第八章 主要酶的制备和测定
α -淀粉酶
β -淀粉酶糖化酶蛋白酶纤维素酶果胶酶脂肪酶乳糖酶超氧化物歧化酶第一节 α -淀粉酶一,α -淀粉酶的特征
α -淀粉酶系统命名为 α -1,4葡聚糖 -4-葡聚糖水解酶（ EC.3.2.1.1），作用与淀粉与糖原时，从底物分子内部不规则的切开 α -1,4 键，而生成麦芽糖、
少量葡萄糖与一系列分子量不等的低聚糖和糊精。
α -淀粉酶是一种金属酶，每个酶分子至少含一个钙离子，多的可以达到 10个钙离子，钙维持酶分子的最大活性与稳定性。
二,α -淀粉酶的品种及其性质
1 枯草杆菌类 α -淀粉酶
2 霉菌类 α -淀粉酶
3 动植物类 α -淀粉酶
4 耐热性 α -淀粉酶
5 酸性 α -淀粉酶和碱性 α -淀粉酶三,α -淀粉酶的工业生产工业生产用的菌种有枯草杆菌 BF-7658和米曲霉 602，前者用液体深层发酵，后者适用固体发酵。
1.固体发酵
（ 1）流程 斜面菌种三角瓶种子种曲厚层通风发酵发酵烘干粗制品抽提过滤沉淀过滤烘干精制品
（ 2）米曲霉 602和 2120生产药用 α -淀粉酶
2．液体深层发酵 (BF— 7658)
3.高温酶的生产四,α -淀粉酶活力的测定（液化型淀粉酶）
1.原理 是应用消色法测定酶活力 。 淀粉被液化型淀粉酶水解 (液化 ）,切断淀粉链的 α -1,4糖苷键 。 对碘呈蓝紫色的反应逐渐消失 。 这种呈色消逝的速度可以表示液化的程度,因而能测定酶的活力 。
2．试剂团碘液：称取碘 11g,碘化钾 22g加水溶解,定容至
500mL。
标淮稀碘液：取碘原液 15mL,加碘化钾 8g用水定容到 200mL。
2％ 可溶性淀粉：称取干可溶性淀粉 2g,先以少许蒸馏水混和,再徐徐倾入煮沸蒸馏水中,继续煮沸 2
分钟,冷却,加水到 100mI。
pH6.0磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液比色稀碘液：取碘原液 2mL,加碘化钾 20g,用水定容到 500mL。
标准糊精液：称 0.3g纯糊精,悬浮于少量水中,再倾于 400mL沸水中,冷却后加水稀释到 500mL。
3.测定方法取 lmL标准糊精液置于盛有 3mI标准稀碘液的试管中,作为比较颜色的标准管 。
在 25× 200mm的试管中,加入 2％ 可溶性淀粉溶液
20mL,在 60℃ 水浴中平衡温度 4— 5分钟,加入 o.5mL
酶液,充分混合,立即记时,定时取出一滴反应液于比色板穴内,穴中先盛有比色稀碘波,当紫色逐渐转变为棕澄色,与标准比色管园色相同时即为反应 终点,记录时间即为液化时间 。
4.计算液化型淀粉酶活力单位定义,1g酶粉,在 60℃,pH值为
6.0,1h液化可溶性淀粉的克数：每小时酶促液化 1g淀粉的酶量为一 个酶的活力单位 。
第二节 β -淀粉酶一,β -淀粉酶特征该酶可以从淀粉分子非还原性末端依次水解 α - 1,4键,
不能切开 α - 1,6键,故水解支链淀粉是不完全的,在达到分枝点前 2~3个葡萄糖残基时就停止不前,而残留下大分子的界限糊精,生成的麦芽糖至多只有 50％
~60％ 。 作用于淀粉时粘度不易下降,糊精化慢 。 与碘的呈色反应只能由深蓝变浅,而不会变为紫,红和无色 。 由于该酶作用于底物时,会发生沃尔登转位反应,
使产物由 α -型 变为 β -型麦芽糖,因此被称为 β -淀粉酶 。
二,β -淀粉酶性质一些植物的 β -淀粉酶最适 pH是 5.0~6.0,微生物 β -
淀粉酶最适 pH是 6.0~7.0。 pH稳定范围：植物的为
5.0~8.0,微生物的为 4.0~9.0。
对热的稳定性因酶源不同而有差别 。 如大麦的 β -淀粉酶在 pH5.5,65℃ 水解 30min损失 50％,70℃ 水解失活 。 同样条件下,山芋粗酶在 60~65℃ 时不失活 。 大麦的 β -淀粉酶在室温和 pH4.5时酶活最高而且稳定 。 微生物 β -淀粉酶耐热性差,一般在 35~50℃ 。
钙离子对 β -淀粉酶有降低稳定性作用 。
三,β -淀粉酶 的生产植物来源的 β -淀粉酶耐热性较微生物来源的酶高,工业上使用来自山芋,麦芽,大豆的酶生产麦芽糖 。 麦麸以 1,5的加水比,在 pH6,温度 45℃ 浸泡 1h,沉渣可作饲料,上清液以硫酸铵盐析沉 淀,后道工序与微生物酶的提取一样,经干燥获得成品酶 。
四,用途
1.用于生产麦芽糖
