酶工程电子教案 第一章 绪论 1、酶的基本概念 酶的概念：具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别。 酶工程：酶的生产与应用的技术过程。 酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用等。 2、酶的发展史 19世纪以前： 4000 多年前的夏禹时代就已经掌握了酿酒技术。 3000多年前的周朝，就会制造饴糖、食酱等食品。 2500多年前的春秋战国时期，就懂得用麴来治疗消化不良等疾病。 19 世纪30年以来： 1833年，佩恩（ Payen）和帕索兹（ Persoz）从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到淀粉酶（ Diastase）。 19 世纪中叶，巴斯德( Pasteur)认为在活酵母细胞内有一种可以将糖发酵生成酒精的物质。 1878年昆尼（ Kunne）首次将酵母中进行酒精发酵的物质称为酶（ Enzyme ），这个词来自希腊文，其意思是“在酵母中”。 1896年，巴克纳（ Buchner）兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。 1902年，亨利（ Henri）根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出中间产物学说。 k1 k2 E ＋ S ======== ES ========E ＋ P K－1 1913年，米彻利斯（ Michaelis ）和曼吞（ menten ）米氏方程： Vm [S] v == Km + [S] “酶是生物体产生的具有生物催化功能的物质”。但是尚未搞清楚究竟是哪一类物质？ 1920年，德国化学家威尔斯塔特（Willstater）将过氧化物酶纯化12 000倍。 1926年，萨姆纳（Sumner）首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。 1960年，雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。 1982年，切克（Thomas Cech）等人发现四膜虫（Tetrahynena）细胞的26 S rRNA前体具有自我剪接功能（Self-splicing）。并将这种具有催化活性的RNA 称为ribozyme。 1983年，阿尔特曼（Sidney Altman）等人发现核糖核酸酶P（RNase P）的RNA部分M1 RNA 具有核糖核酸酶P 的催化活性。 由此引出“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）”的新概念。 3、酶催化作用的特点 3.1酶催化作用的专一性强 酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。 酶的专一性按其严格程度的不同，可以分为绝对专一性和相对专一性两大类。 3.1.1绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。 例如，乳酸脱氢酶 [ EC 1.1.1.27 ] 催化丙酮酸进行加氢反应生成L－乳酸： CH3 CH3 | 乳酸脱氢酶 | C＝O =============== H－C－OH | | COOH NADH NAD COOH 丙酮酸 L－乳酸 核酸类酶也同样具有绝对专一性：四膜虫26 S rRNA前体等催化自我剪接反应的 R酶，只能催化其本身RNA分子进行反应，而对于其它分子一概不作用。 3.1.2相对专一性:一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。 相对专一性又可分为键专一性和基团专一性。 键专一性的酶能够作用于具有相同化学键的一类底物。 如，酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸： O || 酯酶 R－C－O－R’＋ H2O =========== R-COOH ＋ R’-OH （酯） （水） （酸） （醇） 基团专一性的酶则要求底物含有某一相同的基团。 如胰蛋白酶 [EC 3.4.31.4 ] 选择性地水解含有赖氨酰-或精氨酰-的羰基的肽键。 再如核酸类酶M1 RNA（核糖核酸酶P 的RNA部分），催化 tRNA前体5’-末端的成熟。要求底物核糖核酸的3’-端部分是一个tRNA，而对其5’-端部分的核苷酸链的顺序和长度没有要求，催化反应的产物为一个成熟的tRNA分子和一个低聚核苷酸。 3.2酶催化作用的效率高 酶催化的转换数（ 每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数）一般为 103 min-1左右。 酶催化和非酶催化反应所需的活化能有显著差别。如图 1-1 所示。 