Chapter 3
The Extraction,Separation
and Purification of Enzyme
酶的分离纯化
制作：郑穗平
Contents of chapter 3
1、酶的提取与分离纯化技术路线
2、细胞破碎
3、酶的提取
4、酶的分离方法
Go
Go
Go
Go
5、酶的组合分离纯化策略 Go
6,酶的浓缩、干燥与结晶 Go
细胞结构与酶分布
3.1 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存
动物、植物或微生物细胞
发酵液
离心分离，过滤分离，沉淀分
离，层析分离，电泳分离，萃
取分离，结晶分离等。
酶 的纯化过程，约可分为
三 个阶段,
(1) 粗 蛋白质 (crude
protein),采样 → 均 质
打破细胞 → 抽出全蛋白，
多使用 盐 析 沉淀 法 ；可
以粗略去除蛋白质以外的
物质。
(2) 部分纯化
(partially purified),
初步的纯化，使用各钟
柱 层 析法 。
(3) 均 质酶
(homogeneous),目标酶
的 进 一步精制纯化，可用
制备 式 电泳 或 HPLC。
酶分离纯化不同阶段
本章
目录
3.2 细胞破碎
许多酶存在于细胞内。
为了提取这些胞内酶，
首先需要对细胞进行破
碎处理。
1）机械破碎
2）物理破碎
3）化学破碎
4）酶解破碎
JY92-II D超声波
细胞粉碎机
细
胞
破
碎
珠
高
压
细
胞
破
碎
机
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
机械破碎
捣碎法
研磨法
匀浆法
物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法
超声波破碎法
化学破碎
有机溶剂,
甲苯、丙酮
丁醇、氯仿
表面活性剂,
Triton,Tween
酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法
通过机械运动产生的剪切
力，使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用，
使组织、细胞的外层结构破
坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞
膜的作用，而使细胞破碎
通过细胞本身的酶系或外
加酶制剂的催化作用，使
细胞外层结构受到破坏，
而达到细胞破碎
细胞破碎方法及其原理
本章
目录
? 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，
使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。
? 酶提取时首先应根据 酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂 。一般说
来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶
剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
? 酶都能溶解于水，通常可用 水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,
有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
3.3 酶的提取
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓
度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注
意控制好温度,pH值等提取条件。
酶的主要提取方法
提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象
盐溶液提取 0.02～ 0.5mol/L的盐溶
液
用于提取在低浓度盐溶液中溶解度
较大的酶
酸溶液提取 PH2～ 6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，
且稳定性较好的酶
碱溶液提取 PH8～ 12的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且
稳定性较好的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或含
有较多非极性基团的酶
大多数蛋白类酶都溶于水，而
且在低浓度的盐存在的条件下，
酶的溶解度随盐浓度的升高而
增加，这称为 盐溶现象 。 本章
目录
3.4 酶的分离方法
1、沉淀分离
2、离心分离
3、过滤与膜分离
4、层析分离
Go
Go
Go
Go
5、电泳分离 Go
6、萃取分离 Go
本章
目录
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的 溶解度
降低,而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 分离原理
盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在
酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从
而使酶与杂质分离
等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有
不同的等电点这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析
出，从而使酶与杂质分离
有机溶剂沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的
某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离
复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使
酶与杂质分离
选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需
的酶，从而使酶与杂质分离
在盐浓度达到某一界限
后，酶的溶解度随盐浓
度升高而降低，这称为
盐析现象 。
在一定的温度和 pH值条件下（ β 为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋
白质分离的方法称为 Ks分段盐析 ；而在一定的盐和离子强度的条件下（ KsI为常数），
通过改变温度和 pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为 β 分段盐析 。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、
氯化钠和磷酸钠等。其中 以硫酸铵最为常用 。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而
且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行
盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其
它中性盐进行盐析。
在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以 饱和度 表示。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使
溶液的介电常数降低。例如,20℃ 时水的介电常数为 80，而 82％乙
醇水溶液的介电常数为 40。 溶液的介电常数降低，就使溶质分子
间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜
的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破
坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
本节