2.用于啤酒生产外加酶糖化五,活力测定
1.麦芽糖标准曲线制作取 25mL比色管 5支,按下表顺序加入 0.3％ 麦芽糖溶液,水及 3,5-二硝基水杨酸试剂 (DNS试剂 ),混和均匀后在沸水浴中加热 5min,取出立即冷水冷却,用蒸馏水稀释至 25mL,摇匀 。 用分光光度计测定 540nm处的光密度 (OD值 )。 以麦芽糖含量 (mg)为横 坐标,OD
值为纵坐标,作标准曲线 。
2,酶样液酶粉用少量水溶解,移入合适容量的容量瓶中 。 如此重复 。 加 水至刻度,混匀,用四层纱布过滤,取清液备用 。
3,测定向试管中加入 lmL2％ 可溶性淀粉和 1mL0.1mol/l的
PH5.8的柠檬酸 — 磷酸盐缓冲液 。 于 40℃ 水浴保温 3
分钟后,再加入 1mL酶液,立即记时,混匀 。 至 3分钟加入 DNS试剂 1.5mL,混匀以杀酶 。 放入沸水中煮
5min后,立即冷却,定容至 25mL,摇匀 。 作二次平行试验 。 并作空白试验 。
用 721分光光度计测定波长 540nm处的光密度 (OD
值 )。 用 空白试验调零点 。
4,计算在本试验条件下以产生 1mg麦芽糖量为 1个酶活力单位 。
酶活力单位＝ A/3× 60× n
A— 主试验光密度值在标准曲线上对应的麦芽糖量
（ mg）
60— 将 min换算为 1h；
n— 酶的稀释倍数．
第三节 糖化酶葡萄糖淀粉酶 (EC.3.2.1.3)系统名为淀粉 α -1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,目前年产约 7万吨
(其中有近 2万吨发酵液和浓缩治 ),是国内产量最大的酶品种 。 糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开 α -1,4键,也能切开 α -1,3键和 α -1,6
键 。
糖化酶主要用途是作为淀粉糖化剂 。 糖化酶与 α -淀粉酶一起还广泛使用在谷氨酸,酒精等发酵生产,
作为淀粉原料的糖化剂,代替麦芽和液体曲 。 糖化酶还可用于 处理原棉,水解棉中的低聚糖,减少棉纤维的粘缠以利纺纱 。
一,糖化酶的工业生产
1.菌种 2.种子制备 3.发酵 4.提取 5.液体酶制剂二,糖化酶的性质糖化 酶 作用最适温度为 60℃ 。 当温度在 40一 60℃ 之间,酶作用要求 pH范围较宽,最适 pH在 4.5左右,随着 pH的升高,酶活力逐渐下降,尤其是温度超 过
60℃,醇活力下降更加明显 。 对高温 （ 60℃ ） 和极性
pH表现出不稳定 。
三,糖化酶对淀粉的糖化作用黑曲霉糖化酶糖化淀粉的最适 pH为 4.0左右,温度为
60℃ 适宜,添加 60～ 100u/g的糖化剂 。
四,糖化酶 (UV-11,3.4309黑曲霉 )活力测定
1,原理 本方法是采用次亚碘酸法进行糖化酶的活力测定,糖化型淀粉酶具有催化淀粉水解的能力,从淀粉链的非还原端开始,分解 α -I,4-糖苷键,而生成葡萄糖,反应生成的葡萄糖可用次亚碘酸法进行定量测定,以表示酶活力 。
RCHO十 I2十 3NaOH RCOONa十 2NaI十 2H2O
Na2S4O6十 2NaI 2Na2S2O3十 l2
2,试剂
2％ 可溶性淀粉液； 0.1mol/l碘液； pH4.5~4.8的 0.1
mol/l醋酸缓冲液； 0.15mol/lNaOH溶液； 3moI/l硫酸
0.05mol/l 硫 代 硫 酸 钠,称 取 13gNa2S2O3·5H2O 和
0.28Na2CO3加入煮沸过的冷蒸馏水,定容至 1L,配制一周后以重铬酸钾标定 。
3,测定方法取 2％ 淀粉液 10ml,0.1 mol/l醋酸缓冲液 10ml于 50℃
水浴中平衡,加碘液 o.5mL。 保温 10分钟,于水中煮沸
10分钟终止反应,然后用次亚碘酸法测定葡萄糖,取
5mL反应液于碘量瓶中,加 0.1mol/l碘液 5mL,滴加
0.15mol/l氢氧化钠 5m1,摇匀,于室温 20一 30℃ 暗处理,停置 15~30分钟,再加 2ml3mol/l硫酸,酸化,以
0.05mol/l硫代硫酸钠滴定,指示剂为 2％ 淀粉,终点呈无色,记录消耗的毫升数 (B),空白反应以煮沸酶液代替正常酶液 (A)。
4,计算糖化酶活力单位是每毫升酶液,于 40℃,pH4.6,1
小时水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数 。