从图中可以看到，酶催化 反应比非酶催化反应所需的活 活 非催化反应 化能要低得多。 化 能 酶催化反应 图1-1 酶与非酶催化所需的活化能 反应过程 3.3酶催化作用的条件温和 酶的催化作用一般都在常温、常压、pH近乎中性的条件下进行。 原因：一是由于酶催化作用所需的活化能较低，二是由于酶是具有生物催化功能的生物大分子。在高温、高压、在过高或过低pH等极端条件下，大多数酶会变性失活而失去其催化功能。 4.影响酶催化作用的因素 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。 4.1底物浓度的影响 底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素。在其他条件不变的情况下，酶催化反应速度与底物浓度的关系如图1-2所示。 从图中可以看到， 在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与 底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。 v Vm 著名的米氏方程: VmS 0 V = [S] Km + S 图1-2 底物浓度与酶催化反应速度的关系 式中，V为反应速度 S为底物浓度 Vm为最大反应速度 Km为米氏常数，为酶催化反应速度等于最大反应速度一般时的底物浓度。 这一酶催化反应的基本动力学方程阐明了底物浓度与酶催化反应速度之间的定量关系。 有些酶在底物浓度过高时，反应速度反而下降，这是由于高浓度底物引起的抑制作用。 4.2酶浓度的影响 在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速度与酶浓度成正比，如图1-3所示。它们 之间的关系可以用下式表示： V = k [E] 4.3温度的影响 每一种酶的催化反应都有其适宜温度范围 和最适温度。 底物浓度 图1-3 酶浓度与反应速度的关系 在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。 如图1-4所示。 温度 图1-4 温度与反应速度的关系 4.4 pH值的影响 酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系。 每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH 值。 pH值 图1-5 pH值与反应速度的关系 在最适pH值条件下，酶催化反应速度达到最大。如图1-5所示。 pH值影响酶的催化作用：主要是由于在不同的pH值条件下，酶分子和底物分子中基团的解离状态发生改变，从而影响酶分子的构象以及酶与底物的结合能力和催化能力。在极端的pH值条件下，酶分子的空间结构发生改变，从而引起酶的变性失活。 4.5 抑制剂的影响 酶的抑制剂：使酶的催化活性降低或者丧失的物质。 主要的外源抑制剂有各种无机离子，小分子有机物和蛋白质等。例如，银 (Ag+)、汞 (Hg++)、铅 (Pb++) 等重金属离子对许多酶均有抑制作用，抗坏血酸（Vit. C）抑制蔗糖酶的活性，胰蛋白酶抑制剂抑制胰蛋白酶的活性等等。有些酶抑制剂是一类有重要应用价值的药物，例如，胰蛋白酶抑制剂治疗胰腺炎，胆碱酯酶抑制剂治疗血管疾病等。 抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂之分。 不可逆抑制剂：与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。 可逆性抑制剂：与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。 根据可逆性抑制作用的机理不同， 酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。 4.5.1竞争性抑制（competitive inhibition）：指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。 机制：竞争性抑制剂与酶作用底物的结构相似。它与酶分子结合以后，底物分子就不能与酶分子结合，从而对酶的催化起到抑制作用。 例如，丙二酸是琥珀酸的结构类似物。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。 COOH | CH COOH | | CH2 CH2 | | COOH COOH (琥珀酸) （丙二酸） 竞争性抑制的效果强弱与竞争性抑制剂的浓度、底物浓度以及抑制剂和底物与酶的亲和力大小有关。随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。 竞争性抑制的特点：是酶催化反应的最大反应速度Vm不变，而米氏常数Km增大。如图1-6所示。 