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2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、
不同密度的物质分离的技术过程。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的 颗粒大小、密
度和特性的不同,选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在 8000 r/min以内，相对离心力
（ RCF）在 1× 104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞
碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
高速离心机 的最大转速为（ 1～ 2.5） × 104 r/min,相对离心力达到
1× 104～ 1× 105 g,在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的
分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速
离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。
超速离心机 的最大转速达 (2.5～ 12)× 104 r/min，相对离心力可以高达
5× 105 g甚至更高。超速离心主要用于 DNA,RNA、蛋白质等生物大分
子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分
子质量的测定等。
超速离心机按照其用途可以分为 制备
用超速离心机, 分析用超速离心机 和
分析 -制备两用超速离心机 3种
蛋白质 分子在 离心 時，
其 分子量、分子密度,
组成, 形 状 等，均 会影
响 其沉降速率,沉降係
系数 即用來描述此沉降
性质 ； 其 单位为 S
(Svedberg unit)。
每一 种 的沉降 系数与 其
分子密度或分子量成正
比。 不同沉降 系数 的 蛋
白质,可利用超高速 离
心 法，在密度梯度中作
分離。
本节
目录
3、过滤与膜分离
过滤是借助于 过滤介质 将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金
属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。
过滤
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质
膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
过滤的分类及其特性
(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 )
类别 截留颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质
粗滤 > 2μ m 酵母、霉菌、动物细胞、
植物细胞、固形物等
滤纸、滤布、纤维
多孔陶瓷、烧结金
属等
微滤 0.2～ 2μ m 细菌、灰尘等 微滤膜、微孔陶瓷
超滤 20?～ 0.2μ m 病毒、生物大分子等 超滤膜
反渗透 < 20? 生物小分子、盐、离子 反渗透膜
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状
和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技
术。膜分离所使用的薄膜主要是由 丙烯腈, 醋酸纤维素, 赛
璐玢 以及 尼龙 等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以
采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小
于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截
留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
膜分离
加压膜分离
微滤
超滤
反渗透
电场膜分离 电渗析 离子交换膜电渗析
扩散膜分离 透析
根据膜材料和不同进料液的特性，商品应
用的膜产品通常采取如下几种结构形式：
管式；中空纤维；卷式；平板式。
膜技
术
截留物尺寸 nm
（分子量）
推动力
分离机理
微滤
MF
>20 (>40,000)
压力差，
>100kPa
筛分
超滤
UF
1～ 20 (10,000--40,000)
压力差，
>100kPa
筛分
纳滤
NF
>1 (100～ 1000)
压力差，
<1000kPa
优先吸附、表面
电位
反渗
透 RO
(>100)
压力差，
>1000kPa
优先吸附、溶解
扩散
四种常用膜分离技术的基本特征
四种常用膜分离过程的截留特性
本节
目录
4、层析分离
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是 利
用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同
程度分布在两个相中，其中一个相为固定的 (称为固定相 )，
另一个相则流过此固定相 (称为流动相 )并使各组分以不同速
度移动，从而达到分离 。
层析分离方法
层析方法 分离依据
吸附层析 利用吸附剂对不同物质的 吸附力 不同而使混合物中
各组分分离
分配层析 利用各组分在两相中的 分配系数 不同，而使各组分
分离
离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各
种离子的 亲和力 不同而达到分离目的
凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种
组分的 相对分子质量 不同而达到物质分离
亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的 专一而又可逆的
亲和力,使生物分子分离纯化
层析聚焦 将酶等两性物质的 等电点特性 与离子交换层析的特
性结合在一起，实现组分分离
吸附层析是利用吸附剂对不同物质的
吸附力不同而使混合物中各组分分离
的方法。吸附层析是各种层析技术中
应用最早的技术。吸附剂来源丰富、
价格低廉、可再生，吸附设备简单。
吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂
装在吸附柱中，装置成 吸附层析柱 。
层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，
当样品液全部进入吸附层析柱后，再加
入洗脱剂解吸洗脱。
在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸
附、再解吸、再吸附的过程。
溶剂洗脱法
置换洗脱法
前缘洗脱法
分配层析
分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分
分离的方法。
分配系数 是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡
时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，
层析系数是一常数。
在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅
藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为 固定相,这种溶剂在层析过
程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶
的溶剂可沿着固定相流动，称为 流动相 。当某溶质在流动相的
带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。
纸上层析
分配薄层层析
分配气相层析
离子交换层析是利用离子交换剂