酶 活 力 单 位 (u ／ mL)= （ A-B ） × N × 90.05 ×
1/V1× V2/V3× n
式中 A — 空白样品消耗 Na2S2O3的毫升数
B— 样品消耗 Na2S2O3的毫升效；
90.05— ImL的 Na2S2O3相当于葡葡糖毫克数,
V1— 酶液体积 (2mL)；
V2— 反应液总体积 (32mL)；
V3— 取出反应液样品的体积数 (5mL)；
n—— 酶液的稀释倍数；
N—— Na2S2O3的摩尔浓度,以配好后的浓度为准 。
5,注意糖化酶稀释到大约每毫升酶液为 50~90U为宜,本方法是测定液体的糖化酶,而固体的糖化酶 (包 括糖化曲 )
是采用费林试剂法 。
第四节 蛋白酶一,蛋白酶的分类来源 动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶最适 pH 酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶作用方式 内肽酶、外肽酶、水解蛋白质或肽的酯键、水解蛋白质或多肽的酰胺键活性中心和最适 pH相结合丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、
金属蛋白酶、酸性蛋白酶二,中性蛋白酶的生产三,活力测定
1,原理蛋白酶水解酪蛋白,其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林试剂还原,生成蓝色化合物 (钼蓝和钨蓝的混合物 ),可从蓝色的深浅测 知活力的多少 。 以比色法测定 。
2,试剂
(1)福林试剂； (2)0.4mol/l碳酸钠溶液；
(3)0.4mol/l三氯乙酸溶液； (4)缓冲液； (5)酶蛋白溶液； (6)标准 酪氨酸溶液第五节 纤维素酶一,纤维素酶的组分
(1)C1酶 。 C1酶作用于不溶性的固体表面,使形成结晶结构的纤维素键开裂,长链分子的末端部分游离 。 但对 C1酶的作用方式还有争议 。
(2)CX酶 。 亦称 β-1,4-葡聚糖酶 。 它是作用于 C1酶活化的纤维素,分解其 β-1,4-键 。
(3) β-葡萄糖苷酶 。 又称纤维二糖酶,能将纤维二糖,纤维三糖 等短链低聚糖类分解生成葡萄糖 。
二,纤维素酶的作用方式
C1-CX理论的要点是 C1酶首先作用于结晶纤维素,使其改变成可被 CX酶作用的形式； CX酶随机水解非结晶纤维素,即可溶性纤维衍生物和葡萄糖的 β-1,4-
寡聚糖； β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖 。
三,纤维素酶的性质四,纤维素酶的生产纤维素酶的生产有固体培养和液体深层发酵两种 。 生产的菌种酶活力较低,绿色木霉和拟康氏木霉是常用的菌株 。 现以拟康氏木霹的生产工艺为例：
(1)斜面培养基 。 麦芽汁培养基 (％ ),5~7Bx麦芽汁,纤维素粉 2,琼脂 2；马铃薯培养基 (％ )：马铃薯 20,纤维素粉 2,琼脂 2。
(2)固体发酵 。 固体培养基：稻草粉 100g(或稻草粉 90g
加麸皮 l0g),硫酸铵 2.5g,水 220~250mL。 在 500mL的三角瓶中装稻草培养基 15~20g。 在 30℃ 培养 3d。
(3)液体发酵 。 种子培养基 (％ )：米糠 1,麸皮 0.5,硫酸铵 0.2,磷酸二氢钾 0.1,碳酸钙 0.1,葡萄糖母液 1。 在
500mL三角瓶中装培养基 100ml,在 30℃ 摇床上培养
32h。
发酵培养基 (％ )：稻草粉 1,麸皮 0.5,硫酸铵 0.2,磷酸二氢钾 0.1,碳酸钙 0.1,葡萄糖母液 l。 按种量 6％,在
30℃ 培养 50 h。
六．纤维素酶的应用主要用途还限于作为饲料添加剂,用于制豆馅,
用于大豆脱种皮,制豆腐,生产淀粉,抽提茶叶,桔子脱囊衣,发酵工业增加产品 收率以及用于纺织和加酶洗衣粉中 。
1,饲料的添加剂
2,作为洗涤剂用酶
3,纤维素酶使织物柔软,不会造成褪色
4,应用于发酵和食品工业第六节 果胶酶一,果胶酶的分类果胶酶是水解果胶质的一群酶,至少有八种酶分别作用于果胶分子的不同位点,基本上分为解聚酶和果胶酯酶两大类,前者能 催化果胶解聚,后者能催化果胶分子中的酯水解 。
二,果胶酶的性质第七节 超氧化物歧化酶活力测定
1.原理
