有时反应速度甚至还可能升高。
固定化对酶活性及酶反应系统的影响因素：
1 构象改变、立体屏蔽以及微扰
2 分配效应和扩散限制
1 构象改变、立体屏蔽以及微扰这些效应能直接影响酶的催化活性，它们的产生或者和固定化过程有关，或者和载体的性质有关，或者二者兼有之。
构象改变是指固定化过程中酶和载体的相互作用引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性下降的一种效应。
该效应比较难于定量描写，也比较难于预测，但通常多出现于吸附法和共价偶联法。
立体屏蔽是由于载体的孔隙太小，或是由于固定化的方式与位臵不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。
这种效应也难于定量描写，多见于包埋，
吸附法或共价偶联法。
微扰是由于载体的亲水、疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应能力的一种效应。
这种效应更难于定量描写和预见，但是通过改变载体与介质的性质可作出判断与调节。
2.分配效应和扩散限制这两种效应和微环境密切相关。所谓微环境，即是和固定化酶紧邻的微观局部环境，
它和宏观体系不同，是引入了固定化载体以后产生的新概念。
分配效应是由于固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。
扩散限制效应是指底物、产物以及其它效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。
二 固定化对酶稳定性的影响大多数酶在固定化以后，一般都有较高的稳定性和较长的有效寿命，其 原因 可能是：
(1)固定化增加了酶构型的牢固程度；
(2)阻挡了不利因素对酶的侵袭；
(3)限制了酶分子间的相互作用。
但是如果固定化触及到酶活性敏感区，也可能导致稳定性下降。
固定化酶稳定性升高表现在：
1 固定化增加酶的耐热性 ;
2 固定化增大酶对变性剂、抑制剂的抵抗力 ;
3 固定化减轻蛋白酶的破坏作用 ;
4 固定化可以延长酶的操作和保存有效期,
三,固定化酶的特性
1.最适温度受固定化方法和固定化载体的影响
2.固定化酶的最适 pH值有载体性质和产物性质决定
3.底物特异性对低分子底物作用变化不大，而对高分子底物的催化作用明显减弱。是由于载体的空间位阻引起的。
四,固定化细胞的性质,
一，固定化对酶产生的某些影响对细胞同样表现作用。例如固定化增加了它们的稳定性，而且这种稳定性的增加 (包括热稳定性及使用稳定性 )可因二价离子的存在进一步改善；某些细胞酶的稳定性还可能因抗菌素的存在而显著增加。
二，由于细胞内环境的相对恒定和细胞的,缓冲作用,,固定化对细胞内酶产生的影响在某些方面不像固定化酶那样显著。
三，固定化细胞 (内 )酶除了受固定化因素的影响外，还受细胞结构及细胞膜透性的影响。某些固定化细胞 (内 )酶在一定条件经保温处理，或经表面活性剂等试剂处理后，常会出现活性升高的现象。
第四节 固定化酶的应用固定化酶具有游离酶所没有的一些特点，它的出现使酶学展现了令人鼓舞的前景。
一,固定化酶在工农业生产上的应用这是固定化酶应用的一个主要方面。
和溶液游离酶相比，它可能发挥三方面的优越性：
第一，它能反复使用，使生产成本大大降低；同时也能为实现生产的管道化、连续化与自动化提供可能，为建立新型的酶法与化学法相结合的工艺以及酶法处理三废开辟道路。
第二，酶或细胞经过固定化以后往往会获得对有机溶剂的抵抗能力，因此它可能用于进行某些非水系统的反应。
第三，固定化细胞的发展，特别是固定化生长菌体的发展，为需要辅酶系统和多酶系统进行的反应，
某些需要通过发酵进行的生产提供了可能。
1.氨基酰化酶
2.葡萄糖异构酶
3.青霉素酰化酶
4.乳糖酶二 固定化酶在医药治疗上的应用游离酶用于治疗时有一些,致命,弱点，即游离酶注射入人体以后一般会产生三个问题：
(1)酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应；
(2)酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移出和被蛋白酶水解破坏；
(3)由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到最适治疗所需要的高浓度。
溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将药物酶固定化以后就能逐一地加以解决。