上的 可解离基团（活性基团）对
各种离子的亲和力不同而达到分
离 目的的一种层析分离方法。
离子交换剂 是含有若干活性基团
的不溶性高分子物质。通过在不
溶性高分子物质（母体）上引入
若干可解离基团（活性基团）而
制成。
按活性基团的性质不同，离子交
换剂可以分为 阳离子交换剂 和 阴
离子交换剂 。由于酶分子具有两
性性质，所以可用阳离子交换剂，
也可用阴离子交换剂进行酶的分
离纯化。
凝胶层析又称为 凝胶过滤, 分子排阻层
析, 分子筛层析 等。是指以各种多孔凝
胶为固定相，利用流动相中所含各种组
分的相对分子质量不同而达到物质分离
的一种层析技术。
凝胶层析柱中装有 多孔凝胶,当含有各
种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，
大分子物质由于分子直径大，不能进入
凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间
隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小
的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进
出于一个个颗粒的微孔内外，这就使 小
分子物质向下移动的速度比大分子的速
度慢，从而使混合溶液中各组分按照相
对分子质量由大到小的顺序先后流出层
析柱，而达到分离的目的 。
常用的凝胶,
葡聚糖凝胶
琼脂凝胶与琼脂糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
亲和层析是利用生物分子与配基之间
所具有的专一而又可逆的亲和力，而
使生物分子分离纯化的技术。
酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅
助因子,抗原与抗体, 酶 RNA与互补的
RNA分子或片段,RNA与互补的 DNA分子
或片段 等之间,都是具有专一而又可
逆亲和力的生物分子对。故此,亲和
层析在酶的分离纯化中有重要应用,
亲和层析的四个要素
常用的亲和介质及专一性配体
根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为,
共价亲和层析
疏水层析
金属离子亲和层析
免疫亲和层析
染料亲和层析
凝集素亲和层析
疏水层析与反相层析的基本原理
本节
目录
5、电泳分离
带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移
动的过程称为电泳。
电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为,
纸电泳
薄层电泳
薄膜电泳
凝胶电泳
自由电泳
等电聚焦电泳
颗粒在电场中的移动速度主要决定于其 本身
所带的净电荷量,同时受 颗粒形状 和 颗粒大
小 的影响。此外，还受到 电场强度, 溶液
pH值, 离子强度 及 支持体的特性 等外界条
件的影响。
制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc-PAGE 进行，以便回收
具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不
佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。
本节
目录
6、萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技
术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也
可采用其它流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为,
有机溶剂萃取
双水相萃取
超临界萃取
反胶束萃取
各种双水相系统
聚合物 P 聚合物 Q或盐
聚丙二醇 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，
聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡
聚糖
聚乙二醇 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖
甲基纤维素 羟甲基葡聚糖，葡聚糖
乙基羟乙基纤维素 葡聚糖
羟丙基葡聚糖 葡聚糖
聚蔗糖 葡聚糖
聚乙二醇 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，
酒石酸钾钠
某些超临界流体的超临界点和超临界密度
流体名称 临界温度 (℃) 临界压力
(Mpa)
临界密度
（ g/ml）
乙烷 C2H6 32.3 4.88 0.203
丙烷 C3H8 96.9 4.26 0.220
丁烷 C4H10 152.0 3.80 0.228
戊烷 C5H12 296.7 3.28 0.232
乙烯 C2H4 9.9 5.12 0.227
氨 NH3 132.4 11.28 0.236
二氧化碳 CO2 31.1 7.38 0.46
二氧化硫 SO2 157.6 7.88 0.525
水 H2O 374.3 22.11 0.326
笑气 N2O 36.5 7.17 0.451
氟里昂 C 28.8 3.90 0.578 本节
目录
3.5 酶的组合分离纯化策略
Resolution（分辨率）
Speed（速度） Capacity（容量）
Recovery（回收率）
设计分离纯化工艺的基本要求
本章
目录
3.6 酶的浓缩、干燥与结晶
浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分
离纯化过程中是一个重要的环节。
离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓
缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去
水分，也可以达到浓缩效果。
蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸
发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容
易变性失活，故酶液的浓缩通常采用 真空浓缩 。即在一定的真
空条件下，使酶液在 60℃ 以下进行浓缩。
在固体酶制剂的生产过程
中，为了提高酶的稳定性，
便于保存、运输和使用，
一般都必须进行干燥。常
用的干燥方法有,
真空干燥
冷冻干燥
喷雾干燥
气流干燥
吸附干燥
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分
离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了
适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。
酶在结晶之前,酶液必须经过纯化达到一定的纯度 。如果酶液
纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在 50%以上，方
能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。
要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在
纯度达到 50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也
无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相
当的纯度而已。
盐析结晶
有机溶剂结晶
透析平衡结晶
等电点结晶
本章
目录
The Extraction,Separation
and Purification of Enzyme
酶的分离纯化
制作：郑穗平
Contents of chapter 3
1、酶的提取与分离纯化技术路线
2、细胞破碎
3、酶的提取
4、酶的分离方法
Go
Go
Go
Go
5、酶的组合分离纯化策略 Go
6,酶的浓缩、干燥与结晶 Go