1/v [I] 1/Vm －1/Km 1/[S] 图1-6 线性竞争性抑制的Km和Vm变化 4.5.2 非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而引起酶活性降低的抑制作用。 机制：由于非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合，所以，抑制剂的分子结构可能与底物分子的结构毫不相关。增加底物浓度也不能使非竞争性抑制作用逆转。 非竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm减小，而米氏常数Km不变。如图1-7所示。 1/v [I1] [I2] 1/Vm －1/Km 1/ [S] 图1-7 非竞争性抑制的Km和Vm变化 4.5.3反竞争性抑制(uncompetitive inhibition)：在底物与酶分子结合生成中间复合物后， 抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。 机制：反竞争性抑制剂不能与未结合底物的酶分子结合，只有当底物与酶分子结合以后由于底物的结合引起酶分子结构的某些变化，使抑制剂的结合部位展现出来，抑制剂才能结合并产生抑制作用。所以亦不能通过增加底物浓度使反竞争抑制作用逆转。 反竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减小。 如图1-8所示。 1/v 1/Vm [I] 1/Km [S] 图1-8 反竞争性抑制的Km 和Vm变化 4.6激活剂的影响 酶的激活剂或活化剂：能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质。 常见的激活剂有Ca++、Mg++、Co++、Zn++、Mn++等金属离子和Cl- 等无机负离子。 例如，氯离子（Cl-）是α-淀粉酶的激活剂，钴离子（Co+2）和镁离子（Mg+2）是葡萄糖异构酶的激活剂等。 有的酶也可以作为激活剂，通过激活剂的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性显示出来。 5.酶的分类与命名 按其化学组成不同，酶可以分为两大类别。主要由蛋白质组成的酶称为蛋白类酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 5.1．蛋白类酶(P酶)的分类与命名 国际酶学委员会（ International Commission of Enzymes） 根据国际酶学委员会的建议，每一种具体的酶都有其推荐名和系统命名。 5.1.1推荐名:在惯用名称的基础上，加以选择和修改而成。 酶的推荐名一般由两部分组成：第一部分为底物名称，第二部分为催化反应的类型。后面加一个“酶”字（ -ase）。不管酶催化的反应是正反应还是逆反应，都用同一个名称。 例1，葡萄糖氧化酶（ Glucose oxidase），表明该酶的作用底物是葡萄糖，催化的反应类型属于氧化反应。 例2 水解酶类，其催化水解反应，在命名时可以省去说明反应类型的“水解”字样，只在底物名称之后加上“酶”字即可。例如，淀粉酶，蛋白酶，乙酰胆碱酶等。 5.1.2 酶的系统命名 系统名称（ Systematic name）：包括了酶的作用底物，酶作用的基团及催化反应的类型。 例如，上述葡萄糖氧化酶的系统命名为“β-D-葡萄糖：氧 1-氧化还原酶”（ β-D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase）。 蛋白类酶（P酶）的分类原则为： ◆按照酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为 6 大类。即第 1 大类，氧化还原酶；第 2大类，转移酶；第 3 大类，水解酶；第 4 大类，裂合酶；第 5 大类，异构酶；第 6 大类，合成酶（或称连接酶）。 ◆每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类。 ◆每一亚类中再分为若干小类。 ◆每一小类中包含若干个具体的酶。 酶系统编号：采用四码编号方法，第一个号码表示该酶属于 6 大类酶中的某一大类，第二个号码表示该酶属于该大类中的某一亚类，第三个号码表示属于亚类中的某一小类，第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。每个号码之间用圆点（·）分开。 例，葡萄糖氧化酶→ [ EC 1.1.3.4 ]： ◆EC 表示国际酶学委员会（ Enzyme Commission,）； ◆第一个号码“1”表示该酶属于氧化还原酶（第 1 大类）； ◆第二个号码“1”表示属氧化还原酶的第 1 亚类，该亚类所催化的反应系在供体的CH－OH 基团上进行； ◆第三个号码“3”表示该酶属第 1 亚类的第 3 小类，该小类的酶所催化的反应是以氧为氢受体； ◆第四个号码“4”表示该酶在小类中的特定序号。 