三 固定化酶在分析化学中的应用固定化酶在生化分析和临床检验中的应用是一个十分重要的领域，它的发展非常迅速。这不仅仅因为它们比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化；而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，从而可用于较复杂体系的检测。
分析化验中应用的固定化酶可大体分为两种类型：酶传感器和固定化酶柱检测器。
酶传感器：由固定化酶和能量转换器
（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结合组成的传感装臵，是生物传感器的一种。
酶电极 — 葡萄糖氧化酶电极固定化酶膜氧电极 葡萄糖氧化酶电极高分子薄膜第五节固定化细胞的应用一,固定化微生物细胞的应用二,固定化植物细胞的应用 -人工种子三,固定化动物细胞的应用 -生产疫苗四,固定化原生质体的应用一,固定化微生物细胞的应用
1、利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物；
2、微生物电极。
反应条件温和,反应速度较快 。 但是也有一些弱点,例如：
1.游离的溶液酶,在反应过程中会随着产品一起流失,这不仅造成了酶的损失,
增加了生产费用,而且随产品流出的酶又会影响产品的质量；
2.溶液酶反应后,分离困难,无法重复利用；
3.溶液酶十分脆弱,稳定性极差,往往使用不久就变性或者失去活性 。
上世纪 50年代末期,出现了固定化酶技术
（ 1953） 。
1971年第一届国际酶工程会议上,正式建议采用
,固定化酶,（ immobi－ lized enzyme） 的名称 。
固定化酶,是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以回收重复使用 。
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开；
②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；
③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；
④酶反应过程能够加以严格控制；
⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
⑤较游离酶更适合于多酶反应；
①可以增加产物的收率，提高产物的质量；
③酶的使用效率提高，成本降低。
第二节 固定化酶的制备一,制备固定化酶遵循基本原则：
（ 1） 必须注意维持酶的催化活性及专一性 。
（ 2） 固定化应该有利于生产自动化,连续化 。
（ 3） 固定化酶应有最小的空间位阻,尽可能不妨碍酶与底物的接近,以提高产品的产量 。
（ 4） 酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于重复使用 。
（ 5） 固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物,产物或反应液发生化学反应 。
（ 6） 固定化酶成本要低,以利于工业使用 。
二,酶的固定化方法酶的固定化方法很多,但对任何酶都适用的方法是没有的 。 酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类,大体可概括为四种类型：
1.吸附法； 2.共价偶联法； 3.交联法 ;
4.包埋法
1,吸附法包括 物理吸附 和 离子交换吸附法 。
(1)物理吸附法这是通过氢键、疏水键和 π -电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法,
常用的载体有高岭土、皂土、硅胶、磷酸钙胶、
氧化铝及微孔玻璃等无机吸附剂，和纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂,
特点,无机吸附剂的吸附量一般很低,常小于 1
毫克蛋白 /克吸附剂,少数情况可达 17毫克蛋白 /
克吸附剂,有机吸附剂的吸附容量通常高一些,例如,火棉胶对木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶以及葡萄糖 — 6— 磷酸脱氢酶的吸附容量可达 70毫克蛋白 /厘米 2膜 ;胶原膜对 b— β — 果糖呋喃糖苷酶、
溶菌酶、脲酶以及青霉素酰胺酶等的吸附容量可达 50毫克蛋白 /克胶原膜,无机吸附剂的另一缺点是常易使某些酶发生吸附变性,而有机吸附剂一般不会产生这种情况，故更受人们注意。