SOD是一种酸性蛋白,在酶分子上共价连接金属辅基,因此它对热,pH及某些理化性质表现出异常的稳定性,如离子强度非常低,即使加热到 95℃,SOD活性丧失也很少,
是迄今发现热稳定性最高的球蛋白之一 。 利用此性质将猪红血球中其他蛋白质沉淀除去,
再用 DEAE— Sephadex A— 50进行离子交换层析,因为它是弱碱性阴离子交换树脂,可吸附 SOD,然后用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱,收集具有 SOD活性的洗脱液,浓缩,冻干即可得 SOD成品 。
2,猪血 SOD制各
(1)取新鲜猪血,离心 (3000 r/min,20min)除去黄色血浆,红血球用 0.9％ NaCl洗涤二次,接着用两倍量的水搅拌溶血 0.5h。
(2)在溶血后的血液中缓慢加入 0.25倍体积的 95％ 乙醇和 0.15倍体积的氯仿,搅拌 15分钟,离心除去血红蛋白得清夜 。
(3)向清液中缓慢加入丙酮出现沉淀,离心后得沉淀 。
(4)使沉淀溶解于水,然后置恒温水浴中于 55— 65℃,
进行热处理 15min以使杂蛋白变性沉淀,离心去沉淀得清液 。 清液可再加丙酮进行第二次沉淀,离心分离得沉淀供层析用 。
(5)用 DEAE-Sephadex A-50装好层析柱,以沉淀上柱层柱,用 pH7.6,2.5~50mmol/l的磷酸缓冲液进行梯度洗脱,每 4mL收集一管,前 20管不含 SOD活性,
收集具有 SOD活性的洗脱液 。
(6)把具有 SOD活性的洗脱液超滤浓缩 (SOD分子量约为 32000),然后冷冻干燥,可得淡蓝绿色成品 。
在各制备环节测定酶 的总回收率和比活力 。 计算后将结果填入下表中 。
3.酶活力测定 （ 邻苯三酚自氧化法 ）
(1)邻苯三酚自氧化速率测定取 3支试管分别标号 0,1,2,各加入 3mL5mol/l的
Tris-HCl缓冲液 (内含 lmol/l乙二胺四乙酸二钠 ),在
25℃ 保温 15min,试管 1加入预热的 45mmol/l邻苯三酚
10μl左右,记时,速与 0号试管溶液做空白对照,用
752或 754分光光度计在 325nm处测定,4分钟内每分钟 OD值变化为 AA325邻 。
(2)SOD粗酶提取液活力测定,
在 2号试管中加入预热酶液 10μl,摇匀,再加入预热的 45mmol/l邻苯三酚 10μl计时,仍与 0号管作对照,在
325nm处 测 4min内每分钟的 OD值的变化为 AA325酶 。
(3)酶活力计算 。
酶活力定义 在 25℃ 时,1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚 自氧化速率达 50％ 时的酶量为一个活力单位 。
注意：
1)严格控制 邻苯三酚 的自氧化率在 0.07OD/min。
2)SOD对邻苯三酚自氧化抑制在 50％左右，这样测定的酶单 位才可靠。
3)邻苯三酚和被测样液的加入量采用微量进样，
只有 10μl故在整个反应系统中这个量可以忽略不计。
第八节乳糖酶一,乳糖酶概况乳糖酶学名为 β-半乳糖苷半乳糖水解酶 (EC.3.2.1.23)，
常用名为 β-半乳糖苷酶,在人体中位于小肠粘膜上皮细胞刷状缘,能水解乳糖的 β-半乳糖苷键控却不能水解除此之外含 β-半乳糖苷键的 物质 。
二,乳糖酶缺乏和乳糖不耐受迟发性乳糖没缺乏乳糖不耐受症三,乳糖不耐受问题的解决对策
1.超滤浓缩乳
2.酶法分解乳糖乳
3.酸奶
4.产品包装上标明乳糖含量
5.医用乳糖酶的研制四,乳糖酶的生产
1.菌种 酵母、大肠杆菌、米曲霉和黑曲霉等，酵母为佳,K.fragillis是高产乳糖酶的酵母菌株。
2.工厂 1.5吨发酵罐的生产流程
(1)糖蜜预处理糖蜜稀释后加入浓硫酸调 pH至 3.1~3.2,100℃ 蒸汽煮熟 1h,冷却,并加入 。 用 NaOH中和 。 调 pH至
6.6~6.8。 过滤或自然沉降,取上清液作培养基 。
(2)种子罐培养 30℃,16~18h。
(3)发酵罐培养温度 27~28℃,罐压 4900Pa,通风量 1,0.8,搅拌转速 300r／ min。
(4)破膜处理分别以各种破膜剂进行破膜处理,获得 S溶剂 (包括一些含羟基化合物,羰基化台物,强脂溶性化合物及其混合溶剂 )较好,用量 16~256μL,温度 20℃,处理时间 1min。
(5)乳糖酶的提取