细胞结构与酶分布
3.1 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存
动物、植物或微生物细胞
发酵液
离心分离，过滤分离，沉淀分
离，层析分离，电泳分离，萃
取分离，结晶分离等。
酶 的纯化过程，约可分为
三 个阶段,
(1) 粗 蛋白质 (crude
protein),采样 → 均 质
打破细胞 → 抽出全蛋白，
多使用 盐 析 沉淀 法 ；可
以粗略去除蛋白质以外的
物质。
(2) 部分纯化
(partially purified),
初步的纯化，使用各钟
柱 层 析法 。
(3) 均 质酶
(homogeneous),目标酶
的 进 一步精制纯化，可用
制备 式 电泳 或 HPLC。
酶分离纯化不同阶段
本章
目录
3.2 细胞破碎
许多酶存在于细胞内。
为了提取这些胞内酶，
首先需要对细胞进行破
碎处理。
1）机械破碎
2）物理破碎
3）化学破碎
4）酶解破碎
JY92-II D超声波
细胞粉碎机
细
胞
破
碎
珠
高
压
细
胞
破
碎
机
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
机械破碎
捣碎法
研磨法
匀浆法
物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法
超声波破碎法
化学破碎
有机溶剂,
甲苯、丙酮
丁醇、氯仿
表面活性剂,
Triton,Tween
酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法
通过机械运动产生的剪切
力，使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用，
使组织、细胞的外层结构破
坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞
膜的作用，而使细胞破碎
通过细胞本身的酶系或外
加酶制剂的催化作用，使
细胞外层结构受到破坏，
而达到细胞破碎
细胞破碎方法及其原理
本章
目录
? 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，
使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。
? 酶提取时首先应根据 酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂 。一般说
来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶
剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
? 酶都能溶解于水，通常可用 水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,
有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
3.3 酶的提取
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓
度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注
意控制好温度,pH值等提取条件。
酶的主要提取方法
提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象
盐溶液提取 0.02～ 0.5mol/L的盐溶
液
用于提取在低浓度盐溶液中溶解度
较大的酶
酸溶液提取 PH2～ 6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，
且稳定性较好的酶
碱溶液提取 PH8～ 12的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且
稳定性较好的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或含
有较多非极性基团的酶
大多数蛋白类酶都溶于水，而
且在低浓度的盐存在的条件下，
酶的溶解度随盐浓度的升高而
增加，这称为 盐溶现象 。 本章
目录
3.4 酶的分离方法
1、沉淀分离
2、离心分离
3、过滤与膜分离
4、层析分离
Go
Go
Go
Go
5、电泳分离 Go
6、萃取分离 Go
本章
目录
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的 溶解度
降低,而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 分离原理
盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在
酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从
而使酶与杂质分离
等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有
不同的等电点这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析
出，从而使酶与杂质分离
有机溶剂沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的
某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离
复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使
酶与杂质分离
选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需
的酶，从而使酶与杂质分离
在盐浓度达到某一界限
后，酶的溶解度随盐浓
度升高而降低，这称为
盐析现象 。
在一定的温度和 pH值条件下（ β 为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋
白质分离的方法称为 Ks分段盐析 ；而在一定的盐和离子强度的条件下（ KsI为常数），
通过改变温度和 pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为 β 分段盐析 。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、
氯化钠和磷酸钠等。其中 以硫酸铵最为常用 。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而
且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行
盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其
它中性盐进行盐析。
在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以 饱和度 表示。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使
溶液的介电常数降低。例如,20℃ 时水的介电常数为 80，而 82％乙
醇水溶液的介电常数为 40。 溶液的介电常数降低，就使溶质分子
间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜
的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破
坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
本节
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2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、
不同密度的物质分离的技术过程。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的 颗粒大小、密