(2)离子交换吸附法这是指在适宜的 pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到酶的固定化的方法。
常用的交换剂有,CM— 纤维素,DEAE／纤维素、
DEAE— 葡聚糖凝胶等；其它还有各种合成的离子交换树脂等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，通常为 50— 150毫克蛋白／克载体。第一批商品固定化酶就是将氨基酸酰化酶吸附于
DEAE— 纤维素和吸附于 DEAE— 葡聚糖作成的。此外,DEAE— 纤维素吸附的 α — 淀粉酶、蔗糖酶也已作成商品固定化酶。
吸附法的优点,
操作简便，条件温和，吸附刘可再生反复使用。
缺点,
酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的 pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下解吸脱落。
提高吸附容量和酶与载体间的吸附力有以下几种途径：
第一,控制好吸附与操作条件，这包括选择大吸附容量的载体；合理地控制酶量与载体量，
适当地升高酶蛋白浓度；将载体进行一定的分散处理；处理好吸附容量与流体力学间的关系；
同时在整个吸附与使用过程中使用适宜的 pH、
温度和底物浓度以及较低的离子强度。
第二,是开发新的载体。例如，使用 N—
烃基琼脂糖衍生物，它们能强力地吸附等电点处于酸性区的酶，如黄嘌呤氧化酶、
脲酶等，结合牢固程度甚至可经受 1MNaClN
洗脱,因为这种吸附是借助静电力和疏水键等多种力协同发挥作用。又如近年来广泛使用的亲和吸附剂等。
第三,是根据载体性质对酶进行适当的化学修饰。 例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等可先和丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚物进行共价偶联；淀粉葡萄糖苷酶可先将它和乙烯与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚物进行共价偶联。这样修饰后得到的酶的多聚阴离子衍生物，再用
DEAE— 纤维素或 DEAE— 葡聚糖吸附，结合力可大大增强，不仅吸附容量显著升高，而且相当稳定，使用寿命也延长。如其中的淀粉葡萄糖苷酶连续使用 3个星期活性都没有明显改变。
2,共价偶联法这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基闭进行偶联以制备固定化酶的方法。
特点,由于这样得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，因此它是目前应用和报导的最多的一类方法。不过，
共价偶联反应一般比较激烈应加以注意,
(1)共价偶联的固定化载体载体直接关系到固定化酶的形成和性质。一般地说，亲水载体在蛋白的结合量、固定化酶的活力和稳定性上都优于疏水载体，而且亲水基的存在可以减轻疏水基的有害影响。
理想的载体应具有的特点,具有亲水膨润性，结构疏松；表面积大；有一定的机械强度；带有在温和条件下可和酶的侧链基团进行共价偶联反应的功能基团；
同时最好没有或者很少有非专一性吸附活性。
常用的载体有,天然高分子衍生物如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等；也有合成的高聚物如聚丙烯酰胺、
多聚氨基酸、乙烯与顺丁烯二酸酐的共聚物 — 聚苯乙烯、尼龙等；还有无机载体如多孔玻璃等。天然高分子衍生物亲水性较好，但机械性能较差；反之聚苯乙烯、尼龙和玻璃等虽有较强的机械强度，但有疏水结构的缺点。
(2)偶联反应选择什么样的偶联反应取决于载体上的功能基团与酶分子上的非必需侧链基团。常用载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基和氨基等，酶分子上可用于偶联的基团包括：
游离氨基，游离羧基、酚羟基、巯基、咪唑基和羟基等。
载体的活化：通过一定的方法，在载体上引进一个活泼基团。
方法如下,1.重氮法
2.溴化氰法
3.叠氮法
4.烷化法
(3)偶联反应中的保护措施化学偶联反应一般比较激烈，为了减少酶在偶联过程中失效，可考虑如下措施：
1.选择适宜的固定化方法与相应的载体。
2.严格控制反应条件,提高反应的专一性。
3.应用可逆抑制剂或底物封闭或牵制酶的活性中心与必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。