(6)浓缩和干燥酶提取液 超滤酶 浓缩液 冷冻干燥粉状固体
α -淀粉酶
β -淀粉酶糖化酶蛋白酶纤维素酶果胶酶脂肪酶乳糖酶超氧化物歧化酶第一节 α -淀粉酶一,α -淀粉酶的特征
α -淀粉酶系统命名为 α -1,4葡聚糖 -4-葡聚糖水解酶（ EC.3.2.1.1），作用与淀粉与糖原时，从底物分子内部不规则的切开 α -1,4 键，而生成麦芽糖、
少量葡萄糖与一系列分子量不等的低聚糖和糊精。
α -淀粉酶是一种金属酶，每个酶分子至少含一个钙离子，多的可以达到 10个钙离子，钙维持酶分子的最大活性与稳定性。
二,α -淀粉酶的品种及其性质
1 枯草杆菌类 α -淀粉酶
2 霉菌类 α -淀粉酶
3 动植物类 α -淀粉酶
4 耐热性 α -淀粉酶
5 酸性 α -淀粉酶和碱性 α -淀粉酶三,α -淀粉酶的工业生产工业生产用的菌种有枯草杆菌 BF-7658和米曲霉 602，前者用液体深层发酵，后者适用固体发酵。
1.固体发酵
（ 1）流程 斜面菌种三角瓶种子种曲厚层通风发酵发酵烘干粗制品抽提过滤沉淀过滤烘干精制品
（ 2）米曲霉 602和 2120生产药用 α -淀粉酶
2．液体深层发酵 (BF— 7658)
3.高温酶的生产四,α -淀粉酶活力的测定（液化型淀粉酶）
1.原理 是应用消色法测定酶活力 。 淀粉被液化型淀粉酶水解 (液化 ）,切断淀粉链的 α -1,4糖苷键 。 对碘呈蓝紫色的反应逐渐消失 。 这种呈色消逝的速度可以表示液化的程度,因而能测定酶的活力 。
2．试剂团碘液：称取碘 11g,碘化钾 22g加水溶解,定容至
500mL。
标淮稀碘液：取碘原液 15mL,加碘化钾 8g用水定容到 200mL。
2％ 可溶性淀粉：称取干可溶性淀粉 2g,先以少许蒸馏水混和,再徐徐倾入煮沸蒸馏水中,继续煮沸 2
分钟,冷却,加水到 100mI。
pH6.0磷酸氢二钠 -柠檬酸缓冲液比色稀碘液：取碘原液 2mL,加碘化钾 20g,用水定容到 500mL。
标准糊精液：称 0.3g纯糊精,悬浮于少量水中,再倾于 400mL沸水中,冷却后加水稀释到 500mL。
3.测定方法取 lmL标准糊精液置于盛有 3mI标准稀碘液的试管中,作为比较颜色的标准管 。
在 25× 200mm的试管中,加入 2％ 可溶性淀粉溶液
20mL,在 60℃ 水浴中平衡温度 4— 5分钟,加入 o.5mL
酶液,充分混合,立即记时,定时取出一滴反应液于比色板穴内,穴中先盛有比色稀碘波,当紫色逐渐转变为棕澄色,与标准比色管园色相同时即为反应 终点,记录时间即为液化时间 。
4.计算液化型淀粉酶活力单位定义,1g酶粉,在 60℃,pH值为
6.0,1h液化可溶性淀粉的克数：每小时酶促液化 1g淀粉的酶量为一 个酶的活力单位 。
第二节 β -淀粉酶一,β -淀粉酶特征该酶可以从淀粉分子非还原性末端依次水解 α - 1,4键,
不能切开 α - 1,6键,故水解支链淀粉是不完全的,在达到分枝点前 2~3个葡萄糖残基时就停止不前,而残留下大分子的界限糊精,生成的麦芽糖至多只有 50％
~60％ 。 作用于淀粉时粘度不易下降,糊精化慢 。 与碘的呈色反应只能由深蓝变浅,而不会变为紫,红和无色 。 由于该酶作用于底物时,会发生沃尔登转位反应,
使产物由 α -型 变为 β -型麦芽糖,因此被称为 β -淀粉酶 。
二,β -淀粉酶性质一些植物的 β -淀粉酶最适 pH是 5.0~6.0,微生物 β -
淀粉酶最适 pH是 6.0~7.0。 pH稳定范围：植物的为
5.0~8.0,微生物的为 4.0~9.0。
对热的稳定性因酶源不同而有差别 。 如大麦的 β -淀粉酶在 pH5.5,65℃ 水解 30min损失 50％,70℃ 水解失活 。 同样条件下,山芋粗酶在 60~65℃ 时不失活 。 大麦的 β -淀粉酶在室温和 pH4.5时酶活最高而且稳定 。 微生物 β -淀粉酶耐热性差,一般在 35~50℃ 。
钙离子对 β -淀粉酶有降低稳定性作用 。
三,β -淀粉酶 的生产植物来源的 β -淀粉酶耐热性较微生物来源的酶高,工业上使用来自山芋,麦芽,大豆的酶生产麦芽糖 。 麦麸以 1,5的加水比,在 pH6,温度 45℃ 浸泡 1h,沉渣可作饲料,上清液以硫酸铵盐析沉 淀,后道工序与微生物酶的提取一样,经干燥获得成品酶 。
四,用途
1.用于生产麦芽糖
2.用于啤酒生产外加酶糖化五,活力测定