蛋白类酶系统分类的6 大类酶： （1）氧化还原酶（ Oxidoreductases） 催化氧化还原反应的酶称为氧化还原酶。其催化反应通式为： AH2 ＋ B ＝ A ＋ BH2 被氧化的底物（AH2）为氢或电子供体，被还原的底物（B）为氢或电子受体。系统命名时，将供体写在前面，受体写在后面，然后再加上氧化还原酶字样。 例，醇 ＋ NAD＋ ＝ 醛或酮 ＋ NADH ＋ H＋→氢供体是醇， 氢受体是NAD＋ 系统命名→醇：NAD＋氧化还原酶； 推荐名→采用某供体脱氢酶，如醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase） （2）转移酶（Transferases） 催化某基团从供体化合物转移到受体化合物上的酶称为转移酶。其反应通式为： AB ＋ C ＝ A ＋ BC 系统命名：“供体：受体某基团转移酶”。 例，L-丙氨酸：2-酮戊二酸氨基转移酶 ，表明该酶催化氨基从L-丙氨酸转移到 2-酮戊二酸。 推荐名：“受体（或供体）某基团转移酶。 例，丙氨酸氨基转移酶→ L-丙氨酸 ＋ 2-酮戊二酸 ＝ 丙酮酸 ＋ L-谷氨酸 （3）水解酶 (Hydrolases) 催化各种化合物进行时间反应的酶称为水解酶。其反应通式为： AB ＋ H2O ＝ AOH ＋ BH 系统命名：先写底物名称，再写发生水解作用的化学键位置，后面加上“水解酶”。 例，核苷酸磷酸水解酶，表明该酶催化反应的底物是核苷酸，水解反应发生在磷酸酯键上。推荐名：在底物名称的后面加上一个酶字。 例，核苷酸酶（其催化反应式为: 核苷酸 ＋ H2O ＝ 核苷 ＋ H3PO4） （4）裂合酶 (Lyases) 催化一个化合物裂解成为两个较小的化合物及其逆反应的酶成为裂合酶。其反应通式为： AB ＝A ＋ B 系统命名：“底物-裂解的基团-裂合酶”。 如 L-谷氨酸 1-羧基-裂合酶，表明该酶催化L-谷氨酸在 1-羧基位置发生裂解反应。 推荐名：在裂解底物名称后面加上“脱羧酶”（ decarboxylase）、“醛缩酶”（aldolase）、“脱水酶”（dehydratase）等，在缩合反应方向更为重要时，则用“合酶”( synthase) 这一名称。 例子，如谷氨酸脱羧酶（L-谷氨酸 ＝ γ-氨基丁酸 ＋ CO2），苏氨酸醛缩酶（ L-苏氨酸＝ 甘氨酸 ＋ 乙醛），柠檬酸脱水酶（ 柠檬酸 ＝ 顺乌头酸 ＋ 水），乙酰乳酸合酶（ 2-乙酰乳酸 ＋ CO2 ＝ 2-丙酮酸）。 （5）异构酶 (Isomerases) 催化分子内部基团位置或构象的转换的酶称为异构酶。其反应通式为： A＝B。 异构酶按照异构化的类型不同，分为 6 个亚类。命名时分别在底物名称的后面加上异构酶（isomerase），、消旋酶（racemase）、变位酶（mutase）、表异构酶（epimerase）、顺反异构酶（cis-trans-isomerase）等。 例如，木糖异构酶（其催化反应式为: D-木糖＝D-木酮糖） （6）连接酶(Ligases) 或合成酶 (Synthetases) 连接酶是伴随着ATP等核苷三磷酸的水解，催化两个分子进行连接反应的酶。其反应通式为： A + B + ATP ＝ AB + ADP + Pi （或 AB +AMP +PPi）。 系统命名：在两个底物的名称后面加上“连接酶”。如 谷氨酸：氨连接酶，其催化反应式为： L-谷氨酸 + 氨 + ATP =========== L-谷氨酰胺 + ADP +Pi。 推荐名：在合成产物名称之后加上“合成酶”。如，天门冬酰胺合成酶，其催化反应式为： L-天门冬氨酸 + 氨 +ATP =============== L-天门冬酰胺 + AMP +PPi。 5.2核酸类酶（R酶）的分类 ◆目前对其分类和命名还没有统一的原则和规定。 ◆R酶采用的分类原则： ①根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是其它分子，将核酸类酶分为分子内催化（in cis）R酶和分子间催化（in trans）R酶两大类。 ②在每个大类中，根据酶的催化类型不同，将R酶分为若干亚类。如剪切酶，剪接酶，多功能酶等。据此，可将分子内催化的R酶分为自我剪切酶（Self-cleavage），自我剪接酶（Self-splicing）等亚类；分子间催化的R酶可以分为RNA剪切酶，DNA剪切酶，氨基酸酯剪切酶，多肽剪切酶，多糖剪接酶等亚类。 ③在每个亚类中，根据酶的结构特点和催化特性的不同，分为若干小类。如自我剪接酶中，可分为含有I型IVS的自我剪接酶和含II型IVS的自我剪接酶等小类。 ④在每个小类中，包括若干个具体的R酶。 ⑤在可能与蛋白类酶（P酶）混淆的情况下，标明R酶，以示区别。 5.2.1 分子内催化（in cis）的R酶 ◆分子内催化的R酶是指催化本身RNA分子进行反应的一类核酸类酶。该大类酶均为RNA前体。 ◆根据酶所催化的反应类型，可以将该大类酶分为自我剪切酶和自我剪接酶等。 (1)自我剪切酶( Self-cleavage ribozyme):自我剪切酶是指催化本身RNA进行剪切反应的R酶。 (2)自我剪接酶（self-splicing ribozyme）:在一定条件下催化本身RNA分子同时进行剪切和连接反应的R酶。 ◆根据其结构特点和催化特性的不同，自我剪接酶可分为含I 型 IVS 的R酶和含 II 型 IVS的R酶等。 5.2.2分子间催化（in trans）的R酶 ◆分子间催化的R酶是催化其它分子进行反应的核酸类酶。 ◆根据所作用的底物分子的不同，可以分为若干亚类： （1）作用于其它RNA分子的R酶 该亚类的酶可催化其它RNA分子进行反应。根据反应的类型不同，可以分为若干小类。如RNA剪切酶，多功能R酶等。 （2）作用于DNA的R酶 该亚类的酶是催化DNA分子进行反应的R酶。 （3）作用于多糖的R酶 该亚类的酶是能够催化多糖分子进行反应的核酸类酶。 （4）作用于氨基酸酯的R酶 以氨基酸酯为底物的核酸类酶。该酶同时具有氨基酸酯的剪切作用、氨酰基－tRNA的连接作用和多肽的剪接作用等功能。 6. 酶的活力测定 酶活力：指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。 酶催化反应速度：通常用单位时间（t）内底物(S)的减少量或产物(P)的增加量表示。即： d S dP V ＝ － = dt dt 6.1酶活力测定方法 酶活力测定的方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法等。 酶活力测定的要求：快速、简便、准确。 ◆酶活力测定的步骤： (1)根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 (2)根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 温度：室温（25℃）、体温（37℃）、酶反应最适温度或其它选用的温度； pH值：是酶催化反应的最适pH值； 底物浓度：应该大于 5 Km等。 (3)在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 (4) 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。 ◆终止酶反应的方法： （1）反应时间一到，立即取出适量反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活； （2）加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活； （3）加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH，而使反应终止； （4）将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至 10℃以下，而终止反应。 6.2 酶活力单位 ◆酶活力的高低，是以酶活力的单位数来表示的。 ◆酶活力单位的定义：在特定条件下（温度可采用25℃，pH等条件均采用最适条件），每1 min 催化1 μmol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位。这个单位称为国际单位（IU）。（1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定） ◆国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（Kat）。在特定条件下，每秒催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（Kat）。 ◆两种酶活力单位之间可以互相换算。即： 1 Kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60×106 μmol/min = 6×10 7 IU ◆比活力：为了比较酶制剂的纯度和活力的高低。 酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。 酶比活力＝酶活力（单位）/ mg （蛋白或RNA） 6.3 酶的转换数与催化周期 ◆酶的转换数Kp，又称为摩尔催化活性（molar catalytic activity ），是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。单位为 min-1 。 底物转变摩尔数（mol） 酶活力单位数（IU） Kp ＝ ＝ 酶摩尔数 。分钟（mol·min） 酶微摩尔数（μmol） 一般酶的转换数在103 min-1左右，碳酸酐酶的转换数最高，达到3.6×107 min-1. ◆转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。