这样就可得到高活性的固定化酶。
(4)酶的偶联量这个问题关系到单位载体上偶联的总酶量与,相对酶活力 ’ 间的平衡。
,相对酶活力,是指固定化酶和蛋白量与之相等的原酶的活力比。
影响,相对酶活力,因素,固定化载体、方法、
条件以及酶反应系统组成 。当上述因素一定时，还受 偶联量 影响；当偶联量超过一定水平后，由于过多的酶集中于载体的局部，可能造成空间位阻效应，
使部分的酶无法表现活性，故,相对酶活力,往往随偶联酶量的进一步增加而下降。在制备固定化酶时，重要的一点就是要平衡好二者的关系，这对其它类型的固定化方法也具有同样的意义。
3.交联法这是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子与载体间、或酶分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶的方法。
交联法操作简便，但交联反应往往比较激烈，
许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。
可采用保护措施：
1.在交联反应前先用抑制剂或底物进行专一性掩护；
2.在交联反应系统中添加惰性蛋白如血清白蛋白、明胶等。
双重固定法
4 包埋法这是将聚合物的单体和酶溶液混和后，
再借助聚合促进剂 (包括交联剂 )的作用进行聚合，使酶包埋于聚合物中以达到固定化酶方法。
由于酶本身一般不参与结合反应，因而比较安全。不过在化学聚合的过程中由于自由基的产生、放热以及酶和试剂间发生化学反应等，也往往可能导致酶失效，
故在选择包埋方法和控制条件时仍须注意。
包埋法有二种类型：
格型包埋和微囊型包埋。前者是将酶分子分散包埋在聚合的胶格中；后者是将一定量的酶溶液包在半透性的微孔膜内。
这两种方法都适用于底物和产物都是小分子的酶的固定。
二 固定化细胞通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，
制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。
在固定化酶发展的同时，固定化细胞的技术也在开发，其实际应用甚至超过了固定化酶。例如日本和欧美各国最大规模的高果糖浆生产大多是采用固定化细胞的酶柱工艺。
1.微生物细胞固定化
2.植物细胞固定化
3.动物细胞固定化
4.原生质体固定化固定化细胞受到重视的主要原因是：
(1)它可以大大降低成本，省去酶的分离纯化工作，减少酶的活性损失。这对于细胞内酶与不稳定的酶来说特别有意义，而且固定化细胞的制备与使用都比固定化酶简便。
(2)固定化细胞可以作为单一的酶发挥作用，
也可利用它包含的复合酶系完成部分的代谢或发酵过程，包括那些需要辅助因子参与的合成代谢过程。
细胞固定化的方法：
1.包埋，这是固定细胞最主要的方法。
2.吸附，固定化动植物细胞的主要方式，但是难于大规模生产。
第三节 固定化酶的性质由于固定化可能对酶本身和酶所处的环境产生一定的影响，因此固定化酶和游离酶表现有所不同，掌握这些性质对有效地应用固定化酶和研究酶的生物学作用都很重要。
一,固定化对酶活性及酶反应系统的影响固定化对酶活性及酶反应系统所产生的影响十分复杂，常因酶的种类、反应系统的组成、特别是固定化方法以及固定载体而显著不同。在大多数情况下，固定化酶的活力低于相同的游离酶，但也有些固定化不引起酶活力下降，有时反应速度甚至还可能升高。
固定化对酶活性及酶反应系统的影响因素：
1 构象改变、立体屏蔽以及微扰
2 分配效应和扩散限制
1 构象改变、立体屏蔽以及微扰这些效应能直接影响酶的催化活性，它们的产生或者和固定化过程有关，或者和载体的性质有关，或者二者兼有之。
构象改变是指固定化过程中酶和载体的相互作用引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性下降的一种效应。
该效应比较难于定量描写，也比较难于预测，但通常多出现于吸附法和共价偶联法。
立体屏蔽是由于载体的孔隙太小，或是由于固定化的方式与位臵不当，给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。
这种效应也难于定量描写，多见于包埋，
吸附法或共价偶联法。
微扰是由于载体的亲水、疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应能力的一种效应。
这种效应更难于定量描写和预见，但是通过改变载体与介质的性质可作出判断与调节。