1.麦芽糖标准曲线制作取 25mL比色管 5支,按下表顺序加入 0.3％ 麦芽糖溶液,水及 3,5-二硝基水杨酸试剂 (DNS试剂 ),混和均匀后在沸水浴中加热 5min,取出立即冷水冷却,用蒸馏水稀释至 25mL,摇匀 。 用分光光度计测定 540nm处的光密度 (OD值 )。 以麦芽糖含量 (mg)为横 坐标,OD
值为纵坐标,作标准曲线 。
2,酶样液酶粉用少量水溶解,移入合适容量的容量瓶中 。 如此重复 。 加 水至刻度,混匀,用四层纱布过滤,取清液备用 。
3,测定向试管中加入 lmL2％ 可溶性淀粉和 1mL0.1mol/l的
PH5.8的柠檬酸 — 磷酸盐缓冲液 。 于 40℃ 水浴保温 3
分钟后,再加入 1mL酶液,立即记时,混匀 。 至 3分钟加入 DNS试剂 1.5mL,混匀以杀酶 。 放入沸水中煮
5min后,立即冷却,定容至 25mL,摇匀 。 作二次平行试验 。 并作空白试验 。
用 721分光光度计测定波长 540nm处的光密度 (OD
值 )。 用 空白试验调零点 。
4,计算在本试验条件下以产生 1mg麦芽糖量为 1个酶活力单位 。
酶活力单位＝ A/3× 60× n
A— 主试验光密度值在标准曲线上对应的麦芽糖量
（ mg）
60— 将 min换算为 1h；
n— 酶的稀释倍数．
第三节 糖化酶葡萄糖淀粉酶 (EC.3.2.1.3)系统名为淀粉 α -1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,目前年产约 7万吨
(其中有近 2万吨发酵液和浓缩治 ),是国内产量最大的酶品种 。 糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开 α -1,4键,也能切开 α -1,3键和 α -1,6
键 。
糖化酶主要用途是作为淀粉糖化剂 。 糖化酶与 α -淀粉酶一起还广泛使用在谷氨酸,酒精等发酵生产,
作为淀粉原料的糖化剂,代替麦芽和液体曲 。 糖化酶还可用于 处理原棉,水解棉中的低聚糖,减少棉纤维的粘缠以利纺纱 。
一,糖化酶的工业生产
1.菌种 2.种子制备 3.发酵 4.提取 5.液体酶制剂二,糖化酶的性质糖化 酶 作用最适温度为 60℃ 。 当温度在 40一 60℃ 之间,酶作用要求 pH范围较宽,最适 pH在 4.5左右,随着 pH的升高,酶活力逐渐下降,尤其是温度超 过
60℃,醇活力下降更加明显 。 对高温 （ 60℃ ） 和极性
pH表现出不稳定 。
三,糖化酶对淀粉的糖化作用黑曲霉糖化酶糖化淀粉的最适 pH为 4.0左右,温度为
60℃ 适宜,添加 60～ 100u/g的糖化剂 。
四,糖化酶 (UV-11,3.4309黑曲霉 )活力测定
1,原理 本方法是采用次亚碘酸法进行糖化酶的活力测定,糖化型淀粉酶具有催化淀粉水解的能力,从淀粉链的非还原端开始,分解 α -I,4-糖苷键,而生成葡萄糖,反应生成的葡萄糖可用次亚碘酸法进行定量测定,以表示酶活力 。
RCHO十 I2十 3NaOH RCOONa十 2NaI十 2H2O
Na2S4O6十 2NaI 2Na2S2O3十 l2
2,试剂
2％ 可溶性淀粉液； 0.1mol/l碘液； pH4.5~4.8的 0.1
mol/l醋酸缓冲液； 0.15mol/lNaOH溶液； 3moI/l硫酸
0.05mol/l 硫 代 硫 酸 钠,称 取 13gNa2S2O3·5H2O 和
0.28Na2CO3加入煮沸过的冷蒸馏水,定容至 1L,配制一周后以重铬酸钾标定 。
3,测定方法取 2％ 淀粉液 10ml,0.1 mol/l醋酸缓冲液 10ml于 50℃
水浴中平衡,加碘液 o.5mL。 保温 10分钟,于水中煮沸
10分钟终止反应,然后用次亚碘酸法测定葡萄糖,取
5mL反应液于碘量瓶中,加 0.1mol/l碘液 5mL,滴加
0.15mol/l氢氧化钠 5m1,摇匀,于室温 20一 30℃ 暗处理,停置 15~30分钟,再加 2ml3mol/l硫酸,酸化,以
0.05mol/l硫代硫酸钠滴定,指示剂为 2％ 淀粉,终点呈无色,记录消耗的毫升数 (B),空白反应以煮沸酶液代替正常酶液 (A)。
4,计算糖化酶活力单位是每毫升酶液,于 40℃,pH4.6,1
小时水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数 。