单位为毫秒（msec）或微秒（μsec）。 即 T = 1/ Kp 6.4固定化酶的活力测定 ◆固定化酶常用的活力测定方法： (1)振荡测定法：称取一定重量的固定化酶, 放进一定形状一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌， 一边进行催化反应。经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定酶活力。 (2) 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，在适宜的条件下让底物溶液以一定的流速流过酶柱，收集流出的反应液。测定反应液中底物的消耗量或产物的生成量，再计算酶活力。 (3) 连续测定法：利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定,从而测定固定化酶的酶活力。 (4) 固定化酶的比活力测定：在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。 对于酶膜、酶管、酶板等固定化酶，其比活力则可以用单位面积的酶活力单位表示。 即：比活力= 酶活力单位/ cm2 ◆酶结合效率又称为酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率。酶结合效率的计算一般由用于固定化的总酶活力减去未结合的酶活力所得到的差值，再除以用于固定化的总酶活力而得到。 加入的总酶活力 — 未结合的酶活力 酶结合效率 = x 100% 加入的总酶活力 ◆酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。 固定化酶总活力 酶活力回收率 = x 100% 用于固定化的总酶活力 ◆相对酶活力的测定：具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。 7.酶的生产方法 ◆酶的生产方法可以分为提取分离法、生物合成法和化学合成法等3种。 7.1提取分离法 提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程。 ◆酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。主要的提取方法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。 ◆酶的分离纯化是采用各种生化分离技术，诸如：离心分离、过滤与膜分离、萃取分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、以及浓缩、结晶、干燥等，使酶与各种杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。 7.2生物合成法 ◆据所使用的细胞种类不同，生物合成法可以分为微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶和动物细胞培养产酶。自从1949年细菌α- 淀粉酶发酵成功以来，生物合成法就成为酶的主要生产方法。 ◆生物合成法产酶首先要经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法获得优良的产酶细胞，然后在人工控制条件的生物反应器中进行细胞培养，通过细胞内物质的新陈代谢作用，生成各种代谢产物，再经过分离纯化得到人们所需的酶。 7.3 化学合成法 化学合成法是采用合成仪进行酶的化学合成,成本高,难以工业化生产。 用途：行酶的人工模拟和化学修饰，对认识和阐明生物体的行为和规律，具有重要的理论意义和发展前景。 ◆模拟酶是在分子水平上模拟酶活性中心的结构特征和催化作用机制，设计并合成的仿酶体系。 ◆大分子仿酶体系有分子印迹酶模型和胶束酶模型等。 8. 酶工程发展概况 ◆1894年， 日本的高峰让吉首先从米曲霉中制备得到高峰淀粉酶，用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用的先例； ◆1949年， 采用微生物液体深层培养方法进行细菌α-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕。 ◆1960年， 法国的雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，使酶的生物合成可以按照人们的意愿加以调节控制。 ◆20世纪80年代迅速发展起来的动、植物细胞培养技术，继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。 ◆固定化酶 ◆固定在菌体中的固定化酶（又称为固定化死细胞或固定化静止细胞）技术 ◆固定化细胞（固定化活细胞或固定化增殖细胞）技术 ◆固定化原生质体技术 ◆酶分子修饰技术 ◆有机介质中酶的催化