2.分配效应和扩散限制这两种效应和微环境密切相关。所谓微环境，即是和固定化酶紧邻的微观局部环境，
它和宏观体系不同，是引入了固定化载体以后产生的新概念。
分配效应是由于固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。
扩散限制效应是指底物、产物以及其它效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。
二 固定化对酶稳定性的影响大多数酶在固定化以后，一般都有较高的稳定性和较长的有效寿命，其 原因 可能是：
(1)固定化增加了酶构型的牢固程度；
(2)阻挡了不利因素对酶的侵袭；
(3)限制了酶分子间的相互作用。
但是如果固定化触及到酶活性敏感区，也可能导致稳定性下降。
固定化酶稳定性升高表现在：
1 固定化增加酶的耐热性 ;
2 固定化增大酶对变性剂、抑制剂的抵抗力 ;
3 固定化减轻蛋白酶的破坏作用 ;
4 固定化可以延长酶的操作和保存有效期,
三,固定化酶的特性
1.最适温度受固定化方法和固定化载体的影响
2.固定化酶的最适 pH值有载体性质和产物性质决定
3.底物特异性对低分子底物作用变化不大，而对高分子底物的催化作用明显减弱。是由于载体的空间位阻引起的。
四,固定化细胞的性质,
一，固定化对酶产生的某些影响对细胞同样表现作用。例如固定化增加了它们的稳定性，而且这种稳定性的增加 (包括热稳定性及使用稳定性 )可因二价离子的存在进一步改善；某些细胞酶的稳定性还可能因抗菌素的存在而显著增加。
二，由于细胞内环境的相对恒定和细胞的,缓冲作用,,固定化对细胞内酶产生的影响在某些方面不像固定化酶那样显著。
三，固定化细胞 (内 )酶除了受固定化因素的影响外，还受细胞结构及细胞膜透性的影响。某些固定化细胞 (内 )酶在一定条件经保温处理，或经表面活性剂等试剂处理后，常会出现活性升高的现象。
第四节 固定化酶的应用固定化酶具有游离酶所没有的一些特点，它的出现使酶学展现了令人鼓舞的前景。
一,固定化酶在工农业生产上的应用这是固定化酶应用的一个主要方面。
和溶液游离酶相比，它可能发挥三方面的优越性：
第一，它能反复使用，使生产成本大大降低；同时也能为实现生产的管道化、连续化与自动化提供可能，为建立新型的酶法与化学法相结合的工艺以及酶法处理三废开辟道路。
第二，酶或细胞经过固定化以后往往会获得对有机溶剂的抵抗能力，因此它可能用于进行某些非水系统的反应。
第三，固定化细胞的发展，特别是固定化生长菌体的发展，为需要辅酶系统和多酶系统进行的反应，
某些需要通过发酵进行的生产提供了可能。
1.氨基酰化酶
2.葡萄糖异构酶
3.青霉素酰化酶
4.乳糖酶二 固定化酶在医药治疗上的应用游离酶用于治疗时有一些,致命,弱点，即游离酶注射入人体以后一般会产生三个问题：
(1)酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应；
(2)酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移出和被蛋白酶水解破坏；
(3)由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到最适治疗所需要的高浓度。
溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将药物酶固定化以后就能逐一地加以解决。
三 固定化酶在分析化学中的应用固定化酶在生化分析和临床检验中的应用是一个十分重要的领域，它的发展非常迅速。这不仅仅因为它们比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化；而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，从而可用于较复杂体系的检测。
分析化验中应用的固定化酶可大体分为两种类型：酶传感器和固定化酶柱检测器。
酶传感器：由固定化酶和能量转换器
（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结合组成的传感装臵，是生物传感器的一种。
酶电极 — 葡萄糖氧化酶电极固定化酶膜氧电极 葡萄糖氧化酶电极高分子薄膜第五节固定化细胞的应用一,固定化微生物细胞的应用二,固定化植物细胞的应用 -人工种子三,固定化动物细胞的应用 -生产疫苗四,固定化原生质体的应用一,固定化微生物细胞的应用
1、利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物；
2、微生物电极。