酶 活 力 单 位 (u ／ mL)= （ A-B ） × N × 90.05 ×
1/V1× V2/V3× n
式中 A — 空白样品消耗 Na2S2O3的毫升数
B— 样品消耗 Na2S2O3的毫升效；
90.05— ImL的 Na2S2O3相当于葡葡糖毫克数,
V1— 酶液体积 (2mL)；
V2— 反应液总体积 (32mL)；
V3— 取出反应液样品的体积数 (5mL)；
n—— 酶液的稀释倍数；
N—— Na2S2O3的摩尔浓度,以配好后的浓度为准 。
5,注意糖化酶稀释到大约每毫升酶液为 50~90U为宜,本方法是测定液体的糖化酶,而固体的糖化酶 (包 括糖化曲 )
是采用费林试剂法 。
第四节 蛋白酶一,蛋白酶的分类来源 动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶最适 pH 酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶作用方式 内肽酶、外肽酶、水解蛋白质或肽的酯键、水解蛋白质或多肽的酰胺键活性中心和最适 pH相结合丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、
金属蛋白酶、酸性蛋白酶二,中性蛋白酶的生产三,活力测定
1,原理蛋白酶水解酪蛋白,其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林试剂还原,生成蓝色化合物 (钼蓝和钨蓝的混合物 ),可从蓝色的深浅测 知活力的多少 。 以比色法测定 。
2,试剂
(1)福林试剂； (2)0.4mol/l碳酸钠溶液；
(3)0.4mol/l三氯乙酸溶液； (4)缓冲液； (5)酶蛋白溶液； (6)标准 酪氨酸溶液第五节 纤维素酶一,纤维素酶的组分
(1)C1酶 。 C1酶作用于不溶性的固体表面,使形成结晶结构的纤维素键开裂,长链分子的末端部分游离 。 但对 C1酶的作用方式还有争议 。
(2)CX酶 。 亦称 β-1,4-葡聚糖酶 。 它是作用于 C1酶活化的纤维素,分解其 β-1,4-键 。
(3) β-葡萄糖苷酶 。 又称纤维二糖酶,能将纤维二糖,纤维三糖 等短链低聚糖类分解生成葡萄糖 。
二,纤维素酶的作用方式
C1-CX理论的要点是 C1酶首先作用于结晶纤维素,使其改变成可被 CX酶作用的形式； CX酶随机水解非结晶纤维素,即可溶性纤维衍生物和葡萄糖的 β-1,4-
寡聚糖； β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖 。
三,纤维素酶的性质四,纤维素酶的生产纤维素酶的生产有固体培养和液体深层发酵两种 。 生产的菌种酶活力较低,绿色木霉和拟康氏木霉是常用的菌株 。 现以拟康氏木霹的生产工艺为例：
(1)斜面培养基 。 麦芽汁培养基 (％ ),5~7Bx麦芽汁,纤维素粉 2,琼脂 2；马铃薯培养基 (％ )：马铃薯 20,纤维素粉 2,琼脂 2。
(2)固体发酵 。 固体培养基：稻草粉 100g(或稻草粉 90g
加麸皮 l0g),硫酸铵 2.5g,水 220~250mL。 在 500mL的三角瓶中装稻草培养基 15~20g。 在 30℃ 培养 3d。
(3)液体发酵 。 种子培养基 (％ )：米糠 1,麸皮 0.5,硫酸铵 0.2,磷酸二氢钾 0.1,碳酸钙 0.1,葡萄糖母液 1。 在
500mL三角瓶中装培养基 100ml,在 30℃ 摇床上培养
32h。
发酵培养基 (％ )：稻草粉 1,麸皮 0.5,硫酸铵 0.2,磷酸二氢钾 0.1,碳酸钙 0.1,葡萄糖母液 l。 按种量 6％,在
30℃ 培养 50 h。
六．纤维素酶的应用主要用途还限于作为饲料添加剂,用于制豆馅,
用于大豆脱种皮,制豆腐,生产淀粉,抽提茶叶,桔子脱囊衣,发酵工业增加产品 收率以及用于纺织和加酶洗衣粉中 。
1,饲料的添加剂
2,作为洗涤剂用酶
3,纤维素酶使织物柔软,不会造成褪色
4,应用于发酵和食品工业第六节 果胶酶一,果胶酶的分类果胶酶是水解果胶质的一群酶,至少有八种酶分别作用于果胶分子的不同位点,基本上分为解聚酶和果胶酯酶两大类,前者能 催化果胶解聚,后者能催化果胶分子中的酯水解 。
二,果胶酶的性质第七节 超氧化物歧化酶活力测定
1.原理