度和特性的不同,选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在 8000 r/min以内，相对离心力
（ RCF）在 1× 104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞
碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
高速离心机 的最大转速为（ 1～ 2.5） × 104 r/min,相对离心力达到
1× 104～ 1× 105 g,在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的
分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速
离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。
超速离心机 的最大转速达 (2.5～ 12)× 104 r/min，相对离心力可以高达
5× 105 g甚至更高。超速离心主要用于 DNA,RNA、蛋白质等生物大分
子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分
子质量的测定等。
超速离心机按照其用途可以分为 制备
用超速离心机, 分析用超速离心机 和
分析 -制备两用超速离心机 3种
蛋白质 分子在 离心 時，
其 分子量、分子密度,
组成, 形 状 等，均 会影
响 其沉降速率,沉降係
系数 即用來描述此沉降
性质 ； 其 单位为 S
(Svedberg unit)。
每一 种 的沉降 系数与 其
分子密度或分子量成正
比。 不同沉降 系数 的 蛋
白质,可利用超高速 离
心 法，在密度梯度中作
分離。
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3、过滤与膜分离
过滤是借助于 过滤介质 将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金
属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。
过滤
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质
膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
过滤的分类及其特性
(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 )
类别 截留颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质
粗滤 > 2μ m 酵母、霉菌、动物细胞、
植物细胞、固形物等
滤纸、滤布、纤维
多孔陶瓷、烧结金
属等
微滤 0.2～ 2μ m 细菌、灰尘等 微滤膜、微孔陶瓷
超滤 20?～ 0.2μ m 病毒、生物大分子等 超滤膜
反渗透 < 20? 生物小分子、盐、离子 反渗透膜
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状
和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技
术。膜分离所使用的薄膜主要是由 丙烯腈, 醋酸纤维素, 赛
璐玢 以及 尼龙 等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以
采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小
于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截
留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
膜分离
加压膜分离
微滤
超滤
反渗透
电场膜分离 电渗析 离子交换膜电渗析
扩散膜分离 透析
根据膜材料和不同进料液的特性，商品应
用的膜产品通常采取如下几种结构形式：
管式；中空纤维；卷式；平板式。
膜技
术
截留物尺寸 nm
（分子量）
推动力
分离机理
微滤
MF
>20 (>40,000)
压力差，
>100kPa
筛分
超滤
UF
1～ 20 (10,000--40,000)
压力差，
>100kPa
筛分
纳滤
NF
>1 (100～ 1000)
压力差，
<1000kPa
优先吸附、表面
电位
反渗
透 RO
(>100)
压力差，
>1000kPa
优先吸附、溶解
扩散
四种常用膜分离技术的基本特征
四种常用膜分离过程的截留特性
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4、层析分离
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是 利
用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同
程度分布在两个相中，其中一个相为固定的 (称为固定相 )，
另一个相则流过此固定相 (称为流动相 )并使各组分以不同速
度移动，从而达到分离 。
层析分离方法
层析方法 分离依据
吸附层析 利用吸附剂对不同物质的 吸附力 不同而使混合物中
各组分分离
分配层析 利用各组分在两相中的 分配系数 不同，而使各组分
分离
离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各
种离子的 亲和力 不同而达到分离目的
凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种
组分的 相对分子质量 不同而达到物质分离
亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的 专一而又可逆的
亲和力,使生物分子分离纯化
层析聚焦 将酶等两性物质的 等电点特性 与离子交换层析的特
性结合在一起，实现组分分离
吸附层析是利用吸附剂对不同物质的
吸附力不同而使混合物中各组分分离
的方法。吸附层析是各种层析技术中
应用最早的技术。吸附剂来源丰富、
价格低廉、可再生，吸附设备简单。
吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂
装在吸附柱中，装置成 吸附层析柱 。
层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，
当样品液全部进入吸附层析柱后，再加
入洗脱剂解吸洗脱。
在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸
附、再解吸、再吸附的过程。
溶剂洗脱法
置换洗脱法
前缘洗脱法
分配层析
分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分
分离的方法。
分配系数 是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡
时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，
层析系数是一常数。
在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅
藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为 固定相,这种溶剂在层析过
程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶
的溶剂可沿着固定相流动，称为 流动相 。当某溶质在流动相的
带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。
纸上层析
分配薄层层析
分配气相层析
离子交换层析是利用离子交换剂
上的 可解离基团（活性基团）对
各种离子的亲和力不同而达到分
离 目的的一种层析分离方法。
离子交换剂 是含有若干活性基团
的不溶性高分子物质。通过在不