SOD是一种酸性蛋白,在酶分子上共价连接金属辅基,因此它对热,pH及某些理化性质表现出异常的稳定性,如离子强度非常低,即使加热到 95℃,SOD活性丧失也很少,
是迄今发现热稳定性最高的球蛋白之一 。 利用此性质将猪红血球中其他蛋白质沉淀除去,
再用 DEAE— Sephadex A— 50进行离子交换层析,因为它是弱碱性阴离子交换树脂,可吸附 SOD,然后用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱,收集具有 SOD活性的洗脱液,浓缩,冻干即可得 SOD成品 。
2,猪血 SOD制各
(1)取新鲜猪血,离心 (3000 r/min,20min)除去黄色血浆,红血球用 0.9％ NaCl洗涤二次,接着用两倍量的水搅拌溶血 0.5h。
(2)在溶血后的血液中缓慢加入 0.25倍体积的 95％ 乙醇和 0.15倍体积的氯仿,搅拌 15分钟,离心除去血红蛋白得清夜 。
(3)向清液中缓慢加入丙酮出现沉淀,离心后得沉淀 。
(4)使沉淀溶解于水,然后置恒温水浴中于 55— 65℃,
进行热处理 15min以使杂蛋白变性沉淀,离心去沉淀得清液 。 清液可再加丙酮进行第二次沉淀,离心分离得沉淀供层析用 。
(5)用 DEAE-Sephadex A-50装好层析柱,以沉淀上柱层柱,用 pH7.6,2.5~50mmol/l的磷酸缓冲液进行梯度洗脱,每 4mL收集一管,前 20管不含 SOD活性,
收集具有 SOD活性的洗脱液 。
(6)把具有 SOD活性的洗脱液超滤浓缩 (SOD分子量约为 32000),然后冷冻干燥,可得淡蓝绿色成品 。
在各制备环节测定酶 的总回收率和比活力 。 计算后将结果填入下表中 。
3.酶活力测定 （ 邻苯三酚自氧化法 ）
(1)邻苯三酚自氧化速率测定取 3支试管分别标号 0,1,2,各加入 3mL5mol/l的
Tris-HCl缓冲液 (内含 lmol/l乙二胺四乙酸二钠 ),在
25℃ 保温 15min,试管 1加入预热的 45mmol/l邻苯三酚
10μl左右,记时,速与 0号试管溶液做空白对照,用
752或 754分光光度计在 325nm处测定,4分钟内每分钟 OD值变化为 AA325邻 。
(2)SOD粗酶提取液活力测定,
在 2号试管中加入预热酶液 10μl,摇匀,再加入预热的 45mmol/l邻苯三酚 10μl计时,仍与 0号管作对照,在
325nm处 测 4min内每分钟的 OD值的变化为 AA325酶 。
(3)酶活力计算 。
酶活力定义 在 25℃ 时,1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚 自氧化速率达 50％ 时的酶量为一个活力单位 。
注意：
1)严格控制 邻苯三酚 的自氧化率在 0.07OD/min。
2)SOD对邻苯三酚自氧化抑制在 50％左右，这样测定的酶单 位才可靠。
3)邻苯三酚和被测样液的加入量采用微量进样，
只有 10μl故在整个反应系统中这个量可以忽略不计。
第八节乳糖酶一,乳糖酶概况乳糖酶学名为 β-半乳糖苷半乳糖水解酶 (EC.3.2.1.23)，
常用名为 β-半乳糖苷酶,在人体中位于小肠粘膜上皮细胞刷状缘,能水解乳糖的 β-半乳糖苷键控却不能水解除此之外含 β-半乳糖苷键的 物质 。
二,乳糖酶缺乏和乳糖不耐受迟发性乳糖没缺乏乳糖不耐受症三,乳糖不耐受问题的解决对策
1.超滤浓缩乳
2.酶法分解乳糖乳
3.酸奶
4.产品包装上标明乳糖含量
5.医用乳糖酶的研制四,乳糖酶的生产
1.菌种 酵母、大肠杆菌、米曲霉和黑曲霉等，酵母为佳,K.fragillis是高产乳糖酶的酵母菌株。
2.工厂 1.5吨发酵罐的生产流程
(1)糖蜜预处理糖蜜稀释后加入浓硫酸调 pH至 3.1~3.2,100℃ 蒸汽煮熟 1h,冷却,并加入 。 用 NaOH中和 。 调 pH至
6.6~6.8。 过滤或自然沉降,取上清液作培养基 。
(2)种子罐培养 30℃,16~18h。
(3)发酵罐培养温度 27~28℃,罐压 4900Pa,通风量 1,0.8,搅拌转速 300r／ min。
(4)破膜处理分别以各种破膜剂进行破膜处理,获得 S溶剂 (包括一些含羟基化合物,羰基化台物,强脂溶性化合物及其混合溶剂 )较好,用量 16~256μL,温度 20℃,处理时间 1min。
(5)乳糖酶的提取
(6)浓缩和干燥酶提取液 超滤酶 浓缩液 冷冻干燥粉状固体