溶性高分子物质（母体）上引入
若干可解离基团（活性基团）而
制成。
按活性基团的性质不同，离子交
换剂可以分为 阳离子交换剂 和 阴
离子交换剂 。由于酶分子具有两
性性质，所以可用阳离子交换剂，
也可用阴离子交换剂进行酶的分
离纯化。
凝胶层析又称为 凝胶过滤, 分子排阻层
析, 分子筛层析 等。是指以各种多孔凝
胶为固定相，利用流动相中所含各种组
分的相对分子质量不同而达到物质分离
的一种层析技术。
凝胶层析柱中装有 多孔凝胶,当含有各
种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，
大分子物质由于分子直径大，不能进入
凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间
隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小
的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进
出于一个个颗粒的微孔内外，这就使 小
分子物质向下移动的速度比大分子的速
度慢，从而使混合溶液中各组分按照相
对分子质量由大到小的顺序先后流出层
析柱，而达到分离的目的 。
常用的凝胶,
葡聚糖凝胶
琼脂凝胶与琼脂糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
亲和层析是利用生物分子与配基之间
所具有的专一而又可逆的亲和力，而
使生物分子分离纯化的技术。
酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅
助因子,抗原与抗体, 酶 RNA与互补的
RNA分子或片段,RNA与互补的 DNA分子
或片段 等之间,都是具有专一而又可
逆亲和力的生物分子对。故此,亲和
层析在酶的分离纯化中有重要应用,
亲和层析的四个要素
常用的亲和介质及专一性配体
根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为,
共价亲和层析
疏水层析
金属离子亲和层析
免疫亲和层析
染料亲和层析
凝集素亲和层析
疏水层析与反相层析的基本原理
本节
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5、电泳分离
带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移
动的过程称为电泳。
电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为,
纸电泳
薄层电泳
薄膜电泳
凝胶电泳
自由电泳
等电聚焦电泳
颗粒在电场中的移动速度主要决定于其 本身
所带的净电荷量,同时受 颗粒形状 和 颗粒大
小 的影响。此外，还受到 电场强度, 溶液
pH值, 离子强度 及 支持体的特性 等外界条
件的影响。
制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc-PAGE 进行，以便回收
具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不
佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。
本节
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6、萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技
术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也
可采用其它流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为,
有机溶剂萃取
双水相萃取
超临界萃取
反胶束萃取
各种双水相系统
聚合物 P 聚合物 Q或盐
聚丙二醇 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，
聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡
聚糖
聚乙二醇 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖
甲基纤维素 羟甲基葡聚糖，葡聚糖
乙基羟乙基纤维素 葡聚糖
羟丙基葡聚糖 葡聚糖
聚蔗糖 葡聚糖
聚乙二醇 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，
酒石酸钾钠
某些超临界流体的超临界点和超临界密度
流体名称 临界温度 (℃) 临界压力
(Mpa)
临界密度
（ g/ml）
乙烷 C2H6 32.3 4.88 0.203
丙烷 C3H8 96.9 4.26 0.220
丁烷 C4H10 152.0 3.80 0.228
戊烷 C5H12 296.7 3.28 0.232
乙烯 C2H4 9.9 5.12 0.227
氨 NH3 132.4 11.28 0.236
二氧化碳 CO2 31.1 7.38 0.46
二氧化硫 SO2 157.6 7.88 0.525
水 H2O 374.3 22.11 0.326
笑气 N2O 36.5 7.17 0.451
氟里昂 C 28.8 3.90 0.578 本节
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3.5 酶的组合分离纯化策略
Resolution（分辨率）
Speed（速度） Capacity（容量）
Recovery（回收率）
设计分离纯化工艺的基本要求
本章
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3.6 酶的浓缩、干燥与结晶
浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分
离纯化过程中是一个重要的环节。
离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓
缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去
水分，也可以达到浓缩效果。
蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸
发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容
易变性失活，故酶液的浓缩通常采用 真空浓缩 。即在一定的真
空条件下，使酶液在 60℃ 以下进行浓缩。
在固体酶制剂的生产过程
中，为了提高酶的稳定性，
便于保存、运输和使用，
一般都必须进行干燥。常
用的干燥方法有,
真空干燥
冷冻干燥
喷雾干燥
气流干燥
吸附干燥
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分
离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了
适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。
酶在结晶之前,酶液必须经过纯化达到一定的纯度 。如果酶液
纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在 50%以上，方
能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。
要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在
纯度达到 50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也
无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相
当的纯度而已。
盐析结晶
有机溶剂结晶
透析平衡结晶
等电点结晶
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